專利名稱：使用muc1拮抗劑抑制炎癥的制作方法
使用MUC1拮抗劑抑制炎癥
背景技術(shù)：
本申請要求2009年5月27日提交的美國臨時申請序列號61/181，530、2009年10月21日提交的美國臨時申請序列號61/253，730和2010年2月12日提交的美國臨時申請序列號61/303，997的優(yōu)先權(quán)，上述每個申請的全部內(nèi)容均通過引用并入本文。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。具體而言，已證明來源于MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域特定區(qū)域的MUCl肽抑制MUCl與NF- K B的相互作用，從而抑制NF- k B介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，已證明了針對STAT3介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似作用。2.相關(guān)技術(shù) NF-k B 蛋白(RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-k Bl/p50 和 NF-k B2/p52)是普遍表達的轉(zhuǎn)錄因子。在無刺激時，NF-K B蛋白與IKBa和IkB抑制蛋白家族的其他成員形成復(fù)合物定位于細胞質(zhì)中(Hayden&Ghosh，2008)。高分子量I k B激酶(IKKa、IKKP、IKKy)復(fù)合物對IKBa的磷酸化誘導(dǎo)IicBa的泛素化和降解，從而釋放NF- k B進行核轉(zhuǎn)位。繼而NF-k B靶基因的激活通過調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答、細胞增殖和存活促進腫瘤發(fā)生(Karin&Lin，2002)。NF-kB p65與家族其他成員一樣包含負責(zé)二聚化和DNA結(jié)合的N端Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain, RHD)。RHD還作為IKBa蛋白中錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeats)的結(jié)合位點發(fā)揮作用，其阻斷NF-k B p65的核定位信號(nuclear localizationsignal,NLS)。NF-k B_I k B a復(fù)合物在核和細胞質(zhì)之間穿梭(Hayden&Ghosh, 2008)。典型NF-K B通路的激活(例如在對腫瘤壞死因子a (TNFa)的細胞應(yīng)答中)誘導(dǎo)IKK-P介導(dǎo)的I K B a磷酸化和降解，同時NF- K B p65的平衡向核推移。核NF- k B 二聚體占據(jù)啟動子和增強子區(qū)域中的K B共有序列以及簡并變體(Hoffman等,2006 ;Gilmore, 2008)。NF-k B靶基因的激活還通過NF-K B p65的翻譯后修飾及其與轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用而進一步調(diào)節(jié)(Hayden&Ghosh，2008)。許多NF- k B靶基因中的一個是I^Ba，其的激活導(dǎo)致I k B a的重新合成和NF- K B轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的終止。粘蛋白是具有大量0-糖基化的蛋白質(zhì)，其主要由上皮細胞表達。分泌的和膜結(jié)合的粘蛋白形成物理屏障，其保護上皮細胞的頂邊界不受由毒素、微生物和其他形式壓力(發(fā)生在與外界環(huán)境的交界處)所引起的損害。跨膜粘蛋白I(MUCl)也可通過其細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘杺鬟f至細胞內(nèi)部。除具有海膽精子的蛋白-腸激酶-agrin(protein-enterokinase-agrin, SEA)結(jié)構(gòu)域外,MUCl沒有與其他膜結(jié)合粘蛋白相似的序列(Duraisamy等,2006)。因此，MUCl翻譯為單一多肽，然后在SEA結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷自切割(JBC，1992 ；Macao,2006)?？缒UCl的C端亞基(MUCl-C)作為受體起作用(Ramasamy等，2007)，并包含足以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的72個氨基酸的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(MUCKD) (Huang等，2005)。MUCl-C亞基還通過依賴于其寡聚化的過程靶向核(Leng等，2007)。MUCl-⑶作為被表皮生長因子受體(Li等，2001)、c-Src (Li 等 2001)、糖原合酶激酶 3 ^ (GSK3 ^ ) (Li 等，1998)和 c-AbI (Ahmad 等
2006)磷酸化的底物起作用。MUCl-⑶還通過直接相互作用穩(wěn)定Wnt效應(yīng)物、P -聯(lián)蛋白，因此有助于轉(zhuǎn)化(Huang等，2005)。其他研究已證明MUCl-⑶直接與IKK P和IKK Y相互作用，并有助于激活I(lǐng)KK復(fù)合物(Ahmad等，2007)。顯然，沉默MUCl下調(diào)NF-k B p65在人癌細胞內(nèi)的組成型激活，提示MUCl-⑶在NF- K B p65通路的調(diào)節(jié)中起功能性作用(Ahmad等，2007)。這些發(fā)現(xiàn)也暗示，小分子可以靶向MUCl-⑶的功能來干擾癌細胞中的NF-k B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，至今沒有有關(guān)影響NF- K B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MUCl拮抗劑的報道。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signaltransducer and activator oftranscription, STAT)家族成員也參與轉(zhuǎn)化、腫瘤細胞存活、侵襲和轉(zhuǎn)移(Yu和Jove,2004)。STAT3轉(zhuǎn)錄因子被鑒定為白介素-6(IL-6)炎性應(yīng)答的效應(yīng)物(Wegenka，1994)。STAT3 通過以下來激活Janus-激活激酶(Janus-activated kinase, JAK) - I 磷酸化 IL-6受體，募集STAT3，之后磷酸化STAT3的705位保守酪氨酸(Yu和Jove，2004)。表皮生長因子受體的激活也與STAT3Tyr-705的直接磷酸化相關(guān)。然后磷酸化的STAT3經(jīng)歷二聚化，易位至核并誘導(dǎo)STAT3靶基因的激活，所述靶基因編碼細胞周期進展調(diào)節(jié)物(細胞周期蛋白Dl 和 c-Myc)和凋亡抑制物(生存素和 Bcl-xL) (Alvarez, 2005, Alvarez, 2006)。激活的STAT3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Bromberg，1999)。而且，STAT3激活在多種癌和血液惡性腫瘤中被檢測到(Aaronson 和 Horvath, 2002 ；Bowman, 2000 ；Yu 和 Jove, 2004),這與 STAT3 參與控制生長和 存活之基因的轉(zhuǎn)錄相符。