專利名稱：齲齒疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及到疫苗的技術(shù)，更特別為齲齒疫苗，并進一步疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
齲齒，或稱為蛀牙，是一種慢性傳染病，導(dǎo)致鈣化組織的區(qū)域消融和破壞。如果不及時治療，齲齒可以引起相當(dāng)大的痛苦和不適，并最終失去牙齒。齲齒維持一個世界性的高患病率和使得治療的費用非常高，是一個重大的公共衛(wèi)生問題。變形鏈球菌(5被認(rèn)為是造成人類齲齒的首要病源細(xì)菌。變形鏈球菌表達一種表面蛋白，指定為抗原I / II型，B，P1，或PAc。PAc于變形鏈球菌在牙齒表面的初始黏附和爾后變形鏈球菌在牙齒表面的聚集的過程中起作用；因此PAc被認(rèn)為是一個關(guān)鍵的致病因子，促進齲齒的病理發(fā)生。由于其在變形鏈球菌的齲齒生成性(cariogenicity) 中的重要性，PAc是公認(rèn)的研制防齲齒疫苗的目標(biāo)。在一個早期的研究中，雷納等(Lehneret al. (Immunization with Purified Protein Antigens from Streptococcus mutans Against Dental Caries in Rhesus Monkeys. Infection and Immunity 34, 407-415 (1981)))從細(xì)菌培養(yǎng)中直接純化了蛋白抗原I，I / Π，Π，ΙΙΙ。純化抗原與佐劑(弗氏不完全佐劑或氫氧化鋁)肌注給藥?？乖?I，I / II和抗原IK程度較輕)引起齲齒的顯著減少，但是抗原III沒有引起齲齒減少。對齲齒的保護主要是與血清和齦溝液中IgG抗體相關(guān)。在這項研究中使用的免疫計劃下，血清IgA抗體的滴度在10 0.7和2.8之間。然而，在實驗中使用的抗原的純度是一個問題。 此外，聲稱的有效性可能得益于給藥途徑，即肌肉注射。由于變形鏈球菌的感染模式，粘膜免疫應(yīng)是研制一種有效疫苗的優(yōu)選。不幸的是， 許多研究都表明，當(dāng)通過粘膜途徑免疫時，沒有一個合適的佐劑的PAc是一個弱的免疫原。 為了角軍決這個問題，Saito 等(Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccination with Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant. Journal of Infectious Diseases 183, 823-826 (2OOl))從變形鏈球菌培養(yǎng)上清中純化了 PAc。PAc和MCT的鼻腔免疫誘導(dǎo)PAc特異性IgA抗體，唾液中的滴度(， 6. 1+/-1. 7)和鼻洗液樣本中的滴度(10 ，8. 2+/ -1.5)。通過PAc和MCT的鼻腔免疫誘導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答提供顯著抑制變形鏈球菌的定植。然而，這項研究有嚴(yán)重缺陷。首先，使用的PAc抗原不是一個表達的重組蛋白；從細(xì)菌培養(yǎng)直接純化不能排除顯示的成效由污染造成的可能性；這與以上所述的萊納研究相似。二，CT是有毒的；盡管它已經(jīng)被研究多年，離人體應(yīng)用仍然需假以時日。最后，防止齲齒的有效性并沒有直接顯示。綜上所述，盡管先例中已經(jīng)提示PAc可能是一個研發(fā)針對由變形鏈球菌引起的齲齒的疫苗的可能的抗原，但是對什么是一個針對變形鏈球菌引起的齲齒的有效黏膜疫苗并沒有指導(dǎo)或提示。因此，迫切需要的是研發(fā)一個針對變形鏈球菌引起齲齒的有效黏膜疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于由變形鏈球菌感染引起的齲齒的疫苗組合物，該疫苗組合物包含從變形鏈球菌表面蛋白PAc派生的抗原和從鞭毛素派生的佐劑。本發(fā)明進一步提供制備疫苗組合物的方法。本發(fā)明還提供了通過給一個個體應(yīng)用該疫苗組合物來預(yù)防或治療由變形鏈球菌引起的齲齒的方法。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
進一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護的范圍。


根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案現(xiàn)在參考附圖加以描述，其中相似參考數(shù)字代表相似元素。圖1顯示了純化的PAc和FLIC; (A)I道免疫印跡純化的PAc，用HRP-交聯(lián)的抗 His標(biāo)簽的抗體檢測；2道純化的重組PAc的考馬斯亮藍染色，SDS - PAGE ； (B)3道重組FLIC的考馬斯藍染色，SDS - PAGE; 4道免疫印跡純化的FLIC，用HRP-交聯(lián)的抗His 標(biāo)簽的抗體檢測。