專利名稱：金黃色葡萄球菌5型和8型莢膜多糖的偶聯(lián)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于將細(xì)菌莢膜糖，具體是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureuS)5型或8型莢膜多糖偶聯(lián)至運(yùn)載體以形成糖偶聯(lián)物的領(lǐng)域。所述糖偶聯(lián)物可用于免疫。
背景技術(shù)：
在抵御有莢膜細(xì)菌的疫苗中使用細(xì)菌的莢膜糖已有多年歷史。然而，由于糖是不依賴于T細(xì)胞的抗原，它們的免疫原性很弱。與載體偶聯(lián)可將T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)化成T-依賴性抗原，從而增強(qiáng)記憶應(yīng)答，并產(chǎn)生保護(hù)性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶聯(lián)物，原型偶聯(lián)疫苗針對(duì)流感嗜血菌(Haemohilus influenzae) ( ‘Hib，)[例如見參考文獻(xiàn)97的第 14章]。已經(jīng)記載其偶聯(lián)疫苗的另一種細(xì)菌是金黃色葡萄球菌(S. aureus)。已經(jīng)從金黃色葡萄球菌中分離到各種多糖用于糖偶聯(lián)物。兩種特別感興趣的多糖是5型和8型莢膜多糖。大約60%的人金黃色葡萄球菌菌株是8型，大約30%是5型。有關(guān)5型和8型偶聯(lián)物的大量工作是由i^attom等進(jìn)行的，可參見文獻(xiàn)如參考文獻(xiàn)1-9。用于偶聯(lián)5型和8型多糖的!^attom法通常包括用胱胺使純化多糖巰基化。該反應(yīng)依賴莢膜多糖中存在羧基基團(tuán)。 這些基團(tuán)在碳二亞胺如EDAC存在下與胱胺發(fā)生反應(yīng)。然后，將衍生多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體蛋白如綠膿假單胞菌(Pseudomononas aeruginosa)內(nèi)毒素A (ETA)，通常通過接頭偶聯(lián)[2]。 其它研究者已通過還原胺化[10和11]；戊二醛偶聯(lián)[10]；或多糖上的羥基與氰基化劑如 CDAP [12]或三聚氰酰氯(cyanuric trichloride)的反應(yīng)[13]偶聯(lián)純化的5型和8型莢膜多糖。雖然已證明i^attom法制備的偶聯(lián)疫苗在人體中安全且有免疫原性[5]，但仍然需要其它更好的方式來制備金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖的偶聯(lián)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于可用于代替現(xiàn)有技術(shù)公開的偶聯(lián)方法的偶聯(lián)方法。與這些方法不同， 本發(fā)明方法不包括通過多糖中的羥基或羧酸基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比該方法使這些基團(tuán)的形式更接近天然多糖中的形式。替代使用這些基團(tuán)的是，該方法包括在多糖中產(chǎn)生反應(yīng)性醛基用于偶聯(lián)。與現(xiàn)有技術(shù)的偶聯(lián)物相比，所得的偶聯(lián)物可具有不同、優(yōu)選改進(jìn)的免疫學(xué)特性。因此，本發(fā)明提供將金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體蛋白的另選或改進(jìn)的方法和從其獲得的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供可用于本發(fā)明方法的中間體以及制備這些中間體的方法。第一方面，本發(fā)明提供一種制備金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖和運(yùn)載體分子的偶聯(lián)物的方法，其包括以下步驟(a)使莢膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化該片段以便將醛基引入所述片段中的至少一個(gè)糖殘基上得到氧化糖殘基；和(c)通過所述醛基將該氧化糖殘基偶聯(lián)于運(yùn)載體分子，從而得到該偶聯(lián)物。步驟(c)中的偶聯(lián)可以是直接偶聯(lián)，或者可以是通過接頭分子進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明還提供由該方法獲得或可獲得的偶聯(lián)物。莢膜多糖本發(fā)明基于金黃色葡萄球菌5型和8型的莢膜多糖。5型和8型莢膜多糖的結(jié)構(gòu)參見參考文獻(xiàn)14和15，例如5 型— 4) - β -D-ManNAcA (30Ac) - (1 — 4) - α -L-FucNAc (1 — 3) - β -D-FucNAc-(1 —8 型— 3)-β -D-ManNAcA(40Ac)-(1 ^ 3) - α -L-FucNAc (1 — 3) - β -D-FucNAc-(1 —近期的NMR譜圖數(shù)據(jù)[16]導(dǎo)致將這些結(jié)構(gòu)修改為5 型— 4)- β -D-ManNAcA-(1 — 4)_ α -L-FucNAc(30Ac)_(1 — 3)_ β -D-FucNAc-(1 —8 型— 3) - β -D-ManNAcA (40Ac) - (1 — 3) - α -L-FucNAc (1 — 3) - α -D-FucNAc (1 —可以相對(duì)于天然情況下發(fā)現(xiàn)的莢膜多糖對(duì)該多糖進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，多糖可被去-0-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙?