專利名稱：D-氨基酸氧化酶抑制劑預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及阿片耐受的預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)。具體來說，提供了用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的D-氨基酸氧化酶抑制劑，以及使用D-氨基酸氧化酶抑制劑來預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，還提供了使用D-氨基酸氧化酶來預(yù)防和/或治療疼痛的方法，以及鑒定預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物 的方法。
背景技術(shù)：
阿片受體激動(dòng)劑(又稱阿片激動(dòng)劑、阿片、阿片類物質(zhì)和阿片類藥物)如嗎啡等是一類麻醉性止痛劑，當(dāng)使用相對(duì)高劑量時(shí)或者雖然劑量低卻長期重復(fù)使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的藥物耐受性，從而導(dǎo)致止痛劑的止痛效果降低。因而，麻醉性止痛劑應(yīng)以增加的劑量使用，以便獲得所需的止痛效果。這種麻醉性止痛劑的劑量增加，導(dǎo)致不同的副作用，對(duì)人具有嚴(yán)重的毒性，并產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床問題和吸毒等國際范圍的嚴(yán)重社會(huì)問題，所以急需開發(fā)用于治療、預(yù)防、干預(yù)和阻斷阿片耐受的藥劑。
疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，很多疾病或病癥都會(huì)出現(xiàn)疼痛癥狀，并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，治療疼痛已經(jīng)成為健康護(hù)理和疾病治療中最多考慮的因素之一。因此疼痛已獲得醫(yī)藥界越來越多的關(guān)注，2000-2010已被稱為疼痛年代。疼痛是與急性或潛在的組織破壞相關(guān)聯(lián)的不愉快的感覺和情感體驗(yàn)，促使人們避開所述破壞情形，從而保護(hù)身體并避免破壞的進(jìn)一步發(fā)生。大多數(shù)疼痛在疼痛刺激消除以后隨即消失，但有時(shí)盡管刺激已經(jīng)消除并且身體明顯恢復(fù)但疼痛仍然持續(xù)。此外，有時(shí)盡管檢測不到任何刺激、破壞或疾病，但仍出現(xiàn)疼痛。
疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛。慢性疼痛是當(dāng)今國際疼痛研究的熱點(diǎn)，根據(jù)發(fā)生的原因不同，可分為免疫炎癥痛、神經(jīng)源性痛、腫瘤(癌癥)痛、糖尿病疼痛和腰背痛等。慢性疼痛和急性疼痛的區(qū)別，在于不完全是末梢神經(jīng)受刺激引起的一些非損害性刺激，如輕觸、溫?zé)岬却碳ひ部梢鸩∽儏^(qū)的強(qiáng)烈疼痛。慢性疼痛常在損傷后一段時(shí)間發(fā)生，這種疼痛帶有自發(fā)性，隨機(jī)性和持久性，而且服用常用鎮(zhèn)痛藥多無效，并往往終生不愈。慢性疼痛涉及復(fù)雜的形成機(jī)理，外周的異位放電及中樞敏感化(centralsensitization)是目前廣泛認(rèn)可的慢性疼痛包括神經(jīng)源性疼痛和腫瘤疼痛形成的主要機(jī)制(Basbaum et al. Cell139 :267-284，2009)。慢性疼痛發(fā)病率較高，約占總?cè)巳旱?0%，并隨年齡增大和原發(fā)病程延長而增高(如55歲以上發(fā)病率可達(dá)13%，再如在糖尿病診斷初期為8%，而在診斷25年后可聞達(dá)50% )。
疼痛(如各種形式的慢性疼痛包括癌癥疼痛、神經(jīng)源性痛等)治療不充分在病房、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)、急診等中普遍存在?？梢允褂盟幬铩⒕癔煼?、物理療法以及傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)療法等來治療疼痛。目前臨床上治療慢性疼痛主要包括三環(huán)抗抑郁藥如阿米替林(amitriptyline),抗癲癇藥如加巴噴丁和普瑞巴林,局部麻醉藥如利多卡因(Lidocaine),阿片類藥(如嗎啡、二氫嗎啡酮、芬太尼和丁丙諾啡)，腎上腺素受體拮抗劑如可樂定，以及5-HT再攝取抑制劑如度洛西汀和齊考諾肽等。但是由于對(duì)慢性疼痛較低的認(rèn)知度，市場上現(xiàn)有的多數(shù)產(chǎn)品并不專門針對(duì)慢性疼痛，對(duì)大部分患者無效或只能適度緩解疼痛，或會(huì)引起許多不良反應(yīng)，或給藥不方便。例如，目前對(duì)癌痛等疼痛的臨床治療采用三級(jí)止痛階梯療法，即輕度癌性疼痛采用以阿斯匹林和消炎痛等為代表的非留體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，中度癌性疼痛采用曲馬多、可待因、羥考酮等弱阿片類中度鎮(zhèn)痛劑，而劇烈癌性疼痛則須采用嗎啡、度冷丁等強(qiáng)阿片受體激動(dòng)劑的麻醉藥品，這類強(qiáng)阿片受體激動(dòng)劑在對(duì)劇烈疼痛有效控制的同時(shí)，帶來藥物耐受性的嚴(yán)重臨床問題和吸毒等國際范圍的嚴(yán)重社會(huì)問題。另外，原治療劇痛的高劑量麻醉藥物，具有抑制呼吸、導(dǎo)致嘔吐、導(dǎo)致內(nèi)臟平滑肌痙攣等顯著的副作用，而其導(dǎo)致內(nèi)臟平滑肌痙攣的副作用須聯(lián)用阿托品等藥物方可獲得改善，否則將成為加重膽絞痛、腎絞痛等常見內(nèi)臟劇痛的病因，這也是其鎮(zhèn)痛效果時(shí)間持續(xù)短的原因之一。
止痛劑是抑制或緩解急性疼痛常用的醫(yī)療性藥物。止痛劑通常分為麻醉性和非麻醉性兩類。臨床上使用麻醉性止痛劑治療晚期癌癥患者的急性疼痛，因?yàn)樗鼈儗?duì)內(nèi)臟疼痛具有優(yōu)異的止痛效果。然而，當(dāng)麻醉性止痛劑以相對(duì)高劑量給藥或者雖然劑量低卻長期重復(fù)給藥時(shí)，會(huì)導(dǎo)致止痛劑的習(xí)慣性用藥以及發(fā)生對(duì)止痛劑的渴望。此外，當(dāng)使用者反復(fù)地使用規(guī)定量的麻醉性止痛劑時(shí)，其對(duì)止痛劑的耐受性迅速發(fā)展，導(dǎo)致止痛劑的止痛效果降低。因而，麻醉性止痛劑應(yīng)以增加的劑量使用，以便獲得所需的止痛效果。這種麻醉性止痛劑的劑量的增加，導(dǎo)致不同的副作用，因而對(duì)人具有嚴(yán)重的毒性。
作為代表性實(shí)例，已知阿片激動(dòng)劑是最常用的一類麻醉性止痛劑，其中嗎啡、芬太尼類等是目前臨床上常用的阿片激動(dòng)劑類止痛劑，例如嗎啡約占市場80 %份額。然而，反復(fù)給予阿片激動(dòng)劑如嗎啡等會(huì)導(dǎo)致其止痛效果逐步降低，并最終導(dǎo)致發(fā)生阿片止痛作用的耐受性。由于這些原因，盡管其具有優(yōu)異的功效，嗎啡等阿片激動(dòng)劑在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。因此，為了利用阿片激動(dòng)劑如嗎啡等作為止痛劑，保持阿片激動(dòng)劑最初的止痛效果又不在重復(fù)使用時(shí)降低其止痛效果是非常重要的。該目的可以通過抑制對(duì)阿片激動(dòng)劑的耐受性的發(fā)生來實(shí)現(xiàn)。
阿片耐受(opioid tolerance)是指長時(shí)間使用阿片類藥物(阿片激動(dòng)劑)后，藥物鎮(zhèn)痛作用逐漸減退甚至消失，或者若要得到相同程度的鎮(zhèn)痛效應(yīng)必須逐漸增加阿片類藥物的劑量，除表現(xiàn)出藥物鎮(zhèn)痛效應(yīng)減弱、藥物需要?jiǎng)┝吭黾又?，還會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的痛覺過敏(hyperalgesia)。阿片類藥物耐受(阿片耐受)的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，大量實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，阿片受體脫敏與內(nèi)吞(Gainetdinov et al. , Ann Rev Neurosci27 :107-144，2004)、受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Raval et al. ,J Neurosci 27 :107-144，2004)及引起神經(jīng)?？伤苄宰兓霓D(zhuǎn)錄因子(Miyabe and Miletic, NeurosciLett 38 :80-85, 2005)均參與了阿片類藥物耐受的形成。
因此，迫切需要一種預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，以及能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的藥物。此外，還希望獲得代替阿片激動(dòng)劑的用于預(yù)防和/或治療疼痛的其他類藥物。

發(fā)明內(nèi)容
[10]發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，D-氨基酸氧化酶抑制劑包括CBI0，AS057278和苯甲酸鈉等能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片激動(dòng)劑治療時(shí)所產(chǎn)生的耐受性。[11]發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的預(yù)測相反，D-氨基酸氧化酶抑制劑本身即能夠顯著地預(yù)防和/或疼痛。[12]基于以上意外發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明，并得到了以下一系列技術(shù)方案。[13]在一個(gè)方面中，本公開內(nèi)容提供了一種預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。[14]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于預(yù)防和/或治療因阿片耐愛使得其治療功效降低的病癥，這些病癥能夠通過抑制D-氨基酸氧化酶達(dá)到預(yù)防和/或阿片耐受從而得到預(yù)防和/或治療。具體來說，所述病癥可以是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。