專利名稱：一種牛初乳提取物及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛初乳提取物及其提取方法和應(yīng)用，具體涉及一種富含 Mir-30a-5p微囊泡的牛初乳提取物及其提取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是危害人類健康和生命的頭號(hào)殺手。近年來(lái)，全球新增癌癥病例逐年上升，目前達(dá)到1200萬(wàn)例，中國(guó)內(nèi)地每年新增癌癥患者近200萬(wàn)，死亡約150萬(wàn)，目前發(fā)病率以每年 2. 5%的速度增加。盡管人類經(jīng)過(guò)了無(wú)數(shù)的努力試圖攻克癌癥這一頑癥，但即使在發(fā)達(dá)的國(guó)家，癌癥的治愈率也僅為45% 50%，發(fā)展中的國(guó)家癌癥治愈率更低。相當(dāng)多的癌癥晚期患者處在無(wú)休止地手術(shù)、放療、化療中，不但增加了患者們痛苦，還使患者家屬勞民傷財(cái)，使他們背負(fù)了沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前治療癌癥的方法主要是手術(shù)摘除、放射治療和化學(xué)治療三種方式。但手術(shù)治療難免破壞正常組織，威脅生命或造成畸型或功能喪失。放射治療對(duì)擴(kuò)散或侵潤(rùn)廣泛的癌癥達(dá)不到治療效果，而且放射治療時(shí)高劑量射線在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也損傷了正常細(xì)胞。 化療藥物毒副作用較大，造成患者惡心、嘔吐、脫發(fā)、白細(xì)胞減少、不育等?；煴旧硪彩钦T發(fā)腫瘤的一個(gè)因素。臨床實(shí)踐證明，大劑量放、化療只能導(dǎo)致虛弱的生命更加垂危，加速患者死亡。順鉬(DDP)是癌癥化療藥物中的一種，具有抗瘤譜廣、作用強(qiáng)、無(wú)交叉耐藥，可與其他藥物聯(lián)合，廣泛用于多種癌癥的治療，而且價(jià)格便宜。它是一種無(wú)機(jī)鉬的金屬絡(luò)合物， 含一個(gè)二價(jià)鉬及兩個(gè)氨分子和兩個(gè)氯原子，類似于雙功能烷化劑，可與DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA功能，阻止DNA復(fù)制，為細(xì)胞周期非特異性藥物。腫瘤對(duì)化療和放療的耐受機(jī)制與癌細(xì)胞在不利環(huán)境下自吞噬有關(guān)。癌細(xì)胞在抗癌藥物和放射刺激下，可通過(guò)吞噬自身的一部分機(jī)體作為營(yíng)養(yǎng)度過(guò)暫時(shí)的不利環(huán)境以求得繼續(xù)生存。一旦停止用藥或化療，這些癌細(xì)胞又可恢復(fù)惡性增生能力，導(dǎo)致病癥復(fù)發(fā)。癌細(xì)胞的自吞噬生存機(jī)制對(duì)放療和化療效果不利。抑制癌細(xì)胞自吞噬，促進(jìn)其凋亡，是提高藥物療效，增進(jìn)患者康復(fù)的重要課題。癌細(xì)胞自吞噬受Beclin 1基因調(diào)節(jié)，beclin 1表達(dá)增高可促進(jìn)細(xì)胞自吞噬。 Beclin 1基因受到抑制，則會(huì)引起細(xì)胞自吞噬水平降低，從而抑制癌細(xì)胞和腫瘤以自噬的方式繼續(xù)存活，促進(jìn)腫瘤組織消亡或癌細(xì)胞凋亡，增進(jìn)患者康復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種牛初乳提取物。本發(fā)明的另一目的是提供從牛奶中提取分離該牛初乳提取物的方法。本發(fā)明的又一目的是提供該牛初乳提取物的應(yīng)用。 一種牛初乳提取物，該提取物含有序列為SEQ ID NO. 1 (UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)
