專利名稱：可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株及可刺激免疫激活的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可產(chǎn)生高細胞免疫激活反應(yīng)的分離株，其于2011年8月5日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，寄存編號CGMCC No. 5118，也寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC 910500。針對菌種特性與利用16S rDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定為長雙歧桿菌長亞種長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. longum),其可刺激細胞產(chǎn)生高的免疫激活反應(yīng)。
背景技術(shù)：
隨著感染性疾病的控制與工業(yè)化程度的提高，過敏性疾病發(fā)生率逐年上升，已經(jīng)成為世界的趨勢。近二十年來，過敏疾病發(fā)生率平均升高5 10倍，成為不容忽視的健康問題。世界過敏組織(WAO)在2005公布了 30個國家12億總?cè)丝谥校?2% (約2億5千萬人)患有IgE介導(dǎo)(IgE mediated)的過敏性疾病，包括過敏性鼻炎、哮喘、結(jié)膜炎、食物過敏、濕疹、藥物過敏及嚴重過敏反應(yīng)等。過敏性疾病罹病率的迅速增高，已達流行病的程度。這些疾病的罹病率增加，與長期持續(xù)的環(huán)境因素和生活方式改變有關(guān)。工業(yè)化、都市化越高的國家，過敏性疾病的罹病率就越高，像是澳洲、英國、美國、西歐等國家，都是過敏性疾病最嚴重的地區(qū)。過敏疾病是一種免疫疾病，是人體內(nèi)的免疫功能失調(diào)，出現(xiàn)D平衡的D況。人體的免疫系統(tǒng)中可以區(qū)分成第一型T細胞反應(yīng)(Thl)與第二型T細胞反應(yīng)(Th2)，由于人體內(nèi)有抗原(過敏原)進入，身體就會產(chǎn)生免疫保護作用，當人體再次接觸抗原時，就會誘發(fā)身體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)，T細胞會釋放Y干擾素(IFN-γ)、細胞間白素2(IL-2)，使免疫反應(yīng)趨向第一型T細胞反應(yīng)，B細胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。過敏疾病的致病機轉(zhuǎn)是多因子，免疫球蛋白E抗體，嗜伊紅白血球(Eosinophil)，過敏原特異性T淋巴球和細胞間白素4、5、9、13都占有很重要的免疫致病機轉(zhuǎn)，但要如何啟動這些致病機轉(zhuǎn)，進一步引發(fā)過敏癥狀的發(fā)生，則與遺傳因素和環(huán)境因素脫不了關(guān)系。然而,有過敏體質(zhì)的人，當過敏原進入體內(nèi)，則會誘發(fā)身體免疫系統(tǒng)朝第二型T細胞免疫反應(yīng)，T細胞會釋放細胞間白素4、5、9、13，讓免疫B細胞制造免疫球蛋白E(IgE)增加，黏附在肥大細胞(Mastcells)上，再遇過敏原時，過敏原會黏附在免疫球蛋白E上，共同作用后，肥大細胞會釋放發(fā)炎介質(zhì)如組織胺(Histamine)、白三稀素(Leukotriene)、前列腺素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等,這些發(fā)炎介質(zhì)會進一步影響呼吸道產(chǎn)生發(fā)炎反應(yīng)，導(dǎo)致過敏癥D發(fā)生。根據(jù)學(xué)者針對內(nèi)在腸道的原生菌叢研究指出，益生菌與壞菌的多寡與過敏性疾病發(fā)生率息息相關(guān)。研究學(xué)者于瑞典和愛沙尼亞2歲幼童的糞便中，發(fā)現(xiàn)乳酸菌數(shù)和壞菌的菌數(shù)有截然的不同表現(xiàn)，依據(jù)瑞典都市化、西方化的生活型態(tài)和飲食習(xí)慣的改變，使得兒童腸道中厭氧菌(clostridia)菌數(shù)愈增加，患過敏疾病的比D也愈增加；相反的，愛沙尼亞幼兒糞便中益生菌(包括乳酸菌、比菲德氏菌以及腸球菌等)菌數(shù)較多，過敏性疾病的罹病比例偏低。另一個實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果嬰兒出生后第一年腸道中大腸菌菌數(shù)愈高，日后罹患異位性皮膚炎的機率也會提高；如果綠膿桿菌(Clostridium difficile)多，日后摧患氣喘等過敏性疾病的機率也偏高。進一步的研究又發(fā)現(xiàn)，幼兒生活型態(tài)中，愈不常接觸細菌、使用較多抗生素和超清潔的飲食，反而使過敏的可能性增加。根據(jù)這些調(diào)查顯示，人類所接觸的細菌種類、數(shù)量，和時機，正足以影響免疫系統(tǒng)發(fā)育的走向。隨著疫苗的提早普遍接種和公共衛(wèi)生學(xué)的進步，夕卜在感染的形態(tài)正逐年改變，并非我們所能控制，因此許多研究學(xué)者希望能借著調(diào)整腸胃道中乳酸菌菌數(shù)而進一步控制過敏的發(fā)生?！叭樗峋笔侵改軌虼x糖類、產(chǎn)生50%以上乳酸的細菌，具有這些功能的細菌包括了 乳酸桿菌(Lactobacillus)、鍵球菌(Streptococcus)、念球菌(Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等,但乳酸菌為習(xí)慣用語,并不是分類學(xué)上正式用語。