[15]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥選自慢性疼痛，癌癥性疼痛，神經(jīng)性疼痛，慢性腰背痛，頭痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，叢集性頭痛，纖維肌痛綜合征，關(guān)節(jié)痛，炎性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，腫瘤 疼痛，癌癥疼痛，內(nèi)臟痛，軀體痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，頸痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓損傷引起的疼痛，手術(shù)疼痛，術(shù)后疼痛，急性疼痛，或與感染、鐮狀細(xì)胞貧血、自身免疫病、多發(fā)性硬化或炎癥相關(guān)的疼痛，由損傷或手術(shù)造成的疼痛，或它們的組合。[16]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥選自與以下有關(guān)的疼痛糖尿病性神經(jīng)痛，外周神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛，腰或頸的神經(jīng)根痛，纖維肌痛，舌咽神經(jīng)痛，反射交感性營養(yǎng)不良，灼痛，丘腦綜合征，神經(jīng)根撕脫，幻肢痛，開胸術(shù)后的疼痛，癌癥，化學(xué)損傷，毒素，營養(yǎng)缺乏，病毒或細(xì)菌感染，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征，纖維肌痛綜合征，骨質(zhì)疏松，骨轉(zhuǎn)移或其他未知原因引起的骨痛，痛風(fēng)，纖維組織炎，肌筋膜痛，胸廓出口綜合征，背痛或腰痛，骨盆痛，心臟性胸痛，非心臟性胸痛，脊髓損傷相關(guān)性疼痛，中樞性中風(fēng)后疼痛，癌癥痛，AIDS痛，抗腫瘤藥物致神經(jīng)疼痛，鐮狀細(xì)胞痛，老年痛，或它們的組合。[17]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBI0(5-chlorobenzo[d]isoxazol-3-ol, Ferraris et al. , J Med Chem51 3357-3359，2008 ；Hashimoto et al.，Biol Psychiatry 65 :1103-1106，2009 ；Horioet al.，Open Clin Chem J 2 :16-21,2009 ；Gong et al.，J PharmacolExp Ther 336 282-293，2011)， AS057278(5-methylpyrazoIe-3-carboxylicacid, Adage et al. ， EurNeuropsychopharmacol 18 :200-214,2008 ；Gong etal. ， J Pharmacol Exp Ther 336 282-293,2011)，Compound 8 (4H~thieno[3,2-b]pyrrole-5-carboxylic acid，Sparey etal.，Bioorg MedChem Lett 18 :3386-3391，2008 ；Smith et al.，J Pharmacol Exp Ther328 :921-930, 2009 ；Gong et al.，J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293, 2011), Compound2 (3-hydroxyquinolin-2-(IH) -one,Duplantier et al. ,J MedChem 52 :3576-3585,2009 ；Gong et al.，J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)和苯甲酸鈉(Vanoni et al.，Biochemistry 36 :5624-5632,1997 ；Gong et al. ， J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)等及其衍生物。D-氨基酸氧化酶抑制劑可用于防止和抑制反復(fù)施用嗎啡而帶來的嗎啡耐受性，同時(shí)又不影響單獨(dú)給藥時(shí)嗎啡的止痛作用。[18]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)象表現(xiàn)出對(duì)選自以下一種或多種阿片類物質(zhì)的耐受阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多或其衍生物。例如，所述阿片類物質(zhì)可以是嗎啡或其衍生物。[19]在再一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述方法用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥時(shí)，所述方法還包括向所述對(duì)象施用另外的治療劑。例如，當(dāng)用于預(yù)防和/或治療疼痛時(shí)，還可以向所述對(duì)象施用疼痛治療劑，包括但不限于鎮(zhèn)痛劑如阿片類鎮(zhèn)痛齊U，或它們的組合。
[20]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述另外的治療劑選自阿片類物質(zhì)，例如選自以下一種或多種阿片類物質(zhì)阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone>二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、輕苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多或其衍生物。例如，所述阿片類物質(zhì)可以是嗎啡或其衍生物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述阿片激動(dòng)劑可以是嗎啡類藥物，如嗎啡、二氫嗎啡酮、芬太尼、丁丙諾啡和叔丁啡等。[21]在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。[22]在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過口服或胃腸外途徑施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑，例如包括皮下注射，脊髓施用，腦內(nèi)施用、肌肉注射，經(jīng)鼻腔施用，靜脈內(nèi)施用和/或腹腔內(nèi)施用。[23]在第二方面，本公開內(nèi)容提供一種預(yù)防和/或治療疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象阿片類物質(zhì)和D-氨基酸氧化酶抑制劑。[24]具體來說，可以分開和/或一起施用阿片類物質(zhì)和D-氨基酸氧化酶抑制劑。此外，可以在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。[25]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述阿片類物質(zhì)選自以下一種或多種阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多、其衍生物以及它們的任意混合物。[26]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8、Compoun d 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。[27]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疼痛是急性疼痛和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。具體來說，例如所述疼痛可以選自以下一種或多種慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，慢性腰背痛，頭痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，叢集性頭痛，纖維肌痛綜合征，關(guān)節(jié)痛，炎性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，腫瘤疼痛，癌癥疼痛，內(nèi)臟痛，軀體痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，頸痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓損傷引起的疼痛，手術(shù)疼痛，術(shù)后疼痛，急性疼痛，或與感染、鐮狀細(xì)胞貧血、自身免疫病、多發(fā)性硬化或炎癥相關(guān)的疼痛，由損傷或手術(shù)造成的疼痛，糖尿病性神經(jīng)痛，外周神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛，腰或頸的神經(jīng)根痛，纖維肌痛，舌咽神經(jīng)痛，反射交感性營養(yǎng)不良，灼痛，丘腦綜合征，神經(jīng)根撕脫，幻肢痛，開胸術(shù)后的疼痛，癌癥，化學(xué)損傷，毒素，營養(yǎng)缺乏，病毒或細(xì)菌感染，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征，纖維肌痛綜合征，骨質(zhì)疏松，骨轉(zhuǎn)移或其他未知原因引起的骨痛，痛風(fēng)，纖維組織炎，肌筋膜痛，胸廓出口綜合征，上背部痛，下腰痛，骨盆痛，心臟性胸痛，非心臟性胸痛，脊髓損傷相關(guān)性疼痛，中樞性中風(fēng)后疼痛，癌癥痛，AIDS痛，抗腫瘤藥物致神經(jīng)疼痛，鐮狀細(xì)胞痛，老年痛，或它們的組合。[28]在第三方面，本公開內(nèi)容提供一種治療慢性疼痛尤其是癌癥疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。[29]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。[30]基于本公開內(nèi)容的上述發(fā)現(xiàn)，還提供一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步驟提供測試化合物，使所述測試化合物與D-氨基酸氧化酶相接觸，和測定所述D-氨基酸氧化酶的活性；如果所述測試化合物能夠抑制D-氨基酸氧化酶的活性，那么所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。例如，根據(jù)上述方法鑒定的化合物可用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受而使得其治療功效降低的病癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述病癥是疼痛，尤其是慢性疼痛。