圖2是一個圖表，顯示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗體的滴度，四組小鼠滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 10微克PAc ； (3) 10微克PAc + 1微克FLIC; (4) 10微克PAc + 5微克FLIC，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖3是一個圖表，顯示(a)血清抗-PAc IgG，(b)血清抗PAc IgA和(c)唾液抗 PAc IgA的滴度，四組大鼠滴鼻免疫(1 )PBS ;(2)5微克FLIC; (3)20微克PAc + 5微克 FLIC; (4) 40微克PAc + 5微克FLIC，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖4顯示了三個示范圖片，說明(A)大鼠正常磨牙的中位數(shù)矢切片(右頌骨舌側(cè)部分)及(B)大鼠齲磨牙的中位數(shù)矢切片(右舌側(cè)下頌骨的一部分)，大鼠經(jīng)變形鏈球菌 Ingbritt的挑戰(zhàn)和感染，其中在圖片中的箭頭表示不同程度的齲齒。(C)大鼠磨牙的中位數(shù)矢切片(右舌側(cè)下頌骨的一部分)，大鼠經(jīng)20微克PAc + 5微克FLIC免疫，隨后用變形鏈球菌hgbritt挑戰(zhàn)。偶爾可觀察到輕度齲斑和其中一個由箭頭所示。圖5包含兩個圖表，顯示(A)四組大鼠齲齒的整體得分，每個點代表一只大鼠的齲水平和(B)四組大鼠磨牙的不同部分的齲齒的凱斯(Keyes)得分，四組大鼠滴鼻免疫(1) PBS; (2) 5 微克 FLIC; (3) 20 微克 PAc + 5 微克 FLIC; (4) 40 微克 PAc + 5 微克 FLIC。 得分值表示為均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差值。*與陰性對照組有顯著性差異(P <0. 05)。**與陰性對照組有顯著性差異(P <0.01)。***與陰性對照組有顯著性差異(P <0.001)。符號 EZ3,搪瓷病變;_，牙本質(zhì)病變輕微;Θ，中度牙本質(zhì)病變。圖6顯示pET28a-KF_PAc質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖。圖7顯示pET28a-KFD2_PAc質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖。圖 8 顯示純化了的 PAc，KF-PAc 和 KFD2_PAc 的(A) SDS-PAGE 圖及(B) Western Blot 圖。圖9是一個圖表，顯示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。
圖10包括三個圖表，顯示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗 PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖11包括三個圖表，顯示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗 PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖12是一個圖表，顯示五組大鼠齲齒的凱氏(keyes)得分，每個點代表一只大鼠的齲患水平得分值表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
具體實施例方式本發(fā)明可參考以下詳細(xì)描述的某些實施例而更容易理解。在這個申請書的通篇中，在出版物被引用，這些出版物的披露的全部成為本申請書的一部份，為了更充分地描述了與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)。本發(fā)明的應(yīng)用將使用，除非另有說明，分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)為該領(lǐng)域的一般人員所熟知。這些技術(shù)在文獻中有詳細(xì)的解釋，例如，M^ecWar Cloning: A Laboratory Mannual, second edition (Sambrook et al. , 1989)； Current Pro toco Is in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. , eds. , 1987)·。本發(fā)明的一個方面提供針對變形鏈球菌感染引起齲齒的作為預(yù)防或治療藥劑使用的疫苗。在一個實施例中，本發(fā)明的疫苗包括來自變形鏈球菌的表面抗原(PAc)和作為佐劑的鞭毛素。在某些實施例中，PAc和鞭毛素分開表達，然后在利用它們制造疫苗時再混合；在某些實施例中，PAc和鞭毛素作為一個單一的重組蛋白表達，例如PAc插入鞭毛素的高變域或替換鞭毛素的部分或全部高變域；在某些實施例中，PAc和鞭毛素被標(biāo)記或交聯(lián)上互補性基團，使這兩種分子非常接近；在某些實施例中，PAc和鞭毛素交聯(lián)；在某些實施例中，PAc和鞭毛素吸附到一個載體上，使這兩種分子非常接近。在某些實施例中，PAc抗原是全長蛋白(SEQ ID NO. 2)。在某些實施例中，PAc抗原是一個全長蛋白的編輯版本，包括主要的抗原表位。編輯版本指一個或多個PAc的主要抗原表位在一個重組蛋白表達，其中抗原表位直接耦合或被一些氨基酸分開，只要能夠維持其抗原構(gòu)象即可。整個申請書中使用的“變種”，是指一種多肽，具有功能的，并與在序列表中確定的序列至少有90%的同源性，更優(yōu)選至少有95%的身份。例如，對于PAc，PAc的一個變種，是指一種多肽，能用于誘導(dǎo)針對PAc的免疫反應(yīng)，并與SEQ ID NO. 1序列至少有90%的同源性。