；?部分或全部)、 N-丙酰化(部分或全部)等?？稍谂悸?lián)之前、期間或之后進(jìn)行去乙酰化，但通常在偶聯(lián)前進(jìn)行。根據(jù)具體多糖，去乙?；赡苡绊懟虿挥绊懫涿庖咴?，如NeisVac-C 疫苗采用去-0-乙酰化的多糖，而Menjugate 是乙酰化的，但這兩種疫苗都有效?？赏ㄟ^常規(guī)試驗(yàn)評(píng)價(jià)去乙?；鹊男Ч?。例如，金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖上0乙?；南嚓P(guān)性可參見參考文獻(xiàn)6。據(jù)該文獻(xiàn)稱，天然多糖具有75%0_乙?；?。這些多糖將抗體誘導(dǎo)至多糖主鏈和0-乙?；?。具有0%0_乙?；亩嗵侨匀灰l(fā)針對(duì)該多糖主鏈的抗體。兩種抗體類型對(duì)0-乙?；坎煌慕瘘S色葡萄球菌菌株有調(diào)理活性。因此，本發(fā)明所用的 5型或8型莢膜多糖可具有0至100%0_乙?；＠?，5型莢膜多糖的0-乙酰化程度可以是 10-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、 90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%?；蛘撸刹捎?%0乙?；?型莢膜多糖。相似地,8型莢膜多糖的0乙?；潭瓤梢允?0-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40100%、 50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90% 或 80-90%。或者， 可采用0%0乙?；?型莢膜多糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，5型和8型莢膜多糖的0-乙?；潭瓤梢允?10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、 90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在其它實(shí)施方式中，使用0%0_乙?；?型和8型莢膜多糖。本發(fā)明所用5型莢膜多糖的N-乙?；潭瓤梢允?-100%、50-100%、 75-100%,80-100%,90-100%或95_100%。通常5型莢膜多糖的N-乙?；潭仁?00%。相似地，本發(fā)明所用8型莢膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、75-100%、80-100%、 90-100%或95-100%。通常8型莢膜多糖的N-乙?；潭仁?00%。在一個(gè)實(shí)施方式中，5 型和8型莢膜多糖的N-乙?；潭瓤梢允?-100%,50-100%,75-100%,80-100%,90-100%或 95-100%。通常5型和8型莢膜多糖的N-乙?；潭仁?00%。多糖的0-乙?；潭瓤赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定，例如質(zhì)子NMR(如參考文獻(xiàn)17、18、19或20所述)。參考文獻(xiàn)21中記載了另一種方法?？刹捎妙愃品椒y(cè)定多糖的N-乙?；潭??？赏ㄟ^水解去除0-乙?；?，例如用堿如無水胼[2 或Na0H[6]處理。
5可使用類似方法去除N-乙?；榱司S持5型和/或8莢膜多糖上的高水平0-乙?；?最大程度減少導(dǎo)致0-乙?；獾奶幚恚缭跇O端pH下的處理?？赏ㄟ^已知技術(shù)純化莢膜多糖，如本文引用的參考文獻(xiàn)所述。典型方法包括用苯酚-乙醇滅活金黃色葡萄球菌細(xì)胞、離心、溶葡萄球菌素處理、RNA酶/DNA酶處理、離心、滲析、蛋白酶處理、進(jìn)一步滲析、過濾、用乙醇/CaCl2沉淀、滲析、凍干、陰離子交換色譜、滲析、 凍干、大小排阻色譜、滲析和凍干[1]。另一方法包括高壓滅菌金黃色葡萄球菌細(xì)胞、超濾含多糖的上清液、濃縮、凍干、用偏高碘酸鈉處理以除去磷壁酸、進(jìn)一步超濾、滲濾、高效大小排阻液相色譜、滲濾和凍干[23]。優(yōu)選采用參考文獻(xiàn)M所述的純化過程。本發(fā)明不限于純化自天然來源的多糖，然而，可通過其它方法如全合成或部分合成獲得所述多糖。運(yùn)載體分子本發(fā)明包括使用運(yùn)載體分子，它們一般是蛋白質(zhì)。通常，與載體的共價(jià)偶聯(lián)增強(qiáng)糖的免疫原性，因?yàn)榕悸?lián)可以將糖由T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門-依賴性抗原，由此能夠引發(fā)免疫記憶。偶聯(lián)對(duì)于兒科疫苗特別有用[例如參考文獻(xiàn)25]，而且是公知技術(shù)[例如在參考文 U 26-34中綜述的]。