[31]另一方面，本公開內(nèi)容還提供另一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步驟提供測試化合物和阿片類物質(zhì)，在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后向測試對(duì)象施用所述測試化合物，和測定施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)在測試對(duì)象中的活性；與未施用所述測試化合物和/或施用所述測試化合物之前的阿片類物質(zhì)活性相比較，如果在施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)活性水平增強(qiáng)，則所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。例如，根據(jù)上述方法鑒定的化合物可用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受而使得其治療功效降低的病癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述病癥是疼痛，尤其是慢性疼痛。[32]在第六方面，本公開內(nèi)容還提供D-氨基酸氧化酶抑制劑在制備用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的藥物中的用途。在所述用途的各種實(shí)施方案中，尤其包括與上述第一方面所述方法所涉及各實(shí)施方案相對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案。[33]在第七方面，本公開內(nèi)容還提供D-氨基酸氧化酶抑制劑與阿片類物質(zhì)聯(lián)合在制備用于預(yù)防和/或治療疼痛的藥物中的用途。在所述用途的各種實(shí)施方案中，尤其包括與上述第二方面所述方法所涉及各實(shí)施方案相對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案。[34]在第八方面，本公開內(nèi)容還提供D-氨基酸氧化酶抑制劑，其用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受，或者與阿片類物質(zhì)聯(lián)合用于預(yù)防和/或治療疼痛。在所述D-氨基酸氧化酶抑制劑的各種實(shí)施方案中，尤其包括與上述第一和第二方面所述方法所涉及各實(shí)施方案相對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案。[35]在第九方面，本公開內(nèi)容還提供用于制備藥物的D-氨基酸氧化酶抑制劑，所述藥物用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受，或者與阿片類物質(zhì)聯(lián)合用于制備預(yù)防和/或治療疼痛的藥物。在所述D-氨基酸氧化酶抑制劑的各種實(shí)施方案中，尤其包括與上述第一和第二方面所述方法所涉及各實(shí)施方案相對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案。
[36]本公開內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本公開內(nèi)容中具體記載一樣。[37]將結(jié)合附圖以及以下進(jìn)一步的詳細(xì)說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。


[38]圖I示出，單次或連續(xù)皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO對(duì)嗎啡耐受的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)作用。A為小鼠福爾馬林I相急性疼痛反應(yīng)，B為II相慢性疼痛反應(yīng)。與相應(yīng)的生理鹽水組比較，a代表P < 0. 05 ;與相應(yīng)的嗎啡鎮(zhèn)痛組比較，b代表P < 0. 05。[39]圖2示出，連續(xù)7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑AS057278 (40mg/kg)和苯甲酸鈉(400mg/kg)對(duì)嗎啡耐受的預(yù)防作用。A為小鼠福爾馬林I相急性疼痛反應(yīng)，B為II相慢性疼痛反應(yīng)。與相應(yīng)的生理鹽水組比較，a代表P < 0. 05 ;與相應(yīng)的嗎啡鎮(zhèn)痛組比較，b代表P < 0. 05。[40]圖3示出，脊髓鞘內(nèi)單次注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBI0(30iig)、AS057278 (100 U g)和苯甲酸鈉(300 U g)及活性氧(Reactive oxygenspecies, R0S)清除齊[JPBN(Img)對(duì)嗎啡在大鼠福爾馬林疼痛模型耐受的逆轉(zhuǎn)作用。a表示與嗎啡耐受組比較P< 0. 05。[41]圖4示出，單劑量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO，AS057278和苯甲酸鈉在小鼠熱板甩尾(A、B、C)和熱板(D、E、F)疼痛模型中立即逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受的量效關(guān)系。[42]圖5示出，單劑量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO，AS057278和苯甲酸鈉在小鼠甩尾(A)和熱板(B)疼痛模型中逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受的量效關(guān)系以及與抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性的相關(guān)性的分析(C和D)。[43]圖6不出，胚骨接種Walker 256細(xì)胞對(duì)Sprague Dawley大鼠機(jī)械性痛閾(A)和熱輻射痛閾的影響(B) (n = 6)。
[44]圖7示出，連續(xù)7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO (10mg/kg)對(duì)嗎啡耐受的預(yù)防作用(A)。B為第8日給予嗎啡(5mg/kg)刺激后骨癌痛大鼠痛閾值的變化。[45]圖8示出，D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO對(duì)神經(jīng)源疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。[46]圖9示出，骨癌痛大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的變化。[47]圖10示出，骨癌痛大鼠脊髓D-型氨基酸氧化酶mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的變化。[48]圖11示出，皮下注射CBIO對(duì)大鼠骨癌痛痛覺過敏抑制作用。[49]圖12示出，鞘內(nèi)給CBIO對(duì)骨癌痛鎮(zhèn)痛作用的量效曲線和時(shí)效曲線。
具體實(shí)施例方式[50]本文所用術(shù)語具有其在所屬技術(shù)領(lǐng)域的通常含義。為了明確其含義，以下是對(duì)本文所用一些術(shù)語的解釋說明。[51]如本公開內(nèi)容所用，術(shù)語“治療”是指通過醫(yī)學(xué)干預(yù)而使得待治療對(duì)象的目標(biāo)疾病或病癥和/或其任何癥狀和/或其任何可能的并發(fā)癥和/或后遺癥得到根治、消除、緩解、改善、停止加劇、和/或預(yù)防，或者使得待治療對(duì)象獲得立即發(fā)生的和/或潛在的醫(yī)學(xué)意義上的任何積極效果。[52]如本公開內(nèi)容所用，當(dāng)用于醫(yī)學(xué)狀況時(shí)，術(shù)語“預(yù)防”是指防止、避免和/或延緩醫(yī)學(xué)狀況的發(fā)生。例如，“預(yù)防阿片耐受”是指防止、避免和/或延緩阿片耐受的發(fā)生。[53]如本公開內(nèi)容所用，當(dāng)用于醫(yī)學(xué)狀況時(shí)，術(shù)語“逆轉(zhuǎn)”、“解除”是指使已發(fā)生的醫(yī)學(xué)狀況不再發(fā)生、和/或降低其嚴(yán)重程度。例如，“逆轉(zhuǎn)/解除阿片耐受”是指使已經(jīng)發(fā)生的阿片耐受不再發(fā)生和/或降低阿片耐受的水平。[54]如本公開內(nèi)容所用，D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAO)是一種氧化還原酶，其能夠?qū)-氨基酸氧化為相應(yīng)亞氨基酸(iminoacid)，產(chǎn)生氨和過氧化氫。DAO通常含F(xiàn)AD作為輔因子，其在從酵母到人的廣泛物種中表達(dá)，但在細(xì)菌和植物中不存在。[55]如本公開內(nèi)容所用，“抑制劑”是指能夠起到降低、阻斷和/或消除作用的物質(zhì)。“D-氨基酸氧化酶抑制劑”(DA0抑制劑)是指能夠降低、阻斷和/或消除D-氨基酸氧化酶活性的物質(zhì)，它們能夠抑制D-氨基酸氧化酶活性從而降低、阻斷和/或消除D-氨基酸氧化酶產(chǎn)生與其相關(guān)的生物效應(yīng)。抑制D-氨基酸氧化酶活性可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，DAO抑制劑可以結(jié)合DAO并降低、阻斷和/或消除D-氨基酸氧化酶的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DAO抑制劑可以通過RNA干擾的基因沉默作用降低和/或消除DAO表達(dá)，從而抑制DAO活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DAO抑制劑可以通過反義RNA機(jī)制降低和/或消除DAO表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制DAO活性的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DAO抑制劑可以通過基因敲除機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)DAO活性的抑制作用。[56]在本公開內(nèi)容中，在提到藥物化合物時(shí)，其含義還包括其藥學(xué)可接受的鹽、水合物和溶劑化物。[57]如本公開內(nèi)容所用，“阿片”(opioid)可與“阿片類物質(zhì)”和“阿片類藥物”互換使用，是指通過作用于阿片受體(opioid receptor)而發(fā)揮其藥理活性的一類藥物，其最重要的活性之一是麻醉性鎮(zhèn)痛作用，用于治療眾多的急性和慢性疼痛。此外，由于阿片是通過激動(dòng)阿片受體而發(fā)揮其藥理活性，其也被稱為阿片受體激動(dòng)劑(opioid receptoragonist)或阿片激動(dòng)劑(opioid agonist)。阿片受體主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)中表達(dá)，此外其還在例如消化道的周圍神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)?；诖耍⑵荏w的治療功效以及不良反應(yīng)也主要在這些系統(tǒng)和組織中體現(xiàn)。[58]本公開內(nèi)容中所用的阿片激動(dòng)劑包括但不限于阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲 馬多、其藥學(xué)可接受的鹽、水合物和溶劑化物，任何前述物質(zhì)的混合物等。[59]如本公開內(nèi)容所用，“阿片耐受”可與“阿片類藥物耐受”和“阿片類物質(zhì)耐受”互換使用。“耐受”是指受體對(duì)配體敏感性降低從而導(dǎo)致藥物作用降低的神經(jīng)適應(yīng)過程?！鞍⑵褪堋眲t是指阿片類物質(zhì)對(duì)阿片受體的激動(dòng)作用降低從而導(dǎo)致其藥物活性相應(yīng)降低的神經(jīng)適應(yīng)過程。由于阿片耐受的產(chǎn)生，其藥效(如鎮(zhèn)痛)不斷降低，不得不在治療過程(如鎮(zhèn)痛)中不斷增加阿片類物質(zhì)(如嗎啡等)的劑量。最終由于無法再產(chǎn)生足夠的治療效果，或者由于劑量增加而出現(xiàn)了嚴(yán)重的副作用，仍常常無法避免停止阿片類物質(zhì)治療。