在某些實施例中，融合蛋白包括一個可裂解連接件，置于PAc和純化標(biāo)簽之間，能夠通過對融合蛋白的化學(xué)或酶處理而去除融合蛋白的標(biāo)簽。很明顯，可裂解連接件可以根據(jù)用戶的愿望置于融合蛋白中的任何位置。在表達載體中，可裂解連接件包括一個DNA序列，其編碼可在其C -端由化學(xué)或酶裂解的一個氨基酸或氨基酸序列。用于裂解蛋白的化學(xué)試劑的例子包括溴化氰，2-(2 nitrophenylsulfenyl)-3-溴 -3'-methylindolinium (BNPS-skatole)，羥胺，和類似物。溴化氰在蛋氨酸殘基的C -末端裂解蛋白。BNPS-skatole在一個色氨酸殘基的C -末端切割。羥胺在ASN - Z基團的C -末端切割，其中Z是甘氨酸，亮氨酸，或丙氨酸。
用于裂解蛋白的酶試劑的例子包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，纖維蛋白溶酶，凝血酶，腸激酶，和類似物。每一個在其識別的特定氨基酸序列進行切割。例如，腸激酶識別氨基酸序列-(Asp)n-賴氨酸，其中η是一個從2到4的整數(shù)。在某些實施例中，融合蛋白包括一個或多個其它純化標(biāo)簽。例如，6個組氨酸殘基融合到PAc的N -或C-端，允許由Ni2+柱來純化PAc。純化后，可以通過化學(xué)或酶法裂解去掉6個組氨酸殘基。事實上，任何已知的純化標(biāo)簽都是合適的，這里包括myc基因標(biāo)記，標(biāo)志肽，KT3表位，α-微管蛋白表位，T7基因10蛋白肽標(biāo)簽，谷胱甘肽-S -轉(zhuǎn)移酶(GST)， 鏈球菌標(biāo)簽，牛胰胰蛋白酶抑制劑(ΒΡΤΙ)，麥芽糖結(jié)合蛋白(ΜΒΡ)。如上所述，表達載體的克隆，構(gòu)建和擴增技術(shù)是眾所周知的。因此，PAc或FLIC表達載體按常規(guī)程序構(gòu)建；為了不掩蓋本發(fā)明，沒有提供進一步的細(xì)節(jié)。粘膜表面是身體的最重要保護屏障，這是由于主要亞型S-IgA，共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)的產(chǎn)品。有幾個用于局部免疫的粘膜途徑，包括口腔，胃灌注，鼻腔，肺，陰道和直腸。與其它粘膜途徑相比，滴鼻免疫具有更多的優(yōu)點，如更方便的給藥和更容易引發(fā)黏膜反應(yīng)，尤其是在口腔中。鼻腔給藥是一種方便的投送途徑和已被證明在防齲齒疫苗接種中有效誘導(dǎo)唾液IgA反應(yīng)。本文所用“疫苗”指一個用于在個體中誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原制劑。疫苗可以有一個以上的成分是抗原。本文所用“非蛋白載體”指不是蛋白質(zhì)的載體，可以用來展示多個PAc和鞭毛素抗原表位?！拔⑤d體”一詞是指微粒組合物，不溶于水，其大小小于150，120或100微米左右， 更常見的小于約50-60微米左右，并可能小于約10微米左右或甚至小于約5微米左右。 微載體包括“nanocarriers”，這些微載體的大小小于1微米左右，優(yōu)選地小于500納米左右。微載體包括生物相容性自然發(fā)生的聚合物，合成聚合物或合成的共聚物組成的固相顆粒等顆粒。固相微載體可以由在生理條件下不蝕或非降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯，聚丙烯，硅膠，陶瓷，聚丙烯酰胺，金，乳膠，羥基磷灰石，及鐵磁和順磁材料?？缮锝到獾墓滔辔⑤d體可以由在生理條件下降解的聚合物(例如，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)及其共聚物如聚(D，L -乳酸-CO -乙醇酸)或可蝕的(例如，聚(如鄰酯3，9 - diethylidene -2 ,4,8, 10 - tetraoxaspiro [5，5] —^一烷(DETOSU)或聚(酐)，如聚癸二酸(酐)，)等形成。微載體通常是球形的形狀，但偏離球形的微載體這也是可以接受的(例如，橢圓形，桿狀形等)。微載體也可能是液相(例如，油或脂為主)，如脂質(zhì)體，無抗原的iscoms (免疫刺激復(fù)合物，由膽固醇，磷脂和佐劑活性的皂甙形成的穩(wěn)定復(fù)合物)，或在水包油型或油包水的乳化液中的水滴或膠束，如MF59?？缮锝到獾囊合辔⑤d體通常采用一種可生物降解的油，其中一些是眾所周之，包括角鯊烯和植物油。本文所用的“nonbiodegradable” 一詞是指一個微載體在哺乳動物正常生理條件下不被降解或侵蝕。一般地，一個微載體被認(rèn)為是nonbiodegradable，如果它在正常人血清中37°C孵化72小時后沒有被降解(即失去低于 5%它的質(zhì)量或聚合物的平均長度)。“個體”或“主體”是脊椎動物，如鳥類，優(yōu)選地是哺乳動物，如人類。哺乳動物包括但不僅限于人類，非人類靈長類動物，農(nóng)場動物，運動的動物，實驗動物，嚙齒類動物(如小鼠和大鼠)和寵物。
一種物質(zhì)的“有效量”或“足夠量”指它的量足以達到所需的生物效應(yīng)，如有利的結(jié)果，包括臨床結(jié)果，正因為如此，一個“有效量”依賴于它被應(yīng)用的環(huán)境。在本發(fā)明的背景下，包含所需抗原組合物的有效量的一個例子是一個足以在個體中引起免疫反應(yīng)的量。一個有效量可以分一次或多次給予?！按碳ぁ泵庖叻磻?yīng)，如體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，是指反應(yīng)的增加，可能來自反應(yīng)的誘導(dǎo)
