專利名稱：一種抗炎六肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠抑制炎癥因子分泌的六肽分子Lys Val Cit Lys Pro Val，本發(fā)明還涉及這種抗炎六肽的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自1986年核因子-κ B(nuclear factor-κ B, NF-κ B)被偶然發(fā)現(xiàn)以來，其重要性 正日益受到關(guān)注并成為目前最活躍的研究領(lǐng)域之一。典型的NF- κ B是由多肽鏈ρ50和ρ65 兩亞基形成的異二聚體。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κ B主要與κΒ抑制蛋白(IkBS，，其 中起重要作用的是ΙκΒα，ΙκΒβ)結(jié)合形成三聚體，以無活性方式存在于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)細(xì) 胞受到多種外界信號(hào)(如炎性刺激、致癌物、電離輻射、生長(zhǎng)因子及其它應(yīng)激原等)刺激進(jìn) 而啟動(dòng)細(xì)胞第二信使系統(tǒng)時(shí)，IkBs在IkB激酶(I κ Ks :由I κ K α、ΙκΚβ、NIK、IKAP組 成的復(fù)合物)的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-κ B失去I κ Bs的嚴(yán)格控制而被激活，并移位 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；其亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)與靶基因特定部位結(jié)合，啟動(dòng)400余種與炎癥、細(xì)胞存 活、增殖、侵襲及血管生成密切相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。已證實(shí)NF- κ B的活化不僅與腫瘤的 生長(zhǎng)、增殖、存活、侵襲、轉(zhuǎn)移、新生血管生成以及放、化療耐受有關(guān)，而且也與多種炎癥相關(guān) 性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如(類)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌 相關(guān)性胃炎、炎癥性腸道疾病等慢性炎性疾病，膿毒癥、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等 急性炎性疾病，Alzheimer' s病，動(dòng)脈粥樣硬化，系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病和癌 癥的發(fā)生和發(fā)展均于NF-κ B過度或持續(xù)活化密切相關(guān)。因此，NF-κ B被認(rèn)為是極具潛力的 抗腫瘤、抗炎靶點(diǎn)。目前眾多醫(yī)藥公司斥巨資研發(fā)具有治療潛力的NF-K B抑制劑，部分已 進(jìn)入I/II期臨床實(shí)驗(yàn)?？梢娪嘘P(guān)NF-κ B的研究態(tài)勢(shì)正逐漸“從克隆向臨床”(from clone to clinic)過渡。鑒于NF-κ B在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，以NF-K B及其信號(hào)傳導(dǎo)通 路中的相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)，研發(fā)NF-K B相關(guān)疾病的治療藥物已成為本領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。目 前國(guó)外有關(guān)以NF- κ B為靶點(diǎn)的拮抗治療策略主要包括以下幾個(gè)方面(1)抗氧化治療如 抗氧化劑——吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)非特異抑制 NF-K B的轉(zhuǎn)錄活性；(2)抑制IKK的形成及活性應(yīng)用ΙΚΚα的反義核酸、表達(dá)IKKa顯 性失活突變體以及應(yīng)用干擾IKK復(fù)合物形成的干擾肽等抑制IKK的形成及活化；(3)減少 IkB的降解某些蛋白酶小體抑制劑如MG101、MG115、MG132、PS-341、Iactacystin以及近 來發(fā)現(xiàn)的印oxomicin等均可通過抑制I κ B的降解，達(dá)到拮抗NF- κ B活性的目的。(4)促 進(jìn)I κ B的生成應(yīng)用I κ Ba的腺病毒表達(dá)載體，使I κ Ba顯型失活突變體過量表達(dá)，可明 顯抑制NF- κ B的核移位及其后續(xù)效應(yīng)；(5)抑制NF- κ B的合成設(shè)計(jì)Ρ50和Ρ65的反義核 酸和siRNA阻滯NF- κ B的合成；(6)傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥物抑制NF- κ B的活化；(7)來源 于中藥的姜黃素、黃酮類化合物和白藜蘆醇等化合物非特異地抑制NF-κ B信號(hào)通路的活 化。上述以NF- κ B為靶點(diǎn)的治療策略在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已表現(xiàn)出不同程度的療