科學(xué)家最早發(fā)現(xiàn)某些乳酸菌菌種與人類單核球或細胞株培養(yǎng)可以增加第一型T細胞細胞素包括珈瑪干擾素(IFN-Y),細胞間白素-12(IL-12),和細胞間白素-18(IL_18) 的分泌，主要的機轉(zhuǎn)在增加細胞內(nèi)STATl和STAT3轉(zhuǎn)譯分子的磷酸化，增加干擾素的釋放。進一步的研究也指出乳酸菌和腸道內(nèi)皮細胞上的TOLL接受器，尤其是T0LL-2接受器的結(jié)合，能活化細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)譯蛋白NF-κ B移至核內(nèi)而釋放大量細胞素，屬于先天免疫(InnateImmunity)的一環(huán)。因此某些乳酸菌菌種借由其細胞壁成份(Peptidoglycan),經(jīng)由先天免疫系統(tǒng)，確實能活化T細胞的發(fā)育。在動物實驗方面，早期科學(xué)家即發(fā)現(xiàn)，若實驗動物腸中處于無菌狀態(tài)，就不可能誘發(fā)免疫耐受性，因此證明腸胃中菌叢的改變，可以影響免疫反應(yīng)。日本科學(xué)家進一步發(fā)現(xiàn)乳酸菌代田乳酸菌(Lactobacillus caseishirota)可以抑制抗原特異性IgE抗體的產(chǎn)生,并可以預(yù)防過敏反應(yīng)和食物過敏，主要機轉(zhuǎn)是此乳酸菌細胞壁可以誘發(fā)T細胞產(chǎn)生大量的間白素-12。在使用卵蛋白基因轉(zhuǎn)殖鼠的動物實驗中，也證明服用乳酸菌確實能抑制與過敏相關(guān)的IgG和IgE抗體，且能產(chǎn)生大量的干擾素和IgA抗體，可治療食物過敏。因此從動物實驗的結(jié)果，幾乎能確定乳酸菌確實能降低第二型T細胞所造成的過敏免疫發(fā)炎反應(yīng)。最早使用乳酸菌的目的都放在病毒性或細菌性腸炎的治療，尤其是旅行者腹瀉和輪狀病毒所引起的腹瀉癥狀的改善，最常用的菌種是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus GG) (LGG，ATCC 53103)，大部分的雙盲臨床試驗結(jié)果皆證實有部份療效。臨床醫(yī)師又進一步將乳酸菌用于治療食物過敏，尤其是對牛奶過敏所引起的癥狀能有神奇的改善效果，進一步的發(fā)現(xiàn)更證明服用一百億菌落數(shù)的LGG乳酸菌可在血清中增加足夠的細胞間白素-10，能明顯抑制過敏癥狀，尤其是異位性皮膚炎的癥壯。在預(yù)防方面，芬蘭的學(xué)者證明在懷孕媽媽若一等親人中有過敏病者，在產(chǎn)前服用乳酸菌LGG —百億連續(xù)14天，小孩則在出生后服用6個月，則2年的追蹤顯示小孩過敏病的發(fā)生率與對照組比至少降低50%以上，統(tǒng)計上有顯著的意義。從以上研究報告顯示口服乳酸菌能對過敏免疫疾病產(chǎn)生調(diào)節(jié)治療作用。學(xué)者也將嗜酸乳桿菌L. acidophilus引用在氣喘的治療，雙盲試驗證明不論是家塵螨或是花粉所引起的過敏癥狀，都能有效降低，但不能明顯降低IgE和氣道過度收縮反應(yīng)。其它學(xué)者則證明若連續(xù)服用優(yōu)格(Yogurt)，每天至少200公克I年，則不只能改善過敏癥狀，也能降低IgE抗體。
乳酸菌為人體使用超過300年，其作用是多方位的，除了上述免疫作用，包括促進干擾素，細胞間白素-12，和細胞間白素-18的產(chǎn)生，產(chǎn)生IgA抗體，在口服耐受性的研究中，乳酸菌也能促進免疫抑制細胞素細胞間白素-10和細胞轉(zhuǎn)形成長因子(TGF-β)的產(chǎn)生，因此乳酸菌也被使用于調(diào)節(jié)自體免疫反應(yīng)。乳酸菌的其它作用包括能產(chǎn)生乳酸菌和抑菌素(bacteriocin)，可以抑制其他病原菌，改善腸道中的生態(tài)，幫助腸道優(yōu)勢好菌的建立，另外乳酸菌也能黏附M細胞，促進腸細胞分泌生長素，增加腸細胞的再生生長，而其產(chǎn)生的丁酸(Butyric acid)更可中和食物的致癌物質(zhì)。日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)乳酸菌中比菲德氏菌能夠減輕西洋杉花粉癥的癥狀，在花粉季的早期連續(xù)使用長雙歧桿菌長亞種能夠減輕鼻塞、流鼻水、打噴嚏、眼睛癢、流淚等癥狀，同時在使用四周后血清中INF- Y、IL-10濃度下降的情形會減緩，而代表第二型T細胞反應(yīng)的細胞趨化素TARC濃度也較安慰劑組低，使用八周后嗜伊紅性球的比率也下降。TARC是在發(fā)炎的后期由抗原呈現(xiàn)細胞(APC)、脾臟細胞、上皮細胞等細胞所分泌的趨化素(chemokines)，它會吸引嗜伊紅性球等過敏免疫細胞聚集。長雙歧桿菌長亞種能夠調(diào)節(jié)TARC的分泌，減少第二型T細胞的免疫反應(yīng)。長雙歧桿菌長亞種改善花粉癥的機轉(zhuǎn)除了減少第二型T細胞免疫反應(yīng)外，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在花粉癥期間，病人腸道的菌叢會產(chǎn)生變化，F(xiàn)aecalibacterium prausnitzii、Bacteroides fragilis會明顯增加，補充長雙歧桿菌長亞種則能幫助維持正常的菌叢。另一項動物實驗發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌長亞種能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)型T細胞增加，出生小鼠喂食長雙歧桿菌長亞種后血中循環(huán)的調(diào)節(jié)型T細胞數(shù)目會增加，在腸道淋巴組織中Tolllike rec印tor訊息傳導(dǎo)、抗原呈現(xiàn)、細胞激素等基因的表現(xiàn)都會增加。同時，口服長雙歧桿菌長亞種能夠阻斷抗原誘導(dǎo)的IgE合成。