/或提高°本文所用，并在行內(nèi)廣為理解，“治療”是一種方法去獲得有益的或預(yù)期的結(jié)果， 包括臨床結(jié)果。對于這項發(fā)明，有益的或所需的臨床效果包括，但不局限于，減輕或改善一個或多個癥狀，感染的程度逐漸降低，穩(wěn)定(即不惡化)感染，改善或緩解的狀態(tài)傳染病的狀態(tài)，并緩解(不論是部分或全部)，無論是檢出或檢測不到?！爸委煛?，也意味著與如果不接受治療的預(yù)期生存相比延長生存期。根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物的“劑量”，是在一個特定的時間點給予的疫苗組合物的量。一個“劑量”也可能是使用緩釋配方和/或設(shè)備逐步給予個體的疫苗組合物的量。在本發(fā)明的某些實施例中，疫苗組合物的兩個或更多劑量在不同時間點給予個體。根據(jù)本發(fā)明，PAc的“免疫有效量”是指一個PAc的量，在一個處理的個體中引起針對隨后挑戰(zhàn)的變形鏈球菌的完全或部分的免疫力。完全或部分的免疫力，無論是定性或定量，可以通過觀察在被挑戰(zhàn)后，比較未接種疫苗個體與接種疫苗個體的齲齒的臨床癥狀。 如果接種疫苗的個體被挑戰(zhàn)后的的臨床癥狀與未接種疫苗的個體被相似或相同挑癥狀相比是減少，減輕或消除，給予接種疫苗的個體的PAc量被視為一個“免疫有效量”。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞具有通常理解的相同含義
PAc的劑量是0. 1至60微克。優(yōu)選地，PAc劑量是0. 25微克至15微克。更優(yōu)選地，劑量為1至3微克。本發(fā)明的疫苗可能進一步包括另一個佐劑。合適的佐劑的非限制性例子包括角鯊?fù)楹徒酋徬?或其他動物源性油)；嵌段共聚物；清潔劑如吐溫80; Quil，礦物油如Drakeol 或Marcol，植物油如花生油；棒狀桿菌衍生佐劑，如短棒狀桿菌，牛分枝桿菌(卡介苗，卡介苗或卡介苗)；白細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素12 ；單核細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素 1，腫瘤壞死因子；干擾素如Y干擾；表面活性物質(zhì)如十六烷胺，十八烷胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂和多元醇；油乳劑；和礦物質(zhì)如磷酸鋁，氫氧化鋁或明礬凝膠。本發(fā)明的治療組合物可與輔料配制，要處理的對象對輔料耐受。這些輔料包括水， 生理鹽水，林格氏(Ringer’ s)液，葡萄糖溶液，漢克氏(Hank’ s)溶液，和其他水性生理平衡鹽溶液。輔料還可以含有少量添加劑，如提高等張和化學(xué)或生物穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液的例子包括磷酸鹽緩沖液，碳酸氫鹽緩沖液，Tris緩沖液，而穩(wěn)定劑的例子包括A1/A2穩(wěn)定劑。以有效的方式來給予治療組合物的可接受的方案包括個人劑量的大小，劑量的數(shù)目，給藥頻率，及給藥模式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定方案，其例子在本文中已有披露。給予被定義為引入物質(zhì)到個體的身體，包括口腔，鼻腔，眼，直腸，陰道和腸外途徑。組合物可單獨或與其他藥物相結(jié)合而通過任何給藥途徑來給予，包括但不限于皮下 (SQ)，肌肉注射(IM)，靜脈注射(IV)，腹腔(IP)，皮內(nèi)(ID)，通過鼻腔，眼或口腔粘膜(IN)或口頭。
在本發(fā)明的背景下，給予病人的劑量應(yīng)足以在一段適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)達到有利于病人的反應(yīng)。被給予的制劑的數(shù)量可能取決被治療的個體，包括年齡，性別，體重和一般健康狀況。本發(fā)明的免疫治療組合物可用于預(yù)防或治療性地免疫個體如人類。然而，也包括其他動物，優(yōu)選地，脊椎動物包括馴化動物如家畜和伴侶動物。在本發(fā)明中優(yōu)選地使用的藥學(xué)上可接受的載體可能包括非水溶液的無菌水溶液， 懸浮液，和乳液。非水溶劑的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，和可注射的有機酯如油酸乙酯。水溶性載體包括水，酒精/水溶液，乳液或懸浮液，例如鹽水和緩沖介質(zhì)。 腸外用載體包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏溶液或固定油。 靜脈用載體包括液體和營養(yǎng)補充劑，電解質(zhì)補充劑如林格氏葡萄糖，和類似物。防腐劑和其他添加劑也可以存在，例如，抗菌劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體和類似物。提供下面的例子的唯一目的是為了說明本發(fā)明的原則或?qū)嵤凰鼈兘^不是旨在限制或縮小本發(fā)明的范圍。例1 細(xì)菌
在厭氧條件下，變形鏈球菌Ingbritt在腦心浸液培養(yǎng)液(BHI)于37°C培養(yǎng)18小時， 培養(yǎng)物用于感染或在-70°C下保存于甘油-BHI培養(yǎng)液，直到使用。重組PAc和FLIC的表達與純化
