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一種載抗腫瘤小分子干擾rna磁性納米探針的制備方法

文檔序號(hào):1204774閱讀:300來源:國知局
專利名稱:一種載抗腫瘤小分子干擾rna磁性納米探針的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于抗腫瘤小分子干擾RNA載體、癌癥基因治療、核磁共振成像和分子靶 向領(lǐng)域。具體涉及一種載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針的制備方法。
背景技術(shù)
抗腫瘤小分子干擾RNA(簡稱siRNA)是一種具有21 25核苷酸序列的小RNA分 子,由Dicer (RNAase III家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶)的ATP依賴性RNA酶切割雙 鏈RNA所形成。siRNA形成之后,與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體,此 復(fù)合體通過堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別靶mRNA并使其降解,從而導(dǎo)致特定基因沉默。癌癥的發(fā)生可以看作是一種基因的疾病,即某些原癌基因被一些特殊的內(nèi)源或外 源性的因子所激活,從而引起的細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)和生理生化的轉(zhuǎn)變,進(jìn)行非機(jī)體控制的 持續(xù)分裂增殖,最終耗竭機(jī)體導(dǎo)致死亡。癌癥的基因治療是繼手術(shù)、化療、放療后的新型治 療手段,它利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將正?;蛞吧偷韧庠椿?qū)胨拗骷?xì)胞,直接修復(fù)或糾正 腫瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能缺陷,或者阻斷癌癥基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤靶向治療是針對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的環(huán)節(jié),使用某些能與這些靶分子特異結(jié) 合的抗體、配體等,定向引導(dǎo)治療藥物至腫瘤靶部位,從而在分子水平逆轉(zhuǎn)該惡性生物學(xué)行 為,抑制腫瘤細(xì)胞生長。目前已有貝伐單抗、曲妥單抗、阿侖單抗、西妥昔單抗、托西莫單抗 等多種抗體被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于靶向抗腫瘤治療。分子影像學(xué)是利用現(xiàn)有的一些醫(yī)學(xué)影像技術(shù)對(duì)人體內(nèi)部生理或病理過程在分子 水平上進(jìn)行無損傷的、實(shí)時(shí)的成像,是將分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。 其中核磁共振成像具有極高的空間分辨力和組織分辨力,是分子影像學(xué)中的重要研究手 段。核磁共振分子成像能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行早期及特異性的診斷,并能監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療的效果。 構(gòu)建具有腫瘤的分子成像與治療共同作用的靶向納米分子探針是癌癥診斷與基因治療領(lǐng) 域的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種載抗腫瘤SiRNA磁性納米探針的制備方法。用于靶向傳遞抗腫 瘤siRNA至目標(biāo)靶點(diǎn),實(shí)現(xiàn)腫瘤的基因治療,并同時(shí)攜帶超順磁性四氧化三鐵納米顆粒,可 利用核磁共振成像技術(shù)特異性診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果。本發(fā)明的磁性納米探針是這樣實(shí)現(xiàn)的首先將水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆 粒和siRNA通過靜電作用相互結(jié)合形成復(fù)合物,然后采用復(fù)乳化法將復(fù)合物包載于羧基封 端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物(簡稱PLGA-C00H)中制備納米粒,再通過碳二亞胺法 連接上單克隆抗體,最終獲得載抗腫瘤siRNA的磁性納米探針。具體包括以下步驟(1)將抗腫瘤小分子干擾RNA溶于DEPC水中,加入乙酰化小牛血清白蛋白或低分 子量肝素鈉混勻,加入水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒中,4°C冰箱孵育lh,形成水相 復(fù)合物;
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(2)將羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶于二氯甲烷中,加入上述水相復(fù) 合物,形成初乳后溶于聚乙烯醇的DEPC水溶液中,揮去有機(jī)溶劑,離心,超濾,水洗3 5次 得到納米粒溶液;(3)將上述納米粒溶液濃縮,加入pH = 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化,超濾,溶于 PH = 7. 4的PBS緩沖液中,加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰 二亞胺鹽酸鹽,孵育池,加入單克隆抗體,4°C冰箱孵育過夜,脫鹽柱純化,得載抗腫瘤小分 子干擾RNA的磁性納米探針。本發(fā)明所述DEPC水為焦碳酸二乙酯處理的超純水,所用器皿經(jīng)焦碳酸二乙酯處理。本發(fā)明所述低分子量肝素鈉的平均分子量小于8000道爾頓。本發(fā)明所述水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒的粒徑小于50nm,磁飽和強(qiáng)度值 為40 lOOemu/g,水溶液中分散后表面電荷呈陽性。本發(fā)明所述單克隆抗體為貝伐單克隆抗體、曲妥單克隆抗體、阿侖單克隆抗體、西 妥昔單克隆抗體或托西莫單克隆抗體。本發(fā)明所述載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。