專利名稱：大腸桿菌bl21核糖體蛋白亞基l36在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌BL21核糖體蛋白亞基L36在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌,是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，一直被當(dāng)作正常腸道菌群的組成部分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有病原性，尤其對(duì)嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥，它是一種普通的原核生物，是人類和大多數(shù)溫血?jiǎng)游锬c道中的正常茵群。但也有某些血清型的大腸桿菌可引起不同癥狀的腹瀉。BL21是常用的大腸桿菌表達(dá)菌株，適合于外源蛋白表達(dá)的菌株，其內(nèi)源性的蛋白酶基因缺失，一般配合以強(qiáng)表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行目的基因的強(qiáng)表達(dá)。BL21 (DE3)，在BL21的基礎(chǔ)上整合了 17噬菌體基因組的大腸桿菌，包含lac UVS啟動(dòng)子基因和17聚合酶基因。適合于17表達(dá)系統(tǒng)。IaeUVS啟動(dòng)子直接調(diào)控I7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，IacUVS啟動(dòng)子可經(jīng)IPTG誘導(dǎo)。IPTG是一種半乳糖的結(jié)構(gòu)類似物，具有較強(qiáng)的化學(xué)誘導(dǎo)能力，可誘導(dǎo)位于乳糖操縱子控制區(qū)下游的基因表達(dá)，其誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制為通過(guò)使結(jié)合在乳糖操縱子上的阻遏蛋白失活，解除阻遏蛋白對(duì)Lac啟動(dòng)子的抑制，從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，在IPTG的誘導(dǎo)下，可誘導(dǎo)表達(dá)I7RNA聚合酶，重組表達(dá)質(zhì)粒上的I7RNA聚合酶啟動(dòng)子識(shí)別I7RNA聚合酶，從而表達(dá)出亞克隆到重組表達(dá)質(zhì)粒上的目的基因的蛋白。大腸桿菌的核糖體小亞基中約有22種蛋白質(zhì)(編號(hào)為SI至S22)，其核糖體大亞基中約有34種蛋白質(zhì)(編號(hào)為L(zhǎng)I至L36)。這些蛋白質(zhì)是免疫學(xué)上獨(dú)立的蛋白質(zhì)，只有L7與L12之間表現(xiàn)出相互交叉反應(yīng)。這些核糖體蛋白質(zhì)中除S6、L7及L12(等電點(diǎn)約為5)之外全部都是堿性蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)約為10)。此外，除了以下列出的三組例外，其余的核糖體蛋白質(zhì)都是相互有差異的*S20與L26被證實(shí)是同一種蛋白質(zhì),它是唯種同時(shí)出現(xiàn)在大、小亞基中的蛋白質(zhì)。*L7與L12分別是同一種蛋白質(zhì)的N端乙?；姹炯半逆渻?nèi)部甲基化版本。*L8是L7(或L12)與LlO的復(fù)合物。除分子量為61. 2kD的SI外，其余的核糖體蛋白質(zhì)的分子量都相對(duì)集中地分布于4. 3kD至29. 7kD之間。大腸桿菌核糖體蛋白L36位于核糖體50S大亞基上，由rpmj基因編碼，其中文名稱為50S核糖體蛋白亞基L36，簡(jiǎn)寫RPL36，別名有B3299，SecX, Rpmj, 50S核糖體亞基蛋白B，該蛋白含有38個(gè)氨基酸，分子量為4. 364kD。目前，對(duì)大腸桿菌BL21菌株的核糖體蛋白亞基L36的抗癌活性研究及其應(yīng)用尚未見任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對(duì)大腸桿菌BL21菌株的核糖體蛋白亞基L36的抗癌活性進(jìn)行研究，提供了一種大腸桿菌BL21核糖體蛋白亞基L36在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)H印-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率具有時(shí)間和劑量的依賴性。發(fā)現(xiàn)在低濃度下的效果優(yōu)于高濃度下的效果，其中濃度為0. 67,0.5ug/ml時(shí)大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最好。


圖I為大腸桿菌核糖體 蛋白亞基L36對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；(其中1_9分別為0，20，10，5，2. 5，I. 25，1，0. 67，0. 5 ii g/ml大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36濃度)；圖2為不同濃度大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)H印-2細(xì)胞的形態(tài)影響；(圖a至圖 i :分別為 Oii g/ml, 20 u g/ml, 10 u g/ml, 5 u g/ml, 2. 5 u g/ml, I. 25 u g/ml, I u g/ml,
0.67 u g/ml,0. 5 u g/ml大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36濃度)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I :大腸桿菌BL21菌株的RPL36蛋白的獲得從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到大腸桿菌Escherichia coli K_12substr.菌株RPL36基因序列,根據(jù)其序列信息,利用Primer Premier5. 0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),大腸桿菌BL21菌株RPL36基因引物的上游引物RPL36-F :5' -ATGAAAGTTC GTGCTTCC-3'，下游引物RPL36-R. 5' -TCAGCCTTGG CGCTGTTTAT-3'。以大腸桿菌BL21菌株總DNA為模板，以RPL36-F，RPL36-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用 50 u I PCR 反應(yīng)體系=MgCl2 (2. 5mM) 3u I, dNTPs (2. 5mM) 4u 1,10XPCR Buffer5 u I，rTaq DNA 聚合酶(5U/u 1)0. 25 u 1，菌液 1，引物 RPL36_F、RPL36_R 各 I y I，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充終體積至50 ill。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性I分鐘，46°C退火30秒，72°C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)。72°C 10分鐘，4°C保存。I. 0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用GELDoc EQ全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果。按照E. Z.N. A* Gel Extraction Kit說(shuō)明書，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，采用CaCl2法，以大腸桿菌BL21制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接有PCR產(chǎn)物的PUC18-T載體轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，再于含氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)過(guò)夜，篩選轉(zhuǎn)化子，利用堿裂解法小量提取陽(yáng)性單克隆的質(zhì)粒，以質(zhì)粒DNA為模板，采用通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)克隆結(jié)果。