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素，如白喉或破傷風(fēng)毒素、其類毒素或突變體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CRM197白喉毒素突變體[35]適用。綠膿假單胞菌(I^seudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)和其無毒突變體重組外蛋白A(rEPA)已用作金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖的運(yùn)載體蛋白([1]和[2])。也使用了金黃色葡萄球菌α-溶血素(α-毒素)([10]和)、卵清蛋白[13]和人血清白蛋白[11]。這些運(yùn)載體可用于本發(fā)明。其他合適的運(yùn)載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物、合成肽[38，39]、熱激蛋白[40，41]、百日咳蛋白[42，43]、細(xì)胞因子[44]、淋巴因子 [44]、激素[44]、生長(zhǎng)因子W4]、人血清白蛋白(通常是重組的)、包含多種來自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白W5]例如附9[46]、來自流感嗜血桿菌(流感嗜血桿菌)的蛋白饑47-49]、肺炎球菌表面蛋白PspA[50]、肺炎球菌溶血素[51]或其無毒衍生物[52]、攝鐵蛋白[53]、來自艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[M]、GBS蛋白[55]、 GAS蛋白[56]等等。其它合適的運(yùn)載體蛋白包括金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)抗原，例如下述金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)抗原?？梢允褂靡环N以上的載體蛋白，例如用于減少載體抑制的風(fēng)險(xiǎn)。因此，不同的運(yùn)載體蛋白可用于5型和8型莢膜多糖，例如，5型多糖可偶聯(lián)于CRM197而8型多糖可偶聯(lián)于 rEPA。也可能對(duì)某種特定多糖抗原使用超過一種運(yùn)載體蛋白，例如5型多糖可以分為兩組， 一組偶聯(lián)于CRM197且另一組偶聯(lián)于rEPA。然而，通常對(duì)所有多糖使用相同的運(yùn)載體蛋白。一種載體蛋白可攜帶一種以上多糖抗原[57，58]。例如，一種運(yùn)載體蛋白可偶聯(lián)于 5型和8型莢膜多糖。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，可以在偶聯(lián)過程之前混合不同多糖。然而，通常各多糖形成不同偶聯(lián)物，偶聯(lián)后混合不同多糖。單獨(dú)的偶聯(lián)物可基于同一運(yùn)載體。解聚在本發(fā)明方法的步驟(a)中，將莢膜多糖解聚以得到多糖片段。已報(bào)道在偶聯(lián)前通過超聲處理解聚8型莢膜多糖[3]。作者得出結(jié)論，低分子量8型無免疫原性。雖然這些
6作者因此偏好高分子量多糖，但本發(fā)明令人驚訝地利用了分子量低于天然莢膜多糖的多糖片段。可解聚全長(zhǎng)多糖，以得到較短片段用于本發(fā)明的各種方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，切割5 型莢膜多糖中α -L-FucNAc (30Ac)和β -D-FucNAc殘基之間的(1 — 3)糖苷鍵的方法尤其適用。將這些方法應(yīng)用于5型莢膜多糖時(shí)，它們產(chǎn)生在非還原末端具有β-D-FucNAc-a — 部分的多糖片段。此部分包括兩個(gè)相鄰羥基。相似地，這些方法應(yīng)用于8型莢膜多糖時(shí)，認(rèn)為它們產(chǎn)生在非還原末端具有a-D-FucNAc-a —部分的多糖片段，此部分包括兩個(gè)相鄰羥基。5型或8型多糖片段中的此相鄰羥基為隨后將該片段偶聯(lián)于運(yùn)載體分子提供柄，如下所述。因此，本發(fā)明的另一方面提供一種處理金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的方法，其包括解聚莢膜多糖以得到在非還原末端具有β-D-FucNAc-a —部分的多糖片段的步驟。 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種處理金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的方法，其包括解聚莢膜多糖以得到在非還原末端具有a-D-FucNAc-a—部分的多糖片段的步驟。所述莢膜多糖可以是金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖，如上文“莢膜多糖”部分所述。本發(fā)明也提供由這些方法中任一種獲得或可獲得的多糖片段。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可通過酸水解進(jìn)行解聚。在酸水解中，優(yōu)選使用弱酸如乙酸來避免在該多糖中其它基團(tuán)上發(fā)生副反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定適用于水解的酸和條件(如濃度、溫度和/或時(shí)間)。