專利名稱：三維納米結(jié)構(gòu)化復(fù)合支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于組織工程的三維復(fù)合支架及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
組織工程是用于修復(fù)組織或使組織再生的策略。組織工程中所涉及的細(xì)胞培養(yǎng)物還需要三維支架以支撐細(xì)胞。具有三維多孔結(jié)構(gòu)的支架在許多組織培養(yǎng)應(yīng)用中是必要的， 這是由于細(xì)胞在二維單層細(xì)胞培養(yǎng)物中會(huì)失去其細(xì)胞形態(tài)和表型表達(dá)。在組織再生和修復(fù)中，三維支架的裝配是一個(gè)重要的問(wèn)題，支架裝配的方式是支架模擬細(xì)胞外基質(zhì)，從而促使細(xì)胞生長(zhǎng)成功能組織，以及使?fàn)I養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子擴(kuò)散。當(dāng)組織再生時(shí)，三維基質(zhì)的性質(zhì)可以極大地影響細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)，以及決定終產(chǎn)物的質(zhì)量。一種優(yōu)化的支架材料應(yīng)能促進(jìn)細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞特異表型的表達(dá)以及提高細(xì)胞的活性。在許多組織工程應(yīng)用以及再生性藥物領(lǐng)域中，已經(jīng)有許多生物材料用作支架材料，其通過(guò)與移植細(xì)胞相互作用來(lái)控制工程化組織的功能和結(jié)構(gòu)。這些材料包括天然物質(zhì)， 例如膠原和海藻酸鹽。一些生物材料已經(jīng)被證明可以支撐細(xì)胞長(zhǎng)入(ingrowth)和受損組織的再生，并且沒(méi)有免疫排斥現(xiàn)象，這些生物材料還被證明可以通過(guò)刺激細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來(lái)促進(jìn)重構(gòu)過(guò)程而協(xié)助愈合過(guò)程。保留在這些生物材料中的細(xì)胞外基質(zhì)也能通過(guò)與例如細(xì)胞表面受體的特異性相互作用影響干細(xì)胞的表型分化。但是，由于這些分離的生物材料在植入和細(xì)胞灌注接種期間機(jī)械性質(zhì)不足，限制了這些材料的應(yīng)用。高孔隙率的支架通常是受到推薦的，其用于減少植入材料的量并產(chǎn)生較大的表面供細(xì)胞黏附。另外，互相連接性(intercormectivity)，即支架中孔隙之間的連接，是非常重要的，這是因?yàn)槠鋵?duì)于細(xì)胞在支架中的移動(dòng)性以及隨后的營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞產(chǎn)生的廢物的運(yùn)輸 (擴(kuò)散和對(duì)流)，起著決定性的作用。Heijkants等人公開(kāi)Q008) 了通過(guò)組合使用鹽浸和熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)，以聚氨酯制備多孔支架的方法。該方法可以獲得具有非常高的孔隙率和交聯(lián)性的泡沫材料。該方法一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)在于許多可變因素，例如孔隙率、孔徑和交聯(lián)性，在制備過(guò)程中可以單獨(dú)地調(diào)節(jié)而不會(huì)出現(xiàn)毒性物質(zhì)。但是，所得泡沫空隙率的增加卻降低了支架的機(jī)械穩(wěn)定性。W02006093778公開(kāi)了至少部分基于支架層構(gòu)建的三維制品的實(shí)體自由成型制備方法。該方法包括提供支架材料和支撐材料。支撐材料具有泡沫層狀外形。泡沫用于在支架的制備期間支撐支架材料，隨后通過(guò)洗滌出去。在該方法的某些實(shí)施例中，泡沫不被除去，而被保留在結(jié)構(gòu)中。W02006093778中說(shuō)明了將泡沫保留在結(jié)構(gòu)中會(huì)導(dǎo)致問(wèn)題，即其會(huì)夾帶空氣并且可能限制細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)。另外，為了使打印設(shè)備能直接在泡沫中打印，泡沫必須是柔韌的，以使打印裝置的噴嘴能浸入泡沫。因此該泡沫不能是在Heijkants等人的論文中公開(kāi)的聚合物類型。Mo等人Q006)公開(kāi)了一種用于血管組織再生的中空PCL-PLGA復(fù)合物管狀支架。該支架包括中空的涂敷了 PCL的PLGA編織管，這種PLGA編織管通過(guò)以PCL 二氧六環(huán)/水溶液涂敷編織管，然后在相分離后凍干獲得。編織管的這種中空結(jié)構(gòu)使得其對(duì)于在制備、插入和使用時(shí)的壓縮力非常脆弱。因此，本發(fā)明的目的在于提高三維支架的性質(zhì)以用于組織工程。具體地，支架具有改善的機(jī)械穩(wěn)定性的將是有利的。更具體地，支架在制備(例如剪切)、插入和使用(例如植入)過(guò)程中具有改善的壓縮機(jī)械應(yīng)力將是有利的。而且，改善支架內(nèi)細(xì)胞移動(dòng)性以及營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞產(chǎn)生的廢物的運(yùn)輸將是有利的。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法。具體地，本發(fā)明的目的在于提供一種能解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題的方法。因此，本發(fā)明一方面涉及能支撐例如生長(zhǎng)和細(xì)胞分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，所述方法包括-提供包括第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐，所述第一材料包括一種或多種聚合物，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；-向所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分中加入溶液，所述溶液包含一種或多種可生物降解的聚合物與兩種或更多種溶劑的混合物；-除去所述溶劑得到在所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的第二生物相容性材料；所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互連接的腔室使得細(xì)胞生長(zhǎng)成功能組織，并且使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子擴(kuò)散遍及所述支架；本發(fā)明另一方面涉及能支撐例如生長(zhǎng)和細(xì)胞分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，所述方法包括-提供包括第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐，所述第一材料包括一種或多種聚合物，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；-向所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分中加入溶液，所述溶液包含一種或多種生物相容性聚合物與一種或多種溶劑的混合物；-除去所述溶劑得到在所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的第二生物相容性材料；所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互連接的腔室使得細(xì)胞生長(zhǎng)成功能組織，并且使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子擴(kuò)散通過(guò)所述支架；所述網(wǎng)格在制備、插入和使用期間還保護(hù)所述三維生物相容性支架不受壓縮力的影響。本發(fā)明又一方面涉及一種能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形狀為微米級(jí)的線形成的一個(gè)或多個(gè)網(wǎng)格，所述線形成空隙的開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；所述第二材料填充所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互連接，所述第二材料具有多個(gè)均勻分布在其中的開(kāi)孔，所述開(kāi)孔的平均尺寸小至使細(xì)胞不能滲入。本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)明涉及一種能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形狀為微米級(jí)的線形成的一種或多種網(wǎng)格，所述線形成空隙的開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；所述第二材料填充所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中空隙相互連接，所述第二材料具有多個(gè)均勻分布在其中的開(kāi)孔，所述開(kāi)孔的平均尺寸小至使細(xì)胞不能滲入，所述網(wǎng)格為所述第二生物相容性材料提供保護(hù)性機(jī)械支撐，所述網(wǎng)格還保護(hù)所述三維生物相容性支架在制備、插入和使用期間不受壓縮力的影響，所述第二生物相容性材料包含一種或多種生物相容性聚合物。


圖1顯示了所示為PCL在1，4_ 二氧六環(huán)中的濃度與水含量的函數(shù)關(guān)系的初始設(shè)置；圖2顯示了在玻璃圓筒中的凍干的支架，用于切支架的“閘床(Guillotine)”和 IOmm直徑X 5mm高度的最終支架樣品；圖3顯示了經(jīng)NaOH處理前(左圖)后(右圖)的角接觸測(cè)量。處理后表面親水性明顯增強(qiáng)；圖4 顯示了含有 Iwt % 的 H2O (A)、3wt % 的 H2O (B)和 7wt % 的 H2O (C)的支架的 SEM 圖像。水含量越高，觀察到的表面圖像越不均勻；圖5顯示了含有7wt%的H20的溶液制備的支架中的納米結(jié)構(gòu)的高分辨率SEM圖像。最小的特征低至lOnm。整個(gè)支架中形態(tài)是一致的；圖6顯示了來(lái)自ESRF的納米斷層攝影圖像。所示的支架是從含有l(wèi)wt. % H20的溶液制備的實(shí)壁支架(A)和從含有7wt. % H20的溶液制備的多孔壁支架(B)。(A)中壁厚約5 μ m，并且兩幅圖像長(zhǎng)度標(biāo)尺相同；圖7顯示了來(lái)自ESRF的納米斷層攝影圖像。雙級(jí)支架從含有7wt. % H20的溶液制備。該圖的標(biāo)尺與圖6的圖像的標(biāo)尺相等。大孔隙的直徑(白線)為175 μ m，小孔隙直徑約為IOym ；圖8顯示了支架上的lX106hMSC_TERT活/死染色，所述支架從含有Iwt %的 H2O(A)、3wt% WH2O(B)和7wt%mH20(C)的溶液制備。與(C)相比，觀察到(A)和(B)支架細(xì)胞位置更接近表面；圖9顯示了培養(yǎng)1、8和15天時(shí)hMSC-TERT的DNA定量。DNA的量以平均值士SD (η =4)表示。接種為2X106hMSC-TERT/支架；圖10培養(yǎng)1、8和15天時(shí)堿性磷酸酶(ALP)的活性。活性以平均值士SD(n = 4) 表示。活性以納摩爾對(duì)硝基苯酚/毫克DNA每分鐘(nmol/ygDNAXmin)表示。接種量為 2X106hMSC-TERT/支架；圖11顯示了在體外長(zhǎng)達(dá)21天后，組織切片的H&E染色。接種量為 3. 5X106hMSC-TERT/支架。在7wt% H2O的支架中，從第1天觀察到均勻的分布，但是3wt% H2O和H2O的支架中，分別直到15天和21天才觀察到均勻的分布；圖12顯示了細(xì)胞粘附到各支架的SEM圖像。對(duì)于H2O型支架啊(A)和3wt% H2O型支架(B)，細(xì)胞緊密粘附在支架表面上，但是細(xì)胞更接近表面地粘附于7wt% H2O型支架(C)。在左圖中，條帶表示20μπι，在右圖中為IOym;圖13顯示了支架的Goldner三色染色圖像㈧和SEM圖像⑶。在所有類型的支架中，在培養(yǎng)21天后均觀察到hMSC-TERT的礦物化，并且圖像代表了 l-7wt% H20型的支架。觀察到了礦物化的細(xì)胞和表面上的小結(jié)節(jié)(nodule)(條帶在A圖中為150 μ m，在B中為 5 μ m)；圖14顯示了植入小鼠皮下的2mm高的H2O型支架。在左邊的數(shù)字是指在小鼠中的周數(shù)(條帶=Imm)；圖15顯示了抗壓測(cè)試。低、中和高密度對(duì)應(yīng)于20、30和40mg/g聚合物溶液；圖I6顯示了 l(toim (直徑)X 10謹(jǐn)(高度)的3D繪制(plotted)支架。SEM圖像顯示了支架的高孔隙率微結(jié)構(gòu)，其實(shí)心纖維直徑約為175μπι;圖17顯示了在初始吸附M小時(shí)后，打印支架上的細(xì)胞的Actin和Hoechst染色。 一纖維的直徑約為175μπι;圖18顯示了在初始吸附M小時(shí)后，繪制支架上的細(xì)胞的SEM圖像。條帶表示 100 μ m (左)禾口 200 μ m (右)；圖19顯示了打印并凍干的(組合的)支架。纖維直徑約為175 μ m，所用溶液的濃度(以mg (PCL)/g (二氧六環(huán))表示)和水的wt. %顯示在各圖下方；圖20顯示了組合的支架上的hMSC-TERT的活/死染色。本發(fā)明現(xiàn)在將在下文中詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式定義在進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義下列術(shù)語(yǔ)和約定實(shí)體自由成型制備方法(Solid freeform fabrication, SFF)是一類用于制備固態(tài)物體的方法，其通過(guò)將能量和/或物質(zhì)依次傳送至空間中的特殊位置來(lái)制備固體。SFF有時(shí)也被稱作快速成型法、快速制備法、層疊制備法和添加制備法。溶劑澆鑄-粒子浙濾法(SolventCasting-Particulate Leaching(SCPL))使得可以制備具有常規(guī)孔隙率但支架尺寸有限的多孔結(jié)構(gòu)。首先將聚合物溶于合適的有機(jī)溶劑中(例如可以將聚乳酸溶解在二氯甲烷中)，然后將溶液澆注入填充有致孔劑顆粒的磨具中。所述致孔劑可以是例如氯化鈉的無(wú)機(jī)鹽、糖晶體、明膠球或石蠟球。致孔劑顆粒的大小將影響支架空隙的大小，同時(shí)聚合物與致孔劑的比例與最終結(jié)構(gòu)的孔隙率直接相關(guān)。在澆注聚合物溶液后，將溶劑完全蒸發(fā)，然后將模具中的復(fù)合結(jié)構(gòu)浸入適合溶解致孔劑的液體浴中在氯化鈉、蔗糖和明膠用作致孔劑時(shí)，用水作為液體浴，在石蠟用作致孔劑時(shí)，用如己烷之類的脂肪族溶劑作為液體浴。一旦致孔劑完全溶解，便獲得了多孔的結(jié)構(gòu)。除了獲得的支架大小較小外，SCPL另一缺陷在于所使用的有機(jī)溶劑必須完全除去以避免對(duì)接種在支架上的細(xì)胞的任何可能的損傷。最后，與SFF相反，模具決定了支架的整體形狀。氣體發(fā)泡法可以用于克服必須使用有機(jī)溶劑和固體致孔劑的缺陷。該方法通過(guò)將氣體用作致孔劑實(shí)現(xiàn)。首先，通過(guò)壓塑法使用加熱的模具制備由期望的聚合物制成的盤(pán)狀結(jié)構(gòu)。然后將該盤(pán)狀結(jié)構(gòu)至于腔室中，暴露于高壓CO2下數(shù)天。將腔室的內(nèi)部壓力逐漸恢復(fù)至常壓水平。