選取3個(gè)經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示大腸桿菌BL21的RPL36基因與大腸桿菌Escherichia coli K_12substr.菌株RPL36基因的序列完全一致，由 117bp 組成(大腸桿菌 BL21 的 RPL36 基因序列ATGAAAGITC GTGCTTCCGTCAAGAAATTATGCCGTAACT GCAAAATCGT TAAGCGTGAT GGTGTCATCC GTGTGATTTG CAGTGCCGAGCCGAAGCATAAACAGCGCCA AGGCTGA)，所編碼的蛋白也完全一致，即由38個(gè)氨基酸殘基組成(大腸桿菌BL21 的 RPL36 蛋白亞基序列MKVRASVKKL CRNCKIVKRD GVIRVICSAEPKHKQRQG)。因?yàn)榇竽c桿菌BL21的RPL36蛋白僅由38個(gè)氨基酸組成，所以可以采用化學(xué)合成的辦法獲得了大腸桿菌BL21的RPL36蛋白亞基。實(shí)施例2 :大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36的抗癌功能實(shí)驗(yàn)大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)人喉癌細(xì)胞抑制的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)
2. I材料與方法2. I. I 材料2. I. I. I細(xì)胞株人喉癌Ifep-2細(xì)胞(購(gòu)于川北醫(yī)學(xué)院生化與分子免疫研究所)。2. I. I. 2試劑RPMI1640粉末(購(gòu)于Gibco公司，美國(guó))，胎牛血清(購(gòu)于四季青生物制品公司，中國(guó))，雙抗(青霉素，鏈霉素，購(gòu)于Gibco公司) 2. I. 2 方法2. I. 2. I 細(xì)胞培養(yǎng)人喉癌Hep-2細(xì)胞株用含有10 %的滅活的胎牛血清(fetalbovine serum,FBS) 100U/ml 青霉素、100 u g/ml 鏈霉素、pH7. 4 的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液于 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. I. 2. 2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到I X IO5個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔細(xì)胞液量為200 u L，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，于37°C ,5% CO2及飽和濕度的條件下孵育至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，然后加入大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36使其終濃度分別為250、500、1000、2000、4000 ii g/mL.設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，空白組為不含細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出96孔板，加入MTT (5mg/mL)溶液10 u L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，然后加入150 ii L的二甲基亞砜(DMSO)振蕩lOmin，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在在490nm的波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算不同濃度下大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36(本實(shí)施例采用直接加入培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的癌細(xì)胞中觀察結(jié)果，臨床中，蛋白質(zhì)或者多肽類的生物藥物多采用注射劑的劑型，肌注或者靜脈滴注)作用Hep-G2細(xì)胞的抑制率(％ )，公式如下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(I-AmAwa) X 100% 2. I. 2. 3形態(tài)學(xué)觀察將96孔板放在倒置顯微鏡下觀察，拍照記錄不同濃度下細(xì)胞的形態(tài)變化。2. 2 結(jié)果2. 2. I大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)Ifep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響本研究采用MTT法檢測(cè)不同濃度大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36在24h下對(duì)H印_2細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。從圖I可以看出，大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)H印-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率具有時(shí)間和劑量的依賴性。發(fā)現(xiàn)在低濃度下的效果優(yōu)于高濃度下的效果，其中濃度為0. 67,0. 5 u g/ml時(shí)大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)H印-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最好(見圖I)。2. 2. 2大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)Ifep-2細(xì)胞形態(tài)的影響用倒置顯微鏡觀察不同濃度大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36(0，20，10，5，2. 5,1. 25，1,0. 67,0. 5 u g/ml)處理不同時(shí)間24h的Ifep-2細(xì)胞形態(tài)變化(圖2)。從圖2可以看到，在24h的處理時(shí)間下，與對(duì)照組相比，隨著大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36濃度的變化，細(xì)胞出現(xiàn)變圓，成團(tuán)，脫落甚至裂解成碎片的現(xiàn)象(參見圖2)應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌BL21核糖體蛋白亞基L36在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了大腸桿菌BL21核糖體蛋白亞基L36在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率具有時(shí)間和劑量的依賴性。發(fā)現(xiàn)在低濃度下的效果優(yōu)于高濃度下的效果，其中濃度為0.67，0.5μg/ml時(shí)大腸桿菌核糖體蛋白亞基L36對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最好。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102614495SQ20111031391
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者伍春蓮, 侯萬(wàn)儒, 侯怡鈴, 孫冰, 李俊, 蘇秀蘭 申請(qǐng)人:西華師范大學(xué)