專利名稱：抑免蛋白/親環(huán)蛋白和emmprin免疫球蛋白受體超家族成員的雙重抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過獨(dú)立地或者組合地抑制抑免蛋白/親環(huán)蛋白家族成員和/或 EMMPRIN免疫球蛋白受體超家族成員，用于在對(duì)象中調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而不顯著影響先天免疫反應(yīng)的方法和組合物。本發(fā)明還涉及通過獨(dú)立地或者組合地抑制抑免蛋白/親環(huán)蛋白家族成員和/或EMMPRIN免疫球蛋白受體超家族成員用于治療各種臨床癥狀的方法和組合物。
背景技術(shù)：
廣泛種類的臨床癥狀和疾病由急性和慢性炎癥過程介導(dǎo)，受免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。免疫系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成能保護(hù)主體不受感染性的損害，防止在暴露至各種侵入物的生命期間可能出現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞，以及消除外來(lái)的潛在有毒化學(xué)物質(zhì)。在廣義上，免疫系統(tǒng)用于保護(hù)主體的主要效應(yīng)器途徑有兩個(gè)先天免疫和適應(yīng)性免疫。先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)均通過普通效應(yīng)分子促進(jìn)對(duì)于損傷和外來(lái)侵入物的侵入的炎癥性反應(yīng)，特別是促炎細(xì)胞因子TNF α和 IL-I β。因此，兩種類型的免疫均有助于炎性疾病的病理生理。先天免疫被設(shè)置成迅速響應(yīng)，但被限制于其保護(hù)范圍，并且不能發(fā)展成為長(zhǎng)效的記憶。先天免疫反應(yīng)的特征是涉及急性炎癥(由受損或者受感染細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo))、補(bǔ)體系統(tǒng)，和包括吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹狀細(xì)胞)和天然殺傷細(xì)胞的非特異性白細(xì)胞的反應(yīng)。適應(yīng)性免疫發(fā)展的時(shí)間更長(zhǎng)，其發(fā)生于首次暴露于病原體，接種疫苗，或者試驗(yàn)性免疫之后。然而，適應(yīng)性免疫反應(yīng)是特異性的(即，能夠響應(yīng)廣泛范圍的不同類型的對(duì)于主體的潛在危險(xiǎn)性損害)，并能夠發(fā)展長(zhǎng)效的“免疫記憶”。此種能力導(dǎo)致記憶T細(xì)胞庫(kù)，其可以被迅速調(diào)動(dòng)、活化、擴(kuò)大、以及被分化為成熟的外周效應(yīng)細(xì)胞，以針對(duì)大部分，不一定是全部外來(lái)侵入物(即細(xì)菌、病毒和寄生蟲)調(diào)節(jié)保護(hù)性的免疫反應(yīng)。先天和適應(yīng)性免疫兩者高度交互作用，并在誘導(dǎo)炎癥、放大免疫反應(yīng)、形成免疫反應(yīng)的特性、消除病原體，以及在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間終結(jié)免疫效應(yīng)機(jī)制和相關(guān)的炎癥中扮演關(guān)鍵角色。適應(yīng)性和先天免疫共用通常的效應(yīng)分子，特別是細(xì)胞因子和趨化因子。這些介體對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，效應(yīng)細(xì)胞的激活和遷移，以及有效免疫反應(yīng)的產(chǎn)生是關(guān)鍵性的。過度活化的先天或者適應(yīng)性免疫反應(yīng)(或者兩者)引起癥狀，如炎癥和自身免疫病。由慢性炎癥介導(dǎo)的癥狀的例子是自身免疫病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、慢性斑塊銀屑癬(CPPs)和牛皮癬關(guān)節(jié)炎(PsA)。這些慢性炎癥疾病的特征是纖維原細(xì)胞和滑膜細(xì)胞(在RA中)和角質(zhì)細(xì)胞(在CPI^s/PsA中)高度增生，以及活化T細(xì)胞(特別是 TH22細(xì)胞)，ΜΦ，及其它免疫細(xì)胞滲透入損害的皮膚和/或關(guān)節(jié)中。