3效，部分治療策略已進(jìn)入臨床試用階段，且已通過United States Patent and Trademark Office和European Patent Office等注冊(cè)并受專利保護(hù)。如第一個(gè)臨床應(yīng)用治療復(fù)發(fā)或難 治的多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑——硼替佐米(bortezomib，商品名為萬珂Velcade， 最初被稱為PS-341)，主要對(duì)抗NF-k B路徑。如美國(guó)醫(yī)藥公司Corgentech和AlgoRx于 2005年12月聯(lián)合注冊(cè)了商品名為Avrina的藥物，對(duì)濕疹進(jìn)行I、II期臨床試驗(yàn)。該藥物 為NF- κ B誘騙(Decoy)分子，被認(rèn)為是高度選擇性的NF- κ B抑制劑。但眾所周知，NF- κ B 拮抗劑的應(yīng)用必然要面對(duì)如下不可回避的問題①安全性由于NF-κ B遍布全身所有的細(xì) 胞，不加選擇的抑制其活性會(huì)導(dǎo)致廣泛的生理功能紊亂。如上述硼替佐米使用后可出現(xiàn)顯 著的神經(jīng)病變。解決該問題的理想選擇有兩個(gè)一是采用藥物靶向傳輸系統(tǒng)，使其只在病灶 部位或病變細(xì)胞中起作用；二是局部用藥，如上述Avrina藥物對(duì)濕疹治療時(shí)采用的是局部 涂抹用藥方式。②穿膜性NF-κ B拮抗劑只有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮抑制作用。解決方法如 下一是選擇小分子拮抗劑，因其可自由穿過細(xì)胞膜；二是通過轉(zhuǎn)染制劑如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；三 是通過連接穿膜肽后，由其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。③高效性對(duì)獲得的陽(yáng)性多肽或化合物，在提高其 藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(如溶解度、疏水性、轉(zhuǎn)運(yùn)特性等)的基礎(chǔ)上，通過改構(gòu)、優(yōu)化等策略提高其 與靶分子的親和力或同時(shí)作用多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮作用。目前有關(guān)NF-κ B拮抗劑的安全性(靶 向性)、穿膜性、高效性的研究正成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。我們?cè)趪?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助下，利用酵母雙雜交技術(shù)，以NF-K B亞基 ρ65的DNA結(jié)合域?yàn)椤罢T餌”，篩選出系列ρ65相互作用多肽，后經(jīng)Pull-down、表面等離子共 振分析、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、離體細(xì)胞培養(yǎng)和在體炎癥動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成功獲得系列NF-K B 亞基拮抗肽，其中5條分別見專利200510007479. 2,200510069451. 1。為了提高多肽的活性并降低其副作用，需要對(duì)現(xiàn)有的活性多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或結(jié) 構(gòu)優(yōu)化。目前對(duì)多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的方法可分為兩大類①在不改變多肽本質(zhì)基礎(chǔ)上進(jìn)行 的改造。包括將直鏈肽改造成環(huán)肽、定位突變或化學(xué)修飾(如聚乙二醇修飾)、結(jié)構(gòu)拼接組 裝、微囊包埋等設(shè)計(jì)策略。②把肽結(jié)構(gòu)變換成非肽分子。我們通過不同的策略對(duì)自行研制 的上述NF- κ B亞基拮抗肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，意外發(fā)現(xiàn)NF- κ B亞基拮抗肽AspLysProVal序列 本身具有穿膜特性并表現(xiàn)出抗炎作用，而改構(gòu)后的短肽Lys(D-Pr0)ValCit在保留其穿膜 特性的基礎(chǔ)上，表現(xiàn)出的抗炎活性更強(qiáng)，見專利201010111921. 7。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步 對(duì)該肽進(jìn)行改構(gòu)，發(fā)現(xiàn)改構(gòu)后的六肽分子Lys Val Cit Lys Pro Val的抗炎作用更強(qiáng)，且仍 然保留其穿膜特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該六肽不僅能夠抑制炎性細(xì)胞炎癥因子的分泌，還可有 效拮抗酵母多糖A所致的小鼠足跖炎癥反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供以Lys(D-Pr0)ValCit為母體的改構(gòu)六肽，該改構(gòu)六肽具有 穿膜作用且具有更強(qiáng)的抗炎活性。本發(fā)明的另一目的是提供此抗炎六肽的藥物用途。本發(fā)明的六肽，氨基酸序列如下Lys Val Cit Lys Pro Val0本發(fā)明還包括本發(fā)明的多肽的制備方法，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、溶 液中合成方法，基因重組方法或化學(xué)合成方法。