也有研究指出口服長雙歧桿菌長亞種能夠阻止組織胺的訊息傳遞，它能讓血球中histamine Hl receptor (HlR)以及histidinedecarboxylase (HDC)的基因表現(xiàn)下降,減少組織胺的合成，并緩解組織胺所引起的病理反應(yīng)，進而緩解過敏性疾病的癥狀。此外，還有研究也指出口服比菲德氏菌能夠提升免疫力，如增加NK細胞的活性、脾臟淋巴細胞的增生以及血中溶血素(hemolysin)的濃度等。乳酸菌是非致病性的革蘭氏陽性桿菌，是腸道的益生菌，在腸道黏膜表面的正常菌叢中大多數(shù)是乳酸菌與比菲德氏菌，其臨床作用有調(diào)節(jié)腸道的通透性、改變腸道微生物的狀態(tài)與增加腸道IgA的反應(yīng)性。早期的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可刺激老鼠的脾臟細胞株分泌干擾素-Y，同時在人類的研究上也發(fā)現(xiàn)血液中的淋巴球細胞也可被乳酸菌刺激而分泌干擾素-Y，而干擾素-Y可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)產(chǎn)生與否。過敏免疫反應(yīng)之一產(chǎn)生干擾素Y是免疫細胞活化后所產(chǎn)生的，可以增加抗原呈獻細胞的功能，使巨噬細胞能有效的辨識并吞噬侵入的病原體，所以干擾素-Y也被稱為巨噬細胞的活化因子之一。因此乳酸菌能刺激產(chǎn)生干擾素-Y也代表其可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，關(guān)鍵的影響過敏免疫反應(yīng)之一為干擾素Y，免疫細胞活化到某程度后所產(chǎn)生的干擾素- Y，可以增加抗原呈獻細胞的功能，使巨噬細胞能有效的辨識并吞噬侵入的病原體或過敏原，干擾素- Y產(chǎn)生越高細胞免疫激活反應(yīng)越強。本發(fā)明的目的在于，提供一種新的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株及包含該長雙歧桿菌長亞種分離株的可刺激免疫激活的組合物，所要解決的技術(shù)問題是使其可刺激細胞產(chǎn)生高的免疫激活反應(yīng)，非常適于實用。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC910500。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進一步實現(xiàn)。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株為可產(chǎn)生高細胞免疫激活反應(yīng)的分離株。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株是經(jīng)鑒定為長雙歧桿菌長亞種。
前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株是篩選自嬰兒糞便檢體。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株是經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果為革蘭氏陽性桿菌。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株不具有觸酶。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株不
具有氧化酶。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株不具有運動性。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株是于厭氧環(huán)境下生長，好氧環(huán)境下不會生長。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株不產(chǎn)生內(nèi)生孢子。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株是經(jīng)16S rDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定為長雙歧桿菌長亞種。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株其具有長雙歧桿菌長亞種的所有被鑒知的特性。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的分離株可產(chǎn)生較其他乳酸菌種高的細胞免疫激活反應(yīng)。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的其他乳酸菌種為副干酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成的群組。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的細胞免疫激活反應(yīng)為利用ELISPOT assay進行干擾素-Y分析。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，具有刺激人類周邊血液單核球細胞產(chǎn)生干擾素-Y的能力。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，刺激人類周邊血液單核球細胞產(chǎn)生干擾素-Y的免疫激活強度高于其他乳酸菌種3倍以上。前述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其中所述的其他乳酸菌為副干酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成的群組。