對此，JAK-I — STAT3通路的小分子抑制劑在體外和動物模型中有抗癌活性(Song, 2005 ;Siddiquee，2007 ；Ahmad, 2008 ;Germain 和 Frank，2007)。另外，阻斷EGFR至STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的適體抑制惡性上皮和血液細胞的生長(Buerger，2003)。這些發(fā)現(xiàn)共同支持STAT3通路在聯(lián)系炎癥與腫瘤發(fā)生中的重要性。發(fā)明概述因此，按照本發(fā)明，提供了在表達MUCl的細胞中抑制炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。所述肽可包含至少5、6或7個連續(xù)MUCl殘基，而且所述序列可更具體地包含 CQCR(SEQ ID NO :54)、CQCRR(SEQ ID NO :50)、CQCRRR(SEQ ID NO :51)、CQCRRRR (SEQ ID NO : 52)、CQCRRK (SEQ ID NO 4)或 CQCRRKN(SEQ ID NO :53)。所述肽可包含MUCl的不多于10個連續(xù)殘基、11個的連續(xù)殘基、12個連續(xù)殘基、13個連續(xù)殘基、14個連續(xù)殘基、15個連續(xù)殘基、16個連續(xù)殘基、17個連續(xù)殘基、18個連續(xù)殘基或19個連續(xù)殘基。MUCl陽性細胞可以是腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞或炎性細胞，例如巨噬細胞、B細胞、T細胞、樹突狀細胞、骨髓源性抑制細胞、NK細胞或嗜中性粒細胞。所述肽可以與細胞遞送結(jié)構(gòu)域融合，例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。所述方法還可包括將細胞與第二抗炎劑接觸,例如類固醇或C0X-2抑制劑。第二抗炎劑的接觸可在肽之前、之后或與其同時進行。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括NF-K B介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如STAT3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-k B介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括NF-K B激活選自Bcl-xL和MUCl的靶基因。STAT3介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括STAT3激活選自以下的靶基因細胞周期蛋白D1、生存素、Idpl、Idp2、CdknlC, Leftyl、Mest、Aesl、Zfp57、Zfp3611、Sh3bpl、Ccnd3 和 MUCl。在另一實施方案中，提供了在表達MUCl的細胞中抑制MUCl與NF-k B或STAT結(jié)合的方法，其包括將細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。在另一實施方案中，提供了在表達MUCl的細胞中抑制MUCl與IKBa競爭結(jié)合NF- K B的方法，其包括將細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。在另一實施方案中，提供了在表達MUCl的細胞中抑制MUCl誘導(dǎo)的NF-K B核轉(zhuǎn)位的方法，其包括將細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。在又一實施方案中，提供了抑制對象中的炎性應(yīng)答的方法，包括向所述對象施用具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC (SEQ ID NO 4)的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。所述肽可包含至少5、6或7個連續(xù)MUCl殘基，而且所述序列可更具體地包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。所述肽可包含MUCl的不多于10個連續(xù)殘基、11個連續(xù)殘基、12個連續(xù)殘基、13個連續(xù)殘基、14個連續(xù)殘基、15個連續(xù)殘基、16個連續(xù)殘基、17個連續(xù)殘基、18個連續(xù)殘基或19個連續(xù)殘基。炎性應(yīng)答可由NF- K B介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如STAT3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))引起。肽可與細胞遞送結(jié)構(gòu)域融合，例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。施用可包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、口服、瘤內(nèi)、皮下、表面或腹腔內(nèi)施用，或者局部、區(qū)域、系統(tǒng)或持續(xù)施用。抑制可包括抑制或解除炎性應(yīng)答。所述方法還包括向?qū)ο笫┯玫诙寡字委?，例如類固醇或C0X2抑制劑。第二抗炎治療的施用可在肽之前、之后或與其同時進行。對象可以是人。所述肽可以以0. l-500mg/kg/天施用，或更特別地，以10-100mg/kg/天施用。所述肽可以每日施用，例如施用7天、2周、3周、4周、I個月、6周、8周、2個月、12周或3個月。所述肽可以每周施用，例如施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。在又一實施方案中，提供了藥物組合物，其包含⑴具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋；和(ii)除(i)外的第二抗炎劑。第二抗炎劑是類固醇或C0X-2抑制劑。考慮本文描述的任何方法或組合物都可參照本文描述的任何其他方法或組合物實施。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中無數(shù)量詞與術(shù)語“包含”一起使用時，可以表示“一”，但也具有“一或更多”、“至少一”和“一或多于一”的含義。詞“約”是指所示數(shù)值加或減5%。根據(jù)下述詳細說明，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。然而應(yīng)當(dāng)理解，指出本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述和具體實施例僅僅以說明的方式給出，因為對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)該詳細描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾將變得顯而易見。