PVAXl是在臨床試驗中由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的唯一載體。所使用的PAc和鼠傷寒沙門菌鞭毛素的基因和蛋白質(zhì)由SEQ ID NO l(PAc編碼序列)，SEQ ID NO 2 (PAc蛋白質(zhì))，SEQ ID NO 3 (鞭毛素編碼序列)，SEQ ID NO 4 (鞭毛素蛋白)。使用常規(guī)重組技術(shù)，由核苷酸(657-2694)編碼的PAc片段(AA219-680)和FLIC從相關(guān)的菌株進行擴增并克隆到表達質(zhì)粒pET28a中，分別得到pET28a-PAc或pET28a_FLIC。重組 PAC和FLIC蛋白C -末端與6HisTag融合便利純化。表達質(zhì)粒pET28a_PAc或pET28a_FLIC 分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)，單陽性克隆進行了核實。轉(zhuǎn)化菌在添加了 50微克/ ml 卡那霉素Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)液中在37°C培養(yǎng)過夜；0. 5毫摩爾異丙基-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)對數(shù)生長期細(xì)菌。表達的重組蛋白由親和色譜法在Ni - NTA柱(QIAGEN)純化，純化的蛋白由Bradford法進行定量，并通過Western blot證實，采用小鼠抗HigTag抗體(QIAGEN)和第二辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(Pierce)。Western blot檢測采用 SuperSignal化學(xué)發(fā)光底物(Pierce)，由一個Versadoc3000成像儀成像(BIO - RAD)。污染的內(nèi)毒素和脂多糖(LPS)的去除使用AffinityPak Detoxi凝膠內(nèi)毒素卸下凝膠(Pierce)。 最終的蛋白質(zhì)制劑的內(nèi)毒素和內(nèi)毒素的含量用Limulus法(Associates of Cape Cod)進行了測定，其值為<0.001 EU/微克。例2 小鼠的免疫
對于劑量效應(yīng)，4組8周齡雌性BALB / c小鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，間隔為 24天(1外83，(2)10微克？4(，(3)10微克？4(3+1微克？1^1(，或(4)10微克卩八(3 + 5微克 FLIC，每只老鼠的體積為10μ1，所有的蛋白質(zhì)溶解在PBS。最終免疫4周后，收集血清和唾液。從麻醉動物放血，然后血液樣本離心獲得血清。唾液樣本收集，在腹腔(IP)注射(小鼠50 μ L，大鼠250 μ L)200微克/毫升卡巴(Sigma)，以刺激流量。抗體分析之前唾液樣本需要離心。血清和唾液樣本在-70°C保存，直到它們用ELISA法測定。
8
對于長期效應(yīng)，3組8周齡雌性BALB / c小鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，間隔為24天(l)PBS，(2) 10微克PAc，或(3) 10微克PAc +5微克FLIC ；每只老鼠的體積為 10 μ L，所有的蛋白質(zhì)溶解在PBS。最終免疫后，在指定時間，血清和唾液樣本的收集如上所述。對于大鼠的劑量效應(yīng)，4組雌性Wistar大鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，間隔 24 天=(I)PBS ； (2) 5 微克 FLIC; (3) 20 微克 PAc+5 微克 FLIC; (4) 40 微克 PAc +5 微克 FLIC,每只大鼠的體積為10μ 1，所有的蛋白質(zhì)溶解在PBS。唾液和血液樣本在第3，6，9，10 周收集。例3實驗大鼠模型
六組雌性Wistar大鼠(N = 5)，18日齡斷奶和喂食致齲飼料，Keyes 2000。20至22日齡，添加抗生素(氯霉素，氨芐青霉素，羧芐青霉素，1. 0克/公斤飼料或水)，，暫時抑制口腔菌群，促進致齲細(xì)菌定植。24至26日齡，用預(yù)先浸泡細(xì)菌溶液的試子，通過口腔以lxl09CFU 的變形鏈球菌Ingbritt挑戰(zhàn)大鼠。牙齒表面的細(xì)菌樣本進行了檢查，以驗證每只大鼠感
^fe ο治療研究計劃如下。0-3天，適應(yīng)性喂養(yǎng)；第4-8天，喂養(yǎng)抗生素，消除口腔內(nèi)的細(xì)菌；第9-14天，種植變形鏈球菌到牙齒；第14天，首免；第39和64天，加強免疫。預(yù)防研究計劃如下。0-3天，適應(yīng)性喂養(yǎng)；第3天，首免；第28和52天，加強免疫；第35-40 天，喂養(yǎng)抗生素，消除口腔內(nèi)的細(xì)菌；第41-46天，種植變形鏈球菌到牙齒。按照上述計劃， 四組大鼠分別滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 5微克FLIC ； (3) 20微克PAc +5微克FLIC; (4)40 微克PAc +5微克FLIC。例4抗體分析