[60]發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，D-氨基酸氧化酶抑制劑包括CBI0，AS057278和苯甲酸鈉等能完全預(yù)防或立即完全阻斷嗎啡等阿片受體激動(dòng)劑在治療疼痛過程中產(chǎn)生的耐受，其作用部位在脊髓，與脊髓D-氨基酸氧化酶活性抑制呈正性相關(guān)。D-氨基酸氧化酶抑制劑預(yù)防或阻斷阿片耐受。[61]在一個(gè)方面中，本公開內(nèi)容提供了一種預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。[62]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于預(yù)防和/或治療因阿片耐愛使得其治療功效降低的病癥，這些病癥能夠通過抑制D-氨基酸氧化酶達(dá)到預(yù)防和/或阿片耐受從而得到預(yù)防和/或治療。具體來說，所述病癥可以是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。[63]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥選自慢性疼痛，癌癥性疼痛，神經(jīng)性疼痛，慢性腰背痛，頭痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，叢集性頭痛，纖維肌痛綜合征，關(guān)節(jié)痛，炎性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，腫瘤疼痛，癌癥疼痛，內(nèi)臟痛，軀體痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，頸痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓損傷引起的疼痛，手術(shù)疼痛，術(shù)后疼痛，急性疼痛，或與感染、鐮狀細(xì)胞貧血、自身免疫病、多發(fā)性硬化或炎癥相關(guān)的疼痛，由損傷或手術(shù)造成的疼痛，或它們的組合。[64]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥選自與以下有關(guān)的疼痛糖尿病性神經(jīng)痛，外周神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛，腰或頸的神經(jīng)根痛，纖維肌痛，舌咽神經(jīng)痛，反射交感性營養(yǎng)不良，灼痛，丘腦綜合征，神經(jīng)根撕脫，幻肢痛，開胸術(shù)后的疼痛，癌癥，化學(xué)損傷，毒素，營養(yǎng)缺乏，病毒或細(xì)菌感染，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征，纖維肌痛綜合征，骨質(zhì)疏松，骨轉(zhuǎn)移或其他未知原因引起的骨痛，痛風(fēng)，纖維組織炎，肌筋膜痛，胸廓出口綜合征，背痛或腰痛，骨盆痛，心臟性胸痛，非心臟性胸痛，脊髓損傷相關(guān)性疼痛，中樞性中風(fēng)后疼痛，癌癥痛，AIDS痛，抗腫瘤藥物致神經(jīng)疼痛，鐮狀細(xì)胞痛，老年痛，或它們的組合。[65]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO(5-chloroben zo[d]isoxazol-3-ol, Ferraris et al. , J Med Chem51 3357-3359, 2008 ;Hashimoto et al. , Biol Psychiatry 65 :1103-1106,2009 ;Horioet al. , Open Clin Chem J 2 :16-21,2009 ；Gong et al. , J PharmacolExp Ther 336 282-293,2011), AS057278(5-methylpyrazoIe-3-carboxylicacid, Adage et al. , EurNeuropsychopharmacol 18 :200-214,2008 ;Gong etal. , J Pharmacol Exp Ther 336 282-293,2011), Compound 8(4H-thieno[3,2-b]pyrrole-5-carboxylic acid, Sparey etal. , Bioorg MedChem Lett 18 :3386-3391,2008 ；Smith et al. , J Pharmacol Exp Ther328 :921-930,2009 ；Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011), Compound2 (3-hydroxyquinolin-2-(IH)-one, Duplantier et al. , J MedChem 52:3576-3585,2009;Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)和苯甲酸鈉(Vanoni et al.，Biochemistry 36 :5624-5632,1997 ；Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)等及其衍生物。D-氨基酸氧化酶抑制劑可用于防止和抑制反復(fù)施用嗎啡而帶來的嗎啡耐受性，同時(shí)又不影響單獨(dú)給藥時(shí)嗎啡的止痛作用。[66]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述對(duì)象表現(xiàn)出對(duì)選自以下一種或多種阿片類物質(zhì)的耐受阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多或其衍生物。例如，所述阿片類物質(zhì)可以是嗎啡或其衍生物。[67]在再一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述方法用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥時(shí)，所述方法還包括向所述對(duì)象施用另外的治療劑。例如，當(dāng)用于預(yù)防和/或治療疼痛時(shí)，還可以向所述對(duì)象施用疼痛治療劑，包括但不限于鎮(zhèn)痛劑如阿片類鎮(zhèn)痛齊U，或它們的組合。[68]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述另外的治療劑選自阿片類物質(zhì)，例如選自以下一種或多種阿片類物質(zhì)阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone>二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、輕苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多或其衍生物。例如，所述阿片類物質(zhì)可以是嗎啡或其衍生物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述阿片激動(dòng)劑可以是嗎啡類藥物，如嗎啡、二氫嗎啡酮、芬太尼、丁丙諾啡和叔丁啡等。[69]在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。[70]在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過口服或胃腸外途徑施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑，例如包括皮下注射，脊髓施用，腦內(nèi)施用、肌肉注射，經(jīng)鼻腔施用，靜脈內(nèi)施用和/或 腹腔內(nèi)施用。[71]在第二方面，本公開內(nèi)容提供一種預(yù)防和/或治療疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象阿片類物質(zhì)和D-氨基酸氧化酶抑制劑。[72]具體來說，可以分開和/或一起施用阿片類物質(zhì)和D-氨基酸氧化酶抑制劑。此外，可以在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。[73]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述阿片類物質(zhì)選自以下一種或多種阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替啶、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多、其衍生物以及它們的任意混合物。[74]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。[75]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疼痛是急性疼痛和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。