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明提出的一種可刺激免疫激活的組合物，其包括上述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可采用以下技術(shù)措施進一步實現(xiàn)。前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株為菌粉。前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的菌粉為冷凍干燥而得。前述的可刺激免疫激活的組合物，其適應(yīng)癥為病毒感染索引發(fā)的疾病、過敏性疾病、自體免疫疾病及癌癥抑制或預(yù)防所組成的群組。 前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的病毒感染索引發(fā)的疾病包含反復(fù)感冒、季節(jié)流感、腸胃炎及泌尿道感染組成的群組。前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的過敏性疾病包含食物過敏、蕁麻疹及過敏性鼻炎組成的群組。前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的自體免疫疾病包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎及紅斑性狼瘡組成的群組。前述的可刺激免疫激活的組合物，其中所述的癌癥是指大腸癌、胃癌及肝癌組成的群組。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果。由以上可知，為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種一種產(chǎn)生高細胞免疫激活反的分離株BR022，篩選自新生兒糞便檢體的菌種并寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC 910500。本發(fā)明將分離出來的菌株利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，其化學(xué)與物理特性為不具有觸酶、氧化酶及運動性，不會產(chǎn)生內(nèi)生孢子，于厭氧環(huán)境下會生長，好氧環(huán)境下不會生長。另外本發(fā)明利用16S rDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)與標準菌株 B.Ionum subsp. longum BCRC 11847、B.Ionum subsp. infantis BCRC15416、B.Ionumsubsp. suis BCRC 14671進行比對，加以鑒定確認該分離株BR022為Bifidobacteriumlongum subsp. Longum。利用引子RP4進行BR022與市售乳酸菌(B. longum BB536)基因組DNA 的 RAPD 比對，結(jié)果顯示 BR022 RPAD Pattern 為 600bp、450bp，B. longum BB536 RPADPattern 為 600bp、450bp、 340bp、300 200bp 間有 3 條 Band，此一結(jié)果證實 BR022 與B. longum BB536 為兩株不同的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)屬。另一方面，本發(fā)明利用其他乳酸菌種L. paracasei及L. acidophilus作為對照組進行免疫激活反應(yīng)差異分析。將三株菌種L. paracasei、L. acidophilus、BR022與PBMC進行免疫激活反應(yīng)后，利用ELISPOT assay進行干擾素-Y分析。ELISPOT assay利用呈色反應(yīng)，在細胞分泌細胞激素的對應(yīng)位置上顯現(xiàn)可辨的斑點，以ELISPOT辨識系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，I個斑點代表I個細胞，計算出分泌該細胞激素的細胞數(shù)量。且ELISPOT assay利用細胞平臺進行檢測，具有高靈敏度、高親和力、高特異性，能于2. O 3. O X IO5細胞/毫升中即可檢出I顆可分泌細胞激素的細胞，且在刺激細胞時，不會影響細胞分泌細胞激素的反應(yīng)。其檢測原理是利用96孔盤底部PVDF材質(zhì)薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin)的單株抗體。當血液檢體經(jīng)過分離后的取得的PBMC(人類周邊血球細胞)細胞被加至96孔盤上，利用抗原刺激后將微孔盤放置于適當溫度下培養(yǎng)16 24小時后，記憶型T細胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標記的二次抗體來標志，其后再以結(jié)合酵素的鏈霉親和素(StreptAvidin)與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細胞會留下染色斑點，將檢體分析結(jié)果視為免疫激活反應(yīng)強度，并將三株菌種的免疫激活反應(yīng)進行排序。本發(fā)明通過綜合鑒定結(jié)果顯示此分離株(BR022)為一長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. Longum),并可產(chǎn)生較強的免疫激活反應(yīng)。