對于小鼠樣本，用ELISA檢測特異唾液分泌型IgA (S - IgA)和血清IgG和IgA。聚苯乙烯96孔酶標(biāo)平底微孔板(Greiner，德國)，100微升PAC (5微克/毫升，碳酸鹽緩沖液，pH值9.6)包被，371，3小時。在4°C用含牛血清白蛋白(BSA)封閉過夜后，洗板3 次，連續(xù)稀釋的唾液或血清加入到每孔，并在37°C孵育2小時。用含0. 05%吐溫20的PBS (PBST)洗板6次；每孔加入100微升的堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG和羊抗鼠IgA (稀釋 1:2000，SouthernBiotech)。用PBST洗板6次后，每孔加入100 μ L磷酸鹽底物(P -硝基苯磷酸鹽)。在37°C孵育后30分鐘后，記錄在405 nm的光密度(0D值405)。最高稀釋度的吸光度與陰性對照(沒有樣品)的吸光度相比超過> 0. 1，此最高稀釋度定義為終點滴度。對于大鼠樣本，聚苯乙烯96孔酶標(biāo)平底微孔板(Greiner，德國)，100微升PAC (5 微克/毫升，碳酸鹽緩沖液，PH值9. 6)包被，37°C，3小時。在4°C用含1 %牛血清白蛋白 (BSA)封閉過夜后，洗板3次，連續(xù)稀釋的唾液或血清加入到每孔，并在37°C孵育2小時。 每孔再用PBST洗滌，然后加入100 μ L羊抗鼠IgG或IgA (1:1000, Sigma公司)，在37°C孵育2小時，再度洗滌。下一步，每孔加入100 μ L堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG (1:10,000; S0uthernBi0tech)，37°C孵育5小時，其次是磷酸鹽底物(P _硝基苯磷酸鹽)，37°C孵育30 分鐘。在405 nm讀取光密度(OD)值。最高稀釋度的吸光度與陰性對照(沒有樣品)的吸光度相比超過> 0. 1，此最高稀釋度定義為終點滴度。例5大鼠齲齒評估
收集的血清和唾液樣本后，處死大鼠，下顎被拆除，清理，并用紫脲酸銨染色。磨牙洗凈，切片和齲齒程度用凱斯(Keyes)方法確定。齲損的延伸和深度記分為搪瓷(E)，淺表性牙本質(zhì)(Ds)，和溫和牙本質(zhì)(Dm)參與。齲損的整體得分為E，DS和DM分?jǐn)?shù)的總和。例6 統(tǒng)計分析
統(tǒng)計差異采用Student t檢驗進行分析。所有的動物實驗至少重復(fù)3次，并以代表性的實驗結(jié)果顯示。例7 結(jié)果
重組PAc和FLIC被純化和用抗PAc和抗His - tag的抗體核實，一個85 kD的條帶(圖 1，泳道1)和52 kD的條帶(圖1，泳道4)。參照圖2，此圖顯示小鼠的抗體滴度，小鼠經(jīng)滴鼻免疫(1)PBS，(2) 10微克PAc， (3) 10微克PAc +1微克？1^1(，或(4)10微克？4(3 +5微克FLIC。結(jié)果表明，F(xiàn)LIC是一個強有力的增強劑，增加血清和唾液中抗PAc抗體滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能夠誘導(dǎo)血清和唾液中高水平的特異性抗PAc IgG和IgA抗體。參考圖3，此圖顯示四組大鼠的血清抗PAc的IgG，血清抗-PAC IgA和唾液抗PAc IgA抗體滴度，大鼠分別滴鼻免疫=(I)PBS ;( 2) 5微克FLIC; (3) 20微克PAc +5微克 FLIC; (4)40微克PAc +5微克FLIC，數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。大鼠的結(jié)果與從小鼠的結(jié)果相似，顯示FLIC是一個強有力的增強劑，促進血清和唾液中抗PAc抗體滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能夠誘導(dǎo)血清和唾液中高水平的特異性抗PAc IgG和IgA抗體。參考圖4，有兩個示范照片說明(a)大鼠正常磨牙的中位數(shù)矢切片(右上頌舌側(cè)部分)及(b)感染變形鏈球菌Ingbritt大鼠齲壞磨牙的中位數(shù)矢切片(右下頌骨舌側(cè)部分)， 在圖片中的箭頭表示不同程度的齲齒。明顯的，因為在受感染的大鼠上誘導(dǎo)了人工齲齒，所以大鼠模型是有用的。參考圖5，有兩個圖形顯示(A)四組大鼠齲齒的整體得分，每個點代表每只大鼠的齲損水平和(B)在四組大鼠磨牙不同部位的齲齒的凱斯(Keyes)得分，其中四組大鼠分別滴鼻免疫=(I)PBS ； (2)5 微克 FLIC; (3)20 微克 PAc +5 微克 FLIC; (4)40 微克 PAc +5 微克FLIC。數(shù)值表示為平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差值。*與陰性對照組有顯著性差異(P <0.05)。 **與陰性對照組有顯著性差異(P <0.01)。***與陰性對照組有顯著性差異(P <0.001)。 符號―，搪瓷病變;_，牙本質(zhì)病變輕微;Θ，中度牙本質(zhì)病變。至于整體齲損(圖5Α)，第3和4組大鼠通過滴鼻途徑免疫，比第1和2組較少的病變。在第4組和第1組(P <0.01)，第4組和第2組(P <0. 001)，第5組和第1組(P <0.001)， 第5組和第2組(P <0. 001)之間有顯著差異。通過滴鼻途徑免疫40微克PAc和5微克 FLIC的大鼠顯示最少病變。關(guān)于搪瓷，淺表性牙本質(zhì)，中度牙本質(zhì)病變，也有顯著差異(圖 5Β)。至于搪瓷病變(Ε)，在第4組和第1組(P <0.001)，第4組和第2組(P <0.001)，第5 組和第1組(P <0. 001)，第5組和第2組(P <0. 001)之間有顯著性差異；對于淺表性牙本質(zhì)病變(DS)，在第4組和第1組(P <0.05)，第4組和第2組(P <0. 01 )，第5組和第1組(P <0.01)，第5組和第2組(P <0.001)之間有顯著差異。由于中度牙本質(zhì)病變的低齲壞評分， 這些組之間沒有統(tǒng)計上的顯著差異，但我們依然可以看到與其它3組相比，第4和5組的平均得分較低。第1，2，3，和4組的齲平均分?jǐn)?shù)分別為54. 2，54. 4，28和23. 8。因此，第4和5組大鼠分別有48%和56%減少。