在此過(guò)程中，二氧化碳分子離開(kāi)聚合物而形成空隙，從而得到海綿狀結(jié)構(gòu)。該技術(shù)的一個(gè)問(wèn)題是在壓塑過(guò)程中使用過(guò)量的熱量。過(guò)量的熱量阻止了任何對(duì)溫度不穩(wěn)定的物質(zhì)摻入聚合物基質(zhì)。其次，隨著孔隙的形成會(huì)發(fā)生較大的體積變化，這使得如果不使用模具會(huì)難以控制支架的最終整體形狀。再次，SFF方法中未引入對(duì)支架幾何結(jié)構(gòu)的限制。乳化凍干技術(shù)與SCPL不同，不需要使用固體致孔劑。首先，將合成的聚合物溶于合適的溶劑中(例如將聚乳酸溶于二氯甲烷中)。然后，將水加入聚合物溶液中，混合兩種液體以獲得乳液。在兩相分離之前，將乳液澆注入模具中，并通過(guò)浸入液氮中快速冷凍。隨后，凍干冷凍的乳液以除去分散的水和溶劑，從而得到固化的多孔聚合物結(jié)構(gòu)。與SCPL相比，由于其不需要使用耗時(shí)的浙濾步驟，因此凍干制備方法更加迅速。熱誘導(dǎo)的相分離方法(TIPS)與上述技術(shù)相似，該相分離方法需要使用可通過(guò)降低溫度固化并且易于升華的溶劑。例如二氧六環(huán)可用于溶解聚乳酸。例如通過(guò)加入少量水， 導(dǎo)致形成聚合物富集相和聚合物非富集相，從而有利于聚合物相分離。在相分離期間，冷卻混合物至低于溶劑熔點(diǎn)，隨后凍干以升華溶劑，從而得到多孔的結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“生物相容性”應(yīng)理解成，但不限于，不引起給定的生物體的免疫反應(yīng)或引起的免疫反應(yīng)很小。事實(shí)上，由于機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)和修復(fù)功能非常復(fù)雜，僅說(shuō)明一種材料與一種細(xì)胞類型或組織之間的生物相容性是不夠的。生物“可生物降解的”應(yīng)被理解成，但不限于，在生理環(huán)境下，例如人體內(nèi)或動(dòng)物體內(nèi)，材料發(fā)生化學(xué)(例如生物化學(xué))分解。術(shù)語(yǔ)“開(kāi)孔”應(yīng)被理解成，但不限于，分割的中空空間，其中壁或表面是缺口的。其不應(yīng)與所有有機(jī)體的基本組織單元混淆。因此，“開(kāi)孔”并不涉及有機(jī)物質(zhì)，例如從活組織中分離的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“腔室”將被理解成，但不限于，孔隙、相互連接的孔隙和“開(kāi)孔”。不幸的是， 在組織工程文獻(xiàn)中，腔室和孔隙是指“孔”，并且不應(yīng)與所有有機(jī)體的組織單元相混淆。血液的pH值通常呈微堿性，為7. 4。該值在生物學(xué)也醫(yī)學(xué)中被稱為生理pH值。支架聚合物支架意圖用作暫時(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，直至骨和其它組織發(fā)生再生。因此，支架與體內(nèi)微環(huán)境越接近，其可能會(huì)越成功。已經(jīng)考慮將現(xiàn)有的支架形成可克服具體缺陷的3D植入模型。這主要通過(guò)復(fù)制3D 掃描圖像的融合沉積方法獲得。所用的材料為純聚合物、混合的聚合物或聚合物與骨導(dǎo)顆粒(bone-conducting granule)的混合物。但是單纖維上可供細(xì)胞附著的表面積有限，限制了精確的沉積。因此，在本發(fā)明中提出了新的且合理的解決方案，即將嚴(yán)格的3D結(jié)構(gòu)與提供了供細(xì)胞長(zhǎng)入的充裕表面積的內(nèi)部相結(jié)合。通過(guò)提供具有亞微孔結(jié)構(gòu)與相互連接的空隙的組合的材料，獲得了大量的表面積。亞微孔結(jié)構(gòu)定義為平均孔徑低于約1微米的結(jié)構(gòu)。相互連接，即支架中孔隙和/或亞微孔結(jié)構(gòu)之間的連接，是非常重要的，這是因?yàn)槠湓诩?xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入支架以及營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞產(chǎn)生的廢物的運(yùn)輸中具有決定性作用。亞微孔結(jié)構(gòu)太小以致不能使細(xì)胞滲透，這能使?fàn)I養(yǎng)物和細(xì)胞廢物在整個(gè)支架內(nèi)恒定地和持續(xù)地運(yùn)輸。沒(méi)有亞微孔結(jié)構(gòu)，支架可能會(huì)具有滲入細(xì)胞的凝集風(fēng)險(xiǎn)，該風(fēng)險(xiǎn)會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞廢物運(yùn)輸?shù)奈蓙y。這可能導(dǎo)致不利的支架中心部分的細(xì)胞的死亡。本發(fā)明一方面涉及一種能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形狀為微米級(jí)的線形成的一個(gè)或多個(gè)網(wǎng)格，所述線形成空隙的開(kāi)放網(wǎng)絡(luò)；所述第二材料填充所述開(kāi)放網(wǎng)絡(luò)的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互連接，所述第二材料具有多個(gè)均勻分布在其中的開(kāi)孔，所述開(kāi)孔的平均尺寸低至使細(xì)胞不能滲入。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，所述開(kāi)孔的平均尺寸為約1納米至約6微米，例如為從約 1納米至約5微米，例如為從約1納米至約4微米，例如為從約1納米至約2微米，例如為從約1納米至約1微米，例如為從約1納米至約900納米，例如為從約5納米至約800納米， 例如為從約10納米至約700納米，例如為從約15納米至約600納米，例如為從約15納米至約500納米，例如為從約15納米至約300納米，例如為從約20納米至約100納米，優(yōu)選地例如為從約25納米至約50納米。為確保良好的相互連接性，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，所述第二材料中的所述開(kāi)孔的孔密度在約IO9 (10的9次方)至約IO^1開(kāi)孔每立方厘米所述第二材料，例如從約111° 至約1018，更優(yōu)選地例如從約121°至約IO15每立方厘米所述第二材料。在另一實(shí)施例中，所述第二材料中的開(kāi)孔的總體積包含一定比例的所述第二材料的總體積，該比例在約10%至約99%的范圍內(nèi)，例如從約15%至約98%的范圍內(nèi)，例如從約20%至約95%的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地例如從約50%至約90%的范圍內(nèi)。在又一實(shí)施例中，所述第二材料中的孔隙的平均直徑在低于1000微米的范圍內(nèi)， 例如從約0. 01至約800微米，例如從約0. 1至約700微米，例如從約1至約700微米，例如從約1至約500微米，例如從約10至約400微米，優(yōu)選地例如從約10至約50微米。拉動(dòng)單個(gè)細(xì)胞的力在rfa的范圍內(nèi)，并且是表型特異的。Engler等人Q006)研究了與平面基底剛度變化有關(guān)的各種細(xì)胞反應(yīng)，并由此證明了細(xì)胞對(duì)機(jī)械相互作用的依賴。 具體地，他通過(guò)微陣列分析說(shuō)明了接近1、11和34kPa的基底剛度可特異化間質(zhì)干細(xì)胞譜系，并分別形成神經(jīng)元、肌肉或骨表型。因此，可能根據(jù)感興趣的干細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)本發(fā)明第二生物相容性材料的剛度。本發(fā)明另一方面涉及工程化支架用于骨修復(fù)和再生的用途，例如工程化支架用于修復(fù)腦或脊髓組織修復(fù)和再生的用途。本發(fā)明另一方面涉及工程化支架用于軟骨組織修復(fù)和再生的用途。本發(fā)明又一方面涉及整個(gè)器官或局部器官(例如肝、腎和肺)的組織工程化，例如工程化的支架用于治療肝疾病、腎疾病、肺疾病、骨疾病軟骨疾病或其它組織疾病的用途。本發(fā)明另一方面涉及工程化的支架用于培養(yǎng)細(xì)胞和/或細(xì)菌的用途。本發(fā)明又一方面涉及工程化支架用于軟組織修復(fù)和再生的用途。本發(fā)明還一方面涉及工程化支架用于腦或脊髓組織修復(fù)和再生的用途。本發(fā)明另一方面涉及工程化的支架用于制備醫(yī)藥劑的用途，例如工程化支架用作醫(yī)藥劑的用途。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明支架的植入方法。本發(fā)明又一方面涉及工程化支架用作醫(yī)藥劑的用途。選定組織的壓縮剛度下表顯示了選定組織的壓縮剛度組織(人) GPa組織kPa
皮質(zhì)骨(人)4腦3
骨小梁(人)17眼球的晶狀體 1.9
膠原1肝275
關(guān)節(jié)軟骨800
半月板100
彈性蛋白600
腎45因此，為模擬組織的機(jī)械性質(zhì)，可以考慮支架必須具有與感興趣組織相等的壓縮剛度以避免在機(jī)體自身或外力提供的局部壓力下塌陷。但是，支架的剛度必須同時(shí)足以引導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞譜系生長(zhǎng)成正確的組織。從Engler等人的工作Q006)可知，用于生成骨組織的支架優(yōu)化的剛度為34kPa。但是，骨的壓縮剛度在4-17GPa的范圍內(nèi)。因此，具有此優(yōu)化剛度的支架在機(jī)體自身的局部壓力下會(huì)塌陷。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)制備打印和凍干相組合的支架解決了這個(gè)問(wèn)題。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方面涉及一種能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形狀為微米級(jí)的線形成的一種或多種網(wǎng)格，所述線形成空隙的開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；所述第二材料填充所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分空隙，所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互連接，所述第二材料具有多個(gè)均勻分布在其中的開(kāi)孔，所述開(kāi)孔的平均大小小至使細(xì)胞不能滲入，所述網(wǎng)格為所述第二生物相容性材料提供保護(hù)性機(jī)械支撐，所述網(wǎng)格還保護(hù)所述三維生物相容性支架在制備、插入和使用期間不受壓縮力的影響，所述第二生物相容性材料包含一種或多種生物相容性聚合物。本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)制備的支架，其中三維生物相容性支架的第二生物相容性材料的壓縮應(yīng)力(初始?jí)嚎s剛度)在0.31-6. 32kPa的范圍內(nèi)。當(dāng)與包含第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格組合時(shí)，壓縮應(yīng)力經(jīng)測(cè)試在360-5100kPa的范圍內(nèi)。大試樣的機(jī)械測(cè)試根據(jù) IS03386-1 進(jìn)行。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，支撐網(wǎng)格的壓縮應(yīng)力比第二生物相容性材料高5倍， 如高5-100000倍(例如高10倍)，如高15-90000倍(例如高50倍)，如高55-90000倍 (例如100倍，如高200-50000倍(例如高500倍)，如高700-30000倍(例如高900倍)， 如高 1. 500-20. 000 倍。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，支架的壓縮應(yīng)力值與目標(biāo)組織的壓縮應(yīng)力值相當(dāng)。例如， 發(fā)明人已經(jīng)制備了測(cè)量值為5100kl^壓縮應(yīng)力的支架。所述支架可用于骨小梁的重構(gòu)，其中骨小梁的壓縮應(yīng)力值為5000kPa?！跋喈?dāng)?shù)摹敝祵⒈焕斫獬膳c另一個(gè)值偏離不超過(guò)35%的值，如不超過(guò)25 %，例如20 %，優(yōu)選不超過(guò)10 %，例如5 %。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，支架具有相容的抗壓強(qiáng)度以承受周圍目標(biāo)組織的壓縮力?！跋嗳莸摹笨箟簭?qiáng)度將被理解成這樣的方式當(dāng)支架植入時(shí)，在周圍目標(biāo)組織壓在支架上時(shí)，支架仍然保持基本未被壓縮。支架在使用期間必須不能塌陷?；静槐粔嚎s將被理解成這樣的方式支架體積在使用期間減少不超過(guò)35%，如25%，例如20%，優(yōu)選地不超過(guò) 10%,例如 5%0在本發(fā)明的一方面，將具有分化形成期望組織譜系能力的細(xì)胞接種在支架上。為提高接種效率，隨后可為支架涂覆生物相容性聚合物，從而將細(xì)胞包封在支架中。在一個(gè)實(shí)施例中，第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理 PH值下帶負(fù)電荷。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理PH值下帶負(fù)電荷。另外，所述支架包含體外接種的細(xì)胞，所述支架還包括第一生物相容性聚合物涂層，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，所述細(xì)胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂層之間。在另一實(shí)施例中，如果第一生物相容性聚合物涂層帶正電荷，所述支架還包括第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂層位于所述第一生物相容性聚合物涂層的頂部。在一個(gè)實(shí)施例中，第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理 PH值下帶正電荷。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中，第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理PH值下帶正電荷。另外，所述支架包含體外接種的細(xì)胞，所述支架還包括第一生物相容性聚合物涂層，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，所述位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂層之間。在另一實(shí)施例中，如果第一生物相容性聚合物涂層帶負(fù)電荷，所述支架還包括第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂層位于所述第一生物相容性聚合物涂層的頂部。在又一另外的實(shí)施例中，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂層和第二生物相容性聚合物涂層涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物。另外，支架包含在體外接種的細(xì)胞，所述細(xì)胞位于第一和第二生物相容性聚合物涂層之間。在還一另外的實(shí)施例中，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂層和第二生物相容性聚合物涂層涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理pH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物。另外，支架包含在體外接種的細(xì)胞，所述細(xì)胞位于第一和第二生物相容性聚合物涂層之間。在另一實(shí)施例中，接種的細(xì)胞具有分化形成期望組織譜系的能力。在優(yōu)選的實(shí)施例中，接種的細(xì)胞可以具有不同的類型。另一實(shí)施例涉及通過(guò)上述的任何方法制備/獲得的產(chǎn)品。方法近年來(lái)，已經(jīng)提出了大量的制備高分子支架的方法，包括溶劑澆鑄-粒子浙濾法、 凍干法、快速成型法、電紡絲(electrospirming)等。盡管付出了許多努力，特殊的方法或