下述附圖構(gòu)成本發(fā)明說明書的一部分，包括它們以進一步闡明本發(fā)明的某些方面。參照一幅或多幅這些附圖并結(jié)合詳細說明可以更好地理解本發(fā)明。圖IA-Dp65相關(guān)聯(lián)。(圖1A-C)所示細胞的裂解物用抗_p65或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀。沉淀物用抗-MUCl-C和抗-p65 進行免疫印跡。(圖1D)將ZR-75-1細胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUC1-CD孵育。吸附物用抗-p65進行免疫印跡。通過考馬斯亮蘭染色評估引入物GST蛋白。圖2A-D =MUCl減弱I k B a和NF- k B p65的結(jié)合。(圖2A-C)用抗-p65或?qū)φ誌gG 對所示 ZR-75-1/ 載體、ZR-75-1/MUC1 siRNA(圖 2A)、Hela/ 載體、Hela/MUCl (圖 2B)、3Y1/載體和3Y1/MUC1-⑶(圖2C)細胞的胞漿裂解物進行免疫沉淀。沉淀物用抗I k B a和抗P65的抗體進行免疫印跡。(圖2D)在存在或不存在遞增量的MUCl-CD的情況下，將結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST和GST-I KBa用p65 (186-306)孵育。吸附物用抗-p65進行免疫印跡(上)。引入物(input) MUCl-CD通過用抗-MUCl-C進行免疫印跡來評估(中)。引入物GST和GST-I KBa蛋白通過考馬斯亮蘭染色評估(下)。圖3么-0:1^(1-(促進,-1^ 65對此111基因啟動子的占據(jù)。(圖3A)固定ZR-75-1/ 載體和 ZR-75-l/MUClsiRNA 細胞并用抗-MUCl-C (綠色)和抗-NF- k B p65 (紅色)雙染色。細胞核用T0-PR0-3染色。(圖3B和3C)將ZR-75-1/載體、ZR-75-1/MUC1siRNA (圖3B) ,HeLa/載體和HeLa/MUCl (圖3C)細胞的可溶性染色質(zhì)用抗p65或IgG對照進行免疫沉淀。最終的DNA提取物用覆蓋Bcl-xL啟動子NF- k B-RE (-597至-304)或?qū)φ諈^(qū)域(-1001至-760)的引物對進行PCR擴增。(圖3D)將ZR-75-1細胞的可溶性染色質(zhì)用抗MUCl-C或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀，并分析Bcl-xL NF- k B-RE或?qū)φ諈^(qū)域序列(左)。在Re-ChIP實驗中，抗MUCl-C沉淀物被釋放，用抗p65再免疫沉淀，然后分析Bcl-xL啟動子序列(右)。圖4A-D :在MCF-10A細胞對TNF a的應(yīng)答中MUC1-C與NF- k B p65相互作用。(圖4A)將MCF-10A細胞用20ng/ml TNFa刺激所示時間。將裂解物用抗MUCl-C和抗￠-肌動蛋白進行免疫印跡。(圖4B)將未處理或用20ng/ml TNFa刺激24小時的MCF-10A細胞裂解物用抗P65或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀。沉淀物用所示抗體進行免疫印跡。(圖4C)將未處理或用20ng/ml TNFa刺激24小時的MCF-10A細胞可溶染色質(zhì)用抗MUCl-C進行免疫沉淀，然后分析MUCl NF-k B結(jié)合基序啟動子序列。(圖4D)在Re-ChIP實驗中，抗MUCl-C沉淀物被釋放，用抗P65再免疫沉淀，然后分析MUCl NF- K B結(jié)合基序啟動子序列。圖5A-D :1^(1-(促進,-1^ p65 介導(dǎo)的 MUCl 啟動子激活。(圖 5A 和 5B)MCF_10A細胞用對照或p65siRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時。不處理轉(zhuǎn)染的細胞或?qū)⑵溆肨NF a刺激24小時。將裂解物用所示抗體進行免疫印跡(圖5A)。然后轉(zhuǎn)染細胞以表達NF-K B-Luc報告物或MUCl啟動子-Luc報告物(pMUCl-Luc)和SV-40-Reni I Ia-Luc質(zhì)粒(作為對照)(圖5B)。(圖5C和5D)將MCF-10A細胞用對照或MUClsiRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時。不處理轉(zhuǎn)染細胞或?qū)⑵溆肨NFa刺激24小時。將裂解物用所示抗體進行免疫印跡(圖5C)。然后轉(zhuǎn)染細胞以表達 NF- K B-Luc 報告物或 MUCl 啟動子-Luc 報告物(pMUCl-Luc)和 SV-40-Reni I Ia-Luc質(zhì)粒(作為對照)(圖OT)。轉(zhuǎn)染后48小時測量螢光素酶的活性。結(jié)果表示為與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖6A-D MUCI/CQC肽阻斷MUCl和NF-k B p65之間的相互作用。(圖6A)具有聚-dArg轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的MUC1/CQC(G0-201)和MUCI/AQA (CP-1)肽的序列。在存在MUC1/CQC或MUC1/AQA的情況下，在室溫下將GST-MUCl-⑶用純化的NF- k B p65孵育I小時。將谷胱甘肽珠的吸附物用抗p65進行免疫印跡(左)。不處理MCF-10A細胞，或者在存在5 u MMUCI/CQC或MUC1/AQA肽(每24小時添加)的情況下將其用TNF a刺激72小時。將抗p65沉淀物用所示抗體進行免疫印跡(右)。(圖6B和6C)不處理MCF-10A細胞，或者在存在5uM MUCI/CQC或MUCI/AQA肽(每24小時添加)的情況下將其用TNF a刺激72小時。將可溶染色質(zhì)用抗MUCl-C(左)或抗p65(右)進行沉淀，然后分析MUCl NF-K B結(jié)合基序啟動子序列(圖6B)。將裂解物用所示抗體進行免疫印跡(圖6C)。(圖6D)MUCl-C以自誘導(dǎo)調(diào)節(jié)回路通過IKK與p65的相互作用激活NF- K B通路的預(yù)計作用的模型。
圖7A-E =MUCl-C細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與NF- k B p65和p65RHD結(jié)合。(圖7A-B)將所示細胞的裂解物用抗P65或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀。將沉淀物用抗MUCl-C和抗p65進行免疫印跡。(圖7C)將ZR-75-1細胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUCl-⑶孵育。將吸附物用抗P65進行免疫印跡。引入物GST蛋白通過考馬斯亮蘭染色評估。(圖7D-E)用純化的 p65 (1-180)(圖 7D)或 p65 (186-306)(圖 7E)孵育 GST、GST-MUCI-CD 和GST-I K Ba。吸附物和引入物用抗p65進行免疫印跡。圖8 :ZR-75_1乳腺癌細胞中的MUCl沉默。使用BLOCK-iT靶點篩選系統(tǒng)(Invitrogen)產(chǎn)生小干擾 RNA (siRNA)，其靶向 MUCl 序列(AAGITCAGTGCCCAGCTCTAC (SEQ IDNO 55))和對照序列(CGCTTACCGAITCAGAATGG (SEQ ID NO :56))。siRNA 盒用于產(chǎn)生所述慢病毒(Kawano等，2007)。在存在聚凝胺(Sigma)時以感染復(fù)數(shù)5用慢病毒感染ZR-75-1細胞。選擇表達EGFP的細胞克隆。裂解物用所示抗體進行免疫印跡。圖9A-D =MUCl-C 直接與 STAT3DBD 結(jié)合。(圖 9A)將 ZR-75-1 (左)和 MCF-7 (右)細胞的裂解物用抗STAT3或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀。將沉淀物用所示抗體進行免疫印跡。(圖9B)將ZR-75-1細胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST和GST-MUCl-⑶孵育。將吸附物用抗STAT3進行免疫印跡。引入物GST和GST-MUCl-⑶蛋白通過考馬斯亮蘭染色評估。