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本發(fā)明所述藥物用途是治療炎性免疫相關(guān)疾病的藥物用途。其中所述炎性相關(guān)疾 病是膿毒癥、膿毒性休克、(類)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡等。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的多肽的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，必要時(shí)可 以含有藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，可以以任何形式的藥物制劑形式存在。如 適合口服的制劑或適合注射的制劑，優(yōu)選是注射劑。最優(yōu)選是冷凍干燥注射劑。具有本發(fā)明氨基酸序列結(jié)構(gòu)的多肽既可以以多肽形式單獨(dú)存在，也可與其它蛋白 和多肽融和，或被甲基化、乙?；桶被刃揎棧蜻M(jìn)行個(gè)別氨基酸的突變或替代，或插 入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu) 多肽的物質(zhì)可能表現(xiàn)出抗炎活性。含此氨基酸序列的物質(zhì)可有各種應(yīng)用方式，主要包括在體外和體內(nèi)的抗炎活性， 以各種給藥方式實(shí)現(xiàn)以抗炎活性為目的的疾病治療。本發(fā)明的多肽比先前開發(fā)的幾種多肽更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)為本發(fā)明的多肽序列較 短，便于合成，且抗炎活性更強(qiáng)，有關(guān)實(shí)驗(yàn)的比較數(shù)據(jù)見實(shí)施例。


圖1為抗炎六肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-α分泌的影響。圖2為抗炎六肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素6分泌的影響。圖3為酵母多糖A致小鼠足跖炎癥及抗炎六肽治療效果。圖4為抗炎六肽的穿膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1、Lys Val Cit Lys Pro Val制備方法的操作步驟固相多肽合成的主要操作步驟如下1、樹脂溶漲將Wang-Resin樹脂放入反應(yīng)管 中，加 DMF(15ml/g)，30min。2、脫保護(hù)去掉 DMF，加 20%哌啶 DMF 溶液(15ml/g)，5min，去 掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、檢測(cè)抽掉哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙 醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105°C 110°C加熱5min，變深藍(lán)色為陽(yáng)性反 應(yīng)。4、洗滌:DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次。5、縮合加入保 護(hù)氨基酸三倍過量，活化劑HBTU三倍過量，均用盡量少DMF溶解，加入反應(yīng)管，立刻加入NMM 十倍過量，反應(yīng)30min。6、洗滌=DMF (1 Oml/g) 一次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF (10ml/g)兩次。 7、重復(fù)二至六操作依次連接氨基酸(從C端到N端順序Val、Pro、Lys, Cit、Val, Lys)，最 后一次洗滌:DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次，DCM(10ml/g)兩 次。9、裂解配制裂解液(10ml/g)——TFA 94. 5% ；水 2. 5%;EDT 2. 5%;TIS l%,120mino 10、吹干洗滌將裂解液用氮?dú)獗M量吹干，用乙醚洗六次，然后常溫?fù)]干。11、HPLC純化以 水和乙腈做流動(dòng)相，在流動(dòng)相中加入0. 的TFA，梯度從5% —85%，使用C18反相柱。實(shí)施例2、抗炎六肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響取20克左右雌性C57BL/6小鼠，常規(guī)灌洗出腹腔巨噬細(xì)胞，以1 X IO6個(gè)細(xì)胞/孔 細(xì)胞量加入24孔培養(yǎng)板，分別加入內(nèi)毒素(LPS) 1 μ g/ml作用24小時(shí)，同時(shí)加入不同組別不同濃度的多肽，收集上清，以ELISA試劑盒測(cè)定炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF- α )、白細(xì) 胞介素即L-10)水平。