專利名稱：一種制何首烏多糖及其在制備抗衰老藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種制何首烏多糖及其在制備抗衰老藥物中的應用。
背景技術(shù)：
何首烏(A^j^o/w mult ifIorum 7&// 力)，為蓼科多年生草本植物何首烏的塊根。 自古以來，何首烏被人們認為具有益壽延年、延緩衰老之功效，系著名的滋補中藥。2005版藥典何首烏生品與炮制品質(zhì)量控制指標都是二苯乙烯苷。傳統(tǒng)用藥多用制何首烏，其主要有補肝腎、益精血、烏須發(fā)功效，并且現(xiàn)代研究證明二苯乙烯苷是其補益作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。 但研究發(fā)現(xiàn)，何首烏經(jīng)過炮制以后，補益作用增強了，但二苯乙烯苷的含量卻下降了，這說明除了二苯乙烯苷以外，別的成分也具有較好的補益作用。多糖是由10個以上的單糖組成的聚合高分子碳水化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、治療肝腎疾病及消炎鎮(zhèn)痛，美容等藥理作用，且其來源十分豐富，廣泛存在于動物(如動物粘液)、植物(如植物的種子、莖和葉)、微生物(細菌和真菌，昆蟲及甲殼動物的殼真菌，細菌的胞內(nèi)外等)和海藻中，從動植物器官組織、菌類及微生物發(fā)酵產(chǎn)物中可得到不同種類的多糖。淀粉、纖維素等植物多糖早已被人們在日常生活中使用。近年來， 世界范圍內(nèi)對多糖的研究都較多，已經(jīng)從動植物體分離出來了 300多種多糖，經(jīng)過研究和開發(fā)，人們對多糖的作用機制和作用機理有了了解，多糖類藥品和保健品已經(jīng)得到了開發(fā)， 例如香菇多糖由于具有較好的抗腫瘤效果，在臨床上已經(jīng)被得到廣泛應用。關(guān)于何首烏多糖的報道不多，中國專利200610012026. 3 (公開號101081250，
公開日2007-12-05)公開了一種改善貧血的何首烏提取物藥劑及其制備方法和應用。該何首烏提取物中多糖含量大于60%，可以改善血虛動物模型的貧血指征和提高白細胞水平，用于治療貧血。關(guān)于制何首烏中多糖類成分的抗衰老活性還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制何首烏多糖。本發(fā)明的另一目的是提供上述制何首烏多糖的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述制何首烏提取物在制備抗衰老藥物中的應用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的 一種制何首烏多糖，是采用以下方法制備而成的
(1)將制何首烏粉碎成粗粉，95體積％乙醇回流脫脂，濾出溶劑，濾渣干燥后再用80體積％乙醇回流提取，濾出溶劑，濾渣干燥后得到脫脂制何首烏粉；
(2)脫脂制何首烏粉加入1(Γ20倍體積的水(S卩加入水的體積為藥材質(zhì)量的1(Γ20倍)， PH值為7. 0的條件下在6(T90°C恒溫水浴中提取2、次，每次廣2h，然后過濾，濃縮濾液到相對密度為1. 05 ；(3)將濃縮后的濾液加入淀粉酶適量，37°C恒溫過夜，得到脫淀粉后的濃縮液；
(4)向脫淀粉后的濃縮液加入乙醇，調(diào)整使含醇量為509T80%(體積百分含量)，靜置過夜，離心，收集沉淀，得到除淀粉的制何首烏粗多糖；
(5)對除淀粉后的制何首烏粗多糖進行除蛋白、除色素處理，最終得到制何首烏多糖。本發(fā)明所述的制何首烏，是指采用2010版《中國藥典》一部制何首烏項下炮制方法炮制的何首烏加工品。作為一種優(yōu)選方案，上述步驟(1)中95體積％乙醇回流脫脂2次，每次4h ；80體積％乙醇回流提取時間為他。步驟(2)中，加入水的體積優(yōu)選為脫脂制何首烏粉末質(zhì)量的15倍。研究結(jié)果表明， 隨著液固比的增加，多糖的得率逐漸增加，但當料液比達1:15以后，多糖得率不再增加，反而降低。最適料液比為1:15，在料液比為1:15時，多糖的提取量最大。低于1:15時隨料液比的增加多糖的提取量增加，當料液比超過1:15時，隨著的料液比的增大，多糖的提取量減少。一般來說，溶劑用量越大提取效率是越高的，原因可能是由于隨著提取液的增加，溶劑中多糖總量增加。而隨著原料中多糖總量減少，導致濃度差變小，擴散速度會降低，逐漸達到基本平衡狀態(tài)。而且過大的料液比會造成溶劑和能源的浪費，并給后工序的濃縮帶來困難。當料液比大到一定程度時，溶劑已將有效成分基本溶出完全。再增大料液比，雜質(zhì)成分會競爭溶出反而不利于效成分的提取。故料液比選擇1 :1(Γ20為宜，其中1:15最佳。