(圖9C)顯示MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，指示了磷酸化和結(jié)合位點。用純化的重組STAT3孵育結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST、GST-MUCl-CD、GST-MUCI-CD (1-45)和GST-MUC1-CD(46-72)。將吸附物用抗-STAT3進行免疫印跡。引入物GST和GST-MUC1-CD融合蛋白質(zhì)通過考馬斯亮蘭染色評估。(圖9D)STAT3的結(jié)構(gòu)。用純化的MUCl-⑶孵育結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST、GST-STAT3(全長；1-770位氨基酸)、GST-MUCl-CD (N端；1-257位氨基酸)、GST-MUC1-CD (DBD ;257_514 位氨基酸)和 GST-MUCl-CD (C 端；514_770 位氨基酸)。將吸附物用抗MUCl-C進行免疫印跡。引入物GST和GST-STAT3融合蛋白通過考馬斯亮蘭染色評估。圖10A-D =MUCl-C與STAT3轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)聯(lián)。(圖10A-B)表示STAT結(jié)合位點(SBS)位置的MUCl啟動子區(qū)域略圖。將ZR-75-l(圖10A)和MCF-7 (圖10B)細胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3 (左)和抗MUCl-C (右)進行免疫沉淀。最終的DNA提取物用覆蓋MUCl 啟動子STAT結(jié)合位點(SBS ；-689至-414)和對照區(qū)域(CR ；+4524至+4745)的引物對進行PCR擴增。(圖10C-D)將所示細胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3沉淀，并分析MUCl啟動子SBS和CR序列。在re-ChIP實驗中，抗STAT3沉淀物被釋放，用抗MUCl-C再免疫沉淀，然后分析MUCl啟動子序列。圖IlA-D :在MCF-10A細胞對IL-6的應(yīng)答中MUC1-C與STAT3相互作用。(圖11A)將MCF-10A細胞用IL-6刺激所示時間。將全細胞裂解物(左)和核裂解物(右)用所示抗體進行免疫印跡。(圖11B)用IL-6刺激MCF-10A細胞24小時。將裂解物用抗STAT3或?qū)φ誌gG進行免疫沉淀。將沉淀物用 所示抗體進行免疫印跡。(圖11C)將被IL-6刺激所示時間的MCF-10A細胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3或?qū)φ誌gG進行沉淀。分析沉淀物的MUCl啟動子SBS和CR序列。(圖11D)將對照和IL-6刺激的MCF-10A細胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3沉淀，并分析MUCl啟動子SBS和CR序列。在re_ChIP實驗中，釋放抗STAT3沉淀物，用抗MUCl-C再免疫沉淀，然后分析MUCl啟動子序列。圖12A-D IL-6對MUCl啟動子的激活由STAT3介導(dǎo)。(圖12A和B)MCF_10A細胞用對照或STAT3 siRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時。然后不處理轉(zhuǎn)染細胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時。裂解物用所示抗體進行免疫印跡(圖12A)。然后轉(zhuǎn)染細胞以表達MUCl啟動子-Luc報告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48小時測量螢光素酶的活性(圖12B)。結(jié)果表示為與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖12C)轉(zhuǎn)染MCF-10A以表達野生型或在STAT結(jié)合位點突變(mSBS)的pMUCl-Luc以及ReniIIa-Luc。24小時后，不處理細胞或用IL-6刺激24小時，然后測定螢光素酶活性。結(jié)果表示為與用野生型pMUCl-Luc轉(zhuǎn)染的未處理細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖12D)用對照或STAT3siRNA處理MCF-10A。24小時后，不處理細胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時，然后分析螢光素酶活性。結(jié)果表示為與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖13A-D =MUCl-C促進STAT3占據(jù)MUCl啟動子。(圖13A和B)MCF_10A細胞用對照或MUClsiRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時。然后不處理轉(zhuǎn)染細胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時。用抗STAT3沉淀可溶染色質(zhì)，并分析MUCl啟動子SBS和CR序列(圖13A)。然后轉(zhuǎn)染細胞以表達MUCl啟動子-Luc報告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48小時測量螢光素酶的活性(圖13B)。結(jié)果表示為與用對照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖13C)用抗STAT3沉淀ZR-75-1/載體和ZR-75-1/MUC1 siRNA細胞的可溶染色質(zhì)，并分析MUCl啟動子SBS和CR序列。(圖13D)轉(zhuǎn)染 ZR-75-1/ 載體和 ZR-75-1/MUC1 siRNA 細胞以表達 pMUCl-Luc 和 Reni I Ia-Luc。轉(zhuǎn)染后48小時測量螢光素酶的活性。結(jié)果表示為與ZR-75-1/MUC1 siRNA細胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨立實驗的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖14A-D :在IL-6刺激的MCF-10A細胞中G0-201阻斷MUC1-C和STAT3之間的相互作用。(圖14A)在室溫中在G0-201或CP-I的存在下與純化的MUCl-CD孵育GST-STAT31小時。谷胱甘肽珠的吸附物用抗MUCl-C進行免疫印跡(圖14B-C)。在5mM G0-201或CP-I (每24小時添加)的存在下用IL-6刺激MCF-10A細胞72小時。抗STAT3沉淀物用所示抗體進行免疫印跡(圖14B)。用抗STAT3或抗MUCl-C沉淀可溶性染色質(zhì)，并分析MUCl啟動子 SBS 和 CR 序列(圖 14C)。(圖 14D)pMUCl-Luc。