12性質(zhì)的組合還未表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，只要制備的支架具有一些常見(jiàn)的性質(zhì)，例如生物相容性、高孔隙率、生物降解性和臨床可操作性。許多支架的制備方法不能精確地控制孔隙大小、孔隙的幾何形狀或支架中通道的形成。當(dāng)申請(qǐng)臨床使用批件時(shí)，由于需要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行清楚的說(shuō)明，這可能是關(guān)鍵的。但是在本發(fā)明中，由于凍干的聚合物的微米和納米結(jié)構(gòu)具有高度的重現(xiàn)性和可操作性，并且由于打印的骨架決定了外部形狀，因此開(kāi)發(fā)的支架具有高度的均一性。最終植入物的大小和外形由計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，以打印期望的3D模板，并加入凍干內(nèi)部。最終的支架可以被理解成開(kāi)放的、相互連接的分級(jí)排列的結(jié)構(gòu)。對(duì)于微米至亞微米長(zhǎng)度標(biāo)尺，快速成型的上/下制備方法用于制備將組成框架的結(jié)構(gòu)，熱誘導(dǎo)相分離的下/上處理方法在框架中形成多開(kāi)孔的支架，該多開(kāi)孔支架具有呈雙峰分布的高度相互連接的孔隙。一組孔隙尺寸大于約20微米，其它組的孔隙或開(kāi)孔的大小低于5微米。因此，本發(fā)明的一方面涉及能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，該方法包括-提供包括第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐，所述第一材料包括一種或多種聚合物，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；-向所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分中加入溶液，所述溶液包含一種或多種生物相容性聚合物與一種或多種溶劑的混合物；-除去所述溶劑得到在所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互連接的腔室使得細(xì)胞生長(zhǎng)成功能組織，并且使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子在整個(gè)支架中擴(kuò)散。本發(fā)明另一方面涉及能支撐例如生長(zhǎng)和細(xì)胞分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，所述方法包括-提供包括第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐，所述第一材料包括一種或多種聚合物，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；-向所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分中加入溶液，所述溶液包含一種或多種生物相容性聚合物與一種或多種溶劑的混合物；-除去所述溶劑得到在所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互連接的腔室使得細(xì)胞生長(zhǎng)成功能組織，并且使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子遍及所述支架擴(kuò)散；所述網(wǎng)格還保護(hù)所述三維生物相容性支架在制備、插入和使用期間不受壓縮力的影響。在一個(gè)實(shí)施例中，在所述第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理PH值時(shí)帶正電荷，所述方法還包括下列步驟a)以細(xì)胞接種從權(quán)利要求1獲得的三維生物相容性支架；b)以一種或多種在生理pH值時(shí)帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆所述接種了細(xì)胞的支架；c)任選地，以一種或多種在生理pH值時(shí)帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架。在另一實(shí)施例中，在所述第二生物相容性材料中的一種或多種生物相容性聚合物在生理PH值時(shí)帶負(fù)電荷，所述方法還包括下列步驟a)以細(xì)胞接種從權(quán)利要求1獲得的三維生物相容性支架；b)以一種或多種在生理pH值時(shí)帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架；c)任選的，以一種或多種在生理pH值時(shí)帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架。在又一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包括a)以一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；b)任選地，以細(xì)胞接種支架；c)任選地，以一種或多種在生理pH值下帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包括a)以一種或多種在生理pH值下帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；b)任選地，以細(xì)胞接種支架；c)任選地，以一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。在還一個(gè)實(shí)施例中，所述混合物包含兩種或更多種溶劑。在另一實(shí)施例中，接種的細(xì)胞具有分化形成所需組織的譜系的能力。在優(yōu)選的實(shí)施例中，接種的細(xì)胞可以是不同的類型。在整個(gè)支架中的擴(kuò)散將被理解成，但不限于，如下意義基本上整個(gè)支架都有擴(kuò)散，如約99%、如約90%、如約80%，如約70%的支架被擴(kuò)散。在支架中，運(yùn)輸機(jī)理(擴(kuò)散和對(duì)流)可被引導(dǎo)通過(guò)較大的通道。術(shù)語(yǔ)“支架”將被理解成，但不限于，準(zhǔn)備用于植入的構(gòu)建物，例如適合用作植入物。在本發(fā)明的某些方面，支架在植入前先剪切以適合缺陷處。支架的大小必須反映缺陷的大小，細(xì)胞的遷移率(例如支架中的遷移率)也需要考慮。當(dāng)不存在打印的支架，并且使用了較高的細(xì)胞密度(3. 5 X IO6/支架)，支架(0.07) 的大部分呈開(kāi)孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)部在約5mm的整個(gè)高度上具有均勻的細(xì)胞分布，因此其間的細(xì)胞遷移必須仔細(xì)考慮。較低的PCL濃度可進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞遷移，因此現(xiàn)在評(píng)價(jià)了 20mg/g以用于組合的支架。支架的骨架/網(wǎng)格應(yīng)該打印為充分開(kāi)放的結(jié)構(gòu)，以使凍干材料獲得全面的孔隙率，從而保證了良好的遷移和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。高孔隙率通過(guò)雙溶劑熱誘導(dǎo)相分離方法獲得，但是機(jī)械性質(zhì)與孔隙率成反比。因此，在打印形式的支架中，穩(wěn)定的骨架/網(wǎng)格被引入高孔隙率的支架中。通過(guò)該制備方法的組合，制備了最外層穩(wěn)定的具有供細(xì)胞粘附和遷移的柔性內(nèi)部的支架。當(dāng)支架用于移植時(shí)是有利的，這是由于完全柔性的支架可以在使用期間可保持住組織以維持與特定缺陷的適配。本發(fā)明另一方面涉及一種方法，其中所述相互連接的腔室通過(guò)熱誘導(dǎo)的相分離和 /或凍干溶劑形成。本發(fā)明又一方面涉及一種方法，其中所述腔室通過(guò)氣體發(fā)泡形成。本發(fā)明另一方面涉及一種方法，其中所述腔室通過(guò)鹽浙濾和熱誘導(dǎo)的相分離方法形成。本發(fā)明還一方面涉及一種方法，其中所述網(wǎng)格通過(guò)實(shí)體自由成型方法制備。本發(fā)明還一方面涉及一種方法，其中所述第二材料中的平均孔隙直徑在0.01至約800微米的范圍內(nèi)，例如從約0. 1至約700微米，例如從約1至約700微米，例如從約1 至約500微米，例如從約10至約400微米，優(yōu)選地例如從約10至約50微米。本發(fā)明另一方面涉及一種方法，其中所述混合物包含至少兩種溶劑，例如約3種至約10種溶劑，例如約3種至約5種溶劑。溶劑的非限制性的實(shí)例為己烷、庚烷、苯、四氯化碳、氯仿、乙酸、乙酸乙酯、THF、二氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、異丙醇、二氧六環(huán)、乙腈、二甲基亞砜、DMSO和水。本發(fā)明還一方面涉及一種方法，其中所述溶劑的凝固點(diǎn)相互隔開(kāi)至少5°C，例如從約5°C至約100°C，例如從約6°C至約95°C，例如從約8°C至約90°C，例如從約10°C至約 70°C，優(yōu)選例如從約5°C至約100°C。本發(fā)明還一方面涉及一種方法，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆， 所述天然或和成涂覆材料例如蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸和/或小干擾RNA。在又一另外的方面，本發(fā)明涉及工程化的組織，該工程化的組織通過(guò)使生物相容性活性支架與細(xì)胞在生物相容性三維支架與細(xì)胞之間發(fā)生有效反應(yīng)的條件下，在體內(nèi)或體外接觸而制備，所述生物相容性活性支架通過(guò)上述方法制備。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞選自干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或分化細(xì)胞，例如部分或完全分化的細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，細(xì)胞選自再生細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肺細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的至少一種。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞是PC12或神經(jīng)元限制前體(NRP)細(xì)胞，工程化的組織是神經(jīng)元形成組織。應(yīng)該注意的是，在本發(fā)明其中一方面的文中所說(shuō)明的實(shí)施方式和特征也適用于本發(fā)明的其它方面。在本申請(qǐng)中所引用的所有專利和非專利文獻(xiàn)均通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容引入本文。本發(fā)明將通過(guò)下列非限制性實(shí)例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的支架可通過(guò)雙光子聚合復(fù)制，其原理公開(kāi)于Andreas Ostendorf等人的論文
實(shí)施例打印和凍干支架的制備支架——凍干支架通過(guò)聚己酸內(nèi)酯(PCL，商品級(jí)6405，Solvay)的熱誘導(dǎo)相分離(TIPS)及隨后的凍干制備。簡(jiǎn)而言之，在室溫下將PCL溶于1，4_ 二氧六環(huán)中。當(dāng)獲得均質(zhì)混合物時(shí)，力口入少量的水。支架的制備過(guò)程在層流工作臺(tái)中進(jìn)行，并且設(shè)置如圖1所示。對(duì)三種類型的支架進(jìn)行生物學(xué)測(cè)試，并且根據(jù)其水含量百分比進(jìn)行標(biāo)注，例如0. 01,0. 03和0. 07。聚合物濃度為20、30或40mg PCL/g 二氧六環(huán)。將混合物澆注入玻璃量筒中(直徑=9. 6mm，室溫下)。將量筒至于凍干機(jī)中，降低溫度至-25 °C O. 5 °C /分鐘)，并保持20小時(shí)。由于1，4- 二氧六環(huán)的凝固點(diǎn)為12 °C，水的為0°C，它們會(huì)在不同的時(shí)間點(diǎn)上形成晶體。當(dāng)混合物完全固化，PCL鏈包裹在晶界中時(shí)，該
15過(guò)程結(jié)束。將溫度升高至_5°C，壓力降低至約50毫托后，進(jìn)行凍干，再進(jìn)行升華(即直接由固相變成氣相)。PCL量筒先在液氮中冷凍，然后由刀片剪切成最終支架大小。在用于體外時(shí)，剪切成5-10mm的高度，在用于體內(nèi)時(shí)，剪切成2mm的高度。通過(guò)乙醇梯度(96%、70%， 50%，間隔30分鐘)對(duì)支架進(jìn)行滅菌，之后再以無(wú)菌水洗滌。為增強(qiáng)支架的親水性，支架表面以1. 25M的NaOH腐蝕16小時(shí)(產(chǎn)生COCT基團(tuán))，再以IM HCl中和1小時(shí)(使COCT基團(tuán)質(zhì)子化形成C00H)，然后再以大量的無(wú)菌水洗滌。干燥支架或?qū)⑵淅洳赜谏睇}水中直至使用。支架——3D打印快速成型設(shè)備Bioscaffolder (SysEng，HUnxe，Germany)用于打印 PCL 支架。PCL 聚合物(τ = 108°C )從直徑為200 μ m的針管中擠出(最終纖維直徑約為175 μ m)，并根據(jù)載入Bioplotter CAM軟件中的模型逐層沉積。沉積速度為MOmm/分鐘，纖維之間的距離約為600 μ m(0/90度型)以獲得高空隙率。支架為圓筒狀(直徑為10mm，高度為5mm)。細(xì)胞和構(gòu)建物的培養(yǎng)用于測(cè)試PCL支架的細(xì)胞為hMSC-TERT，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或補(bǔ)充了 IOOnM地塞米松、290nM抗壞血酸(Merck，Darmstadt, Germany)和5mM甘油磷酸脂的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，以用于礦化測(cè)試(成骨介質(zhì))。接種密度在1-3. 5X IO6每支架之間。構(gòu)建物的細(xì)胞性(cellularity)將高度為5mm的凍干支架接種2 X IO6細(xì)胞，并按照前述在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)21 天。DNA量使用PicoGreen根據(jù)制造商的說(shuō)明(n = 4)進(jìn)行測(cè)定。移植入小鼠為測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞的長(zhǎng)入以及退化行為，將未接種的0. 01和0. 07支架移植入雄性 CDFl小鼠(18-20周，25-45g)。操作在麻醉下Q5mg/kg氟阿尼酮，0. 7875mg/kg枸櫞酸芬太尼和12.5mg/kg安定，靜脈注射)進(jìn)行。在手術(shù)之前，以70%的乙醇對(duì)小鼠皮膚進(jìn)行消毒。在每只小鼠背部的皮膚上剪一個(gè)1厘米長(zhǎng)的切口，并且通過(guò)鈍性分離形成兩個(gè)皮下的小囊。