步驟(2)中恒溫水浴溫度優(yōu)選為90°C。隨著提取溫度的升高，多糖含量不斷增加， 而以100°C為最佳。這可能是由于制何首烏多糖主要存在于細胞壁中，要提取多糖，首先要使細胞壁成分降解或分離，需要較高的溫度。但鑒于高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)與活性有一定的影響，多糖易發(fā)生降解而喪失活性，并且從已得到的多糖干品發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，多糖色澤亦加深。所以選擇提取溫度不宜超過90°c。步驟(2)中恒溫水浴中提取次數(shù)優(yōu)選2 3次，最佳方案為提取2次。隨著提取次數(shù)的延長，多糖的得率不斷增加，提取兩次明顯比提取一次效果好，但是提取兩次后，增加變緩。因此，提取次數(shù)限制在2 4次提取為宜。再綜合其他提取因素后測評后，發(fā)現(xiàn)提取 2次最佳。步驟(2)中恒溫水浴每次提取時間為lh。隨著提取時間的延長，多糖的得率增加， 60min后趨于平緩。提取時間過短時，多糖難以從何首烏細胞中溶出，影響多糖含量。當提取達到一定時間時，有效成分濃度達到平衡，提取率最高。為縮短工時，減少能耗，提取時間宜選擇60 120min。而提取時間過長多糖得率增加不明顯且會造成不必要的浪費，因此確定為60min最為適合。綜合以上各因素，最終得出的步驟(2)中提取優(yōu)選方案為提取溫度90°C、提取時間為60min、提取次數(shù)為3次，提取時的料液比1 :15。研究發(fā)現(xiàn)，在上述眾多影響因素中，提取溫度、提取時間和料液比對制何首烏多糖提取率起主要作用，而提取次數(shù)的作用不明顯，因此從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮，最終確定步驟(2)中的最佳提取條件為提取溫度90°C，提取時間為60min，提取次數(shù)為2次，提取時的料液比1 :15。步驟(3)中除淀粉選擇淀粉酶用量為每100克藥材(即濃縮后的濾液)加入20mg 淀粉酶。隨著淀粉酶用量的加大，何首烏總多糖的提取率沒有明顯增加，而淀粉含量在加入
420mg淀粉酶時含量最低，而隨淀粉酶含量加大含量區(qū)域平緩。為純化何首烏多糖，降低生產(chǎn)成本考慮，最終確定為每IOOg藥材加入20mg淀粉酶。步驟(4)中調(diào)節(jié)醇沉濃度為60% (體積)。隨著乙醇濃度升高，總多糖純度也隨之升高，在乙醇濃度為60%時總多糖純度最高，之后平緩下降；而其中淀粉含量卻隨乙醇濃度升高而降低，在乙醇濃度60%時最低，之后含量升高，綜合考慮何首烏多糖的純化工藝，應得何首烏多糖量多，純度高，盡量減少非有效物質(zhì)淀粉的含量，最終確定為60%乙醇沉淀。步驟(5)中除蛋白方法可以選擇Sevag法和三氯乙酸-正丁醇法。其中Sevag法脫蛋白6次、三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白3次都可以達到較好的脫蛋白效果，但是相比之下三氯乙酸_正丁醇對多糖的破壞性較大，因此選擇Sevag法脫蛋白6次作為最佳的脫蛋白方案。步驟(5)中所述除色素的方法可以選擇大孔吸附樹脂、雙氧水或活性炭等，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，多糖脫色率雙氧水>大孔吸附樹脂DlOl >活性炭，多糖保存率大孔吸附樹脂DlOl >雙氧水>活性炭，雙氧水的脫色效果遠好于大孔吸附樹脂D101，二者的多糖保存率又十分接近，并且操作更為方便。因此將制何首烏多糖除色素方法的確定為取一定量粗多糖水溶液，慢加雙氧水使雙氧水的質(zhì)量百分比濃度達到10%，45°C恒溫水浴鍋中脫色4h。上述制何首烏多糖在制備抗衰老藥物中的應用，所述的衰老尤其指由H2O2損傷引起的衰老。上述制何首烏多糖可以用于制備清除自由基的藥物、保護超氧化物歧化酶活力的藥物或保護谷胱甘肽過氧化物酶活力的藥物。我們研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏多糖對H2O2損傷的PC12細胞模型具有很好的保護作用， 添加制何首烏多糖后H2O2損傷細胞密度大，生長均勻，與模型組相比細胞形態(tài)明顯改善。在PC12細胞凋亡測定中，添加制何首烏多糖的細胞，細胞凋亡數(shù)有所減少，且呈劑量依賴關(guān)系，尤其是制何首烏多糖濃度為1(T20 mg/L時效果最為明顯。同時，制何首烏多糖在2(T0. 156mg/ml范圍內(nèi)對H2O2損傷的H印G2細胞也具有很好的保護作用，能夠顯著增加細胞存活率。對小鼠衰老模型(注射D-半乳糖造模)的研究表明，制何首烏多糖灌胃的小鼠腦丙二醛(MDA)活力顯著低于模型組和空白組，提示多糖可以顯著降低機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。 同時研究還表明制何首烏多糖能夠顯著提高機體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明提供了一種精制的制何首烏多糖，采用的制備方法操作簡單、合理、多糖提取率高，外觀色澤好，能夠較好的應用于生產(chǎn)；同時驗證了精制后的制何首烏多糖的抗衰老作用，提供了制何首烏多糖的新用途，并提出了其開發(fā)方向。