圖15 :MUC1_CD 吻合妝(Stapled Peptide)的序列。圖16A :MUC1-⑶吻合肽對非小細胞肺癌細胞H1650生長的作用。為評價對MUCl功能抑制的敏感性，用I和5iiM MUCl CQC吻合肽(G0-200-1B)處理H1650NSCLC細胞7天。用5 ii M G0-200-1B處理H1650細胞與生長的顯著抑制和細胞數(shù)降低相關(guān)。圖16B G0-200-2B對細胞增殖的作用。非小細胞肺癌細胞系H-1975培養(yǎng)在含有10%熱失活胎牛血清、100單位/mL青霉素、100 u g/ml鏈霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM。細胞在處理前一天重新接種。用5iiM G0-200-2B處理細胞3天，細胞活力由臺盼藍排除法測定。圖17 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對激素依賴性乳腺癌細胞生長的作用。為確定暴露于包含不同MUCl-⑶CQC區(qū)域的肽是否影響生長，用5iiM不同的肽處理ZR-75-1乳腺癌細胞4天并監(jiān)測細胞增殖。顯著地，與未處理的細胞相比有極大的生長抑制。圖18 :不同MUCl-CD CQC區(qū)域肽對非小細胞癌細胞生長的作用。用5 y M G0-203、G0-203-2或G0-203cyc處理非小細胞肺癌細胞A5497天。第7天的活細胞數(shù)通過臺盼藍排除法測定，通過比較未處理細胞的細胞生長來計算生長抑制百分比。圖19 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對非小細胞癌細胞H1975生長的作用。用5yM不同的MUCl-⑶CQC區(qū)域肽處理非小細胞肺癌細胞H19756天。第6天的活細胞數(shù)通過臺盼藍排除法測定。結(jié)果證明，用5 u M不同肽處理H1975細胞與顯著的生長抑制相關(guān)。圖20 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對三陰性乳腺癌細胞生長的作用。用5 ii M不同的MUCl-CD CQC區(qū)域肽處理三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-2316天。第6天的活細胞數(shù)通過臺盼藍排除法確定。結(jié)果證明，用不同肽處理MDA-MB-231細胞與顯著的生長抑制相關(guān)。圖21 :更短的G0-203肽對ZR-75-1乳腺癌細胞增殖的作用。將人ZR-75-1乳腺癌細胞培養(yǎng)在補充了 10%熱失活胎牛血清、100單位/mL青霉素、100 u g/ml鏈霉素的RPMI1640中。每天用5 ii M的不同肽處理細胞4天，細胞活力通過臺盼藍排除法確定。與G0-210相比，每天用 5iiMG0-203(SEQ ID NO :53)、G0_207 (SEQ ID NO :4)、G0_208 (SEQ ID NO :50)和G0-209 (SEQ ID NO :54)處理ZR-75-1乳腺癌細胞4天與顯著的生長抑制相關(guān)。說明性實施方案的描述本發(fā)明人和其他人已對MUCl在癌癥中的作用進行了廣泛研究。如上所述，人MUCl是異源二聚體糖蛋白，其作為單一多肽翻譯，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被切割成N端和C端亞基(Ligtenberg 等，1992 ；Macao 等，2006 ；Levitin 等，2005)。MUCl 的異常過表達在大多數(shù)人癌中被發(fā)現(xiàn)(Kufe等，1984),其賦予非錨定依賴性生長和致瘤性(Li等,2003a ；Huang等，2003 ；Schroeder等,2004 ；Huang等,2005)。其他研究已證明MUCl的過表達賦予對氧化應(yīng)激和基因毒性抗癌劑所誘導(dǎo)凋亡的抗性(Yin和Kufe，2003 ；Ren等，2004 ；Raina等，2004 ；Yin 等，2004 ；Raina 等，2006 ；Yin 等，2007)。栓系(tethered)和分泌的粘蛋白家族的作用是在上皮細胞表面提供保護性屏障。在上皮層有損壞時，鄰近細胞間的緊密連接被破壞，由于細胞開始heregulin誘導(dǎo)的修復(fù)程序而喪失極性(Vermeer等2003)。MUCl-N從細胞表面脫落(Abe和Kufe, 1989),剩余 MUCl-C的作用是作為將環(huán)境壓力信號傳至細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。對此，MUCl-C與ErbB受體家族成員形成細胞表面復(fù)合物，而且MUCl-C應(yīng)答于heregulin刺激而靶向核(Li等，2001 ；Li等，2003c) JUCl-C還通過MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(⑶)與聯(lián)蛋白家族成員的直接相互作用從而將ErbB受體和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路整合來發(fā)揮作用(Huang等，2005 ；Li等，2003c ；Yamamoto等，1997 ；Li等，1998 ；Li等，2001 ；Li和Kufe, 2001)。其他研究已證明，MUCl-CD被糖原合酶激酶3 0、^1^、蛋白激酶〇8和c-Abl磷酸化(Raina等，2006 ;Li等，1998 ;Li等，2001 ；Ren 等，2002)。負責(zé)MUCl-C核靶向的機制未知。包含典型核定位信號(NLS)的蛋白質(zhì)通過首先結(jié)合至輸入蛋白a (importin a )，然后結(jié)合至輸入蛋白0而輸入核(Weis, 2003)。乘載物(cargo)-輸入蛋白a/0復(fù)合物通過與核孔蛋白結(jié)合而?？吭诤丝?，并且通過依賴于RanGTPase的機制轉(zhuǎn)運通過核孔。典型的NLS是單組分(monopartite)的,其帶有4_5個堿性氨基酸的單一簇；或者是雙組分(bipartite)的，帶有由10-12個氨基酸的接頭分隔開的兩簇堿性氨基酸。MUCl-⑶包含并不符合單組分NLS原型的RRK基序(Hodel等，2002)。然而，包含非典型NLS的某些蛋白質(zhì)通過直接結(jié)合至輸入 蛋白P轉(zhuǎn)運通過核孔(Kau等，2004)。輸入蛋白P與一些核孔蛋白相關(guān)聯(lián)(Ryan和Wente, 2000),所述核孔蛋白包括Nup62,其位于核孔復(fù)合物的細胞質(zhì)和核質(zhì)兩面(Percipalle等，1997)。其他研究已表明，￠-聯(lián)蛋白通過不依賴于輸入蛋白和核孔蛋白的機制輸入核中(Suh和Gumbiner, 2003)。2006年，本發(fā)明人報道MUCl通過涉及與Nup62結(jié)合的機制輸入核(Leng等，
2007)。他們也證明MUCl通過MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的CQC基序形成寡聚體，而且MUCl寡聚化是核輸入所必需的。2007年，他們還證明MUCl在人癌細胞內(nèi)的過表達與NF-k B p65的組成型激活相關(guān)(Ahmad等，2007)。已表明MUCl在體內(nèi)與高分子量I k B激酶(IKK)復(fù)合物相互作用，而且MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與IKKP和IKKy直接結(jié)合。MUCl與IKK3和IKKy 二者的相互作用對IKKP激活是必需的，其導(dǎo)致IKBa的磷酸化和降解。這些發(fā)現(xiàn)表明，MUCl對IKKP的生理激活是重要的，而且如在人癌癥中所發(fā)現(xiàn)的，MUCl過表達賦予IKK P -NF- K B p65通路的持續(xù)誘導(dǎo)。在另外的未發(fā)表工作中，本發(fā)明人已將其研究擴展至進一步闡明CQC基序在寡聚體形成中的作用。他們還證明對應(yīng)于這一區(qū)域的短肽能夠以干擾MUCl寡聚體形成，阻止其轉(zhuǎn)運至腫瘤細胞核中。這些肽能抑制腫瘤細胞生長，而且誘導(dǎo)這些細胞的凋亡甚至腫瘤組織的壞死?？紤]到MUCl在炎癥疾病狀態(tài)中的新作用，本發(fā)明人試圖研究這些肽是否能用于治療炎癥疾病。目前的研究證明，MUCl-⑶與NF-K B p65直接結(jié)合并阻斷NF-K B p65和IkBq之間的相互作用。