本發(fā)明所述載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針可以作為造影劑,應(yīng)用于實(shí)時(shí) 監(jiān)測(cè)腫瘤病變和治療中的變化情況。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下有益效果1.采用帶正電荷的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒與帶負(fù)電荷的乙酰化白 蛋白或低分子量肝素鈉稀釋的抗腫瘤siRNA通過靜電吸引方式結(jié)合,形成的復(fù)合物穩(wěn)定性 好;2.采用羧基封端修飾的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物作為高分子基包載物,使得 所制備的納米粒表面具有可化學(xué)鍵接的活性位點(diǎn);3.采用碳二亞胺法在納米粒表面連接單克隆抗體,使整個(gè)納米探針具有較高的特 異性識(shí)別作用;4.通過本發(fā)明制備的納米探針既可傳遞抗腫瘤siRNA用做腫瘤基因治療,又可同 時(shí)攜帶超順磁性納米粒子進(jìn)入腫瘤部位,方便腫瘤的分子影像診斷與實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤治療效


圖1為本發(fā)明實(shí)施例3在作用4 后,利用MTT法檢測(cè)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率結(jié)
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明,不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1取IOD的抗腫瘤siRNA溶于50 μ L焦碳酸二乙酯(簡稱DEPC)水中,加入50 μ L 質(zhì)量濃度10%的乙?;∨Q灏椎鞍?,混勻器上渦旋震蕩ailin,加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化三鐵(簡稱USPI0)納米粒子的DEPC水溶液,4°C冰箱孵育Ih得 SPIO-siRNA 復(fù)合物。取IOmg PLGA-C00H溶于2mL 二氯甲烷中,加入SPIO-siRNA復(fù)合物,超聲30秒, 形成油包水型初乳,在超聲的條件下,將初乳慢慢滴加到30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %的聚乙烯醇 (簡稱PVA)的DEPC水溶液中,揮去有機(jī)溶劑,2500rpm離心去除大顆粒雜質(zhì),6000rpm 超濾管離心(濾膜截留分子量為20kDa)去除PVA乳化劑,水洗3 5次,得納米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。將上述SPIO-siRNA-PLGA-COOH納米粒溶液濃縮至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH為 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin,超濾離心2次,納米粒重分散于5mL pH = 7. 4的PBS 緩沖液中,加入NHS和EDC各100 μ g,孵育2h,加入50 μ L貝伐單抗(AbAvastin),4°C冰箱孵 育過夜,脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去除小 分子雜質(zhì),得載siRNA的磁性納米探針SPIO-siRNA-PLGA-AbAvastin。實(shí)施例2取20D的抗腫瘤siRNA溶于50 μ L DEPC水中,加入50 μ L質(zhì)量濃度10%的乙酰化 小牛血清白蛋白,混勻器上渦旋震蕩2min,加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化 三鐵納米粒子的DEPC水溶液,4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA復(fù)合物。取IOmgPLGA-COOH溶于2mL 二氯甲烷中,加入SPIO-siRNA復(fù)合物,超聲30秒,形 成油包水型初乳,在攪拌的條件下,將初乳慢慢滴加到30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的PVA的DEPC水 溶液中,揮去有機(jī)溶劑,2500rpm離心去除大顆粒雜質(zhì),6000rpm超濾管離心(濾膜截留分子 量為20kDa)去除PVA乳化劑,水洗3 5次,得納米粒SPI0-siRNA-PLGA_C00H。將上述SPI0-siRNA-PLGA-C00H納米粒溶液濃縮至 ImLJnAlOmL 0. lmol/L pH為 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin,超濾離心2次,納米粒重分散于5mL pH = 7. 4的PBS 緩沖液中,加入NHS和EDC各100 μ g,孵育2h,加入50 μ L曲妥單抗(Ablteeeptin),4°C冰箱孵 育過夜,脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去除小 分子雜質(zhì),得載siRNA的磁性納米探針SPI0-siRNA-PLGA-AbHerceptin。實(shí)施例3取20D的抗腫瘤siRNA溶于50 μ L DEPC水中,加入50 μ L質(zhì)量濃度10%的低分子 量肝素鈉,混勻器上渦旋震蕩2min,加入100 μ L 10mg/mL的水溶性超順磁性四氧化三鐵納 米粒子的DEPC水溶液,4°C冰箱孵育Ih得SPIO-siRNA復(fù)合物。取20mg PLGA-C00H溶于2mL 二氯甲烷中,加入SPIO-siRNA復(fù)合物,超聲30秒, 形成油包水型初乳,在超聲的條件下,將初乳慢慢滴加到50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的PVA的DEPC 水溶液中,揮去有機(jī)溶劑,2500rpm離心去除大顆粒雜質(zhì),6000rpm超濾管離心(濾膜截留 分子量為20kDa)去除PVA乳化劑,水洗3 5次,重分散于IOmL DEPC水中,得納米粒 SP10-s i RNA-PLGA-C00H。取5ml 上述 SPI0-siRNA-PLGA-C00H 納米粒溶液濃縮至 lmL,加入 IOmL 0. Imol/ LpH = 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化lOmin,超濾離心2次,納米粒重分散于5mL pH = 7. 4 的PBS緩沖液中,加入NHS和EDC各100 μ g,孵育2h,加入50 μ L托西莫單抗(Ab麗),4°C冰 箱孵育過夜,脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, MWCO = 5000Da)純化去 除小分子雜質(zhì),得載siRNA的磁性納米探針SPI0-siRNA-PLGA-AbTMM。