例8 pET28a-KF-PAc 質(zhì)粒構(gòu)建
KF-PAc的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)和氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，其中KF表示來源于大腸桿菌的鞭毛素(SEQ ID NO 15顯示KF核苷酸序列；SEQ ID NO 16顯示KF氨基酸序列)。首先PCR擴增出KF和PAc片段，其中，KF的上游引物為5，GCGCCATG GCACAAGTCATTAATACC 3，(SEQ ID NO 7)，下游引物為5，AACAAGCTTACCCTGCAGCAGAGACAGAAC 3，(SEQ ID NO 8),上下游分另Ij 引入了 Nco I和Hind III兩個酶切位點(下劃線處表示酶切位點)；PAc的上游引物為5，TCAAAGCTTGGAACCAATGCTGCCAATC 3，(SEQ ID NO 9)，下游弓| 物為5， ACGTCTCGAGCTCATAAGTT GGCTCAACAG 3，(SEQ ID NO 10)，上下游分別引入了 Hind III 和Xho I兩個酶切位點。選擇pET28a作為載體，將兩個片段依次連入載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3) star ；挑取陽性克隆進行酶切及測序鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為 pET28a-KF-PAc,其表達產(chǎn)物KF-PAc的C-端帶有6聚組氨酸標(biāo)簽。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖 6，其中KF片段包含1494堿基，編碼498個氨基酸(1-498)，PAc片段包含2085堿基，編碼 695個氨基酸(501-1195) ；KF和PAc片段之間包含2個氨基酸組成的連接。例9 pET28a-KFD2-PAc 質(zhì)粒構(gòu)建
KFD2-PAc的核苷酸序列(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。首先PCR擴增出 PAc 片段，上游引物為5，TATAGCTAGCGGA ACCAATGCTGCCAATC 3，(SEQ ID NO 13)，下游引物為5’ ATTAGGATCCGTCGTCTCATAAGTTGGCTC 3’ (SEQ ID NO 14)，分別在上下游引入了 Nhe I和BamH I兩個酶切位點(下劃線處表示酶切位點)，然后將片段連入構(gòu)建好的質(zhì)粒 pET28a-KFD2中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) star ；挑取陽性克隆進行酶切及測序鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-KFD2-PAc，其表達產(chǎn)物KFD2_Pac的C-端帶有6聚組氨酸標(biāo)簽。質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖如圖7 ；其中PAc片段包含2061堿基，編碼687個氨基酸(174-860)。圖 8 顯示純化了 的 PAc，KF-PAc 和 KFD2_PAc 的(A) SDS-PAGE 圖及(B) Western Blot 圖。例 10
五組小鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 1微克PAc ； (3) 1微克PAc + 0. 7微克KF ； (4) 1. 7 微克KF-PAc ;(5) 1.4微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗體分析如例4。圖9是一個圖表，顯示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。例 11
11組大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 1微克PAc + 0. 7微克KF ； (3) 1. 4微克KFD2-PA。； (4)2. 5 微克 PAc + 1.8 微克 KF ； (5)3. 5 微克 KFD2-PA。； (6)5 微克 PAc +3. 5 微克 KF ； (7) 7 微克 KFD2-PAc ； (8)10 微克 PAc + 7 微克 KF ； (9) 14 微克 KFD2_PAc ； (10)20 微克 PAc + 14微克KF ;(11)28微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗體分析如例4。圖10包括三個圖表，顯示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。例12