本發(fā)明人現(xiàn)在證明，MUCl-C亞基與NF-k B靶基因啟動子上的NF-kB p65相關(guān)聯(lián)，并促進NF-k B介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果還證明MUCl-C寡聚化抑制劑阻斷MUCl與NF- K B p65的相互作用并且阻斷炎性NF- k B通路的組成型激活。此外，已證明與STAT3(另一個炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子)的類似相互作用，MUCl對該過程的參與甚至更多。 下面更詳細地描述本發(fā)明的這些和另一些方面。I. MUClA.結(jié)構(gòu)MUCl是粘蛋白型糖蛋白，其表達于正常分泌性上皮細胞的頂邊界(Kufe等，1984)。MUCl作為單一肽合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將前體切割成兩個亞基，之后形成異源二聚體(Ligtenberg等，1992)。切割可通過自催化過程介導(dǎo)(Levitan等,2005)。大于250kDa的MUClN端(MUClN-ter，MUCI-N)亞基包含數(shù)量可變的20個氨基酸的串聯(lián)重復(fù)，其因高度保守變化而不完全并且被O-連接聚糖修飾(Gendler等，1988 ；Siddiqui等，1988)。MUCl-N通過與約23kDa的C端亞基(MUClC-ter，MUCl-C) 二聚化而栓系于細胞表面，所述C端亞基包含58個氨基酸的胞外區(qū)、28個氨基酸的跨膜區(qū)和72個氨基酸的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD ；SEQID NO: I) (Merlo等，1989)。人MUCl序列在以下顯示GSVVVQLTLA FREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGffG I ALLVLVCVLVALA I VYL I ALAV COCRRKNYGOLPIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA TSANL (SEQID NO 2)加粗序列表示⑶，下劃線部分是寡聚化抑制肽(SEQ ID NO :3)。隨著正常上皮細胞轉(zhuǎn)化成癌細胞，MUCl在胞質(zhì)內(nèi)和整個細胞膜上異常過表達(Kufe等，1984 ;Perey等，1992)。與細胞膜結(jié)合的MUCl通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用靶向內(nèi)涵體(Kinlough等，2004)。另夕卜，MUCl-C 而不是 MUCl-N 靶向核(Baldus 等，2004 ；Huang 等，2003 ；Li 等，2003a ；Li 等，2003b ；Li 等，2003c ；ffei 等，2005 ；ffen 等，2003)和線粒體(Ren 等，2004)。B.功能MUCl 與 ErbB 受體家族成員(Li 等,2001b ；Li 等，2003c ；Schroeder 等，2001)以及Wnt效應(yīng)子、￠-聯(lián)蛋白(Yamamoto等，1997)相互作用。表皮生長因子受體和c_Src將MUCl細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(MUCl-CD)的Y-46磷酸化，從而增加MUCl和P -聯(lián)蛋白的結(jié)合(Li等，2001a ;Li等，2001b)。MUCl和P -聯(lián)蛋白的結(jié)合也被糖原合酶激酶3 P和蛋白激酶C S調(diào)節(jié)(Li等，1998 ;Ren等，2002)。MUCl與3 -聯(lián)蛋白共定位于核內(nèi)(Baldus等，2004 ;Li等，2003a ；Li等，2003c ;Wen等，2003)，并共同激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄(Huang等，2003)。其他研究顯示MUCl還與p53直接結(jié)合并調(diào)節(jié)p53靶基因的轉(zhuǎn)錄(Wei等，2005)。值得注意的是，MUCl過表達足以誘導(dǎo)非錨定依賴性生長和致瘤性(Huang等，2003 ；Li等，2003b ；Ren等，2002 ； Schroeder 等，2004)。大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)在核內(nèi)編碼，并且通過線粒體外膜和內(nèi)膜中的易位復(fù)合物輸入線粒體內(nèi)。某些線粒體蛋白質(zhì)包含N端線粒體革巴向序列，并且與線粒體外膜中的Tom20相互作用(Truscott等,2003)。其他線粒體蛋白質(zhì)包含內(nèi)部革巴向序列，并且與Tom70受體相互作用(Truscott等,2003)。近期工作顯示,無內(nèi)部革巴向序列的線粒體蛋白質(zhì)通過HSP70與HSP90的復(fù)合物遞送至Tom70 (Young等，2003)。II. MUCl 肽A.結(jié)構(gòu)本發(fā)明考慮設(shè)計、生產(chǎn)及使用多種MUCl肽。這些肽的結(jié)構(gòu)特征如下。首先，所述肽具有不多于20個的連續(xù)MUCl殘基。因此，術(shù)語“具有不多于20個的連續(xù)殘基的肽”(甚至包含術(shù)語“包含”時)不應(yīng)被理解為包含更多數(shù)量的連續(xù)MUCl殘基。其次，所述肽包含CQC基序，而且還可包含CQCR、CQCRR或CQCRRK基序。因此，所述肽具有(至少)MUC1_C結(jié)構(gòu)域的這4、5或6個連續(xù)殘基。第三，所述肽有至少I個氨基酸殘基與CQCRRK基序第一個C殘基的NH2端一側(cè)連接，使得所述第一個C殘基被與其連接的至少一個氨基酸所“覆蓋”。該殘基可以是MUCl中天然存在的(即來自跨膜結(jié)構(gòu)域)，可以隨機選擇(選自20個天然氨基酸或其類似物中的任一個)，或者可以是另一肽序列的一部分(例如，用于純化的標(biāo)簽序列、穩(wěn)定化序列或細胞遞送結(jié)構(gòu)域)。
通常，所述肽為50個殘基或更少，并且包含不多于20個的連續(xù)MUCl殘基。全長可以是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個殘基。考慮的肽長度范圍是4-50個殘基、7-50個殘基、4-25個殘基、7_25個殘基、4_20個殘基、7_20個殘基、3-15個殘基和7-15個殘基。連續(xù)MUCl殘基數(shù)可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。考慮的連續(xù)殘基范圍是4-20個殘基、5-20個殘基、6-20個殘基、7-20個殘基、4-15個殘基、5-15個殘基、6-15個殘基和7_15個殘基。本發(fā)明可以使用L-構(gòu)型氨基酸、D-構(gòu)型氨基酸或其混合物。盡管L氨基酸占蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)氨基酸的絕大多數(shù)，但D-氨基酸在異域海生生物(例如海蝸牛)產(chǎn)生的一些
蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。它們也是細菌細胞壁肽聚糖的主要組分。D-絲氨酸可在腦中起神經(jīng)遞質(zhì)的作用。氨基酸構(gòu)型的L和D規(guī)則不涉及氨基酸本身的光學(xué)活性，而是涉及理論上可合成氨基酸的甘油醛異構(gòu)體的光學(xué)活性(D-甘油醛是右旋的，L-甘油醛是左旋的)?！叭獶”肽的一種形式是逆反(retro-inverso)肽。天然多肽的逆反修飾涉及這樣的氨基酸的合成組裝，即其具有與相應(yīng)L-氨基酸立體化學(xué)相反的a -碳，即D-氨基酸相對于天然肽序列順序相反。因此逆反類似物具有顛倒的末端和顛倒的肽鍵方向(NH-C0而不是C0-NH)，而大概維持了與天然肽序列相同的側(cè)鏈拓撲結(jié)構(gòu)。見美國專利6，261，569，其通過引用并入本文。如上所述，本發(fā)明考慮融合或綴合細胞遞送結(jié)構(gòu)域(也稱為細胞遞送載體，或細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。該結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的，而且通常以短的兩性或陽離子肽和肽衍生物為特征，通常包含多個賴氨酸和精氨酸殘基(Fischer，2007)。特別感興趣的是聚D-Arg和聚D-Lys序列(例如，右旋殘基，長8個殘基)。表I
權(quán)利要求
1.在表達MUCl的細胞中抑制炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將所述細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽包含至少5、6或7個連續(xù)MUCl殘基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述序列包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽包含MUCl的不多于10個連續(xù)殘基、11個連續(xù)殘基、12個連續(xù)殘基、13個連續(xù)殘基、14個連續(xù)殘基、15個連續(xù)殘基、16個連續(xù)殘基、17個連續(xù)殘基、18個連續(xù)殘基或19個連續(xù)殘基。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述MUCl陽性細胞是腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞或炎性細胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述炎性細胞是巨噬細胞、B細胞、T細胞、樹突狀細胞、骨髓源性抑制細胞、NK細胞或嗜中性粒細胞。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽與細胞遞送結(jié)構(gòu)域融合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細胞遞送結(jié)構(gòu)域是聚D-R、聚D-P或聚D-K。
9.權(quán)利要求I的方法，其還包括將所述細胞與第二抗炎劑接觸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述第二抗炎劑是類固醇或COX-2抑制劑。
11.權(quán)利要求9的方法，其中在所述肽之前接觸所述第二抗炎劑。
12.權(quán)利要求9的方法，其中在所述肽之后接觸所述第二抗炎劑。
13.權(quán)利要求9的方法，其中與所述肽同時地接觸所述第二抗炎劑。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽包含的全部是L氨基酸。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽包含的全部是D氨基酸。
16.權(quán)利要求I的方法，其中所述肽包含L和D氨基酸的混合物。
17.權(quán)利要求I的方法，其中所述炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括NF-K B介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中NF-kB介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括NF-k B激活選自Bcl-xL和MUCl的靶基因。
19.權(quán)利要求17的方法，其中STAT介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括STAT3激活。
20.權(quán)利要求19的方法，其中STAT3介導(dǎo)的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括STAT3激活選自細胞周期蛋白 01、生存素、1(1 1、1(1 2、0(11011(、1^代71、]^81六681、2邙57、2邙3611、5113匕？1、(。11(13和MUCl的靶基因。
21.在表達MUCl的細胞中抑制MUCl與NF-kB或STAT結(jié)合的方法，其包括將所述細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。
22.在表達MUCl的細胞中抑制MUCl與IK B a競爭結(jié)合NF- k B的方法，其包括將所述細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。
23.在表達MUCl的細胞中抑制MUCl誘導(dǎo)的NF-k B核轉(zhuǎn)位的方法，其包括將所述細胞與具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋。
24.抑制對象中的炎性應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC (SEQ ID NO 4)的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆至Jhl o
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽包含至少5、6或7個連續(xù)MUCl殘基。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述序列包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽包含MUCl的不多于10個連續(xù)殘基、11個連續(xù)殘基、12個連續(xù)殘基、13個連續(xù)殘基、14個連續(xù)殘基、15個連續(xù)殘基、16個連續(xù)殘基、17個連續(xù)殘基、18個連續(xù)殘基或19個連續(xù)殘基。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述炎性應(yīng)答是由NF-kB介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述肽與細胞遞送結(jié)構(gòu)域融合。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述細胞遞送結(jié)構(gòu)域是聚D-R、聚D-P或聚D-K。
31.權(quán)利要求24的方法，其中施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、口服、瘤內(nèi)、皮下、表面或腹腔內(nèi)施用。
32.權(quán)利要求24的方法，其中施用包括局部、區(qū)域、全身或持續(xù)施用。
33.權(quán)利要求24的方法，其中抑制包括抑制或解除所述炎性應(yīng)答。