結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽(陽(yáng)性肽1)可抑制腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激的炎 癥因子的分泌，且該抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，該作用強(qiáng)度明顯高于陽(yáng)性肽2組(序列為 Lys(D-Pro)ValCit)；而陰性肽則無明顯作用。如圖1、圖2所示。取20克左右雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、致炎組與不同治療組，每組5 只。以酵母多糖A(15mg/ml)注入致炎組、治療組雙后肢足跖部各50 μ 1，對(duì)照組于相應(yīng)部 位注入等劑量的生理鹽水。注射當(dāng)天定為0天，于第2天對(duì)治療組分別應(yīng)用地塞米松注射 液(750ymOl/L)、多肽注射液(75ym0l/L) —次，50 μ 1/足，觀察期內(nèi)動(dòng)態(tài)測(cè)定小鼠足跖容 積。結(jié)果表明，致炎組發(fā)生足跖炎癥腫脹，本發(fā)明的多肽(陽(yáng)性肽1)可有效減輕其炎 癥腫脹程度，其抗炎效果優(yōu)于陽(yáng)性肽2 (序列為L(zhǎng)ys (D-Pro) ValCit)和地塞米松；而陰性多 肽則不具有這種治療作用。如圖3所示。實(shí)施例4、抗炎六肽的穿膜實(shí)驗(yàn)熒光素FITC標(biāo)記的多肽序列(FITC-Lys Val Cit Lys Pro Val)由上海強(qiáng)耀生物 科技有限公司合成，純度> 95%。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW 264. 7細(xì)胞，以5 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔 細(xì)胞量加入至放有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，加入FITC標(biāo)記的多肽10 μ M分別作用0. 5、1、2 小時(shí)，之后取蓋玻片在激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。結(jié)果顯示，本發(fā)明的多肽在0.5小時(shí)即可穿膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，1、2小時(shí)經(jīng)過多肽穿膜 的細(xì)胞幾乎達(dá)到100%。如圖4所示經(jīng)過多肽穿膜1小時(shí)的細(xì)胞。
權(quán)利要求
一種抗炎六肽，結(jié)構(gòu)如下Lys Val Cit Lys Pro Val。
2.權(quán)利要求1的六肽在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，所述抗炎是對(duì)抗炎性免疫相關(guān)的疾病。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述炎性免疫相關(guān)的疾病是膿毒癥、膿毒性休克、風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
5.含有權(quán)利要求1的六肽的藥物組合物。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中含有藥物可接受的載體。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，其以任何形式的藥物制劑形式存在。
8.權(quán)利要求5的藥物組合物，其是注射劑。
9.權(quán)利要求5的藥物組合物，其是冷凍干燥注射劑。
10.權(quán)利要求1的多肽的制備方法，其特征在于，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、 溶液中合成方法、基因重組方法或化學(xué)合成方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗炎六肽Lys Val Cit Lys Pro Val，及這種抗炎六肽的制備和應(yīng)用，本發(fā)明還包括本發(fā)明的多肽的制備方法，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重組方法或化學(xué)合成方法，本發(fā)明所述藥物用途是治療炎性免疫相關(guān)疾病的藥物用途，其中所述炎性相關(guān)疾病是膿毒癥、膿毒性休克、(類)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101974073SQ201010536659
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者張醇, 楊雪, 梁華平, 王希, 范霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院