具體來說，例如所述疼痛可以選自以下一種或多種慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，慢性腰背痛，頭痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，叢集性頭痛，纖維肌痛綜合征，關(guān)節(jié)痛，炎性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，腫瘤疼痛，癌癥疼痛，內(nèi)臟痛，軀體痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，頸痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓損傷引起的疼痛，手術(shù)疼痛，術(shù)后疼痛，急性疼痛，或與感染、鐮狀細(xì)胞貧血、自身免疫病、多發(fā)性硬化或炎癥相關(guān)的疼痛，由損傷或手術(shù)造成的疼痛，糖尿病性神經(jīng)痛，外周神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛，腰或頸的神經(jīng)根痛，纖維肌痛，舌咽神經(jīng)痛，反射交感性營養(yǎng)不良，灼痛，丘腦綜合征，神經(jīng)根撕脫，幻肢痛，開胸術(shù)后的疼痛，癌癥，化學(xué)損傷，毒素，營養(yǎng)缺乏，病毒或細(xì)菌感染，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征，纖維肌痛綜合征，骨質(zhì)疏松，骨轉(zhuǎn)移或其他未知原因引起的骨痛，痛風(fēng)，纖維組織炎，肌筋膜痛，胸廓出口綜合征，上背部痛，下腰痛，骨盆痛，心臟性胸痛，非心臟性胸痛，脊髓損傷相關(guān)性疼痛，中樞性中風(fēng)后疼痛，癌癥痛，AIDS痛，抗腫瘤藥物致神經(jīng)疼痛，鐮狀細(xì)胞痛，老年痛，或它們的組合。[76]在第三方面，本公開內(nèi)容提供一種治療慢性疼痛尤其是癌癥疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。[77]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。[78]基于本公開內(nèi)容的上述發(fā)現(xiàn)，還提供一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步驟提供測試化合物，使所述測試化合物與D-氨基酸氧化酶相接觸，和測定所述D-氨基酸氧化酶的活性；如果所述測試化合物能夠抑制D-氨基酸氧化酶的活性，那么所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。例如，根據(jù)上述方法鑒定的化合物可用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受而使得其治療功效降低的病癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述病癥是疼痛，尤其是慢性疼痛。 [79]另一方面，本公開內(nèi)容還提供另一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步驟提供測試化合物和阿片類物質(zhì)，在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后向測試對(duì)象施用所述測試化合物，和測定施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)在測試對(duì)象中的活性；與未施用所述測試化合物和/或施用所述測試化合物之前的阿片類物質(zhì)活性相比較，如果在施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)活性水平增強(qiáng)，則所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。例如，根據(jù)上述方法鑒定的化合物可用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受而使得其治療功效降低的病癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述病癥是疼痛，尤其是慢性疼痛。[80]我們對(duì)這些D-氨基酸氧化酶抑制劑進(jìn)行體內(nèi)抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)脊髓和皮下給予D-氨基酸氧化酶抑制劑包括CBIO，AS057278和苯甲酸鈉能夠幾乎完全預(yù)防或逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受。[81]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說明，其不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本申請(qǐng)中所有引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包含文章參考、授權(quán)的專利、公開的專利申請(qǐng)和共同未決的專利申請(qǐng))均明確地通過引用并入本文。以下實(shí)施例中，若未具體指出，所用試劑和材料是能夠商業(yè)獲得的至少分析純或與此相當(dāng)級(jí)別的產(chǎn)品。實(shí)施例實(shí)施例I單次或連續(xù)7日皮下注射DAO抑制劑CBIO對(duì)嗎啡耐受作用的影響[82]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，自由飲水、進(jìn)食，分為10組，每組4只。3組小鼠分別皮下注射生理鹽水(10ml/kg)，每天兩次，連續(xù)7 天,第 8 天分別給予生理鹽水(10ml/kg)、CBIO (10mg/kg,來源于 Maybridge Chemicals,Cornwall, U.K.)或嗎啡(5mg/kg,來源于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)；2組小鼠分別皮下注射CBI0(10mg/kg)或嗎啡(10mg/kg),每天兩次,連續(xù)7天,第8天分別給予CBI0(10mg/kg)或嗎啡(5mg/kg) ;2組小鼠分別皮下注射CBI0(10mg/kg)或嗎啡(IOmg/kg)，每天兩次，連續(xù)7天,第8天分別給予嗎啡(5mg/kg)或CBIO (10mg/kg) ；2組小鼠分別皮下注射CBI0(10mg/kg)或CBI0(10mg/kg)+嗎啡(10mg/kg),每天兩次,連續(xù)7天，第8天分別給予生理鹽水(10ml/kg)或嗎啡(5mg/kg) ;1組小鼠皮下注射嗎啡(10mg/kg),每天兩次，連續(xù)7天(共14次)，第14次給藥同時(shí)給予CBI0(10mg/kg),第8天給予嗎啡(5mg/kg)。第8天給藥20分鐘后，小鼠右后足背注射IOiU 5%福爾馬林致痛，觀察福爾馬林注射后0-5分鐘(I相急性反應(yīng))和20-40分鐘(II相慢性反應(yīng))小鼠持續(xù)舔足時(shí)間作為疼痛指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖IA和IB所示，表明在7日連續(xù)皮下注射生理鹽水的對(duì)照小鼠中，單劑量注射嗎啡(5mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛均有抑制作用，抑制率分別為92. 7%和100%;單劑量注射CBI0(10mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛不影響，但能有效抑制小鼠福爾馬林II相慢性疼痛，抑制率為 64. 3% ;連續(xù)7日皮下注射CBI0(10mg/kg)不產(chǎn)生明顯耐受性，即連續(xù)7日給藥后單劑量注射CBI0(10mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛不影響，但仍能有效抑制福爾馬林II相慢性疼痛，抑制率為62. 8% ;連續(xù)7日皮下注射嗎啡產(chǎn)生明顯耐受性，即連續(xù)7日給藥后單劑量注射嗎啡(5mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為0%和20. 7% ;連續(xù)7日皮下注射CBI0(10mg/kg)，單劑量注射嗎啡(5mg/kg)能有效抑制福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛，抑制率分別為88. 4%和100%，說明CBIO對(duì)嗎啡不產(chǎn)生交叉耐受；連續(xù)7日皮下注射嗎啡(5mg/kg)，單劑量注射CBI0(10mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛不影響，能有效抑制福爾馬林II相慢性疼痛，抑制率為57. 1%，說明嗎啡對(duì)CBIO不產(chǎn)生交叉耐受；連續(xù)7日給予CBIO(IOmg/kg)不發(fā)生藥物蓄積，第8天不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；CBI0和嗎啡聯(lián)用7日后，能完全預(yù)防嗎啡產(chǎn)生的耐受作用，單劑量注射嗎啡對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為81. 5%和100% ;連續(xù)7日皮下注射嗎啡，第14次嗎啡后給予單劑量CBIO后，能完全逆轉(zhuǎn)嗎啡已產(chǎn)生的耐受，單劑量注射嗎啡對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為65. 7%和100%。結(jié)果表明，CBIO與嗎啡聯(lián)用，對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的耐受性均有預(yù)防作用，單劑量CBIO亦能完全逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受性。實(shí)施例2連續(xù)7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑AS057278和苯甲酸鈉對(duì)嗎啡耐受的預(yù)防作用[83]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，自由飲水、進(jìn)食，分為5組，每組4只。2組小鼠分別皮下注射生理鹽水(10ml/kg)，每天兩次，連續(xù)7天，第8天分別給予生理鹽水(10ml/kg)或嗎啡(5mg/kg) ;3組小鼠分別皮下注射嗎啡(IOmg/kg)、AS057278 (40mg/kg,來源于 Sigma-Aldrich, St Louis, MO)+嗎啡(10mg/kg)或苯甲酸鈉(400mg/kg,來源于國藥集團(tuán)，上海，中國)+嗎啡(10mg/kg),每天兩次,連續(xù)7天,第8天分別給予嗎啡(5mg/kg)。第8天給藥20分鐘后，小鼠右后足背注射10 u I 5%福爾馬林致痛，觀察福爾馬林注射后0-5分鐘(I相急性反應(yīng))和20-40分鐘(II相慢性反應(yīng))小鼠持續(xù)舔足時(shí)間作為疼痛指標(biāo)。如圖2A和2B所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在連續(xù)7日皮下注射生理鹽水的對(duì)照小鼠中，單劑量注射嗎啡(5mg/kg)對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛均有抑制作用，抑制率分別為84. 