3的Mir-30a-5p微囊泡。其中，所述的牛初乳提取物通過(guò)如下方法獲得將牛初乳以5000Xg離心30分鐘后取中層液，再依次以12000 X g,35000 X g、70000 X g、110000 X g離心力，取上一次離心所得的中層液作為下一次離心的原液各離心1小時(shí)，最后得到的IlOOOOXg離心中層液即為所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳為乳牛分娩后最初3日內(nèi)所擠的乳汁。一種提取所述的牛初乳提取物的方法將牛初乳以5000Xg離心30分鐘后取中層液，再依次以12000Xg,35000Xg、70000XgU 10000Xg離心力，取上一次離心所得的中層液作為下一次離心的原液各離心1小時(shí)，最后得到的IlOOOOXg離心中層液即為所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳為乳牛分娩后最初3日內(nèi)所擠的乳汁。所述的牛初乳提取物在制備治療各種癌癥的藥物中的應(yīng)用。所述的癌癥為乳腺癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病、肺癌、肝癌、腎癌、食道癌、卵巢癌、 直腸癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、鼻咽癌或腦瘤等。有益效果發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)牛初乳中含有豐富的Mir-3a-5p，是牛成乳中的6 8倍。并從牛初乳中分離到富含Mir-30a-5p微囊泡的提取物。使用該牛初乳提取物處理順鉬化療后的癌細(xì)胞，可增加癌細(xì)胞中的Mir-30a-5p，而細(xì)胞自源性I^re Mir-30a變化不大，吞噬相關(guān)基因Beclin-I表達(dá)降低，抑制癌細(xì)胞依賴自吞噬而繼續(xù)生存，自噬泡減少，自噬泡相關(guān)蛋白 LC3-II降低，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本發(fā)明所需的牛初乳獲得容易，所需設(shè)備簡(jiǎn)易，僅需高速離心機(jī)和超速離心機(jī)，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，效果顯著。


圖1. Solexa分析牛初乳和牛成乳中micro RNA的含量。括號(hào)圈住的為mir-30a_5p。圖2. Q-PCR驗(yàn)證牛初乳和成乳中mir-30a_5p的含量。圖3.牛初乳各離心組分中的Mir-30a-5p含量比較。comp為未做組分分離的牛初乳，5kg代表離心力5000 X g，12kg代表離心力 12000 X g, 35kg代表離心力35000 X g, 70kg代表離心力70000 X g, 1 IOkg代表離心力 IlOOOOXg, up代表上層，mid代表中層，sed代表沉淀。圖4.從牛初乳IlOOOOXg離心中層液中分離到的微囊泡，A 掃描電鏡圖；B 透射電鏡圖。圖5.用牛乳IlOOOOXg離心中層液轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后癌細(xì)胞中的Mir-30a-5p含
量比較。圖6.用牛乳110000 Xg離心中層液轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后癌細(xì)胞中的pre Mir-30a_5p
含量比較。圖7.牛乳IlOOOOXg離心中層液處理后的Hela癌細(xì)胞中Beclin-I水平比較。圖8.牛乳IlOOOOXg離心中層液抑制順鉬化療過(guò)的Hela癌細(xì)胞自吞噬形成自噬泡數(shù)量比較。A 順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞加入牛乳IlOkXg離心組分后自吞噬泡數(shù)量的影響；B:順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞加入牛乳IlOkX g離心組分后自吞噬泡數(shù)量的變化；圖9.牛乳IlOOOOXg離心中層液處理順鉬化療過(guò)的Hela癌細(xì)胞，自噬體標(biāo)志蛋白LC3-II/LC3-I的比例比較。A 順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞在加入牛乳IlOkX g離心組分后LC3-II/LC3-I的變化；B 順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞在加入牛乳IlOkX g離心組分后LC3-II/LC3-I比值的變化。圖10.牛乳IlOOOOXg離心中層液促進(jìn)Hela癌細(xì)胞凋亡效果比較。A 牛乳IlOkXg離心中層液對(duì)順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞凋亡率的影響；B 順鉬化療后的Hela癌細(xì)胞加入牛乳IlOkX g離心中層液后凋亡率的變化。