借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株及可刺激免疫激活的組合物至少具有下列優(yōu)點及有益效果本發(fā)明的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種可刺激細胞產(chǎn)生高的免疫激活反應(yīng)。綜上所述，本發(fā)明是有關(guān)于一種可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株BR022，該菌株分離自新生兒糞便檢體，利用菌種特性與16SrDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定,確認該分離株為長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longumsubsp. longum)，其寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC 910500。本發(fā)明利用人類周邊淋巴血球細胞免疫激活反應(yīng)分析，該分離株可刺激細胞產(chǎn)生較高的免疫激活反應(yīng)。本發(fā)明在技術(shù)上有顯著的進步，并具有明顯的積極效果，誠為一新穎、進步、實用的新設(shè)計。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實施例，并配合附圖，詳細說明如下。


圖I是BR022革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果圖。圖2是BR022與B. longum BB536基因組DNA的RAPD比對電泳圖，其中A為B. longum BB536 基因組 DNA 的 RAPD，B 為 DNA marker, C 為 BR022 基因組 DNA 的 RAPD。圖3是ELISPOT assay分析免疫激活反應(yīng)差異性分析圖。
具體實施例方式為更進一步闡述本發(fā)明為達成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株其具體實施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細說明如后。I. BR022乳酸菌分離鑒定本發(fā)明BR022乃由光晟生物科技公司篩選自新生兒糞便檢體的菌種，寄存編號BCRC 910500。利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，結(jié)果如圖I所示，不具有觸酶、氧化酶及運動性，不會產(chǎn)生內(nèi)生孢子，于厭氧環(huán)境下會生長，好氧環(huán)境下不會生長；根據(jù)2002 P. S. M. Yeung et. al.等人研究指出，利用特殊引子對Primer PAF[5' AGA GTT TGATCC TGGCTC AG 3']與Primer 536R[5' GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3']，進行乳酸菌 16SrDNA gene PCR放大，即可進行乳酸菌屬的鑒定。利用16S rDNA部分序列進行比對，加以鑒定確認該分離株BR022為長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp. Longum)，如表I所不，可得知BR022 16SrDNA gene片段與Bifidobacterium longum高達99%的相似度，證實BR022為Bifidobacterium longum菌屬。另利用Biolog鑒定系統(tǒng)，依據(jù)微生物95種不同炭原利用的生化代謝特性，比對分析來鑒別微生物，其結(jié)果顯示BR022與標準菌株 Bif idobacterium longum subsp. longum BCRC11847 于 95 種炭原代謝特性中有 93 項具有相同反應(yīng)，證實BR022為Bifidobacteriumlongum菌屬。結(jié)果如表2、表3所示。表I. 16S rDNA 部分序列(507bp)
GAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCAAGCTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGA GTAATG
CGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCC
GGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAiGCTTTCGCGGTATGGGATGGG
GTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAAGGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGT
AGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCC
TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGQGCGCAAGCCTGATGCAGCGA
CGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAA
GCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG
GGGGTAATACT
權(quán)利要求