8%和100% ;連續(xù)7日皮下注射嗎啡產(chǎn)生明顯耐受性，單劑量注射嗎啡對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為12. 2%和12. 4% ；AS057278和嗎啡聯(lián)用7日后，能預(yù)防嗎啡耐受作用，單劑量注射嗎啡對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為76. 1%和100% ;同樣苯甲酸鈉和嗎啡聯(lián)用7日后，亦能預(yù)防嗎啡產(chǎn)生的耐受作用，單劑量注射嗎啡對(duì)福爾馬林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分別為69. 8%和89. 1%。結(jié)果表明，AS057278和苯甲酸鈉與嗎啡聯(lián)用，均能有效預(yù)防嗎啡鎮(zhèn)痛作用的耐受性。實(shí)施例3脊髓鞘內(nèi)單次注射0-氨基酸氧化酶抑制劑0810(301^)43057278(1001^)和苯甲酸鈉(300 iig)及活性氧(Reactive oxygen species, R0S)清除劑PBN(Img)對(duì)嗎啡耐受作用的影響[84]雄性Wistar大鼠(體重150_170g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，分為5組，每組4只。鞘內(nèi)注射嗎啡(50 u g/10 Ul/大鼠)，每天一次，連續(xù)5天，第5次注射同時(shí)分別給予生理鹽水(IOiil/大鼠)、CBI0(30ii g)、AS057278(100ii g)、苯甲酸鈉(300 u g)和活性氧(Reactiveoxygen species, R0S)清除劑PBN(Img),第6天分別給予嗎啡(5 ii g/10U I/大鼠)，30分鐘后大鼠右后足背注射50 ill 5%福爾馬林致痛，在福爾馬林注射后0-90分鐘間，每隔十分鐘觀察I分鐘內(nèi)大鼠抬腳或抖腳次數(shù)作為疼痛指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，大鼠鞘內(nèi)連續(xù)給予嗎啡(50 y g/10 Ul/大鼠)5天后產(chǎn)生明顯耐受性。脊髓鞘內(nèi)單劑量 給予 CBIO (30 u g)、AS057278 (100 y g)、苯甲酸鈉(300 u g)和 PBN(Img)，均能幾乎完全逆轉(zhuǎn)嗎啡已產(chǎn)生的耐受，即單劑量注射嗎啡對(duì)這些大鼠福爾馬林I相急性疼痛抑制率分別為70. 8%,69. 3%,79. 5%和 54. 3% ；11 相慢性疼痛的抑制率分別為 92. 6%,95. 6%,94. 9%和92. 3%。結(jié)果表明，單次脊髓鞘內(nèi)給予CBI0、AS057278、苯甲酸鈉和PBN能完全逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受性，說明D-氨基酸氧化酶抑制劑阻斷嗎啡耐受作用部位在脊髓。實(shí)施例4單劑量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO，AS057278和苯甲酸鈉立即逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受的量效關(guān)系，以及與抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性的相關(guān)性[85]根據(jù)D’ Aniello檢測D-氨基酸氧化酶純酶活性方法檢測不同濃度CBIO(0，
0.003,0. 01,0. 03,0. 1,0. 3,l,3uM)，AS057278 (0，0. 1,0. 3,1,3,10，100, 300 u M)和苯甲酸鈉(0，3，10，30，100，300，1000，3000，10000 u M)抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性作用，進(jìn)行量效關(guān)系研究，計(jì)算半數(shù)抑制量(IC50)和最大抑制率(Emax)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-氨基酸氧化酶抑制劑CBIO，AS057278和苯甲酸鈉均能100%抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性，IC50 分別為 I. 3，83. 5 和 290. 2 ii M(Gonget al.，JPET 336 :282-293, 2011)。[86]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，自由飲水、進(jìn)食，分為15組，每組4只。2組小鼠皮下注射生理鹽水(10ml/kg)，每天兩次，連續(xù)7天，第8天給藥前檢測小鼠甩尾和熱板疼痛閾值，然后給予生理鹽水(10ml/kg) ; 13組小鼠皮下注射嗎啡(10mg/kg),每天兩次,連續(xù)7天,第8天給藥前檢測小鼠甩尾和熱板疼痛閾值,然后分別給予 1、3 和 10mg/kg CBIO, 3,10 和 100mg/kg AS057278 以及 10、30、100 和 300mg/kg苯甲酸鈉。在給予生理鹽水或D-氨基酸氧化酶抑制劑15分鐘后，檢測所有小鼠甩尾和熱板疼痛閾值，再給予嗎啡(5mg/kg),分別于0. 5,1和2小時(shí)檢測小鼠甩尾和熱板疼痛閾值。比較各藥物不同劑量對(duì)小鼠甩尾和熱板疼痛的影響，并計(jì)算閾值凈值和2小時(shí)內(nèi)曲線下面積(AUC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，連續(xù)7日皮下注射嗎啡產(chǎn)生明顯耐受性，單劑量注射嗎啡對(duì)小鼠甩尾和熱板疼痛均不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；單劑量皮下注射CBI0，AS057278和苯甲酸鈉能劑量依賴式地逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受。量效關(guān)系分析表明CBI0，AS057278和苯甲酸鈉阻斷嗎啡耐受作用的最大阻斷率均可達(dá)100%，其ED50在小鼠甩尾疼痛模型中分別為I. 0,2. 5和40. 5mg/kg，在小鼠熱板疼痛模型中分別為I. 1,7. 4和50. 4mg/kg(圖5A和圖5B)。進(jìn)一步分析表明，CBIO，AS057278和苯甲酸鈉在小鼠甩尾和熱板疼痛模型中抑制嗎啡產(chǎn)生耐受性的作用與其抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性呈正性相關(guān)(圖5C和圖5D)。結(jié)果表明，單劑量給予D-氨基酸氧化酶抑制劑(CBI0，AS057278和苯甲酸鈉)均能立即有效逆轉(zhuǎn)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性，并與D-氨基酸氧化酶活性抑制作用呈正性相關(guān)。實(shí)施例5骨癌痛模型的建立[87]復(fù)蘇Sprague Dawley大鼠乳腺癌Walker 256細(xì)胞(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院)，使用RPMI 1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，在5% C02、37°C條件下培養(yǎng)。待其生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)收集，用無菌磷酸緩沖液洗滌2次、計(jì)數(shù)，調(diào)整密度在I X 107個(gè)/ml。以Walker256細(xì)胞腹腔接種幼年^0_80g)雌性Sprague Dawley大鼠制備腹水瘤細(xì)胞，以0. 5ml/只的劑量接種。6-7天后接種的Sprague Dawley大鼠出現(xiàn)明顯的腹水癥狀,抽取含有Walker256細(xì)胞的腹水并提取腫瘤細(xì)胞。用無菌磷酸緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度在8X 107個(gè)/ml，冰上放置備用。 [88] Sprague Dawley雌性大鼠(150_180g,上海斯菜克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)用戍巴比妥鈉(50mg/kg, i. p.)麻醉,在距胚骨頭下0. 5cm處沿胚骨方向上下暴漏胚骨并鉆孔。鉆孔時(shí)不損壞對(duì)側(cè)脛骨骨髓腔面。然后換用滅菌的25 u I微量注射器將5 u I準(zhǔn)備好的上述Walker 256細(xì)胞懸液注射到骨髓腔內(nèi)，用無菌骨臘封孔，以免細(xì)胞外漏。右側(cè)脛骨注射磷酸緩沖液作對(duì)照，其它操作痛左側(cè)。術(shù)后將動(dòng)物放置37°C恒溫墊上復(fù)溫，待其蘇醒后，放回動(dòng)物房飼養(yǎng)。于術(shù)前及術(shù)后第5，10，15，20，25，32天檢測機(jī)械性痛覺閾值和熱輻射痛覺閾值。[89]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，手術(shù)后第10天大鼠骨癌側(cè)機(jī)械性痛覺閾值開始降低，15天時(shí)，痛閾降低至Sg左右m ;而熱輻射痛覺閾值在整個(gè)檢測過程中沒有顯著的變化(6B)。本研究隨后采用機(jī)械性痛覺閾值作為大鼠骨癌痛模型指標(biāo)。實(shí)施例6單次或連續(xù)I日皮下注射DAO抑制劑CBIO對(duì)骨癌痛大鼠嗎啡耐受作用的影響[90]選取造模成功的骨癌痛大鼠(200_220g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)，自由飲水、進(jìn)食，分為4組，每組6只。大鼠分別皮下注射生理鹽水(lml/kg)、CBIO(10mg/kg,來源于 Maybridge Chemicals, Cornwall, U. K.)、嗎啡(5mg/kg,來源于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)或CBI0(10mg/kg) +嗎啡(5mg/kg),每天兩次,連續(xù)7天，于第一天給藥前以及每天給藥后I小時(shí)檢測大鼠患側(cè)足機(jī)械性痛閾的變化。第8天分別皮下給予各組大鼠嗎啡(5mg/kg)，于給藥前及給藥后I小時(shí)檢測大鼠患側(cè)足機(jī)械性痛閾的變化。[91]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7A和7B所示，表明在7日連續(xù)皮下注射生理鹽水的對(duì)照大鼠中，連續(xù)7日皮下注射CBI0(10mg/kg)不產(chǎn)生明顯耐受性，連續(xù)7日給藥后單劑量注射嗎啡(5mg/kg)產(chǎn)生較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用，即CBIO對(duì)嗎啡在骨癌痛大鼠不產(chǎn)生交叉耐受；連續(xù)7日皮下注射嗎啡產(chǎn)生明顯耐受性，即連續(xù)7日給藥后單劑量注射嗎啡(5mg/kg)對(duì)骨癌痛大鼠不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用；CBI0和嗎啡聯(lián)用7日后，能完全預(yù)防嗎啡產(chǎn)生的耐受作用，第8天單劑量注射嗎啡對(duì)骨癌痛大鼠產(chǎn)生較強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果表明，CBIO與嗎啡聯(lián)用，對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的耐受性有預(yù)防作用。