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)適合用2、乙酸(ν/ν)在90°C處理ang/ml多糖3小時(shí)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)適合用5%乙酸在90°C處理ang/ml多糖30分鐘、5小時(shí)或6小時(shí)。也可能適合用其它酸，如三氟乙酸或其它有機(jī)酸進(jìn)行處理。具體說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可使用鹽酸提高解聚效率，特別是對(duì)8型莢膜多糖的解聚效率。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)適合用2M 鹽酸在100°C處理多糖30分鐘。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)適合用2M鹽酸在100°C處理1、1. 5、2或 2. 5小時(shí)。這類鹽酸處理可能導(dǎo)致多糖發(fā)生脫-0-乙?；?，如下所述。其它多糖解聚方法也可能適用。這些方法包括加熱、微流化[59]、聲輻射[3]、氧化還原[60]或臭氧解[61]。可通過色譜，如大小排阻色譜鑒定多糖片段。具體的分子量可通過凝膠過濾相對(duì)于支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，如購自PSS公司(Polymer Standard Service)的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定[62]。 通常，本發(fā)明片段是質(zhì)量在一定范圍之內(nèi)的片段的混合物。就解聚的5型莢膜多糖而言， 片段的分子量通常在l_500kDa，例如5-100kDa，具體是10_50kDa，更具體是20_30kDa。相似地，就解聚的8型莢膜多糖而言，片段的分子量可以是l_500kDa，例如5_100kDa，具體是 10-50kDa,更具體是20-30kDa。在一些實(shí)施方式中，選擇低分子量的5型和/或8型多糖片段以用于本發(fā)明。例如，可選擇和匯集對(duì)應(yīng)于低分子量片段的凝膠過濾組分。所述低分子量多糖片段的分子量通常為5至20kDa。解聚可導(dǎo)致莢膜多糖的0-乙?；潭雀淖?。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)酸水解可導(dǎo)致 0-乙?；潭冉档?。在一些實(shí)施方式中，片段的0-乙酰化程度可以是10-90%、20-70%、 30-50%、特別是35-45%。在其它實(shí)施方式中，片段的0-乙?；潭瓤梢允?_10%、0_5%、 0-2%，特別是0%。引入醛基在該方法的步驟(b)中，將片段氧化以將醛基引入該片段中的至少一個(gè)糖殘基上。這一步驟可包括將一個(gè)以上醛基引入該糖殘基。具體說，可引入兩個(gè)醛基。例如，步驟(a)中的解聚導(dǎo)致5型多糖片段在非還原末端具有β-D-FucNAc-a—部分時(shí)，可氧化該部分中的兩個(gè)相鄰羥基，以便將兩個(gè)醛基引入該部分。以此方式，β-D-FucNAc-a — 部分可以是步驟(b)的糖殘基。相似地，解聚導(dǎo)致8型多糖片段在非還原末端具有 a -D-FucNAc-(1 —部分時(shí)，可氧化該部分中的兩個(gè)相鄰羥基，以便引入兩個(gè)醛基。以此方式，a-D-FucNAc-d —部分可以是步驟(b)的糖殘基。因此，本發(fā)明另一方面提供一種提供金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非還原末端具有β-D-FucNAc-a —部分的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖，以便將β-D-FucNAc-a —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)化成兩個(gè)醛基的步驟。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種提供金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非還原末端具有a-D-FucNAc-a —部分的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖，以便將 a -D-FucNAc-(1 —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)化成兩個(gè)醛基的步驟。所述莢膜多糖可以是上文“解聚”部分所述的多糖片段。本發(fā)明還提供由這些方法中任一種獲得或可獲得的金黃色葡萄球菌莢膜多糖衍生物。典型的產(chǎn)醛反應(yīng)包括使用高碘酸鹽，特別是偏高碘酸鹽(如偏高碘酸鈉或鉀，如 NaIO4)，以氧化相鄰羥基W3]。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定適合氧化的條件。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)適合用NaIO4以1:1比例(w/w)在室溫下避光處理ang/ml多糖1_2小時(shí)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)適合用93mMNaI04在室溫下避光處理2mg/ml多糖8小時(shí)?？