上述圖5 10 中 FBS 胎牛血清；DDP 順鉬；Anti 含 mir-30a_5p inhibitor 的脂質(zhì)體；MMV 牛成乳110000Xg離心所得中層液；CMV 牛初乳110000Xg離心所得中層液。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1. Solexa測(cè)量牛初乳與牛成乳中的micro RNA取Iml牛初乳與牛成乳分別加入15ml離心管，分別加入3ml苯酚混勻后各加 Iml氯仿混勻，以12000Xg離心lOmin，取上清液，各加Iml異丙醇混勻后，放在_20°C沉淀lh，再以12000Xg離心lOmin，棄上清，往沉淀中加入75%乙醇-DEPC水1ml，混勻后以 12000 Xg離心lOmin，棄上清，敞口置室溫直至管內(nèi)液體揮發(fā)干凈，加入20 μ 1 DEPC水溶解，各取適量牛初乳和牛成乳提取總RNA作Solexa測(cè)試和Q-PCR，測(cè)試其中所含的micro RNA及相應(yīng)含量。利用OligodT的beads富集總RNA樣本中mirRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄-PCR 反應(yīng)體系DEPC 7jC 4. 5 μ 1 ；5 XAMV buffer 2 μ 1 ；AMV 0. 5 μ 1 ；dNTP mixture 1 μ 1 ;RT Primer 1 μ 1 (SEQ ID NO. 2 5' GCAATTCAGTTGAGCACAAGACTGACCTTC 3' ) ；RNA 1μ 1。逆轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)程序:16°C 30分鐘，42°C 60分鐘，85°C 5分鐘，4°C保溫，直至取出。Solexa 測(cè)試(Illumina Digital Gene Expression 試劑盒)1)采用4堿基識(shí)別酶DpnII酶切雙鏈cDNA，鏈接Illumina adapter 1 ；2)利用MmeI酶切3，端20堿基，并在3，端鏈接Illumina adapter2 ；再加入Primer GXl和Primer GX2,進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序 980C 10 秒，60°C 30 秒，72°C 15 秒，72°C 10 分鐘；3)擴(kuò)增后樣本通過(guò)6% TBE PAGE膠回收85堿基條帶，純化后通過(guò)Illumina基因表達(dá)測(cè)序法測(cè)序。Q-PCR 反應(yīng)體系:DEPC 水 12 μ 1，10 X buffer (不含 MgCl2) 2 μ 1，MgCl2L 7 μ 1， dNTPmixture 0. 4μ 1, rTAQ 0. 3 μ 1，引物 0. 3 μ 1 (SEQ ID NO. 3 :5，CTGACCTTC 3，)，cDNA 3. 3 μ 1。
Q-PCR反應(yīng)程序①95°C 5分鐘，②95°C 15秒，③60°C 30秒，③重復(fù)40次循環(huán)。Solexa結(jié)果見(jiàn)圖1，Solexa分析表明牛初乳中mir-30a-5p的含量是牛成乳中的 6. 5倍。Q-PCR驗(yàn)證牛初乳中的mir-30a-5p含量是牛成乳中的8倍(圖2)。實(shí)施例2.牛初乳離心分離液和微囊泡的獲得將牛初乳與牛成乳各均分成六管，每組先預(yù)留1管未做組分分離的牛乳作對(duì)照；其余五管均以5000Xg離心30分鐘，取1份離心后的牛成乳與牛初乳，將各自的上層，中層和沉淀保存；余下的四管牛初乳、牛成乳均取中層液，再以12000Xg離心1小時(shí)，取離心后的牛初乳、牛成乳各一管，小心取出上、中、下層保留；其余三管牛初乳、牛成乳均取中層液，以35000Xg離心1小時(shí)，保留一管中的上、 中、下層；剩余二管的中層液用70000Xg離心1小時(shí)，將其中一管中的上、中、下層分別保存；牛初乳和牛成乳最后剩余的一管再以IlOOOOXg離心1小時(shí)后，將分層的上、中、 下組分分開(kāi)收集，其中的中層液即為下文所稱的IlOOOOXg離心中層液。以上各轉(zhuǎn)速下所得的上層，中層液和沉淀組分以及未做組分分離的牛初乳測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，取含ι μ g蛋白質(zhì)的上述各組分均抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，做定量實(shí)時(shí)PCR，測(cè)量這些組分中Mir-30a-5p的含量。