這些患者體內(nèi)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，其包括腫瘤壞死因子-a (TNFa)、白細(xì)胞介素(IL-Ιβ)，和白細(xì)胞介素-32 γ (IL-32 Y)，并引起和保持慢性炎癥。包括ΜΦ的活化的免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)這些因子的向上調(diào)控驅(qū)動(dòng)了這些病癥的發(fā)病機(jī)制。已有顯示，在臨床相關(guān)的動(dòng)物模型中，T細(xì)胞在 ΜΦ活化和自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。除自身免疫病之外，慢性炎癥還在許多腫瘤和心血管疾病中發(fā)揮作用。銀屑癬影響近2-3%全世界的人口，并且其僅僅在美國(guó)的治療費(fèi)用每年超過30億美元。在此種相對(duì)普遍的免疫性疾病的病理生理學(xué)中，活化的T細(xì)胞和細(xì)胞因子是重要的。 若干促炎細(xì)胞因子，特別是TNF α的皮膚和組織超量表達(dá)被認(rèn)為造成皮膚損害的誘導(dǎo)、維持和復(fù)發(fā)。已經(jīng)證明，引入TNFa抑制劑對(duì)于自身免疫和風(fēng)濕性疾病的炎癥是有效的治療方式，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎和強(qiáng)直性脊柱炎。然而 TNFa抑制劑有許多嚴(yán)重的缺點(diǎn)。TNFa抑制劑治療不能治愈該疾病。對(duì)于那些感受癥狀解除的人，該解除通常只是臨時(shí)的。另外，由TNFa抑制劑所引起的副作用包括增加感染以及其它病的風(fēng)險(xiǎn)，如肺結(jié)核、革蘭氏陽(yáng)性感染、淋巴瘤；以及狼瘡類病和脫髓鞘疾病。用TNFa 抑制劑治療的病人嚴(yán)重感染風(fēng)險(xiǎn)增加的原因是該抑制劑同時(shí)抑制適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)， 使該患者對(duì)感染不設(shè)防。已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)銀屑癬和牛皮癬關(guān)節(jié)炎特異性靶向的生物制品，其作為有前途的新治療選擇。這些治療是“靶向的”，并且通過阻滯活化T細(xì)胞的信號(hào)產(chǎn)生而起作用。Amevive (alefacept (阿法賽特))是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療銀屑癬的生物制劑，其結(jié)合至T細(xì)胞上的⑶2受體，破壞在免疫突觸中和LFA-3的相互作用，引起病原性T細(xì)胞的凋亡。Raptiva (efalizumab)結(jié)合至LFA-1，阻擋T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞的ICAM-I結(jié)合，由此阻止T細(xì)胞活化和進(jìn)入真皮和表皮。治療劑(如依那西普(etanerc印t)、英利昔單抗(infliximab)和阿達(dá)木單抗(adalimumab))是生物制品，其被設(shè)計(jì)成結(jié)合TNF α，抑制炎癥反應(yīng)，細(xì)胞過濾和角質(zhì)細(xì)胞增殖。然而，這些生物治療劑不是對(duì)所有患者有效，這提示可能存在另外的T細(xì)胞致病通道和/或T細(xì)胞共激化分子。圖1顯示了 IS的一個(gè)實(shí)施例，以及目前治療劑的作用位點(diǎn)。對(duì)于涉及慢性炎癥的癥狀缺乏有效治療的現(xiàn)狀已導(dǎo)致對(duì)于可減少慢性炎癥而不使患者失去適應(yīng)性和先天免疫防御的治療的需要。

發(fā)明內(nèi)容
概述在一個(gè)實(shí)施方式中，本公開涉及抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，該方法包括給予有效量的抑制CD147的活性和/或表達(dá)的組合物。在一些實(shí)施方式中，該方法可以使用同時(shí)抑制⑶147和FKBP52或者⑶147和親環(huán)蛋白A(CypA)的活性和/或表達(dá)的組合物。在一些實(shí)施方式中，該組合物可以包括兩種或更多種使⑶147和FKBP52表達(dá)沉默的siRNA分子。在其它實(shí)施方式中，該組合物包括抑制CD147活性的抗體或者功能抗體片段，或者，抑制CD147和FKBP52活性的兩種或更多種抗體或其功能片段。在一些實(shí)施方式中，該抗體可以是雙特異性抗體。