在各個(gè)囊中放置一個(gè)支架，并針對(duì)側(cè)面和小鼠，對(duì)支架順序進(jìn)行隨機(jī)化。兩種支架類型以4種形式出現(xiàn)。以線縫和切口，并在術(shù)后三天對(duì)小鼠進(jìn)行止痛處理(5mg/kg卡洛芬， 皮下注射)。在植入后1-6周，靜脈注射戊巴比妥對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，回收樣品進(jìn)行組織學(xué)分析。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)丹麥機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(Danish Institutional Animal Care and Use Committee)的批準(zhǔn)。活/死染色按照活/死染色試劑盒的說(shuō)明，使用該試劑盒進(jìn)行可行性測(cè)試。組織學(xué)對(duì)于組織學(xué)分析，體外和體內(nèi)樣品均以4%的甲醛溶液(pH 7.0)固定，嵌入 iTechnovit 7100 (Ax-lab，Vedbaek, Denmark)，并使用 Polycut E 顯微鏡用薄片切片機(jī) (Reichert&Jung,Heidelberg,Germany)切成10 μ m切片。切片取自支架的中心部分，并以蘇木精和曙紅染色。使用CamediaC-5060數(shù)碼相機(jī)(Olympus，Denmark)在BX50顯微鏡上獲取圖像。其它體外切片以Goldner三色法染色。該方法由以下步驟組成以0.4%酸性品紅(5分鐘)，橙黃G(20分鐘)和2%的淡綠(5分鐘)染色，各染色步驟之間以乙酸沖洗。 切片用蒸餾水中的蘇木素進(jìn)行復(fù)染。核染色質(zhì)染成藍(lán)色，礦物化骨染成綠色，膠原/類骨質(zhì)染成亮紅色。肌動(dòng)蛋白免疫染色細(xì)胞骨架的排列根據(jù)肌動(dòng)蛋白染色確定。將培養(yǎng)了 M小時(shí)的構(gòu)建物以4%的多聚甲醛PBS溶液固定，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明使用微絲骨架和粘著斑染色試劑盒(Chemicon International, Inc)染色。TRITC共軛的鬼筆環(huán)肽稀釋度為1 400 (在室溫下孵育60分鐘，肌動(dòng)蛋白染色)，DAPI稀釋度為1 1000(孵育5分鐘，核對(duì)比染色)。在激光掃面顯微鏡5IOMeta上獲取圖像。激光激發(fā)為M3nm，濾光片在520/5M之間透光，在580nm下可見(jiàn)肌動(dòng)蛋白。SEM對(duì)于SEM，支架在液氮中冷凍后以刀片在中部切片，而構(gòu)建物以含有0. IM 二甲胂酸鈉緩沖液(PH 7.4)的2. 5%的戊二醛固定，并在轉(zhuǎn)移至干燥器空氣干燥之前以梯度乙醇脫水(50 %、70 %、90 %、99 %，間隔30秒)。支架和構(gòu)建物使用低真空二次電子檢測(cè)儀(Nova NanoSEM 600，F(xiàn)EI Company)分析。高分辨率X射線斷層攝影X射線斷層顯微鏡(XTM)研究在歐洲同步輻射裝置(European Synchrotron Radiation Facility)第19實(shí)驗(yàn)站(Grenoble，F(xiàn)rance)中進(jìn)行，這利用了由同步加速器實(shí)現(xiàn)的高X射線強(qiáng)度獲得高對(duì)比度。正弦式軌跡激勵(lì)磁鐵用于選擇20keV的光子，通過(guò)所用的檢測(cè)器，X射線敏感的轉(zhuǎn)換器產(chǎn)生可見(jiàn)光，并且在FReLoN相機(jī)中，在冷卻的電荷耦合裝置上成像。最終分辨率由光束的性質(zhì)特性決定，檢測(cè)器的有效像素大小選定為0. ^ymJSg 為0. 6X0. 6mm2。從單個(gè)樣品確定的數(shù)據(jù)包括1500幅角掃描圖像，所述圖像在樣品旋轉(zhuǎn)期間獲得，其中步長(zhǎng)為0. 12°，樣品與檢測(cè)器的距離為8mm。曝光時(shí)間為每幅圖像0. 15秒。在該圖像獲得方案后計(jì)算物質(zhì)的空間分布，所述物質(zhì)使用平行光過(guò)濾的逆投影算法從工程圖像中重構(gòu)，該過(guò)程由ESRF軟件PyHST實(shí)時(shí)。這提供了包含具有0-255的灰度值的三維像素的3D圖像。從該圖像，材料的形態(tài)的渲染可通過(guò)在等值的像素之間插入表面積而可視化為等值面。在此圖像中的單個(gè)像素具有^OX^OX^Onm的大小。因此通過(guò)該3D圖像，切片可揭示分析的支架的形態(tài)。分析了約8mm3的樣品(η = 2)。它們以氰基丙稀酸酯膠固定在鋁制圓筒表面上，圓筒置于斷層攝影操作臺(tái)的回轉(zhuǎn)臺(tái)上。聚己酸內(nèi)酯支架在玻璃管中凍干PCL會(huì)得到長(zhǎng)筒狀的支架(圖2)。其在閘床(guillotine)中手動(dòng)剪切，所以最終支架在高度上稍有不同。熱解質(zhì)譜分析法顯示，無(wú)論支架中的水含量，其中不存在有機(jī)溶劑。無(wú)論水含量，凍干會(huì)導(dǎo)致表面具有很高的疏水性。如接觸角測(cè)試所顯示的(圖3)， 該角度在NaOH處理后顯著降低，顯示該表面變得具有明顯更高的親水性。SEM顯示了一些結(jié)構(gòu)上的差異，即0.01支架比0.07和0.03的表面更加均勻(圖 4)。0. 07支架的表面形態(tài)非常粗糙，具有許多裂縫和鼓包，但是0. 01支架外表較為光滑。 在一些制備批次之間，這些外觀是可以再現(xiàn)的。當(dāng)仔細(xì)觀察0. 07支架時(shí)，可以觀察到均勻精細(xì)的ECM裝結(jié)構(gòu)(圖5)，這接近地模擬了天然組織的各種纖維尺寸。高分辨率微斷層攝影顯示了取決于制備期間加入水量的雙級(jí)支架結(jié)構(gòu)(圖6)，這是由于兩種溶劑的結(jié)晶點(diǎn)不同。支架由規(guī)則的大約250 μ m的較大孔隙組成，孔隙壁上的孔隙率的量不相同(從0.01支架0至0.07支架的1-5 μ m)。水量的增加導(dǎo)致供細(xì)胞附著的表面積顯著增加。該雙級(jí)孔隙在二氧六環(huán)結(jié)晶(較大孔)后由殘留在聚合物溶液中結(jié)晶水 (小孔)形成，由于1-3%的水含量不會(huì)形成多孔的孔隙壁，因此需要一定量的大于5-6%的水。對(duì)于具有較低濃度聚合物(30mg/g)的0.01支架，所得的支架的壁較薄，但是孔隙大小相似，并且沒(méi)有二次分級(jí)(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)對(duì)較大的0.07支架切片進(jìn)行觀察時(shí)，可以看到花狀的結(jié)構(gòu)(圖7)。殘留在孔隙壁中的水晶體在升華時(shí)可能引起了爆炸式的轉(zhuǎn)變，這是由于許多壁看起來(lái)是內(nèi)-外指向的(例如，參見(jiàn)正好位于白線的上端的扇狀區(qū)域)。在活/死染色中(圖8)，與更常規(guī)分散在0. 07中的細(xì)胞相比，從0. 01至0. 07的強(qiáng)度梯度可以反映0.01中的細(xì)胞的高表面值。一般而言，細(xì)胞在表面上的接種形態(tài)反映了支架表面的波浪狀的特征，這導(dǎo)致了細(xì)胞層的不均勻的外觀。PCL支架的細(xì)胞性從DNA定量估算。大量的0. 07支架在滅菌期間溶解，因此沒(méi)有獲得可靠的DNA定量(n = 4/時(shí)間點(diǎn))所需的數(shù)據(jù)。因此，僅顯示了 0.01和0.03的結(jié)果 (圖9)。在所有的時(shí)間點(diǎn)上，0.01支架中的細(xì)胞性略高，但是沒(méi)有明顯的差異。在培養(yǎng)期間細(xì)胞性有較小的增加，這顯示增殖不是最佳的，經(jīng)推測(cè)是因?yàn)榧?xì)胞盡在支架表面生長(zhǎng)(見(jiàn)圖11的組織學(xué)圖像)。對(duì)于ALP酶活性，兩種支架類型均在8天后達(dá)到峰值水平(圖10)。在三種類型的支架中，細(xì)胞的長(zhǎng)入有很大的不同(圖11)。0. 01和0. 03支架在第1天和第7天有較淺的一層細(xì)胞，然而0. 07支架在第一天起整個(gè)橫截面上就已經(jīng)有均勻分布的細(xì)胞。在0. 01支架中，直到第21天細(xì)胞才分布均勻， 而0. 03支架要到第14天。0. 07支架是第一個(gè)在第1天便觀察到完全均勻的細(xì)胞分布的支架。細(xì)胞粘附在所有的三種支架上(圖12)。在0.01支架上，細(xì)胞是平滑的，并且緊鄰支架結(jié)構(gòu)，僅有數(shù)個(gè)較小的凹陷橫跨在表面上。在0. 03支架中，拉伸的外觀比較明顯，但是 0. 07支架最為顯著，其中伸出的細(xì)胞固定了許多粘附點(diǎn)從而橫跨了大量的凹陷。在0. 07支架上，細(xì)胞傾向于具有浮動(dòng)的外觀，僅接觸支架架構(gòu)的端部，這未得到組織學(xué)切片的證實(shí)。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)三周后，通過(guò)三色法染色的組織學(xué)切片，觀察到形成了礦物化細(xì)胞的區(qū)域(圖13)。在染色片中觀察到了不同的分化水平；灰綠色的細(xì)胞是礦物化的成骨細(xì)胞，紅色圓形的是未礦物化的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，細(xì)長(zhǎng)的亮紅色細(xì)胞是未分化的前體細(xì)胞。SEM顯示在構(gòu)建物的表面的簇中有較小的(0.5-1μπι)結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)形成。圖像代表了三種類型的支架。將空支架皮下植入小樹(shù)，在實(shí)驗(yàn)期間未觀察到炎癥跡象或不良組織反應(yīng)。從第一周就觀察到接受的細(xì)胞的長(zhǎng)入，但是直到第四周才獲得完全細(xì)胞化的支架(圖14)。在觀察階段期間，發(fā)現(xiàn)形成了越來(lái)越多的基質(zhì)以及支架的收縮。第六周后，支架中完全滲入了細(xì)胞，但是沒(méi)有明顯的降解。在第六周的切片中觀察到了一些與炎性反應(yīng)有關(guān)的多核細(xì)胞，這表明了宿主組織和PCL之間的生物相容性。這些支架的機(jī)械性質(zhì)普遍會(huì)存在問(wèn)題。獲得的支架的穩(wěn)定性非常低，并且在“閘床”剪切和NaOH制備期間經(jīng)常可以觀察到崩潰現(xiàn)象。壓力測(cè)試表明孔隙率和剛性成反比， 0. 01,0. 03和0. 07的估計(jì)剛性分別為0. 31,5. 76和6. 32kPa。為優(yōu)化支架的機(jī)械性質(zhì)，試驗(yàn)了另一制備方法，快速成型或3D打印方法。針對(duì)定義的結(jié)構(gòu)和孔隙率，3D打印方法獲得了非常均勻的支架(圖16)。各層沉積在彼此的頂部，并且由于聚合物溶液在打印時(shí)會(huì)融合，因此單個(gè)纖維固定在臨近的纖維上，從而得到具有良好穩(wěn)定性的多層結(jié)構(gòu)。由于各纖維為實(shí)體，因此該方法獲得的支架的機(jī)械性質(zhì)與凍干的支架相比明顯增強(qiáng)。肌動(dòng)蛋白絲與細(xì)胞的附著和遷移高度相關(guān)，其染色用于說(shuō)明hMSC-TERT 細(xì)胞和打印支架的生物相容性(圖17)。拉長(zhǎng)的肌動(dòng)蛋白的表面上有大量的附著點(diǎn)，這些附著點(diǎn)會(huì)被認(rèn)為是在融合沉積工藝后支架和細(xì)胞的相容性的表現(xiàn)。但是由于不存在凍干支架的高孔隙率的支架壁，因此聚集在支架上的細(xì)胞的密度會(huì)低很多。根據(jù)肌動(dòng)蛋白染色，SEM顯示打印的支架具有良好的細(xì)胞粘附性，并且細(xì)胞在支架的各層之間伸展(圖18)。為結(jié)合兩種類型支架的最佳的性質(zhì)，制備了打印和凍干(組合)支架。打印的PCL 芯材在冷凍和凍干之前，先浸入二氧六環(huán)-水-聚合物溶液。根據(jù)工藝窗(process window) (圖1)測(cè)定全范圍的聚合物濃度和H2Owt. %，并且可以在繪制的支架內(nèi)合成所有之前的結(jié)構(gòu)(圖19)。從而獲得了具有良好的細(xì)胞粘附性和長(zhǎng)入的機(jī)械穩(wěn)定的支架。通過(guò)繪制的微米級(jí)結(jié)構(gòu)提供了高剛度，并且該高剛度可通過(guò)網(wǎng)格布局調(diào)整。由熱誘導(dǎo)的相分離期間形成的結(jié)構(gòu)引入支架的納米結(jié)構(gòu)提供了極高的表面積和滲透性。納米結(jié)構(gòu)的特征可通過(guò)改變濃度水平調(diào)整。最重要的是用于調(diào)節(jié)宏觀性質(zhì)的機(jī)理與用于調(diào)節(jié)納米級(jí)性質(zhì)的機(jī)理并不關(guān)聯(lián)，因此這些性質(zhì)可單獨(dú)地調(diào)節(jié)。由于打印結(jié)構(gòu)決定了形式，過(guò)量的凍干物質(zhì)可以通過(guò)鉗子除去，所以支架幾乎可以形成任何3D外形。這克服了模具的邊緣效應(yīng)，該效應(yīng)可能閉合供營(yíng)養(yǎng)物流動(dòng)的支架周邊?；?死染色確認(rèn)了組合支架也具有全細(xì)胞活性(圖20)。在PCL 0. 07上觀察到了高伸展的細(xì)胞，盡管在打印的PCL支架上，細(xì)胞在形態(tài)上看起來(lái)更圓——這可能是由于繪制的PCL的表面比其它支架表面更加平滑。打印和凍干支架在兔軟骨細(xì)胞上的體內(nèi)測(cè)試將兔軟骨細(xì)胞接種在打印和凍干支架上，并與商業(yè)產(chǎn)品Chondro-Gide (CG，從I 型和III型膠原蛋白制備)的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。軟骨相關(guān)的基因(S0X 9，AGC, Col II和Col X)和成骨相關(guān)的基因Col I的轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)qRT-PCR測(cè)量。實(shí)時(shí)定量聚合物酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)使用TaqMan⑥基因表達(dá)測(cè)試儀(Applied Biosystems)在7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上，在標(biāo)準(zhǔn)的酶和循環(huán)條件下進(jìn)行。接種的支架的SOX 9的表達(dá)是CG的2倍。接種的支架的Col II的表達(dá)是CG的4倍。接種的支架的AGC的表達(dá)是CG的5倍。接種的支架的Col X的表達(dá)與細(xì)胞刮的相同，表面了相同的活性。接種的支架的Col I的表達(dá)比所有的細(xì)胞刮(cell scrape)低4被，表面當(dāng)細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)時(shí)形成較少的瘢痕組織。宏觀封裝的打印支架的制備該研究評(píng)價(jià)了打印支架的涂層和接種系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞接種效率、增殖和分化的影響。 這些參數(shù)對(duì)于組織工程的成功是最重要的。涂層系統(tǒng)是天然的和合成的聚合物的混合物， 使用三步方法與細(xì)胞一起施加到支架上。申請(qǐng)人使用了永生化hMSC群在兩種不同的培養(yǎng)方法(反應(yīng)瓶和靜態(tài)培養(yǎng))下來(lái)測(cè)試基于PCL的打印支架，該支架通過(guò)聚合電解質(zhì)復(fù)合凝聚涂敷了透明質(zhì)酸、甲基化的膠原和三元共聚物。為提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)在3D支架中的接種效率和活力，實(shí)施了通過(guò)聚合電解質(zhì)復(fù)合凝聚的宏觀封裝。用于復(fù)合凝聚的兩種復(fù)合電解質(zhì)為甲基化膠原以及甲基丙烯酸羥乙基酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的三元共聚物(HEMA-MMA-MAA)。