實(shí)施例4對(duì)本發(fā)明制備的磁性納米探針進(jìn)行抗腫瘤藥效學(xué)試驗(yàn)肺癌細(xì)胞系似49、肝癌細(xì)胞系H印G2和胃癌細(xì)胞系SGC7901在含15%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum,簡稱FBS)的DMEM完全培養(yǎng)基(GIBC0公司,美國)培養(yǎng),培養(yǎng)條件 為37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中濕潤培養(yǎng)。將4. 0 X IO4ceIVcm2細(xì)胞接種于96孔板,孵育24h使細(xì) 胞貼壁后,設(shè)立空白對(duì)照組、載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針處理組和陰性對(duì)照組, 每組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育44h后棄去上清培養(yǎng)液,每孔加入20 μ L新配制的5g/L 3-(4, 5-二甲基噻唑-2) -2,5- 二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT),孵育4h,移去上清液,加入150 μ L 二甲基亞砜溶解,混勻后用酶標(biāo)儀在490nm波長處測(cè)定吸光度,計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。圖1為作用4 后MTT法檢測(cè)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率結(jié)果。結(jié)果顯示,經(jīng)過本發(fā) 明載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針作用后的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)M9、肝癌細(xì)胞系HepG2和 胃癌細(xì)胞系SGC7901的分裂明顯減少,細(xì)胞生長受到明顯抑制,載抗腫瘤小分子干擾RNA磁 性納米探針在0 60 μ M對(duì)腫瘤細(xì)胞系的抑制作用逐漸增強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針的制備方法,其特征在于,包括以下步驟(1)將抗腫瘤小分子干擾RNA溶于DEPC水中,加入乙?;∨Q灏椎鞍谆虻头肿恿?肝素鈉混勻,加入水溶性超順磁性四氧化三鐵納米顆粒中,4°C冰箱孵育lh,形成水相復(fù)合 物;(2)將羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物溶于二氯甲烷中,加入上述水相復(fù)合 物,形成初乳后溶于聚乙烯醇的DEPC水溶液中,揮去有機(jī)溶劑,離心,超濾,水洗3 5次得 到納米粒溶液;(3)將上述納米粒溶液濃縮,加入pH= 5的2-嗎啉乙磺酸溶液活化,超濾,溶于pH = 7. 4的PBS緩沖液中,加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞 胺鹽酸鹽,孵育池,加入單克隆抗體,4°C冰箱孵育過夜,脫鹽柱純化,得載抗腫瘤小分子干 擾RNA的磁性納米探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述DEPC水為焦碳酸二乙酯處理的 超純水,所用器皿經(jīng)焦碳酸二乙酯處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述低分子量肝素鈉的平均 分子量小于8000道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述水溶性超順磁性四氧化 三鐵納米顆粒的粒徑小于50nm,磁飽和強(qiáng)度值為40 lOOemu/g,水溶液中分散后表面電荷 呈陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)所述單克隆抗體為貝伐單克 隆抗體、曲妥單克隆抗體、阿侖單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體或托西莫單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1所述的載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針在抗腫瘤中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤 病變和治療中的變化情況中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載抗腫瘤小分子干擾RNA磁性納米探針的制備方法,包括以下步驟將超順磁性四氧化三鐵納米顆粒和抗腫瘤小分子干擾RNA通過靜電作用相互結(jié)合形成復(fù)合物,采用復(fù)乳法將復(fù)合物包載于羧基封端的聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物中制備納米粒,通過碳二亞胺法連接上單克隆抗體獲得磁性納米探針。本發(fā)明制備的磁性納米探針可以通過單克隆抗體的特異性介導(dǎo)納米粒進(jìn)入細(xì)胞,所載抗腫瘤小分子干擾RNA具有較高的轉(zhuǎn)染效率,可阻斷基因活性,抑制腫瘤細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,具有抗腫瘤作用。同時(shí)納米探針?biāo)d的超順磁性納米顆??勺鳛楹舜殴舱癯上窦夹g(shù)的造影劑,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤病變和治療中的變化情況。
文檔編號(hào)A61K31/713GK102091027SQ201110008658
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者凌友, 魏坤 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)
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