圖1.不同溫度處理脫脂何首烏粉末后多糖含量測定結(jié)果。圖2.不同時間處理脫脂何首烏粉末后多糖含量測定結(jié)果。圖3.不同提取次數(shù)處理脫脂何首烏粉末后多糖含量測定結(jié)果。圖4.不同pH值處理脫脂何首烏粉末后多糖含量測定結(jié)果。
圖5.不同料液比處理脫脂何首烏粉末后多糖含量測定結(jié)果。圖6.淀粉的標準曲線。圖7.不同淀粉酶含量除淀粉后淀粉含量測定結(jié)果。圖8.不同醇沉濃度醇沉后粗多糖中多糖含量測定結(jié)果。圖9.蛋白質(zhì)的標準曲線。圖10. Sevag法脫除次數(shù)對蛋白含量的影響檢測結(jié)果。圖11.三氯乙酸-正丁醇法脫除次數(shù)對蛋白含量的影響檢測結(jié)果。圖12.兩種方法除蛋白能力的比較，其中ISkvag法，2為三氯乙酸-正丁醇法。圖13.兩種方法多糖含量的比較，其中1為Sevag法，2為三氯乙酸-正丁醇法。圖14.大孔吸附樹脂與多糖水溶液的加入比例對多糖脫色率的影響。圖15.雙氧水在不同溫度下對多糖脫色率的影響。圖16.活性炭脫色法不同時間對多糖脫色率的影響。圖17.不同脫色方法對多糖脫色率的影響。圖18.制何首烏多糖對H2O2誘導PC12細胞損傷的形態(tài)學顯微鏡照片，其中A.正常細胞組，B. H2O2損傷模型組，C.何首烏多糖組(20mg/ml)，D.何首烏多糖組(1. 25mg/ml)， Ε.何首烏多糖組(0. 188mg/ml)。圖19.流式細胞術(shù)檢測制何首烏多糖對H2A誘導PC12細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻的影響結(jié)果分析圖，其中A.正常對照組，B. H2O2模型組，C.大劑量多糖保護組(5mg/ml)， D.多糖保護組(2. 5mg/ml)，E.多糖保護組(1. 25mg/ml)，F(xiàn).多糖保護組(0. 625mg/ml)。圖20.制何首烏多糖對H2O2損傷PC12細胞Hochest熒光染色結(jié)果圖(X200)， 其中 A-F 分別為多糖試驗組，多糖濃度為 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2. 5mg/ml、l. 25mg/ml、 0. 156mg/ml，G.模型組，H.空白對照組。
具體實施例方式實施例1制何首烏多糖的提取 1.制何首烏藥材的預處理
稱取制何首烏500g，粉碎成粗粉，過20目篩。2.脫脂，除去單糖和低聚物
將步驟1中制何首烏粗粉裝入3000mL燒瓶中，加入95%乙醇2000mL，置于電熱套中， 冷凝回流4h，回流脫脂兩次，濾出溶劑，自然風干濾渣。風干的濾渣加入80%乙醇2000mL， 再回流他，除去部分單糖和低聚糖以及苷類、生物堿、氨基酸等，濾出溶劑，自然風干濾渣， 得到脫脂何首烏粉末。3.制何首烏多糖提取工藝單因素考察 (1)提取溫度對制何首烏多糖得率的影響
精確稱取IOg的脫脂何首烏粉末5份，分別加入150mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7. 0，然后分別在在60°〇、701、801、901、1001恒溫水浴中提取2h，過濾，殘渣以上述條件重復提取一次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并兩次上清液，定容到250mL容量瓶中，從中吸取 ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，測定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著提取溫度的升高，多糖含量不斷增加，而以100°C為最佳。這可能是由于制何首烏多糖主要存在于細胞壁中，要提取多糖，首先要使細胞壁成分降解或分離，需要較高的溫度。但鑒于高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)與活性有一定的影響，多糖易發(fā)生降解而喪失活性，并且從已得到的多糖干品發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，多糖色澤亦加深。所以選擇提取溫度不宜超過90°C。(2)提取時間對制何首烏多糖得率的影響