實(shí)施例7 CBIO對(duì)大鼠神經(jīng)源性疼痛的影響
雄性Wistar大鼠(體重150_170g)，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3天。用戊巴比妥(i. p.，50mg/kg)麻醉大鼠。在髂骨位置脊髓插入PE-10導(dǎo)管到要脊髓膨大處，并對(duì)大鼠左側(cè)進(jìn)行L5/6脊神經(jīng)結(jié)扎。[92]待大鼠恢復(fù)3-7天后，使用IITC CE220檢測大鼠左側(cè)腳掌機(jī)械性痛覺閾值；挑選左側(cè)機(jī)械性痛覺閾值< Sg的大鼠，為造模成功的大鼠。并對(duì)大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為Vehicle組(50% DMSO生理鹽水，10 yl/大鼠)和CBIO (60 y g/大鼠)組，每組4只。此外兩組大鼠Vehicle組(70% DMSO生理鹽水，10 iil/ 大鼠)和CBIO (100 y g/大鼠)組，每組4只。給藥后，分別在0. 5、1、2和4小時(shí)檢測大鼠左側(cè)機(jī)械性痛覺閾值。[93]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，CBIO無論60 ii g(圖8A)或IOOyg(圖8B)對(duì)大鼠神經(jīng)源性疼痛均無明顯鎮(zhèn)痛作用。專利申請(qǐng)公開(WO 2005/089753A2 ；US2005/0143434A1)描述了 CBIO的化學(xué)結(jié)構(gòu)，專利申請(qǐng)公開US 2005/0143434A1同時(shí)披露了D-型氨基酸氧化酶抑制劑治療神經(jīng)源性疼痛，但未提供具體實(shí)施例。出乎意料之外，我們證明給予CBIO對(duì)神經(jīng)源性疼痛治療無效。[94]在上述意外發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步研究了 CBIO對(duì)疼痛的作用。[95]通過皮下注射研究了 CBIO對(duì)大鼠蜜蜂毒疼痛模型中引起的自發(fā)痛和機(jī)械痛的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮下注射CBI0(10mg/kg)后,大鼠蜜蜂毒誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)與生理鹽水基本保持一致，4小時(shí)時(shí)機(jī)械疼痛達(dá)到峰值，而后逐漸恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CBIO對(duì)蜜蜂毒誘發(fā)的機(jī)械痛敏沒有抑制作用。[96]在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，角叉菜膠模型大鼠給予嗎啡后
0.5小時(shí)鎮(zhèn)痛作用較明顯，且致痛足與對(duì)照足痛閾值均顯著升高，說明嗎啡有鎮(zhèn)痛作用，隨著時(shí)間的延長，其鎮(zhèn)痛作用減弱，兩小時(shí)后鎮(zhèn)痛作用消失。而CBIO組大鼠痛閾值隨著時(shí)間的延長與生理鹽水組大鼠基本保持一致，說明CBIO對(duì)角叉菜膠引起Wistar大鼠痛覺超敏反應(yīng)沒有影響。[97]此外，在皮下注射CBIO對(duì)小鼠醋酸扭體疼痛模型中發(fā)現(xiàn)，嗎啡能有效降低小鼠腹腔注射醋酸所致的內(nèi)臟疼痛，而CBIO (皮下或尾靜脈注射)對(duì)小鼠腹腔注射醋酸所致的內(nèi)臟疼痛亦無明顯的鎮(zhèn)痛作用。[98]在另外的研究中還發(fā)現(xiàn)，CBIO對(duì)小鼠腹腔注射醋酸所致的內(nèi)臟疼痛亦無明顯的鎮(zhèn)痛作用，CBIO對(duì)小鼠熱水甩尾實(shí)驗(yàn)和熱板實(shí)驗(yàn)的痛閾值無明顯影響，CBIO對(duì)急性疼痛也沒有顯著影響。[99]根據(jù)以上結(jié)果分析，DAO氧化酶抑制劑對(duì)疼痛(如慢性疼痛和急性疼痛)并不具有一致的作用。實(shí)施例8骨癌痛大鼠脊髓性狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP mRNA表達(dá)的變化
將Sprague Dawley大鼠分為兩組(n = 5-6)進(jìn)行手術(shù)，一組在左側(cè)脛骨注射磷酸緩沖液作為對(duì)照組，另一組給左側(cè)脛骨注射Walker256細(xì)胞。手術(shù)后第18天選取造模成功的骨癌痛大鼠，檢測PWT值。大鼠斷頭處死后，取出脊髓腰膨大部位，放入準(zhǔn)備好的
1.5ml離心管中，并標(biāo)記。按照IOOmg組織加入Iml Trizol試劑,加入相應(yīng)體積的Trizol試劑。檢測0D260/0D280和核酸電泳檢測提取的RNA質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄酶，在相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄條件下，將IygS RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的CDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參。用熒光定量PCR檢測對(duì)照組與骨癌痛大鼠脊髓性狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP mRNA表達(dá)的變化。
結(jié)果(圖9)表明GFAP (星狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白)基因mRNA表達(dá)量顯著升高(70% ) (P < 0. 05)，提示膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤自發(fā)痛中被激活。實(shí)施例9骨癌痛大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶mRNA和蛋白表達(dá)的變化
將Sprague Dawley大鼠分為兩組(n = 5-6)進(jìn)行手術(shù)，一組在左側(cè)脛骨注射磷酸緩沖液作為對(duì)照組，另一組給左側(cè)脛骨注射Walker256細(xì)胞。手術(shù)后第18天選取造模成功的骨癌痛大鼠，檢測PWT值。大鼠斷頭處死后，取出脊髓腰膨大部位，放入準(zhǔn)備好的
I.5ml離心管中，并標(biāo)記。按照IOOmg組織加入Iml Trizol試劑,加入相應(yīng)體積的Trizol試劑。檢測0D260/0D280和核酸電泳檢測提取的RNA質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄酶，在相應(yīng)的逆轉(zhuǎn) 錄條件下，將I U g總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參。用熒光定量PCR檢測對(duì)照組與骨癌痛大鼠脊髓目的基因D-氨基酸氧化酶的表達(dá)量的變化情況，用2-A ACt方法計(jì)算目的基因D-氨基酸氧化酶的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖IOB所示，脊髓D-氨基酸氧化酶基因mRNA表達(dá)量降低(20% ) (P < 0. 05)。
將Sprague Dawley大鼠分為兩組(n = 5-6)進(jìn)行手術(shù),一組在左側(cè)胚骨注射磷酸緩沖液作為對(duì)照組，另一組給左側(cè)脛骨注射Walker256細(xì)胞。手術(shù)后第18天選取造模 成功的骨癌痛大鼠。迅速斷頭處死大鼠，取脊髓腰膨大部位，按照20mg組織加入150 Ul裂解液，用勻漿器將組織勻漿，40C I, OOOrpm離心，取上清，加入等體積的上樣buffer，加熱煮沸5分鐘，進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜，室溫封閉I小時(shí)，一抗孵育(I 500)2小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌3次，10分鐘/次；二抗孵育(I 1000) I小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌3次，10分鐘/次；TAB顯色。進(jìn)行光密度掃描。
結(jié)果顯示如圖10C，骨癌痛組大鼠比對(duì)照組大鼠D-氨基酸氧化酶蛋白表達(dá)水平顯著降低。上述結(jié)果表明，骨癌疼痛造成脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化，同時(shí)下調(diào)脊髓DAO基因和蛋白表達(dá)。此結(jié)果與前期研究結(jié)果相反，后者證明脊髓神經(jīng)結(jié)扎可引起神經(jīng)源性疼痛，并上調(diào)D-氣基酸氧化酶水平(Zhao et al.，2010)。實(shí)施例10皮下注射CBIO對(duì)大鼠骨癌痛模型的抑制作用
選取造模成功的骨癌痛大鼠，分7組生理鹽水(10ml/kg)，l，3，10，30，100mg/kg CBIO劑量組(n = 5-6),嗎啡組(n = 3)。皮下給藥,檢測給藥前及給藥后0. 5,I，2，4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械性痛閾的變化。檢測的機(jī)械性痛閾呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，皮下注射CBIO不影響大鼠正常肢體機(jī)械性痛覺閾值(圖11A)，但抑制患側(cè)足機(jī)械性痛覺閾值，I小時(shí)時(shí)達(dá)到最高峰，2小時(shí)時(shí)鎮(zhèn)痛作用降低，4小時(shí)時(shí)機(jī)械性痛閾降低至初始值范圍(圖11B);并且CBIO呈劑量依賴式抑制骨癌痛痛覺超敏，最大抑制率Emax為45. 5%, ED50為8mg/kg(圖11C)。實(shí)施例11脊髓注射CBIO對(duì)大鼠骨癌痛模型的抑制作用