通過(guò)調(diào)節(jié)接觸時(shí)間，可以形成封裝3D支架的不同厚度和密度的膠原-三元共聚復(fù)合物。該水性凝膠的密度可以通過(guò)控制許多參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如聚合電解質(zhì)對(duì)的材料性質(zhì)、聚合電解質(zhì)在復(fù)合凝聚期間的接觸時(shí)間，這可以確保有效的細(xì)胞捕獲同時(shí)不會(huì)損及基質(zhì)內(nèi)的傳質(zhì)。支架的制備和表面處理聚己酸內(nèi)酯(PCL)支架以Bic^caffolder (SYS+ENG GmbH，德國(guó))通過(guò)融合沉積成型方法制備。以活檢咬取鉗(biopsy punch) (Acuderm, Florida)從5mm厚的多孔PCL墊中沖出直徑為IOmm的圓筒狀支架。整體纖維寬度和高度分別為170和120 μ m。在各沉積層中，中心-中心纖維距離為1.0mm，各連續(xù)層的纖維取向呈105°角，偏移0.17mm。為提高表面的親水性從而促進(jìn)細(xì)胞的附著，以乙醇和氫氧化鈉處理支架，以切斷表面的聚合物鏈，以及使端基羥基化。支架以無(wú)菌水潤(rùn)洗多次，干燥并置于無(wú)菌干燥器中保存。甲基化膠原和三元共聚物的制備陽(yáng)離子型膠原通過(guò)使用甲醇酯化羧基制備(Chia，Leong等人，2000)。甲基化膠原的濃度為3mg/ml。陰離子型HEMA-MMA-MAA三元共聚物按照其它部分的描述合成和純化 (Chia, Leong等人，2000)。用3%的三元共聚物宏觀封裝3D支架。支架上的共聚合膜的裝配和特征在室溫下在抽空的干燥器中，將支架浸入在4.0mg/ml的透明質(zhì)酸溶液中 (780kDa, Lifecore Biomedical he.，批號(hào)P9805-9A) 24 小時(shí)，然后凍干(Lyphoware，NJ， US)。移取100 μ 1 (微升)3mg/ml的甲基化的膠原溶液進(jìn)入干燥的透明質(zhì)酸預(yù)涂敷的支架， 然后以最后一層3%的三元共聚物溶液覆蓋，從而完成宏觀封裝。在接觸10分鐘后，復(fù)合凝聚反應(yīng)亦磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ淬滅。掃描電子顯微鏡(SEM)用于檢查支架上共聚合物膜的形態(tài)和分布。hMSC-TERT 的擴(kuò)培端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群hMSC-TERT細(xì)胞群用于本研究。這些細(xì)胞保持了其初始MSC的功能特征，并且在特殊刺激下能分化形成某些中胚層細(xì)胞類型(成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)。在含有10%的胎牛血清(FBS)的Dulbecco' s改性的必需培養(yǎng)基 (DMEM)中，將來(lái)自PD水平沈2 (通道45)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)燒瓶中，并在37°C和5% CO2的潮濕氛圍中培養(yǎng)。一周后，以PBS洗滌細(xì)胞，以在PBS中的1. 25%的胰蛋白酶和5mM的EDTA 分離，補(bǔ)種，再培養(yǎng)一周。胰蛋白酶處理細(xì)胞(PD水平271，通道47)，再分散于DMEM/10% FBS (青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100mg/l))中備用(4X IO7細(xì)胞/ml)。hMSC-TERT在PCL支架中的宏觀封裝將涂敷了透明質(zhì)酸的支架置于瓊脂糖涂敷的6孔培養(yǎng)板G個(gè)支架/孔)中。將在 3mg/ml的甲基化膠原溶液中的2 X IO7細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸浮液100 μ 1分散在支架上，從而得到了 1 X IO6細(xì)胞/支架的接種量。將接種的支架孵育2小時(shí)，然后通過(guò)100 μ 1的3%的三元共聚物溶液以滴加的方式包封。接觸10分鐘后，向各孔中加入7. 5ml DMEM/10% FBS, 100U/ml青霉素、100mg/l鏈霉素，并將該支架孵育過(guò)夜以使細(xì)胞附著。在對(duì)照組中，未涂敷
20的PCL支架接種了 IX IO6細(xì)胞/支架。未涂敷的和涂敷的PCL支架的旋動(dòng)反應(yīng)瓶培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)M小時(shí)后，將支架轉(zhuǎn)移至新的瓊脂糖涂敷的6孔板(1支架/孔)或置于直徑為 58mm的單側(cè)壁反應(yīng)瓶(Bellco glass, Vineland NJ, USA) 0裝配具有4個(gè)枕頭的可加熱剛結(jié)構(gòu)，并將其置于反應(yīng)瓶中。各枕頭上放置兩個(gè)接種了細(xì)胞的支架，每個(gè)反應(yīng)瓶上共裝有8 個(gè)支架。于側(cè)臂帽松散地連接的CO2孵育器中，將具有120ml介質(zhì)的反應(yīng)瓶置于具有4mm的攪拌棒的Bell-enniumTM五位磁力攪拌器(Bellco Biotechnology, NJ, USA)中，攪拌速度為30轉(zhuǎn)每分鐘。從第一天開(kāi)始，介質(zhì)是用于DNA、ALP和基因表達(dá)分析的DMEM/10% FBS，其含有 10-8M 1，25-(OH)2-維生素 D3 (Vit D, LEO Pharma，Denmark)。在第 1、7、14 和 21 天， 各組的四個(gè)支架(涂敷的和未涂敷的、靜態(tài)的和反應(yīng)的)以PBS潤(rùn)洗，并冷凍以用于DNA定量，收集三個(gè)支架用于活/死染色、組織學(xué)和SEM，另外的四個(gè)支架在冷的PBS中潤(rùn)洗并冷凍在Iml Trizol (Invitrogen, Taastrup, Denmark)中用于基因表達(dá)分析。此外,在第7天和 14天，四個(gè)支架用于ALP活性測(cè)試。細(xì)胞接種效率根據(jù)下式確定％接種效率=第一天的每個(gè)支架的DNA量/每100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的DNA量。對(duì)于鈣沉積測(cè)量，將接種了細(xì)胞的支架在DMEM/10% FBS中培養(yǎng)1周，然后以成骨刺激介質(zhì)(含有IOOnM地塞米松、290 μ M抗壞血酸和5mM β -甘油磷酸鹽的DMEM/10% FBS， Sigma)替換培養(yǎng)基。在第14天、21天和觀天，收集各組的四個(gè)支架用于鈣測(cè)試，另外的支架進(jìn)行von Kossa染色。所有培養(yǎng)基中的介質(zhì)每3_4天進(jìn)行更換。DNA 定量3D多孔支架中的總細(xì)胞數(shù)量通過(guò)使用Quant-iTaPicoGreen dsDNA測(cè)試 (Invitrogen)測(cè)量每個(gè)支架中的dsDNA量進(jìn)行測(cè)量。支架在Iml MEM中冷凍，融化，再以 1秒開(kāi)/5秒關(guān)閉的間隔進(jìn)行超聲波降解，總共進(jìn)行1分鐘。向各DNA樣品中加入3mg膠原酶，然后在45°C的水浴下孵育過(guò)夜。以Tris-EDTA緩沖液將樣品體積稀釋10倍，渦旋以從支架碎片中釋放DNA。從各樣品中取出2Χ50μ 1，與PicoGreen 制備，避光孵育5分鐘， ^fflBlfeftVictor3 1420Multilabel Counter(PerkinElmer Life Sciences,Denmark) 96孔板中進(jìn)行測(cè)量。在480nm下激發(fā)樣品，在520nm下測(cè)量熒光發(fā)射強(qiáng)度。根據(jù)制造商的說(shuō)明制備標(biāo)準(zhǔn)物(lambda DNA，濃度范圍0_1 μ g/ml)。技術(shù)復(fù)制用于各生物樣品?；?死染色支架以PBS潤(rùn)洗，并以在PBS中的2μ M鈣黃綠素AM和4 μ M乙錠同源二聚體 (EthD-I) (LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes)避光染色 30 分鐘。非熒光鈣黃綠素AM通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯酶的活性轉(zhuǎn)變成熒光的鈣黃綠素，其將活力細(xì)胞染成綠色，但是 KhD-I進(jìn)入膜受損的細(xì)胞并通過(guò)與DNA結(jié)合將死細(xì)胞染成紅色。圖像使用激光掃描共聚焦顯微鏡510Meta(Zeiss Microimaging GmbH, Germany)立即獲得。所有細(xì)胞圖像的共聚焦設(shè)置(激發(fā)、激光功率、檢波器增益和針孔大小)均相同。使用單獨(dú)的通道和過(guò)濾器，鈣黃綠素的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為494/517nm，EthD-I的為5^/617nm。堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)試ALP活性使用色度終點(diǎn)測(cè)試法測(cè)定，該測(cè)試法測(cè)量在ALP的存在下對(duì)硝基苯基磷酸酯(Sigma)轉(zhuǎn)變成黃色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的酶轉(zhuǎn)化率。對(duì)硝基苯酚的吸光度通過(guò)顯微分光光度計(jì)在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為405/600nm下測(cè)量。標(biāo)準(zhǔn)物從對(duì)硝基苯酚(濃度范圍0-0. 2mM)制備。技術(shù)復(fù)制用于各生物樣品。鈣含量測(cè)試接種了細(xì)胞的支架的鈣含量通過(guò)色度終點(diǎn)測(cè)試法定量，該測(cè)試法基于一種鈣離子與兩種偶氮胂III分子絡(luò)合形成藍(lán)紫色產(chǎn)物這種絡(luò)合反應(yīng)(Diagnostic Chemicals Limited, Charlottetown，ΡΕ, Canada)。簡(jiǎn)而言之，將鈣沉積物溶于IM的乙酸中，并置于搖床中過(guò)夜。樣品以ddH20稀釋50倍，再將等分的20 μ 1稀釋液轉(zhuǎn)移至96孔板中。加入偶氮胂III溶液O80ml)，在室溫下孵育10分鐘。制備從0至50 μ g/ml的鈣標(biāo)準(zhǔn)物的系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，并以顯微分光光度計(jì)在650nm下定量Ca2+濃度。鈣含量以Ca2+的毫克數(shù)表示。Von Kossa 染色支架以PBS輕輕地潤(rùn)洗，并在甲醛中固定5分鐘，然后以ddH20洗滌，與2. 5 %的硝酸銀溶液避光孵育20分鐘，隨后加入對(duì)苯二酚顯色兩分鐘。最后，使用硫代硫酸鹽除去剩余的銀，時(shí)間為5分鐘。在真空中干燥支架，然后拍照。將支架嵌入在Technovit 7100 (Ax-lab, Vedb3/4k, Denmark)中，^ ^ ffi Sawing Microtome KDG 95(Meprotech, Heerhugowaard, theNetherlands)切成25 μ m的切片。以0. 1 %的甲苯胺藍(lán)染色切片。觀察圖像，并使用數(shù)碼相機(jī)(Camedia C-5060)在BX50顯微鏡上拍照(所有的照片均使用 Olympus 拍攝，Denmark)。組織學(xué)支架以70% 的乙醇固定，嵌入 iTechnovit 7100 (Ax-lab，Vedb3/4k，Denmark)，使 M Sawing Microtome KDG 95 (Meprotech, the Netherlands) 25 μ m 的。 ^])^ 自支架的周圍部分和中心部分，支架以在PBS中的lmg/1 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Brondby, Denmark)在37°C下染色10分鐘，再裝配。觀察圖像，并使用數(shù)碼相機(jī)(Camedia C-5060)在BX50顯微鏡上拍照(所有的照片均使用Olympus拍攝，Denmark)。RNA提取和實(shí)時(shí)RT-PCR以1ml Trizol收集的支架劇烈漩渦處理，加入氯仿，再次漩渦樣品。以異丙醇沉淀 RNA,以75%的乙醇洗滌，并溶于無(wú)核糖核酸酶、DEPC處理的水(Ambion，Cambridgeshire, UK)中。RNA的量、純度和完整性使用UV/vis分光光度計(jì)(在260和^Onm下的吸光度) 和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量。然后以脫氧核糖核酸酶I (Invitrogen)處理RNA樣品。使用High Capacity cDNAArchive Kit (Applied Biosystems, Naerum, Denmark)從 2 μ g 總 RNA 制備 cDNA。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)在7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上在標(biāo)準(zhǔn)酶和循環(huán)條件下進(jìn)行，Hs00427621ml (TATA盒結(jié)合蛋白，TBP)、Hs99999907_ml ( β-2-微球蛋白，Β2Μ)、Hs99999908_ml (葡萄糖酸酸酶 β，GUSB)，Hs00165814_ml (S0X9)、Hs00153936_ ml (Aggrecan, AGC)、Hs00166657_ml(Col X)、Hs00231692_ml (Runx2)，Hs00758162_ ml(ALP)、Hs00164004_ml(I 型禾口 α-I 型膠原，Col I)、Hs01587813_gl (骨鈣蛋白，0C)、 Hs00277762_ml(骨粘連蛋白，ON)、Hs00167093_ml (骨涎蛋白 I，BSP I/骨橋蛋白，0P)、 Hs00173720_ml (骨涎蛋白II，BSPII)使用TaqMan 基因表達(dá)測(cè)試，人RNA聚合物II (RPII) 使用定制的TaqMan 測(cè)試。所有的這些測(cè)試均包括兩種未標(biāo)記的引物和一種跨越外顯子邊界的FAMTM染料標(biāo)記的TaqMan MGB核酸外切酶探針。擴(kuò)增子大小均小于170bp。使用了用于7500快速系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)酶和循環(huán)條件。將對(duì)應(yīng)于40ng RNA的模板cDNA加入各PCR反應(yīng)中，并且對(duì)各種基因，各生物樣品進(jìn)行技術(shù)復(fù)制。使用7500快速系統(tǒng)序列檢測(cè)軟件(1.3 版，F(xiàn)ast System Sequence Detection Software)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。感興趣的基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為BestKe印er指數(shù)(Pfaffl等人，2004)，基于來(lái)自GAPDH、UBC和RPII的閾值循環(huán)(Ct)的幾何平均值對(duì)各樣品進(jìn)行計(jì)算。下列等式用于各樣品感興趣的基因的相對(duì)表達(dá)=2Ct (BestKe印er)-Ct (感興趣的基因)。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于η = 4的生物復(fù)制物，結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。統(tǒng)計(jì)使用Mata 10. 0 (College station, TX)進(jìn)行測(cè)量。