1.一種可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC910500。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株為可產(chǎn)生高細胞免疫激活反應(yīng)的分離株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株是經(jīng)鑒定為長雙歧桿菌長亞種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株是篩選自嬰兒糞便檢體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株是經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果為革蘭氏陽性桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株不具有觸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株不具有氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株不具有運動性。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株是于厭氧環(huán)境下生長，好氧環(huán)境下不會生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株不產(chǎn)生內(nèi)生孢子。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株是經(jīng)16S rDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定為長雙歧桿菌長亞種。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株其具有長雙歧桿菌長亞種的所有被鑒知的特性。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的分離株可產(chǎn)生較其他乳酸菌種高的細胞免疫激活反應(yīng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的其他乳酸菌種為副干酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成的群組。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的細胞免疫激活反應(yīng)為利用ELISPOT assay進行干擾素-Y分析。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其具有刺激人類周邊血液單核球細胞產(chǎn)生干擾素-Y的能力。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其刺激人類周邊血液單核球細胞產(chǎn)生干擾素-Y的免疫激活強度高于其他乳酸菌種3倍以上。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的其他乳酸菌為副干酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成的群組。
19.一種可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其包括一根據(jù)權(quán)利要求I所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株，其特征在于其中所述的可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株為菌粉。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其中所述的菌粉為冷凍干燥而得。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其適應(yīng)癥為病毒感染索引發(fā)的疾病、過敏性疾病、自體免疫疾病及癌癥抑制或預(yù)防所組成的群組。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其中所述的病毒感染索引發(fā)的疾病包含反復(fù)感冒、季節(jié)流感、腸胃炎及泌尿道感染組成的群組。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其中所述的過敏性疾病包含食物過敏、蕁麻疹及過敏性鼻炎組成的群組。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其中所述的自體免疫疾病包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎及紅斑性狼瘡組成的群組。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的可刺激免疫激活的組合物，其特征在于其中所述的癌癥是指大腸癌、胃癌及肝癌組成的群組。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種可產(chǎn)生高免疫激活反應(yīng)的長雙歧桿菌長亞種分離株及可刺激免疫激活的組合物。該菌株分離自新生兒糞便檢體，利用菌種特性與16S rDNA部分序列進行比對及Biolog鑒定系統(tǒng)鑒定，確認該分離株為長雙歧桿菌長亞種(Bifidobacterium longum subsp.longum)，其寄存于中國臺灣新竹的食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號BCRC 910500。本發(fā)明利用人類周邊淋巴血球細胞免疫激活反應(yīng)分析，該分離株可刺激細胞產(chǎn)生較高的免疫激活反應(yīng)。
文檔編號A61P17/00GK102899261SQ20111024127
公開日2013年1月30日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者許清祥, 呂春美, 李欣樺, 王櫻諭, 賴訂穎, 薛如婷 申請人:光晟生物科技股份有限公司