選取造模成功的骨癌痛大鼠，分4組生理鹽水(IOiil/大鼠)，l，3，10iig/大鼠CBIO劑量組(n = 6)。脊髓給藥，檢測給藥前及給藥后0. 5，1，2，4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械性痛閾的變化。[10]如圖12所示，鞘內(nèi)注射CBIO不影響大鼠正常肢體機(jī)械性痛覺閾值(圖12A)，但抑制患側(cè)足機(jī)械性痛覺閾值，0. 5小時(shí)時(shí)，CBIO已發(fā)揮作用，I小時(shí)時(shí)達(dá)到最高峰，2小時(shí)時(shí)鎮(zhèn)痛作用降低，4小時(shí)時(shí)機(jī)械性痛閾降低至初始值范圍(圖12B);并且CBIO鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴式，Emax和
[11]專利申請(qǐng)公開(WO 2005/089753A2 ；US 2005/0143434A1)描述了 CBIO 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，專利申請(qǐng)公開US 2005/0143434A1同時(shí)披露了 D-氨基酸氧化酶抑制劑治療神經(jīng)源性疼痛，但未提供具體實(shí)施例。但出乎意料之外我們證明給予全身或脊髓給予CBIO對(duì)福爾馬林慢性疼痛和腫瘤疼痛有效(最大抑制率達(dá)45-65%)，但對(duì)神經(jīng)源性疼痛治療無效(見實(shí)施例 7)。福爾馬林慢性疼痛(Coderre et al. Pain 54 :43-50,1993 ;Jett etal. Pain69 :161-169,1997)，神經(jīng)源性疼痛(Jett et al. Pain 69 :161-169，1997)和腫瘤疼痛(Yanagisawa et al. Mol Pain 2010 ;6 :38_50，2010)都涉及到中樞敏感化，但 CBIO對(duì)慢性疼痛和腫瘤疼痛與神經(jīng)源性疼痛具有不同作用難以用此機(jī)制解釋，但可能與我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)源性疼痛能誘導(dǎo)脊髓DAO表達(dá)升高(Zhao et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332 248-254，2010)，而腫瘤疼痛模型中脊髓DAO表達(dá)降低有關(guān)。[12]本發(fā)明已通過各個(gè)具體實(shí)施例作了舉例說明。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明并不限于各個(gè)具體實(shí)施方式
，普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以作出各種改動(dòng)或變型，而仍不背離本發(fā)明的精神和范圍。這樣的改動(dòng)和變型均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述方法用于預(yù)防和/或治療因阿片耐受使得其治療功效降低的病癥。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述病癥是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8, Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)象表現(xiàn)出對(duì)選自以下一種或多種阿片類物質(zhì)的耐受阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、 二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻 丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替唳、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定和曲馬多。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。
7.一種預(yù)防和/或治療疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象分開和/或一起施用阿片類物質(zhì)和D-氨基酸氧化酶抑制劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制劑。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述阿片類物質(zhì)選自以下一種或多種阿芬太尼、烯丙羅定、阿法羅定、阿尼利定、芐嗎啡、苯腈米特、丁丙諾啡、布托啡諾、氯尼他秦、可待因、去氧嗎啡、右嗎拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氫可待因、二氫嗎啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、嗎苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基嗎啡、乙氧硝唑、埃托啡、雙氫埃托啡、芬太尼及衍生物，二氫可待因酮、氫嗎啡酮、羥哌替唆、異美沙酮、凱托米酮、左啡烷、左芬啡烷、羅芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氫甲嗎啡酮、嗎啡、麥羅啡、narceine、尼可嗎啡、羥啡烷、去甲美沙酮、烯丙嗎啡、納布啡、去甲嗎啡、諾匹哌酮、阿片、羥可待酮、羥嗎啡酮、阿片金堿、噴他佐辛、苯嗎庚酮、羥苯乙嗎喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米諾定、氰苯雙哌酰胺、propheptazine、三甲利定、異丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲馬多以及它們的任意混合物。
10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8, Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。
11 權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述疼痛是急性疼痛和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌癥疼痛。
12.權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述疼痛選自慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，慢性腰背痛，頭痛，偏頭痛，三叉神經(jīng)痛，叢集性頭痛，纖維肌痛綜合征，關(guān)節(jié)痛，炎性疼痛，關(guān)節(jié)炎疼痛，骨關(guān)節(jié)炎疼痛，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛，腫瘤疼痛，癌癥疼痛，內(nèi)臟痛，軀體痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，頸痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓損傷引起的疼痛，手術(shù)疼痛，術(shù)后疼痛，急性疼痛，或與感染、鐮狀細(xì)胞貧血、自身免疫病、多發(fā)性硬化或炎癥相關(guān)的疼痛，由損傷或手術(shù)造成的疼痛，糖尿病性神經(jīng)痛，外周神經(jīng)痛，皰疹后神經(jīng)痛，腰或頸的神經(jīng)根痛，纖維肌痛，舌咽神經(jīng)痛，反射交感性營養(yǎng)不良，灼痛，丘腦綜合征，神經(jīng)根撕脫，幻肢痛，開胸術(shù)后的疼痛，癌癥，化學(xué)損傷，毒素，營養(yǎng)缺乏，病毒或細(xì)菌感染，顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征，纖維肌痛綜合征，骨質(zhì)疏松，骨轉(zhuǎn)移或其他未知原因引起的骨痛，痛風(fēng)，纖維組織炎，肌筋膜痛，胸廓出口綜合征，上背部痛，下腰痛，骨盆痛，心臟性胸痛，非心臟性胸痛，脊髓損傷相關(guān)性疼痛，中樞性中風(fēng)后疼痛，癌癥痛，AIDS痛，抗腫瘤藥物致神經(jīng)疼痛，鐮狀細(xì)胞痛，老年痛，或它們的組合。
13.一種治療慢性疼痛尤其是癌癥疼痛的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶抑制劑選自以下一種或多種CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸鈉及其衍生物。
15.一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括 提供測試化合物， 使所述測試化合物與D-氨基酸氧化酶相接觸，和 測定所述D-氨基酸氧化酶的活性， 如果所述測試化合物能夠抑制D-氨基酸氧化酶的活性，那么所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。
16.一種鑒定能夠預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法，其包括 提供測試化合物和阿片類物質(zhì)， 在施用阿片類物質(zhì)之前、同時(shí)和/或之后向測試對(duì)象施用所述測試化合物，和 測定施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)在測試對(duì)象中的活性， 與未施用所述測試化合物和/或施用所述測試化合物之前的阿片類物質(zhì)活性相比較，如果在施用所述測試化合物之后所述阿片類物質(zhì)活性水平增強(qiáng)，則所述測試化合物可用作預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物。
全文摘要
本文提供了用于預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的D-氨基酸氧化酶抑制劑，以及使用D-氨基酸氧化酶抑制劑來預(yù)防或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的方法，還提供了使用D-氨基酸氧化酶抑制劑來預(yù)防和/或治療疼痛的方法，以及鑒定預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)阿片耐受的化合物的方法。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102727896SQ201110094219
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者王永祥, 黃金路, 龔念 申請(qǐng)人:王永祥