刹捎闷渌趸瘲l件，例如使用四氧化鋨等。偶聯(lián)于運(yùn)載體分子在所述方法的步驟(C)中將氧化糖殘基偶聯(lián)于運(yùn)載體分子可以是直接偶聯(lián)或通過接頭偶聯(lián)?？刹捎萌魏魏线m的偶聯(lián)反應(yīng)，必要時(shí)采用任何合適的接頭。步驟(b)中的氧化產(chǎn)生在其非還原末端具有β -D-FucNAc (1 —部分的5型多糖片段且該部分中引入兩個(gè)醛基時(shí)，步驟(c)中的偶聯(lián)可通過這些醛基之一實(shí)現(xiàn)。以此方式，氧化的β-D-FucNAc-a—部分可以是步驟(c)的氧化糖殘基。相似地，氧化產(chǎn)生在其非還原末端具有a-D-FucNAcd —部分的8型多糖片段且該部分中引入兩個(gè)醛基時(shí)，步驟(C)中的偶聯(lián)可通過這些醛基之一實(shí)現(xiàn)。以此方式，氧化的a-D-FucNAc-a—部分可以是步驟 (c)的氧化糖殘基。因此，本發(fā)明另一方面提供一種提供偶聯(lián)的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的方法，所述方法包括將在其非還原末端具有β -D-FucNAc-(1 —部分的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體分子的步驟，所述部分經(jīng)氧化其中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)醛基， 其中所述偶聯(lián)通過醛基之一實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種提供偶聯(lián)的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的方法，所述方法包括將在其非還原末端具有a -D-FucNAc-(1 —部分的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體分子的步驟，所述部分經(jīng)氧化其中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)醛基，其中所述偶聯(lián)通過醛基之一實(shí)現(xiàn)。所述莢膜多糖可以是上文中“引入醛基”部分所述的莢膜多糖。運(yùn)載體分子可以是上文中“運(yùn)載體分子”部分所述的運(yùn)載體。本發(fā)明還提供由這些方法中任一種獲得或可獲得的偶聯(lián)莢膜多糖。將氧化糖殘基或接頭連接于運(yùn)載體通常通過胺(-NH2)基進(jìn)行，例如運(yùn)載體蛋白的賴氨酸或殘基中的胺基，或精氨酸殘基的胺基。連接至運(yùn)載體也可通過巰基(-SH)進(jìn)行，例
8如半胱氨酸殘基側(cè)鏈中的巰基。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過使氧化糖殘基中的醛基與運(yùn)載體的胺基發(fā)生還原型胺化反應(yīng)，方便地進(jìn)行直接偶聯(lián)。因此，本發(fā)明優(yōu)選此種性質(zhì)的直接偶聯(lián)。相反，參考文獻(xiàn)2提示在金黃色葡萄球菌5型和8型偶聯(lián)物中接頭可能有利。如果需要，本發(fā)明可采用接頭偶聯(lián)，例如使氧化糖殘基中的醛基與接頭中的胺基發(fā)生還原型胺化反應(yīng)，或者通過還原型胺化將醛基轉(zhuǎn)化成胺基以提供連接接頭用的胺基。還原型胺化是有機(jī)化學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，已廣泛用于生產(chǎn)疫苗用的莢膜多糖偶聯(lián)物，包括金黃色葡萄球菌莢膜多糖[10]。在一個(gè)實(shí)施方式中，氧化糖殘基中的醛基與運(yùn)載體或接頭中的胺基發(fā)生反應(yīng)。這可通過在合適還原劑(例如氰基硼氫化物，如氰基硼氫化鈉 NaBH3CN ；硼烷-吡啶；三乙酸基硼氫化鈉；硼氫化物交換樹脂；等)存在下將多糖與運(yùn)載體或接頭混合方便地實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方式中，通過還原型胺化將醛基轉(zhuǎn)化成胺基，以提供連接接頭用的胺基。還原型胺化涉及氨或伯胺(NH2R)。這可通過將銨鹽(如氯化銨)與合適還原劑(如上所述)聯(lián)用方便地實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定適合還原型胺化的條件。 例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)適合用運(yùn)載體蛋白質(zhì)以4:1多糖蛋白質(zhì)比例(w/w)并用NaBH3CN以 2:1多糖INaBH3CN比例處理10mg/ml多糖。通過接頭基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)可以使用任何已知方法，例如上述還原型胺化方法進(jìn)行。 在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用雙官能接頭提供用于偶聯(lián)于氧化糖殘基中醛基的第一基團(tuán)和用于偶聯(lián)于運(yùn)載體的第二基團(tuán)。例如，可采用式X1-Ll2的雙官能接頭，其中&可與醛發(fā)生反應(yīng)A2可與運(yùn)載體發(fā)生反應(yīng)；L是接頭中的連接部分。