五組大鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 5微克PAc ； (3) 5微克PAc + 3. 5微克KF ； (4) 8. 5 微克KF-PAc ； (5)7微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗體分析如例4。圖11包括三個圖表，顯示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗PAc IgA抗體的滴度，其中數(shù)據(jù)表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差。
例 13
五組大鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 5微克PAc ； (3) 5微克PAc + 3. 5微克KF ； (4) 8. 5 微克KF-PAc ； (5) 7微克KFD2-PAC。先感染再免疫，感染劑量為2xl09CFU，感染后12周計算得分，齲齒分析如例5。圖12是一個圖表，顯示五組大鼠齲齒的凱氏(keyes)得分，每個點代表一只大鼠的齲患水平得分值表示為均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差值。
權(quán)利要求
1.用于由變形鏈球菌感染引起的齲齒的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗包括從變形鏈球菌表面蛋白PAC派生的抗原；從鞭毛素派生的佐劑；藥學(xué)上可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原是由SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 1的部分編碼的PAC多肽或由SEQ ID NO. 2代表的PAC多肽變種；所述PAC多肽或變種包含至少一個抗原表位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原是由SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 1的部分編碼的PAC多肽或由SEQ ID NO. 2代表的PAC多肽變種；所述多肽或變種是一個交接至少兩個分散的抗原表位的重組多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述鞭毛素是由SEQID NO. 3或SEQ ID NO. 3 一個或多個部分編碼的多肽或由SEQ ID NO. 4代表的鞭毛素變種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述鞭毛素是由SEQID NO. 3或SEQ ID NO. 3—個或多個部分編碼的多肽或由SEQ ID NO. 4代表的鞭毛素變種，所述多肽或變種包含在鞭毛素高變域中的缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐劑鞭毛素是分別表達的重組蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐劑鞭毛素表達為一個單一的重組蛋白，優(yōu)選的PAC被插入到鞭毛素的高變域或替代部分或全部的鞭毛素高變域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐劑鞭毛素表達為一個單一的重組蛋白如SEQ ID NO 6。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原PAC被插入到鞭毛素的高變域或替代部分或全部的鞭毛素高變域。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述疫苗組合物，其特征在于，所述抗原PAC被插入到鞭毛素的高變域如 SEQ ID NO 12。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素帶有標(biāo)簽或與互補性基團共軛而使這兩個分子非常接近。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素共軛在一起。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素結(jié)合到一種載體上，而使這兩個分子非常接近。
14.使用根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗組合物來治療個體中由變形鏈球菌感染引起的齲齒。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療，其特征在于，所述個體是人。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于由變形鏈球菌感染所造成的齲齒的疫苗組合物，該疫苗組合物包括從變形鏈球菌表面蛋白PAC派生的抗原和從鞭毛素派生的佐劑。本發(fā)明進一步提供制備疫苗組合物的方法。本發(fā)明還提供了通過將該疫苗組合物應(yīng)用到個體來預(yù)防或治療由變形鏈球菌引起的齲齒的方法。
文檔編號A61P31/04GK102488898SQ201110438088
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者孫穎, 楊菁毅, 石偉, 鄢慧民 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所