結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可見(jiàn)等蛋白量條件下(1微克)，牛初乳差速離心分離所得各組分中以IlOOOOXg離心得到的中層液所含的mir-30a-5p最高。將IlOOOOXg離心得到的中層液固定脫水干燥，鍍金后在掃描電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4A，可看到微囊泡，直徑在30nm 300nm ；負(fù)染后在透射電鏡下觀察可見(jiàn)囊泡內(nèi)有可著色成分(圖4B)。實(shí)施例3.檢測(cè)對(duì)比初牛乳IlOOOOXg離心中層液對(duì)化療后癌細(xì)胞自吞噬的抑制以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，并與牛成乳相同成分的效果比較。 用含順鉬(30ng/ml)的5 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))6h，然后加入實(shí)施例2制備的初牛乳和成牛乳IlOOOOXg離心所得中層液(含蛋白量100yg/ml)培養(yǎng)細(xì)胞14h后，與光加順鉬、小牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)、加牛乳IlOOOOXg離心中層液同時(shí)加mir-30a-5p inhibitor(SEQ ID NO. 4 CUUCCAGUCGAUGUUUACA)脂質(zhì)體培養(yǎng)的癌細(xì)胞對(duì)比，比較各組細(xì)胞凋亡比率，自吞噬標(biāo)志蛋白Beclin-I的含量變化，每個(gè)細(xì)胞中平均自吞泡的個(gè)數(shù)，自吞泡標(biāo)志蛋白LC3 II/LC3 I的比值，以及mir-30a-5p含量。3. 1取含蛋白量IOOyg的牛初乳和牛成乳IlOOOOXg離心中層液加入Iml含 30ng/ml順鉬(DDP)的5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的Hela細(xì)胞14小時(shí)后，Q-PCR測(cè)得初牛乳IlOOOOXg離心中層液可顯著提高細(xì)胞中Mir-30a-5p含量，而細(xì)胞自源性pre Mir-30a-5p差異不大，說(shuō)明細(xì)胞中升高的mir-30a-5p來(lái)源于牛奶離心中層液(圖5、圖6)。3. 2將上述培養(yǎng)Mi的Hela細(xì)胞用培養(yǎng)基洗三遍，用胰酶消化3分鐘，轉(zhuǎn)入離心管 1700rpm離心5分鐘，去除上清，加入100微升RIPA lysis (碧云天公司)裂解細(xì)胞30分鐘， 然后以12000Xg離心10分鐘，去沉淀，測(cè)蛋白濃度后，加入蛋白上樣液100°C煮5分鐘，然后上SDS-凝膠電泳80V，300mA轉(zhuǎn)膜90分鐘，牛奶封閉lh，用兔抗人Beclin-I免疫球蛋白(一抗)(Abeam公司)孵育過(guò)夜，洗凈多余的一抗，再以羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam 公司)孵育lh，洗凈多余的二抗，在暗室曝光，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果可見(jiàn)Hela癌細(xì)胞經(jīng)順鉬化療后，自吞噬相關(guān)基因Beclin-I表達(dá)增加；加入含Mir_30a_5p的牛初乳110000 X g離心中層液則抑制beclin-Ι基因表達(dá)其蛋白；牛成乳IlOOOOXg離心中層液對(duì)細(xì)胞beclin-Ι基因表達(dá)的抑制效果不明顯。3. 3將培養(yǎng)他的貼壁細(xì)胞用純甲醇固定lh，然后用PBS洗三遍，用兔抗人LC3免疫球蛋白(一抗)(Abeam公司)孵育池，用PBS洗去游離的一抗，孵以FITC標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam公司)，室溫Ih后，用PBS洗凈多余的二抗，在熒光顯微鏡下觀察，拍照，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明牛初乳IlOOOOXg離心中層液可抑制順鉬化療過(guò)的Hela癌細(xì)胞自吞噬形成自噬泡，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞依賴自吞噬而繼續(xù)生存。3. 