典型的&基團(tuán)是胺基。典型的L基團(tuán)是含 1 -10 個(gè)碳原子(如 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、Cltl)的直鏈烷基，如-(CH2) 4_ 或-(CH2) 3_。 在另一實(shí)施方式中，可采用雙官能接頭提供用于偶聯(lián)于氧化糖殘基中醛基衍生的胺基(例如通過上述還原型胺化)的第一基團(tuán)和用于偶聯(lián)于運(yùn)載體(通常偶聯(lián)于運(yùn)載體的胺)的第二基團(tuán)。例如，可使用式X-L-X的均質(zhì)雙官能接頭，其中兩個(gè)X基團(tuán)相同，并可與胺發(fā)生反應(yīng)；L是接頭中的連接部分。典型的X基團(tuán)是N-氧琥珀酰亞胺。L通常具有式L' -L2-L'， 其中L'是羰基。典型的L2基團(tuán)是含1-10個(gè)碳原子(如‘⑷而⑶、?！薄啊ⅰ?；) 的直鏈烷基，如-(CH2) 4_。因此，典型接頭是己二酸N羥基琥珀酰亞胺二酯(SIDEA)
權(quán)利要求
1.一種制備金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖和運(yùn)載體分子的偶聯(lián)物的方法，其包括以下步驟(a)使所述莢膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化該片段以便將醛基引入所述片段中的至少一個(gè)糖殘基上得到氧化糖殘基；和(c)通過所述醛基將該氧化糖殘基偶聯(lián)于運(yùn)載體分子，從而得到該偶聯(lián)物。
2.—種處理金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的方法，其包括解聚莢膜多糖以得到在非還原末端具有β-D-FucNAc-a —部分的多糖片段的步驟。
3.—種處理金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的方法，其包括解聚莢膜多糖以得到在非還原末端具有a-D-FucNAc-a —部分的多糖片段的步驟。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述解聚通過乙酸酸水解進(jìn)行。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述片段的平均分子量為5至 lOOkDa。
6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述片段的0-乙酰化程度是 10-90%ο
7.如權(quán)利要求1和4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)是權(quán)利要求2 或3中限定的步驟。
8.一種提供金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非還原末端具有β -D-FucNAc-(1 —部分的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖，以便將β -D-FucNAc-(1 —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)化成兩個(gè)醛基的步驟。
9.一種提供金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非還原末端具有α -D-FucNAc-(1 —部分的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖，以便將α -D-FucNAc-(1 —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)化成兩個(gè)醛基的步驟。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)是權(quán)利要求8或9中限定的步驟。
11.一種提供偶聯(lián)的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖的方法，所述方法包括將在其非還原末端具有β -D-FucNAc-I —部分的金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體分子的步驟，所述部分經(jīng)氧化其中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)醛基，其中所述偶聯(lián)通過所述醛基之一實(shí)現(xiàn)。
12.一種提供偶聯(lián)的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖的方法，所述方法包括將在其非還原末端具有α -D-FucNAc-(1 —部分的金黃色葡萄球菌8型莢膜多糖偶聯(lián)于運(yùn)載體分子的步驟，所述部分經(jīng)氧化其中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓚€(gè)醛基，其中所述偶聯(lián)通過所述醛基之一實(shí)現(xiàn)。