在其它實(shí)施方式中，該組合物可以包括抑制CD147和 FKBP52活性或者表達(dá)的兩種或更多種小分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開涉及用于在對(duì)象中選擇性抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而不顯著影響先天免疫反應(yīng)的方法，該方法包括在該對(duì)象中抑制CD147和FKBP52蛋白質(zhì)的活性和/或表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，可以通過給予SiRNA分子以沉默⑶147和FKBP52表達(dá)，或者給予兩種或更多種阻滯CD147和FKBP52活性的抗體或者功能抗體片段或者小分子，來(lái)抑制 ⑶147和FKBP52的活性和/或表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，該抗體可以是雙特異性抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本公開涉及用于治療慢性炎癥疾病的方法，該方法包括向?qū)ο蠼o藥以治療有效量的藥物組合物，其可在所述對(duì)象中抑制FKBP52和/或CD147的活性和/或表達(dá)，該藥物組合物包括⑶147抑制劑和/或FKBP52抑制劑，和藥學(xué)上可接受的載體。該慢性炎癥疾病可以是自身免疫病，更特別地，該疾病可以是銀屑癬。在一些實(shí)施方式中，該⑶147和FKBP52抑制劑包括兩種或更多種siRNA分子，以抑制⑶147和FKBP52的表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，該⑶147和FKBP52抑制劑可以包括兩種或更多種抗體或者功能抗體片段，其可阻滯CD147和FKBP52活性。在其它實(shí)施方式中， ⑶147和FKBP52抑制劑可以包括雙特異性抗體，其可阻滯FKBP52和⑶147的活性。在另外的實(shí)施方式中，該CD147和FKBP52抑制劑包括兩種或更多種小分子，其可阻滯CD147和 FKBP的活性或者表達(dá)。


圖1是免疫突觸的示意圖，顯示了已知的共刺激分子和目前可獲得的相關(guān)的治療劑。圖2為顯示了當(dāng)活化T細(xì)胞以培養(yǎng)Μφ時(shí)，和單獨(dú)的T細(xì)胞對(duì)照培養(yǎng)相比，產(chǎn)生近兩倍多的TNF α的圖。圖3是這樣的圖，顯示了 TNF α和IL-I β在ΡΗΑ/ΡΜΑ刺激的Molt4和Jurkat細(xì)胞中幾乎不被誘導(dǎo)，而在其余初級(jí)人類T細(xì)胞，未刺激的Hut-78、H9、Molt4或者Jurkat細(xì)胞中完全不被誘導(dǎo)。TNFa和IL-β在Hut-78和H9細(xì)胞中被誘導(dǎo)。圖4是FKBP52(圖4A)、全長(zhǎng)細(xì)胞EMMPRIN(圖4B)、可溶性EMMPRIN配位體(圖 4C)和可溶性EMMPRIN受體(圖4D)的示意圖。顯示了潛在抑制劑和結(jié)合位點(diǎn)。圖5是雙特異性抗體(bsAb)如何可能作用，以識(shí)別(圖5A)或者阻滯(圖5B)人類⑶4+T細(xì)胞表面上的FKBP52和⑶147的相互作用的示意圖。圖6是如何制備一組對(duì)FKBP52和⑶147的哺乳動(dòng)物細(xì)胞衍生的雙特異性高親合力抗體的示意圖。圖7是⑶147的Ig域和能夠與其連接的抑免蛋白/親環(huán)蛋白的示意圖。圖8顯示了重組體⑶147具有活性，并可以在溶液中進(jìn)行研究。A)⑶14722_269刺激 TNFa和IL-Ιβ在THP-I巨噬細(xì)胞中的分泌。用PMA初級(jí)誘導(dǎo)THP-I細(xì)胞M小時(shí)，產(chǎn)生粘連巨噬細(xì)胞，其進(jìn)一步用緩沖液，LPS，或者lOOug/ml重組蛋白質(zhì)刺激。ELISA檢測(cè)試劑盒定量細(xì)胞因子。B)顯示兩個(gè)構(gòu)建物的15N-HSQC譜，其還包括兩個(gè)提議的親環(huán)蛋白靶標(biāo)位點(diǎn)， Pro180 和 Pro211。