精確稱取IOg的脫脂制何首烏5份，分別加入150mL的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7. 0， 然后在90°C溫水浴中分別提取0. 5h、lh、l. 5h、2h和2. 5h，過濾，殘渣以上述條件重復提取一次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并兩次上清液，定容到250mL容量瓶中，從中吸取ImL 到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，測定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，多糖的得率增加，60min后趨于平緩。提取時間過短時，多糖難以從何首烏細胞中溶出，影響多糖含量。當提取達到一定時間時，有效成分濃度達到平衡，提取率最高。為縮短工時，減少能耗，提取時間宜選擇60 120min。(3)提取次數(shù)對制何首烏多糖得率的影響
精確稱取IOg的脫脂制何首烏粉末5份，分別加入150mL的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后90°C的恒溫水浴中提取2h，過濾，5份樣品分別提取1、2、3、4、5次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并上清液，定容到250mL容量瓶中，從中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的延長，多糖的得率不斷增加，提取兩次明顯比提取一次效果好，但是提取兩次后，增加變緩。因此，提取次數(shù)限制在2 4次提取為宜。(4)提取液pH值對制何首烏多糖得率的影響
精確稱取IOg的脫脂制何首烏粉末5份，分別加入150mL的蒸餾水，然后調(diào)提取液pH 值分別為5、6、7、8、9，90°C熱水提取2h，過濾，殘渣以上述條件重復提取一次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并兩次上清液，定容到250mL容量瓶中，從中吸取ImL到50mL容量瓶中， 采用苯酚_硫酸法測定多糖含量，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，在pH 5.0 7.0時，隨著pH值升高，多糖得率有所提高，在pH7.0時最高。pH超過7.0(pH 7.0 9.0)時又呈降低趨勢，這很可能過強的酸堿度影響到制何首烏多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從理論上來說多糖在堿性溶液中易發(fā)生烯醇化、異構(gòu)化和分解等反應， 因此最終確定提取液pH為7. 0。(5)料液比對制何首烏多糖得率的影響
在PH為7. 0條件下，90°C熱水提取3h，通過改變料液比，考察料液比對制何首烏多糖含量的影響。精確稱取IOg的脫脂制何首烏粉末5份，分別加入80、100、150、200和250mL 蒸餾水，調(diào)節(jié)PH值至7. 0，然后在90°C恒溫水浴中提取2h，過濾，殘渣以上述條件重復提取一次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并兩次上清液，定容到250mL容量瓶中，再從250mL容量瓶中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，隨著液固比的增加，多糖的得率逐漸增加，但當料液比達1:15以后，多糖得率不再增加，反而降低。最適料液比為1:15，在料液比為1:15時，多糖的提取量最大。 低于1 15時隨料液比的增加多糖的提取量增加，當料液比超過1 15時，隨著的料液比的增大，多糖的提取量減少。一般來說，溶劑用量越大提取效率是越高的，原因可能是由于隨著提取液的增加，溶劑中多糖總量增加。而隨著原料中多糖總量減少，導致濃度差變小，擴散速度會降低，逐漸達到基本平衡狀態(tài)。而且過大的料液比會造成溶劑和能源的浪費，并給后工序的濃縮帶來困難。當料液比大到一定程度時，溶劑已將有效成分基本溶出完全。再增大料液比，雜質(zhì)成分會競爭溶出反而不利于效成分的提取。故料液比選擇1 :1(Γ20為宜，其中1:15最佳。實施例2制何首烏多糖的提取工藝的優(yōu)化 1.制何首烏多糖熱水提取正交試驗
為了進一步考察最佳提取工藝，經(jīng)過分析，我們選用提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，根據(jù)以多糖含量為指標的制何首烏多糖的水提單因素考察實驗結(jié)果，而分別選出三個水平，采用正交試驗設(shè)計對制何首烏多糖提取工藝進行研究。選取用L9(34) 正交表安排試驗。( 1)水煎煮提取正交試驗方法設(shè)計