34.權(quán)利要求24的方法，其還包括對所述對象施用第二抗炎治療。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述第二抗炎治療是類固醇或COX2抑制劑。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述第二抗炎治療在所述肽之前施用。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述第二抗炎治療在所述肽之后施用。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述第二抗炎治療與所述肽同時施用。
39.權(quán)利要求24的方法，其中所述對象是人。
40.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽以0.l-500mg/kg/天施用。
41.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽以10-100mg/kg/天施用。
42.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽每日施用。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述肽每日施用，持續(xù)7天、2周、3周、4周、I個月、6周、8周、2個月、12周或3個月。
44.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽每周施用。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述肽每周施用，持續(xù)2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。
46.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽包含的全部是L氨基酸。
47.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽包含的全部是D氨基酸。
48.權(quán)利要求24的方法，其中所述肽包含L和D氨基酸的混合物。
49.藥物組合物，其包含(i)具有至少4個連續(xù)MUCl殘基但不多于20個連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋；和(ii)除(i)外的第二抗炎劑。
50.權(quán)利要求49的組合物，其中第二抗炎劑是類固醇或COX-2抑制劑。
51.MUCl肽，其具有至少7個并且不多于20個的殘基，具有3-20個連續(xù)MUCl殘基，并且包含序列CQC，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋，而且其中所述肽還包含與第一氨基酸側(cè)鏈連接的第一連接部分和與第二氨基酸側(cè)鏈連接的第二連接部分，所述第一和第二連接部分(a)相互結(jié)合而且(b)由介于其間的三個氨基酸殘基分隔開。
52.權(quán)利要求51的肽，其中所述肽長8-20個殘基、長8-17個殘基、長9-17個殘基、長10-17個殘基、長10-16個殘基或長10-15個殘基。
53.權(quán)利要求51的肽，其中所述肽長8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個殘基。
54.權(quán)利要求51的肽，其中所述連續(xù)願(1殘基數(shù)是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15.16或 17。
55.權(quán)利要求51的肽，其還包含與第三氨基酸側(cè)鏈連接的第三連接部分，所述第二和第三連接部分相互結(jié)合，而且所述第二和第三氨基側(cè)鏈由介于其間的三個氨基酸殘基分隔開，并且所述肽長至少10個殘基。
56.權(quán)利要求51 的肽，其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYG、IVYLALACQCRRKNYGQ、VYLALACQCRRKNYGQL 或 YLALACQCRRKNYGQLD。
57.權(quán)利要求51的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于Y4和A8。
58.權(quán)利要求55的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于A8和R12。
59.權(quán)利要求55 的肽，其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYG、IVYLALACQCRRKNYGQ、VYLALACQCRRKNYGQL 或 YLALACQCRRKNYGQLD。
60.權(quán)利要求59的肽,其中第一、第二和第三氨基酸側(cè)鏈分別位于Y4、A8和R12。
61.MUCl肽，其具有至少10個并且不多于20個殘基，具有3-20個連續(xù)MUCl殘基，并且包含序列CQC，其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個氨基酸殘基所覆蓋，而且其中所述肽還包含與第一氨基酸側(cè)鏈連接的第一連接部分和與第二氨基酸側(cè)鏈連接的第二連接部分，所述第一和第二連接部分(a)相互結(jié)合而且(b)由介于其間的七個氨基酸殘基分隔開。
62.權(quán)利要求61的肽，其中所述肽長11-20個殘基、長11-19個殘基、長11-18個殘基、長12-18個殘基、長12-19個殘基或長12-18個殘基。
63.權(quán)利要求61的肽，其中所述肽長10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個殘基。
64.權(quán)利要求61的肽，其中所述連續(xù)願(1殘基數(shù)是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15.16或 17。
65.權(quán)利要求61的肽，其還包含與第三氨基酸側(cè)鏈連接的第三連接部分，所述第二和第三連接部分相互結(jié)合，并且所述第二和第三氨基側(cè)鏈由介于其間的七個氨基酸殘基分隔開，所述肽長至少18個殘基。
66.權(quán)利要求61 的肽，其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYGQ、!VYLALACQCRRKNYGQL 或VYLALACQCRRKNYGQLD。
67.權(quán)利要求67的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于I2和Q1(l。
68.權(quán)利要求67的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于A8和Y16。
69.權(quán)利要求65的肽，其中所述肽包含AIVYLALACQCRRKNYGQLD。
70.權(quán)利要求69的肽,其中第一、第二和第三氨基酸側(cè)鏈分別位于Y2、R12和D2(i。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自MUC1細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的肽以及使用其的方法。這些肽可以抑制MUC1寡聚化、抑制MUC1與NF-κB或STAT的相互作用，并且阻斷由NF-κB或STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)的炎性應(yīng)答。
文檔編號A61K38/09GK102665748SQ201080033096
公開日2012年9月12日 申請日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者唐納德·W·庫弗, 蘇倫德·克哈班達 申請人:屬腫瘤有限責(zé)任公司, 達娜-法勃腫瘤研究所公司