ALP活性、鈣含量和基因表達(dá)使用方差分析(時(shí)間X處理)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)發(fā)現(xiàn)有明顯的主效應(yīng)或主效應(yīng)間有相互作用時(shí)，使用t檢驗(yàn)(方差齊性)或威爾科克森秩和檢驗(yàn)(方差非齊性)做具體的比較。當(dāng) P < 0. 05時(shí)，平均值之間的差異被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。支架上的共聚膜的特征PCL支架的SEM顯微(未顯示)顯示了約180 μ m寬的PCL顯微如何形成支架。其中心-中心纖維距離為1mm，各層纖維之間邊緣-邊緣的距離為640 μ m。未涂敷的纖維的表面顯示了 20-50μπι寬的凹陷和淺層裂縫，這些凹陷和裂縫在球粒形成期間產(chǎn)生。當(dāng)支架以聚電解質(zhì)復(fù)合凝聚宏觀封裝后，透明質(zhì)酸-甲基化的膠原-三元共聚物復(fù)合物形成在支撐網(wǎng)格(PCL支架)中和周圍。包含納米纖維網(wǎng)格的共聚物復(fù)合物均勻地分布在PCL支架中，并且由PCL支架支撐。細(xì)胞接種效率假定在接種后的首個(gè)M小時(shí)期間，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞分裂，未涂敷的PCL支架的接種效率經(jīng)計(jì)算為49. 6%，涂敷的PCL支架為70. 7% (t_檢驗(yàn)，ρ = 0. 0001，η = 4)。DNA 定量由于DNA的量與細(xì)胞的量成比例，所以從支架中提取DNA。從而可以追蹤細(xì)胞隨著時(shí)間的增殖。在培養(yǎng)期間，在所有的培養(yǎng)物中，均能觀察到DNA的量增多。對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，在第7天(ρ = 0. 001)和14天(ρ = 0. 003)，涂敷的支架的DNA水平明顯較未涂敷的高。對(duì)于動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)物，在第7天(ρ = 0. 006)和14天(ρ = 0. 013)，未涂敷的支架的DNA 水平高于涂敷的支架。在第14天和21天，對(duì)未涂敷的和涂敷的支架，與靜態(tài)的培養(yǎng)相比， 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的DNA水平較高。活/死染色和共聚焦顯微法在活/死熒光標(biāo)記方法染色后，通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)支架表面上的活細(xì)胞的分布進(jìn)行可視化。在第一天，接種導(dǎo)致了涂敷的支架和未涂敷的支架上的細(xì)胞有輕微不規(guī)則的分散。但是在第7天，在靜態(tài)培養(yǎng)物中，涂敷的支架和未涂敷的支架上，細(xì)胞增殖和遷移覆蓋了整個(gè)支架表面，從而克服了上述現(xiàn)象。但是對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，在所有的時(shí)間點(diǎn)上，涂敷的支架顯示了在支架表面上分布得更加均勻的細(xì)胞群，相比于未涂敷的支架。對(duì)于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)物，在第14天和21天，涂敷的和未涂敷的支架的表面均獲得了均勻分散的細(xì)胞曾。在第 14天，未涂敷的支架比涂敷的支架顯示了更加融合的細(xì)胞層，但是在第21天，兩者沒(méi)有差另O。靜態(tài)培養(yǎng)物與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)物相比，靜態(tài)培養(yǎng)物中獲得了更加融合的細(xì)胞層，這可能是由于與靜態(tài)培養(yǎng)物相比，細(xì)胞的總體數(shù)量并沒(méi)有減少，從而在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)物中細(xì)胞遷移至支架的中心。
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ALP 活性在第7天和14天，靜態(tài)的和動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)物中涂敷的支架的ALP活性顯著高于未涂敷的支架。動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)物達(dá)到峰值的時(shí)間早于靜態(tài)的培養(yǎng)物。礦物化為評(píng)價(jià)hMSC-TERT細(xì)胞的礦物化，測(cè)定了細(xì)胞/支架構(gòu)建物的鈣含量。在第21和觀天，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)物中，涂敷的支架的鈣沉積明顯高于未涂敷的支架。靜態(tài)培養(yǎng)物中，涂敷的支架和未涂敷的支架在所有的時(shí)間點(diǎn)上沒(méi)有明顯的區(qū)別。對(duì)于未涂敷的和涂敷的支架，在第21天和觀天，動(dòng)態(tài)反應(yīng)瓶培養(yǎng)物與靜態(tài)培養(yǎng)物相比，鈣沉積明顯增加。對(duì)于未涂敷的支架，在第21天和觀天，反應(yīng)瓶培養(yǎng)物比靜態(tài)培養(yǎng)物的分別高2. 2倍和3. 5倍，對(duì)于涂敷的支架，分別高4. 6倍和5. 3倍。在第21天和觀天，申請(qǐng)人觀察到反應(yīng)瓶培養(yǎng)物的von Kossa染色比靜態(tài)培養(yǎng)物的更加黑。與為涂敷的支架相比，涂敷的支架整個(gè)支架上的黑色更加均勻。無(wú)論采用哪種培養(yǎng)方法，活細(xì)胞存在于涂敷的支架的內(nèi)部。對(duì)于靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)物，涂敷的支架中細(xì)胞滲入深度比未涂敷的更深。在反應(yīng)瓶培養(yǎng)下，涂敷的支架中強(qiáng)的von Kossa染色表明了更高的基質(zhì)礦物化。組織學(xué)支架中的細(xì)胞分布通過(guò)對(duì)樣品的橫截面進(jìn)行熒光顯微來(lái)評(píng)價(jià)。從支架的頂部到底部，穿過(guò)整個(gè)支架的切片的中心部分進(jìn)行拍照，并使用Photoshop CS3進(jìn)行合并。在培養(yǎng)7 天后，細(xì)胞滲透進(jìn)入支架的內(nèi)部，并遷移至底部的纖維。在靜態(tài)和反應(yīng)瓶構(gòu)建物中，在第7 天觀察到形成了新的ECM，在涂敷的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下的支架中最為明顯。培養(yǎng)14天后，顯著量的細(xì)胞增殖并在整個(gè)支架中遷移，該現(xiàn)象在細(xì)胞培養(yǎng)3周后更加明顯。在第21天，反應(yīng)瓶培養(yǎng)物中涂敷的和未涂敷的支架之間有明顯的差異。與未涂敷的構(gòu)建物相比，在涂敷的構(gòu)建物中，細(xì)胞在纖維內(nèi)空襲中分散范圍更廣。實(shí)時(shí)定量RT-PCR軟骨形成相關(guān)的基因(SOX 9,AGC和Col X)和成骨形成相關(guān)的基因Runx2的轉(zhuǎn)錄水平、ALP、Col I、0C、0N、骨涎蛋白 I (BSP I/0P)和骨涎蛋白 II (BSP II))通過(guò) qRT-PCR 測(cè)量。與反應(yīng)瓶培養(yǎng)的構(gòu)建物相比，靜態(tài)培養(yǎng)的構(gòu)建物的SOX 9表達(dá)水平在所有時(shí)間點(diǎn)上均較高。對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，未涂敷的支架和涂敷的支架之間沒(méi)有明顯的區(qū)別，并且表達(dá)在第14天達(dá)到峰值。對(duì)于反應(yīng)瓶培養(yǎng)物，直到第7天涂敷的支架中的表達(dá)水平一直增加，然后保持穩(wěn)定。靜態(tài)培養(yǎng)物中AGC的表達(dá)高于反應(yīng)瓶培養(yǎng)物，并且在動(dòng)態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)的支架中涂敷均降低了 AGC的表達(dá)。在反應(yīng)瓶培養(yǎng)的支架中，Col X從第7天開(kāi)始高度表達(dá)，并在第21天達(dá)到峰值，但是在靜態(tài)培養(yǎng)的支架中，Col X的表達(dá)在所有時(shí)間點(diǎn)上均較低。無(wú)論培養(yǎng)方法，未涂敷的比涂敷的表達(dá)高。靜態(tài)培養(yǎng)的Rimx 2的表達(dá)在所有的時(shí)間點(diǎn)上比反應(yīng)瓶培養(yǎng)的高。對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，表達(dá)從第14天達(dá)到峰值。對(duì)于反應(yīng)瓶培養(yǎng)物，涂敷增加了表達(dá)并且在第21天達(dá)到峰值。靜態(tài)培養(yǎng)的ALP的表達(dá)在所有的時(shí)間點(diǎn)上比反應(yīng)瓶培養(yǎng)的高。無(wú)論培養(yǎng)方法，涂
24敷的比未涂敷的表達(dá)高。在靜態(tài)培養(yǎng)的支架中，培養(yǎng)期間表達(dá)升高，但是在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的支架中，觀察到穩(wěn)定的表達(dá)。在第21天，反應(yīng)瓶培養(yǎng)的支架的Col I表達(dá)顯著增加，但是在第2天兩培養(yǎng)物表達(dá)均穩(wěn)定。從第7天，靜態(tài)培養(yǎng)OC表達(dá)比反應(yīng)瓶培養(yǎng)的高，并且在第7天達(dá)到峰值隨后下降。 對(duì)于靜態(tài)的培養(yǎng)物，在第7天前的大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)，無(wú)論培養(yǎng)方法，涂層都會(huì)使OC表達(dá)上調(diào)。反應(yīng)瓶培養(yǎng)物的ON表達(dá)比靜態(tài)培養(yǎng)物的高。在第7天和14天，兩培養(yǎng)物中涂層使表達(dá)上調(diào)，但是在第21天并未上調(diào)。在靜態(tài)和反應(yīng)瓶培養(yǎng)物中，BSP I(OP)的表達(dá)從第2天下降。對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，涂層通常導(dǎo)致表達(dá)上調(diào)。對(duì)于反應(yīng)瓶培養(yǎng)物，涂層僅在第2天使表達(dá)上調(diào)。在靜態(tài)和反應(yīng)瓶培養(yǎng)物中，BSP II表達(dá)在第2天最高，隨后大幅下降。從RT-PCR結(jié)果可知，對(duì)于Col X.Runx 2和ALP，未涂敷的反應(yīng)瓶培養(yǎng)的支架的基因轉(zhuǎn)錄類型更顯著。X類型膠原是肥大軟骨細(xì)胞的標(biāo)志物，肥大軟骨細(xì)胞是最終軟骨細(xì)胞分化前的最終階段。雖然所有的培養(yǎng)都使用了成骨介質(zhì)，ALP/DNA測(cè)量清楚地表明在該組中成骨表型最弱。這些發(fā)現(xiàn)表明該組中的細(xì)胞啟動(dòng)了軟骨細(xì)胞的骨化，其中媒介軟骨模板下沉然后鈣化。結(jié)論涂敷的PCL支架申請(qǐng)人:的研究顯示使用透明質(zhì)酸-膠原-三元共聚物涂層顯著提高了所有的結(jié)果變量，另外似乎對(duì)多孔支架中的細(xì)胞分布具有分散作用。涂層的作用主要來(lái)自于在細(xì)胞緊鄰區(qū)域中其對(duì)天然ECM的模擬。由于透明質(zhì)酸和I型膠原衍生物是ECM的主要成分，因此其被用于此目的。透明質(zhì)酸是存在于大多數(shù)組織中的非常大的粘多糖。分子的大小和親水性對(duì)于孵育組織膨脹和機(jī)械回彈性的功能是重要的，特別是肌肉骨骼系統(tǒng)。在分子水平上， 透明質(zhì)酸是CD44的主要配體，CD44是普遍存在的調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞_基質(zhì)粘附的跨膜受體，其中CD44能結(jié)合其它ECM分子，例如纖連蛋白和膠原蛋白。CD44受體-配體相互作用可觸發(fā)決定細(xì)胞形態(tài)和生存的通路。這與粘合素受體的作用相似，兩種受體家族都聚焦于Ras和Rac的活化。懸浮液中的單細(xì)胞保持了富含透明質(zhì)酸的細(xì)胞外層。該外層介導(dǎo)了對(duì)基底的快速的與粘合素?zé)o關(guān)的粘附。如果使用透明質(zhì)酸酶酶性除去了外層，細(xì)胞將從基底彈開(kāi)，即使存在粘合素配體。另一方面，如果基底和細(xì)胞均覆蓋了大量的透明質(zhì)酸，則不會(huì)出現(xiàn)粘合素依賴的附著，細(xì)胞也將彈開(kāi)。在細(xì)胞遷移和細(xì)胞分裂期間，附著力的調(diào)節(jié)是重要的，當(dāng)惡性細(xì)胞過(guò)度表達(dá)透明質(zhì)酸或CD44時(shí)腫瘤侵襲性提高就表明了這一點(diǎn)。涂敷過(guò)程的原理在于發(fā)明人希望通過(guò)在涂敷在支架表面的帶正電荷的甲基化膠原和帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸之間形成凝聚復(fù)合物。將膠原溶液結(jié)合至支架可能有利于該反應(yīng)。細(xì)胞混合入膠原溶液而不是透明質(zhì)酸，這是因?yàn)橥该髻|(zhì)酸粘度太高以致于不能得到均勻的細(xì)胞懸浮液。最終步驟為使用帶負(fù)電荷的三元共聚物進(jìn)行包封。一般而言，結(jié)果顯示涂敷的支架具有較高的細(xì)胞接種效率，較多的分化細(xì)胞數(shù)量， 并且分布均勻。定性地，涂敷降低了在支架表面上形成的細(xì)胞片的范圍，該細(xì)胞片會(huì)限制營(yíng)養(yǎng)物的運(yùn)輸。在涂敷的支架中，ALP活性、鈣含量和一些成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)(例如ALP、