精確稱取IOOg的脫脂制何首烏粉末，選用不同的提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和加水量進行煎煮提取，調(diào)節(jié)PH值至7. 0，然后在90°C恒溫水浴中提取池，過濾，殘渣分別提取 2次，離心，收集上清液，減壓濃縮，合并兩次上清液，定容到2L容量瓶中，再從2L容量瓶中吸取ImL到50mL容量瓶中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。采用正交設(shè)計試驗，對提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和加水量進行條件優(yōu)選，用L9(34)正交表安排試驗。因素水平表見表1。表1制何首烏多糖熱水提取因素水平表
權(quán)利要求
1.一種制何首烏多糖，其特征在于是由以下方法制備而成(1)將制何首烏粉碎，95體積％乙醇回流脫脂，濾出溶劑，濾渣干燥后再用80體積％乙醇回流提取，濾出溶劑，濾渣干燥后得到脫脂制何首烏粉；(2)脫脂制何首烏粉加入1(Γ20倍體積的水，ρΗ值為7.0的條件下在6(T90°C恒溫水浴中提取2、次，每次廣2h，然后過濾，濃縮濾液到相對密度1. 05 ；(3)將濃縮后的濾液加入淀粉酶，37°C恒溫過夜，得到脫淀粉后的濃縮液；(4)向脫淀粉后的濃縮液加入乙醇，調(diào)整使含醇量為5(Γ80體積％，靜置過夜，離心，收集沉淀，得到除淀粉的制何首烏粗多糖；(5)對除淀粉后的制何首烏粗多糖進行除蛋白、除色素處理，最終得到制何首烏多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(2)中加入水的體積為脫脂制何首烏粉末質(zhì)量的15倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(2)中恒溫水浴溫度為90°C， 提取2次，每次提取時間為lh。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(3)中加入淀粉酶的量為每 IOOg濃縮后的濾液加入20mg淀粉酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(4)中含醇量調(diào)整為60體積％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(5)中所述除蛋白是用kvag 法脫蛋白6次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖，其特征在于步驟(5)中所述除色素是向制何首烏粗多糖水溶液中加入雙氧水使其質(zhì)量百分比濃度為10%，45°C條件下脫色4h。
8.權(quán)利要求1所述的制何首烏多糖在制備抗衰老藥物中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述制何首烏多糖在制備抗衰老藥物中的應用，其特征在于所述衰老為由H2A和/或D-半乳糖引起的衰老。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制何首烏多糖在制備抗衰老藥物中的應用，其特征在于所述抗衰老藥物為清除氧自由基藥物、保護谷胱甘肽過氧化物酶活力藥物和/或保護超氧化物歧化酶活力藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制何首烏多糖及其在制備抗衰老藥物中的應用。該制何首烏多糖制備方法制何首烏粉碎，95%乙醇回流脫脂，濾出溶劑，濾渣干燥后用80%乙醇回流提取，濾出溶劑，濾渣干燥得脫脂制何首烏粉，然后將脫脂制何首烏粉加入水，pH7.0的條件下在60~90℃恒溫水浴中提取，過濾，濾液合并濃縮到相對密度1.05，加淀粉酶37℃恒溫過夜，過濾，濾液加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為50~80%，靜置過夜，過濾，沉淀經(jīng)過除蛋白、除色素處理后即得到制何首烏多糖。本發(fā)明的制何首烏多糖可以應用于制備抗衰老藥物，具有良好的治療效果，且為中藥制劑，毒副作用小，安全可靠，應用領(lǐng)域廣泛，可以作為膠囊劑、顆粒劑、片劑等進行開發(fā)。
文檔編號A61P39/06GK102344500SQ20111030256
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者梁生旺, 王淑美, 王霆, 申洪超, 蘇智斌, 陳占科 申請人:廣東藥學院