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法用于制備金黃色葡萄球菌5 型莢膜多糖和運(yùn)載體分子的偶聯(lián)物，所述方法包括以下步驟(a)使所述莢膜多糖解聚， 得到在非還原末端具有β-D-FucNAc-a —部分的多糖片段；(b)氧化該片段，從而將 β -D-FucNAc-(1 —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變成兩個(gè)醛基；和(c)通過所述醛基之一將該氧化片段偶聯(lián)于運(yùn)載體分子，從而得到所述偶聯(lián)物。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法用于制備金黃色葡萄球菌8 型莢膜多糖和運(yùn)載體分子的偶聯(lián)物，所述方法包括以下步驟(a)使所述莢膜多糖解聚， 得到在非還原末端具有a-D-FucNAc-α —部分的多糖片段；(b)氧化該片段，從而將·α -D-FucNAc-(1 —部分中的兩個(gè)相鄰羥基轉(zhuǎn)變成兩個(gè)醛基；和(c)通過所述醛基之一將該氧化片段偶聯(lián)于運(yùn)載體分子，從而得到所述偶聯(lián)物。
15.如權(quán)利要求1和4-7和10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)是通過所述醛基與所述運(yùn)載體的胺基發(fā)生還原胺化反應(yīng)進(jìn)行的直接偶聯(lián)。
16.如權(quán)利要求1和4-7和10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)是通過所述醛基與接頭的胺基發(fā)生還原胺化反應(yīng)進(jìn)行的接頭偶聯(lián)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述接頭連接于所述運(yùn)載體分子。
18.如權(quán)利要求1和4-7和10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)導(dǎo)致多糖蛋白質(zhì)比例(w/w)為1:5至1:2。
19.一種通過或可通過前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法獲得的偶聯(lián)物、片段、衍生物或偶聯(lián)多糖。
20.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求19所述的偶聯(lián)物或偶聯(lián)多糖。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)抗原clfA抗原；clfB抗原；sdrE2抗原；sdrC抗原；sasF抗原；emp抗原；sdrD抗原；spa抗原；esaC抗原；esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；isdC抗原；Hla抗原；StaOll抗原；isdA抗原；isdB抗原；和sta073抗原。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)抗原選自esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；Hla抗原；staOll抗原；和sta073抗原。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含下述組合(I)-(IO)之一所述的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)抗原(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和Hla抗原；(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和staOll抗原；(3)esxA抗原、esxB抗原和staOll抗原；(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原和staOll抗原；(5)esxA抗原、esxB抗原和Hla抗原；(6)Hla抗原、sta006抗原和staOll抗原；(7)esxA抗原和esxB抗原；(8)esxA抗原、esxB抗原和sta006抗原；(9)esxA抗原、esxB抗原、staOll抗原和sta073抗原；和(10)sta006 抗原和 staOll 抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備金黃色葡萄球菌5型或8型莢膜多糖和運(yùn)載體分子的偶聯(lián)物的方法，其包括以下步驟(a)使莢膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化該片段以便將醛基引入所述片段中的至少一個(gè)糖殘基上得到氧化糖殘基；和(c)通過醛基將該氧化糖殘基偶聯(lián)于運(yùn)載體分子，從而得到該偶聯(lián)物。步驟(c)中的偶聯(lián)可以是直接偶聯(lián)，或者可以是通過接頭分子進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明還提供由該方法獲得或可獲得的偶聯(lián)物。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102596254SQ201080050122
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者F·伯爾蒂, M·R·羅馬諾, P·科斯塔蒂諾 申請(qǐng)人:諾華有限公司