25OC和BSP I)明顯較高。反應(yīng)瓶培養(yǎng)在細(xì)胞的增殖和存活方面優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)，這對(duì)于基質(zhì)礦物化尤其重要。本次體外研究提供的證據(jù)表明，共聚物膜提高細(xì)胞接種效率、增加細(xì)胞滲透深度和促進(jìn)細(xì)胞在3D支架中的分布。能控制干細(xì)胞多譜系分化的支架的制備復(fù)雜組織和器官的制備是組織工程學(xué)的終極目標(biāo)。工程化的形態(tài)學(xué)需要在空間上控制了多種細(xì)胞在植入物(支架)中的發(fā)展。本發(fā)明發(fā)明人針對(duì)該要求提出了新的解決方案，其通過(guò)將含有不同小干擾RNA(SiRNA)的納米顆粒吸附至納米結(jié)構(gòu)的支架上。這使得 siRNA空間保留在納米孔隙中直至其細(xì)胞釋放。釋放的siRNA能使間質(zhì)干細(xì)胞中的BCL2L2 和TRIB2基因沉默，從而分別增強(qiáng)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化。位于單個(gè)植入物中的空間上不同位置的不同納米顆粒使得兩種不同的組織類型在植入物的可控的區(qū)域中形成。該簡(jiǎn)單且有效的用于增加分化的方法立即被用于所有的組織工程領(lǐng)域。而且，該技術(shù)使得復(fù)雜組織和器官通過(guò)多細(xì)胞類型在空間限制的納米顆粒的引導(dǎo)下的原位形成而被工程化。發(fā)明人提出了新的技術(shù)，siRES(siRNA增強(qiáng)的支架)，該技術(shù)由可生物降解的納米結(jié)構(gòu)的聚-ε -己內(nèi)酯(PCL)支架構(gòu)成，該支架以凍干的聚合物/基于脂質(zhì)的納米顆粒siRNA運(yùn)輸系統(tǒng)功能化。使用用作祖細(xì)胞的hMSC和靶向增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)、 tribble 同系物 2 (TRIB2,也稱為 TRB2)和 BCL 樣 2 (BCL2L2,也稱為 BCL_w)的 siRNA，研究了顆粒的位置和保留性質(zhì)，以及系統(tǒng)分化的沉默和體內(nèi)體外的增強(qiáng)。該研究成功地證明了分化的增強(qiáng)，并且在復(fù)合支架中的離散的位置中，通過(guò)控制含有納米顆粒BCL2L2siRNA和 TRIB2siRNA的沉積，細(xì)胞特化受到的影響不同。結(jié)果單層培養(yǎng)物在單層培養(yǎng)物中初步研究了以siRNA逆轉(zhuǎn)染hMSC的可能性。組織培養(yǎng)板接種端粒酶永生化的hMSC23，組織培養(yǎng)物通過(guò)凍干方法以具有水力直徑059士 14nm)和界面電位 (12. 6士0. 5mV)的 iTransIT-TKO/siRNA 進(jìn)行涂敷。使用了靶向 EGFP (EGFP 表達(dá) hMSC，用于這種情況24)、BCL2L2和TRIB2。流式細(xì)胞儀和定量PCR(qPCR)顯示運(yùn)輸系統(tǒng)在2天后能將所有siRNA靶向基因的表達(dá)降低至少50%。EGFP蛋白的水平在轉(zhuǎn)染后第7天減少了超過(guò) 95%。通過(guò)將hMSC在siRNA涂敷的板上在維持培養(yǎng)及中生長(zhǎng)2天，再在不同的分化介質(zhì)中生長(zhǎng)12天，研究siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活力的影響。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活力在維持培養(yǎng)基中稍有降低 (EGFP、TRIB2和BCL2L2siRNA活力降低約30%、約40%和約45% )。該降低與通過(guò)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的相當(dāng)。當(dāng)經(jīng)受siRNA轉(zhuǎn)染和分化培養(yǎng)基時(shí)，使用堿性磷酸酶和油紅0染色，hMSC 顯示出分別分化成成骨細(xì)胞譜系和脂肪細(xì)胞譜系?？傊瑑龈傻腡ransIT-TKO/siRNA顆粒是hMSC單層培養(yǎng)物的有效的轉(zhuǎn)染劑。siRNA涂敷的支架分層排列的支架通過(guò)在雙溶劑中PCL的熱誘導(dǎo)的相分離，隨后通過(guò)部分化學(xué)講解引入納米-粗糙度和親水性表面來(lái)制備。當(dāng)以掃描電子顯微鏡(SEM)可視化時(shí)(未顯示)， 支架的孔隙大小呈現(xiàn)出雙峰分布。大孔隙(直徑>50μπι)由壁(厚度為10-40μπι)隔開(kāi)，壁含有大小較小的腔室(最小的結(jié)構(gòu)特征在于其延伸小于15nm)。這些納米結(jié)構(gòu)特征大幅提高了表面及。當(dāng)以納米顆粒涂敷時(shí)，較小的腔室填滿了具有維持約20nm大小范圍的siRNA。 相反，突出的結(jié)構(gòu)不含有可見(jiàn)的納米顆粒。熒光siRNA顆粒被吸附到支架上以研究顆粒的吸附。當(dāng)涂敷的支架加入介質(zhì)和血清時(shí)，siRNA在M小時(shí)后繼續(xù)位于壁上(未顯示)。含有細(xì)胞的支架顯示了 siRNA的攝入，在一些細(xì)胞中限制了高達(dá)M小時(shí)，但是在大多數(shù)群中是在72小時(shí)后(未顯示)。涂敷方法導(dǎo)致完整粘附的顆粒沉積在支架壁上，并使得siRNA 內(nèi)化入接種的細(xì)胞。siRNA在支架上誘導(dǎo)的沉默為進(jìn)行定量敲除，將支架涂敷以含有EGFP siRNA的顆粒，并接種表達(dá)hMSC的 EGFP。48小時(shí)后，通過(guò)qPCR測(cè)量mRNA的表達(dá)。在EGFP siRNA涂敷的支架上EGFP表達(dá)降低(與未涂敷的支架相比降低了 60%，p = 0. 02，與涂敷了錯(cuò)配的siRNA的支架相比降低了 35%,ρ = 0. 05) ο隨后，在含有靶向BCL2L2或TRIB2的siRNA顆粒的支架上接種hMSC。72 小時(shí)后，通過(guò)qPCR測(cè)量mRNA的表達(dá)。BCL2L2siRNA和TRIB2siRNA分別的BCL2L和TRIB2 分別降低了 40% (p = 0. 004)和47% (p = 0. 002)?？傊瑂iRNA為細(xì)胞接納并且誘導(dǎo)了基因沉默。siRNA在支架上增強(qiáng)分化為研究siRES是否影響分化，將hMSC加入預(yù)涂敷了針對(duì)TRIB2或BCL2L的siRNA 的支架中。在維持培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用分化介質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化。 在不同的時(shí)間點(diǎn)，收集樣品進(jìn)行qPCR、微型計(jì)算機(jī)斷層掃描和組織學(xué)分析。在脂肪細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，在未涂敷的支架和eGFP或TRIBkiRES中，早期脂肪細(xì)胞標(biāo)志物(載脂蛋白(aP2))、脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(PPARY2)以及晚期脂肪細(xì)胞標(biāo)志物(脂肪連接蛋白(ADN)和脂蛋白脂肪酶)的表達(dá)隨著時(shí)間增加。在第7天，與未涂敷的支架相比，在TRIBkiRES中，除LPL外所有的標(biāo)志物的表達(dá)特異地增加(PPAR γ 2，高2. 9倍，ρ = 0. 03。aP2，高 2· 8 倍，ρ = 0. 04。AND，高 4· 7 倍，ρ = 0. 01)。在成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，早期成骨細(xì)胞標(biāo)志物，堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)在第7天達(dá)到峰值，增加了高達(dá)140倍。在第7天，在BCL2L2siRNA涂敷的支架中ALP的表達(dá)比在 EGFP siRNA涂敷的支架中高(高3.4倍，p = 0. 004)?？蛇x的早期成骨細(xì)胞標(biāo)志物，I型膠原(COLI)的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)期間降低高達(dá)80%。但是在BCL2L2siRNA涂敷的支架中減少得最慢，并且在第7天和第12天，該組中COLl水平最高(第7天，比EGFP siRNA涂敷的支架稿 2. 1倍，ρ = 0. 01。第12天，比未涂敷的支架高1. 4倍，ρ = 0. 004，比EGFP siRNA涂敷的支架高1.3倍，p = 0. 00幻。在第7天和第14天，晚期成骨細(xì)胞標(biāo)志物，骨鈣蛋白(OC)和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)期間增加，并且樣品之間的差異不明顯。在第21天， 在兩對(duì)照中，兩種金銀的表達(dá)均降低，但是在BCL2L2siRNA涂敷的支架中保持較高(RUNX2， 比未涂敷的高1. 2倍，比EGFP siRNA高1. 7倍，ρ值分別為0. 03和0. 02。0C,比未涂敷的高2. 1倍，比EGFP siRNA涂敷的高2. 2倍，ρ值分別為0. 02和0. 03)。對(duì)在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 21天的siRES進(jìn)行微型計(jì)算機(jī)斷層掃描、染色和免疫組織化學(xué)測(cè)試以確認(rèn)qPCR的發(fā)現(xiàn)。微型計(jì)算機(jī)斷層掃描和vonKossa染色顯示在整個(gè)支架中成功地礦物化，但是骨鈣蛋白免疫組織化學(xué)證明骨鈣蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)中的沉積。在所有的三個(gè)測(cè)試中，成骨基質(zhì)在以BCL2L siRNA涂敷的支架中生長(zhǎng)的最為明顯。在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)的陰性對(duì)照未顯示von Kossa或骨鈣蛋白染色。綜上，這些體外測(cè)試結(jié)果表明， 以BCL2LsiRNA涂敷支架植入物促進(jìn)了成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，TRIB2siRNA涂敷促進(jìn)了其脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)。CN 102481389 A說(shuō)明書(shū)24/26 頁(yè)
為研究siRNA涂層對(duì)體內(nèi)組織生長(zhǎng)的作用，發(fā)明人將未涂敷的支架以及TRIB2或 BCL2L2siRNA皮下植入非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(N0D/SCID)小鼠。植入前，將支架接種hMSC 16小時(shí)。8周后，取出支架，使用免疫組織化學(xué)和染色(未顯示)進(jìn)行研究。所有的支架顯示了新血管形成，并且在整個(gè)支架中有陽(yáng)性人特異性⑶99染色，這確認(rèn)了大部分細(xì)胞是人類細(xì)胞。具有早期脂肪細(xì)胞標(biāo)志物S 100的陽(yáng)性染色僅在TRIBkiRNA涂敷的支架中觀察到，這表明使該基因沉默使得一個(gè)分支的細(xì)胞開(kāi)始脂肪細(xì)胞分化。在BCL2L2siRNA 涂敷的支架中，膠原被染色成濃密的天狼星紅色，并且在偏振光下顯示雙折射，這表明其具有成熟的結(jié)構(gòu)。相反，未涂敷的對(duì)照中，雙折射和天狼星紅染色強(qiáng)度較低，在TRIBkiRNA涂敷的支架中，幾乎沒(méi)有染色和雙折射。另外，I型教員特異的染色支持了天狼星紅的發(fā)現(xiàn)，這確認(rèn)了沉積的膠原為成骨型膠原。BCL2L2siRNA涂敷的支架中比未涂敷的支架的骨粘連蛋白和RUNX2染色更加明顯，其比TRIB2siRNA涂敷的支架染色更強(qiáng)。但是，沒(méi)有觀察到礦物化的跡象。這些體內(nèi)測(cè)試結(jié)果確認(rèn)了體外測(cè)試的發(fā)現(xiàn)，但是細(xì)胞在植入位置最終沒(méi)有分化成成骨細(xì)胞，siRNA是僅有的分化線索。支架中的雙重分化為構(gòu)建具有兩種類型細(xì)胞的組織，將支架圓筒對(duì)半切開(kāi)，各部分涂敷TRIB2或 BCL2L2siRNA。然后連接兩側(cè)，加入hMSC。對(duì)于體外測(cè)試，支架在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，在復(fù)合分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天。然后將兩側(cè)分開(kāi)，測(cè)量各部分的分化標(biāo)志物的mRNA水平。兩側(cè)PPAR y 2、RUNX2、AND和OC的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)上相同。但是，TRIB2siRNA涂敷的部分，ap2上調(diào)了幾乎4倍，BCL2LkiRNA 涂敷的部分ALP上調(diào)了 45%。對(duì)于體內(nèi)測(cè)試，將組合的支架接種hMSC，在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，在皮下植入2周大的小鼠。然后手術(shù)取出支架，切片，使用H&E、天狼星紅和von Kossa染色進(jìn)行染色。H&E的顯色顯示兩部分支架均含有細(xì)胞，但是生長(zhǎng)成非常不同的形態(tài)。BCL2L2siRNA 涂敷的部分表現(xiàn)的致密，而TRIBkiRNA涂敷的部分為具有較大孔隙的海綿結(jié)構(gòu)。天狼星紅染色顯示在BCL2L2siRNA涂敷的部分中，在偏振光下有序的雙折射膠原大量沉積，但是 TRIB2siRNA涂敷的部分沒(méi)有觀察到雙折射。von Kossa染色顯示兩部分中均沒(méi)有礦物化。 這些結(jié)果表明在相同的體內(nèi)和體外植入物內(nèi)的特異的位置，通過(guò)在不同的位置放置不同的 siRNA，可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入不同的通路。討論該工作說(shuō)明了涂敷了納米顆粒的納米結(jié)構(gòu)的支架，該支架能保留和運(yùn)輸SiRNA，對(duì)于干細(xì)胞在體內(nèi)和體外的分化具有廣闊的用途。當(dāng)以兩種不同的siRNA功能化時(shí)，這種支架顯示出在體內(nèi)和體外促進(jìn)了在具體位置的兩種不同的分化途徑。SiRNA之前已經(jīng)通過(guò)將其嵌入柔性凝膠或?qū)⑵浼尤肱囵B(yǎng)基中，運(yùn)輸至在三維基質(zhì)中生長(zhǎng)的細(xì)胞，或者細(xì)胞在接種到植入物上之前，先以siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。但是，所有的這些方法均不能用于將siRNA運(yùn)輸至具體的位置以在基質(zhì)中生成多種類型的細(xì)胞。這使siRNA 穩(wěn)定地結(jié)合支架成為必需，直至隨手直接運(yùn)輸至附著的細(xì)胞。從支架的DNA運(yùn)輸比siRNA探索得更為廣泛。這些研究通過(guò)將DNA含有納米顆粒和病毒載體的裸露的質(zhì)粒DNA吸附到支架上進(jìn)行。裸露的核酸的轉(zhuǎn)染效率通常非常低，并且由于裸露的siRNA對(duì)核糖核酸酶不穩(wěn)定使得其運(yùn)輸更加復(fù)雜。由于病毒載體具有致腫瘤性和免疫原性的缺陷，非病毒載體提供了具有吸引力的運(yùn)輸解決方案。蛋白保護(hù)的干燥的 siRNA納米顆粒通常可達(dá)到較高的沉默，但是常見(jiàn)的蛋白保護(hù)劑，例如葡萄糖，可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化。重要的是，TransIT-TKO/siRNA沒(méi)有蛋白保護(hù)劑時(shí)也可以凍干，可以干燥保存較長(zhǎng)的時(shí)間，并且仍然保留在血清中高的敲除效率，促進(jìn)了其用于支架的運(yùn)輸。當(dāng)凍干到支架上時(shí)，納米顆粒保留了其在預(yù)凍干的形態(tài)，并且位于支架壁鐘較小的腔室內(nèi)。NaOH處理的PCL由于暴露了羧酸帶負(fù)電荷，并且發(fā)明人發(fā)現(xiàn)TransIT-TKO/siRNA 帶正電荷。因此觀察到的相互反應(yīng)本質(zhì)上最可能為靜電反應(yīng)。經(jīng)推測(cè)，納米結(jié)構(gòu)的孔隙大幅增加了表面積，陽(yáng)離子的TransIT-TKO組分可通過(guò)多離子相互反應(yīng)相互作用。另外，預(yù)期這些納米孔隙可保護(hù)流體流頂替(fluid flow displacement) 0相互作用的穩(wěn)定性通過(guò)在含有血清的培養(yǎng)基中M小時(shí)后納米顆粒的繼續(xù)保留率來(lái)指示。該穩(wěn)定的粘附可使siRNA 納米顆粒定位以及其誘導(dǎo)的區(qū)域敲除。在體外，發(fā)明人觀察到當(dāng)與成骨細(xì)胞培養(yǎng)基組合時(shí)，BCL2L2沉默增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的分化。在體內(nèi)，發(fā)明人沒(méi)有發(fā)現(xiàn)礦物化的跡象，這證明了之前在體內(nèi)試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，即僅 BCL2L2敲除不會(huì)誘導(dǎo)礦物化。但是，對(duì)于I型膠原在體內(nèi)的沉積和組織，發(fā)明人的確發(fā)現(xiàn)僅BCL2L2敲除增強(qiáng)了早期成骨細(xì)胞分化。