4將上述培養(yǎng)Mi的Hela細(xì)胞用培養(yǎng)基洗三遍，用胰酶消化3分鐘，轉(zhuǎn)入離心管 1700rpm離心5分鐘，去除上清，加入100微升RIPA lysis (碧云天公司)裂解細(xì)胞30分鐘，然后以12000Xg離心10分鐘，去沉淀，測(cè)蛋白濃度后，加入蛋白上樣液100°C煮5分鐘， 然后上SDS-凝膠電泳80V，300mA轉(zhuǎn)膜90分鐘，牛奶封閉lh，用兔抗人LC3 —抗(Abeam公司)孵育過(guò)夜，洗凈多余的一抗，再以羊抗兔免疫球蛋白(二抗)(Abeam公司)孵育lh，洗凈多余的二抗，在暗室曝光，結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果可見(jiàn)牛初乳IlOOOOXg離心中層液處理順鉬化療過(guò)的Hela癌細(xì)胞，自噬體標(biāo)志蛋白LC3-II/LC3-I的比例降低。3. 5將細(xì)胞用胰酶消化3分鐘，用PBS洗3遍，1700rpm離心棄去上清液，加含Ca2+ 的凋亡細(xì)胞熒光孵育液(BD公司)100微升，然后加入PI和Armexin-V孵育15分鐘，上流式細(xì)胞儀測(cè)量和計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖10。結(jié)果顯示順鉬處理Hela癌細(xì)胞14h后，加入IOOyg 蛋白/ml牛初乳IlOOOOXg離心中層液，約38. 5%的細(xì)胞凋亡，而不加牛乳的細(xì)胞僅凋亡 1.86%，加牛成乳IlOOOOXg離心中層液的細(xì)胞凋亡率為1.43%。
權(quán)利要求
1.一種牛初乳提取物，其特征在于該提取物含有序列為SEQ ID NO. 1的Mir-30a-5p微囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳為母牛產(chǎn)犢后最初 3天內(nèi)的乳汁。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳提取物通過(guò)如下方法獲得將牛初乳以5000Xg離心30分鐘后取中層液，再依次以12000Xg、35000Xg、 70000Xg、110000Xg的離心力，取上一次離心所得的中層液作為下一次離心的原液各離心 1小時(shí)，最后得到的IlOOOOXg離心中層液即為所述的牛初乳提取物。
4.一種提取權(quán)利要求1所述的牛初乳提取物的方法，其特征在于將牛初乳以5000Xg 離心30分鐘后取中層液，再依次以12000 X g,35000 X g、70000 X g、110000 X g得離心力，取上一次離心所得的中層液作為下一次離心的原液各離心1小時(shí)，最后得到的IlOOOOXg離心中層液即為所述的牛初乳提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取權(quán)利要求1所述的牛初乳提取物的方法，其特征在于所述的母牛產(chǎn)犢后最初3天內(nèi)的乳汁。
6.權(quán)利要求1所述的牛初乳提取物在制備治療各種癌癥的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥為乳腺癌、宮頸癌、白血病、肺癌、肝癌、腎癌、食道癌、卵巢癌、直腸癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、鼻咽癌或腦瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛初乳提取物及其提取方法和應(yīng)用，該提取物含有序列為SEQ ID NO.1的Mir-30a-5p微囊泡，可通過(guò)如下方法獲得將牛初乳以5000×g離心30分鐘后取中層液，再依次以12000×g、35000×g、70000×g、110000×g離心力，取上一次離心所得的中層液作為下一次離心的原液各離心1小時(shí)，最后得到的110000×g離心中層液即為所述的牛初乳提取物。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明牛初乳提取物含有豐富的Mir-30a-5p，用它處理經(jīng)順鉑化療后的癌細(xì)胞，可有效抑制其依靠吞噬自身而繼續(xù)生存，加速死亡，可增進(jìn)化療藥物的治療效果。
文檔編號(hào)A61K35/20GK102172360SQ20111003972
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月17日
發(fā)明者吳臨平, 張辰宇, 張騎鵬, 曾科, 鄒珍友 申請(qǐng)人:南京大學(xué)