當(dāng)與脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基組合時(shí)，TRIB2沉默增加了脂肪細(xì)胞的在體內(nèi)的分化。這確認(rèn)了一些體內(nèi)單層研究，這些研究證明了 TRIB家族成員抑制脂肪細(xì)胞分化。TRIB2通過(guò)抑制Aktl活化同時(shí)增加C/EBP的講解來(lái)抑制脂肪形成。EGFP 特異的siRNA似乎增加了脂肪細(xì)胞的分化，雖然不如TRIBkiRNA的多。體內(nèi)研究顯示僅 TRIB2敲除足以消除膠原雙折射，同時(shí)使一部分在8周后分化形成SlOO陽(yáng)性脂肪細(xì)胞。發(fā)明人推測(cè)一種siRNA在增強(qiáng)分化時(shí)，沒(méi)有繼續(xù)刺激是不足以驅(qū)使晚期成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞特化的。在體內(nèi)觀察到少量的SlOO陽(yáng)性脂肪細(xì)胞，這可能是來(lái)自支架或植入微點(diǎn)的較弱的脂肪細(xì)胞刺激的結(jié)果。不使用分化介質(zhì)，會(huì)需要多種SiRNA以完成分化14?；蛘呤褂胢icroRNA(miRNA)或miRNA抑制劑(antimirs)。miRNA是與siRNA相關(guān)的內(nèi)源性 RNA，其同時(shí)也調(diào)節(jié)了多種基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA增加了成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的表達(dá)。鑒于"TransIT-TKO運(yùn)輸系統(tǒng)可運(yùn)輸miRNA和antimirs，此處說(shuō)明的系統(tǒng)應(yīng)該也可以直接用于 miRNA調(diào)控子的支架運(yùn)輸。發(fā)明人能開(kāi)發(fā)納米結(jié)構(gòu)的支架，該支架使用含有針對(duì)TRIB2和BCL2L2的siRNA的定位圖層，優(yōu)先地刺激在不同區(qū)域的脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化。這在體外得到了標(biāo)志物 aP2和ALP的分化表達(dá)的確認(rèn)。另外，體內(nèi)孵育的支架中，兩相鄰的部分的形態(tài)明顯不同；在 BCL2L2涂敷的部分中，膠原沉積和排列高度增加。同時(shí)由于siRNA納米顆粒已知的多功能性，發(fā)明人以專注于siRNA，其它分化方法的空間定位可能用于達(dá)到相同的結(jié)果。此外，可以相信其它組裝技術(shù)，例如用于區(qū)分位置的不同藥物的快速成型技術(shù)，可用于代替手動(dòng)裝配的模塊。發(fā)明人開(kāi)發(fā)了能運(yùn)輸SiRNA至接種的細(xì)胞的納米顆粒功能化的支架的實(shí)例。而且，發(fā)明人證明了 siRNA在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)序列特異的基因沉默。作為臨床相關(guān)的實(shí)例，發(fā)明人顯示了特異地靶向TRIB2和BCL2L2分別導(dǎo)致脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)。因此， 具有單種類型的siRNA的支架涂層是多用途的，并且是用于增加單細(xì)胞類型組織的有效方法，代表了進(jìn)行3D基因敲除的方法。重要的是，支架的納米結(jié)構(gòu)的性質(zhì)使不同的siRNA的納米顆粒保留和定位于植入物的不同部位。這使得引導(dǎo)干細(xì)胞在具體位置進(jìn)行交替分化成為可能。參考文獻(xiàn)R. 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權(quán)利要求
1.一種能支撐諸如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，所述方法包括-提供包括第一生物相容性材料的支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐，所述第一材料包括一種或多種聚合物，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；-向所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分中加入溶液，所述溶液包含一種或多種生物相容性聚合物與一種或多種溶劑的混合物；-除去所述溶劑得到在所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的第二生物相容性材料，所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，在所述第二生物相容性材料中的所述相互連接的腔室允許細(xì)胞生長(zhǎng)成為功能組織，并且允許營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子遍及所述支架擴(kuò)散；所述網(wǎng)格還保護(hù)所述三維生物相容性支架在制備、插入和使用期間不受壓縮力的影響。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種生物相容性聚合物在生理PH值時(shí)帶正電荷，所述方法還包括下列步驟a)以細(xì)胞接種從權(quán)利要求1獲得的三維生物相容性支架；b)以一種或多種在生理pH值時(shí)帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架；以及c)任選的，以一種或多種在生理pH值時(shí)帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種生物相容性聚合物在生理pH值時(shí)帶負(fù)電荷，所述方法還包括下列步驟a)以細(xì)胞接種從權(quán)利要求1獲得的三維生物相容性支架；b)以一種或多種在生理pH值時(shí)帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架；以及c)任選地，以一種或多種在生理pH值時(shí)帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆所述細(xì)胞接種的支架。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括a)以一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；b)任選地，以細(xì)胞接種支架；以及c)任選地，以一種或多種在生理pH值下帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括a)以一種或多種在生理pH值下帶正電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面；b)任選地，以細(xì)胞接種支架；c)任選地，以一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物涂覆支架表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述混合物包含兩種或更多種溶劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述相互連接的腔室通過(guò)熱誘導(dǎo)的相分離和/或所述溶劑的凍干來(lái)形成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腔室通過(guò)氣體發(fā)泡形成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述網(wǎng)格由實(shí)體自由成型制造方法制得。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二生物相容性材料的平均孔徑在25nm至800 μ m的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶劑的凝固點(diǎn)至少相差5°C。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆，所述天然或合成涂覆材料為例如蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、和/或小的干擾RNA。
13.一種可支撐諸如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架，所述支架包含第一和第二生物相容性材料，所述第一材料的形狀為微米級(jí)的線形成的一個(gè)或多個(gè)網(wǎng)格，所述線形成具有空隙的開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；所述第二材料填充所述開(kāi)放網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大部分空隙， 所述第二材料是多孔的，其中孔隙相互連接，所述第二材料具有多個(gè)大致均勻地分布于其中的開(kāi)孔，所述開(kāi)孔的平均尺寸小至使細(xì)胞不能滲入，所述網(wǎng)格為所述第二生物相容性材料提供保護(hù)性機(jī)械支撐，所述網(wǎng)格還保護(hù)所述三維生物相容性支架在制備、插入和使用期間不受壓縮力的影響，所述第二生物相容性材料包含一種或多種生物相容性聚合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的支架，所述支架的壓縮應(yīng)力值與目標(biāo)組織的壓縮應(yīng)力值相當(dāng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的支架，所述支架具有相容的抗壓強(qiáng)度以承受來(lái)自目標(biāo)組織周圍的壓縮應(yīng)力。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的支架，其中所述一種或多種生物相容性聚合物在生理 PH值時(shí)帶負(fù)電荷。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的支架，所述支架還包含細(xì)胞，所述細(xì)胞在體外接種，所述支架還包括第一生物相容性聚合物涂層，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，所述細(xì)胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂層之間。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的支架，所述支架還包括第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂層位于所述第一生物相容性聚合物涂層的上面。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的支架，其中所述一種或多種生物相容性聚合物在生理 PH值時(shí)帶正電荷。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的支架，所述支架還包含細(xì)胞，所述細(xì)胞在體外接種，所述支架還包括第一生物相容性聚合物涂層，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理pH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，所述細(xì)胞位于所述第二生物相容性材料和所述第一生物相容性聚合物涂層之間。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的支架，所述支架還包括第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，所述第二生物相容性聚合物涂層位于所述第一生物相容性聚合物涂層的上面。
22.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的支架，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂層涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，其中在所述第一生物相容性聚合物涂層上面有第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，其中細(xì)胞位于所述第一和第二生物相容性聚合物涂層之間。
23.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的支架，其中所述第二生物相容性材料以第一生物相容性聚合物涂層涂覆，所述第一生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶負(fù)電荷的生物相容性聚合物，其中在所述第一生物相容性聚合物涂層的上面有第二生物相容性聚合物涂層，所述第二生物相容性聚合物涂層包含一種或多種在生理PH值下帶正電荷的生物相容性聚合物，其中細(xì)胞位于所述第一和第二生物相容性聚合物涂層之間。
24.根據(jù)權(quán)利要求13-23所述的支架，其中所述開(kāi)孔的平均尺寸小于1微米。
25.根據(jù)權(quán)利要求13-24中任一項(xiàng)所述的支架，其中所述第二材料中的所述開(kāi)孔的孔密度的范圍為約IO9至約IO15開(kāi)孔每立方厘米所述第二材料。
26.根據(jù)權(quán)利要求13-25中任一項(xiàng)所述的支架，其中在所述第二材料中形成的開(kāi)孔的總體積占所述第二材料的總體積的比例在約20% -90%的范圍內(nèi)。
27.根據(jù)權(quán)利要求13-26中任一項(xiàng)所述的支架，其中在所述第二材料中形成的孔隙的平均直徑小于1000微米。
28.根據(jù)權(quán)利要求13-27中任一項(xiàng)所述的支架，其中所述支架表面以天然或合成涂覆材料涂覆，所述天然或合成涂覆材料為例如蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸和/或小的干擾RNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求13- 任一項(xiàng)所述的工程化的支架用于修復(fù)或再生組織，所述組織選自骨、軟組織、軟骨、以及腦或脊髓組織。
30.根據(jù)權(quán)利要求13-28中任一項(xiàng)所述的工程化的支架用作藥劑。
全文摘要
一種能支撐例如生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞活動(dòng)的三維生物相容性支架的制備方法，所述方法包括提供支撐網(wǎng)格，所述網(wǎng)格形成開(kāi)放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并且為第二生物相容性材料提供機(jī)械支撐。所述第二生物相容性材料具有相互連接的腔室，所述腔室使得營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和可溶性因子擴(kuò)散通過(guò)所述支架。支架的設(shè)計(jì)可以理解成分層排列的結(jié)構(gòu)，在微米至亞微米的長(zhǎng)度標(biāo)尺上，上/下制備方法用于制備將組成框架的結(jié)構(gòu)，下/上處理方法用于在所述框架中形成具有特殊納米大小特征的開(kāi)放多孔支架。該分層排列的涉及的優(yōu)勢(shì)在于其可以同時(shí)具有微米和納米大小結(jié)構(gòu)的有點(diǎn)，促進(jìn)特殊的細(xì)胞活動(dòng)和提供充分的機(jī)械順應(yīng)性。
文檔編號(hào)A61L27/34GK102481389SQ201080039370
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者弗萊明·貝森巴赫, 科迪·埃里克·邦杰, 詹斯·文吉·尼高, 黎·比埃爾 申請(qǐng)人:中日德蘭大區(qū), 奧胡斯大學(xué)