圖9顯示了 NMR溶液研究結(jié)果，其表明⑶147Ig樣域不自身連接或者彼此相互作用。用NMR溶液研究表征該兩種主要CD147同種型，(a)同種型2 (CD14722_2°5)和(b)同種型3(CD14794_2°5)的胞外區(qū)。用X射線晶體結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取碼3B5H)與相應(yīng)的 15N-HSQC譜和NMR松弛數(shù)據(jù)顯示研究的特定區(qū)域。特別地，獲取兩種⑶147構(gòu)建物的酰胺 Rl (點(diǎn))和R2(黑條)松馳速率，并用于計(jì)算相關(guān)倍率。得出的相關(guān)倍率被顯示于鄰近每一個(gè)Ig樣域，Igl和Ig2處。二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向被顯示于每一圖的頂端，其由我們的化學(xué)位移任務(wù)組用程序TALOS計(jì)算。03)所有的數(shù)據(jù)在25°C和900MHz收集。圖10顯示CypA和CypB通過它們的活性部位靶向CD147。自由0. 5mM15N-標(biāo)記的 A) CypA 和 B) CypB 的 15N-TR0SY-HSQC 光譜。自由酶(黑)與 0. 5mMCD1479[214。由此，這兩種酶均特異性識(shí)別⑶147。在25°C和900MHz下進(jìn)行滴定(左圖)，只有分別顯示15N或者 IH位移> 0. 1，0. 02ppm的殘余物在黑暗中被顯示映射在該結(jié)構(gòu)上(右面板)。圖11顯示了對(duì)酶活性CypA/⑶147復(fù)合物的監(jiān)測(cè)。A)在沒有受緩慢異構(gòu)化支配的親環(huán)蛋白配位體的情況下，CD147殘基以兩種構(gòu)象存在。B)添加亞化學(xué)計(jì)量濃度的CypA導(dǎo)致新的峰值，稱為“交換峰值”(黑箭頭)，其指示CypA增強(qiáng)了催化速率。C)順式共振強(qiáng)度的減弱(線變寬)比反式共振更快。D)定量上，該更快的順式共振強(qiáng)度的減少提示CypA對(duì)于此構(gòu)象的CD147的親合力高于反式。E)改變?cè)擁樖椒词狡胶獾腃ypA靶向 ⑶147Pro211的卡通描繪導(dǎo)致胞內(nèi)發(fā)信號(hào)。圖12顯示了 CypA/⑶147結(jié)合的表征和在溶液中⑶147的CypA-介導(dǎo)的催化作用。 A)已將包括⑶147 P211的親環(huán)蛋白-靶標(biāo)位點(diǎn)的稱為⑶1471(lmCT的短肽用于估算此復(fù)合物的親合力。CypA殘基展現(xiàn)的化學(xué)位移變化為KD 5mM。顯示了 W121HE和AlOlra的結(jié)合等勢(shì)線。B)用[CypA] = 0. 05mM, [CD14794-214] = 0. 5mM的自動(dòng)和交換峰值的ZZ-交換的 Wl 2 Ine。圖13的圖表顯示，和取自健康供體的血液相比，在取自銀屑癬患者的血液的T細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子TNFa被增量調(diào)節(jié)。圖14是H9T細(xì)胞的2D凝膠電泳。用PMA/洛諾霉素刺激H9細(xì)胞，并通過2D凝膠電泳分離。用串聯(lián)質(zhì)譜法和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定為FKBP52的點(diǎn)13比未刺激細(xì)胞中的對(duì)應(yīng)點(diǎn)表達(dá)至少增加3倍。圖15是串聯(lián)質(zhì)譜圖，其顯示來(lái)自圖14的2D凝膠電泳結(jié)果的對(duì)于點(diǎn)13(FKBP52) 的相對(duì)吸收。圖16是蛋白質(zhì)印跡，其顯示FKBP52在⑶3+細(xì)胞中的增量調(diào)節(jié)。泳道1、2 :H9細(xì)胞， 未刺激(U)和用PMA/洛諾霉素刺激(S)。泳道3、4 :CD3+T細(xì)胞，U禾口 S。泳道5、6 Jurkat 細(xì)胞，U和S。泳道7:+對(duì)照。圖17是蛋白質(zhì)印跡，其通過⑶3+細(xì)胞中的SiRNA證明FKBP52的有效擊倒。泳道 1、2 未刺激(U)和洛諾霉素刺激(S)的H9細(xì)胞。泳道3、4 :FKBP52siRNA轉(zhuǎn)染的H9細(xì)胞， U和S。泳道5、6 :CD3+T細(xì)胞，U和S。泳道7、8 =FKBP siRNA轉(zhuǎn)染的CD3+T細(xì)胞，U和S。圖18的圖表顯示FKBP52對(duì)于TNFa水平?jīng)]有明顯的抑制效果，以及以4-1BB為陽(yáng)性對(duì)照的插入圖表。圖19是FACS分析，其顯示⑶147細(xì)胞表面表達(dá)在刺激的T細(xì)胞中被增量調(diào)節(jié)，并通過T細(xì)胞Mcp接觸誘導(dǎo)。
圖20的圖表顯示了圖19的FACS分析結(jié)果。圖21顯示了 15N-標(biāo)記的CD147在0.5mM(較暗的線)的NMR數(shù)據(jù)，其用0. 5mM未標(biāo)記的FKBP52滴定。與受體的膜近側(cè)區(qū)，殘基207-234對(duì)應(yīng)的⑶147的共振顯示NMR化學(xué)位移變化，指示弱的結(jié)合。圖22的圖表顯示⑶147和FKBP52的雙siRNA擊倒導(dǎo)致TNF α的產(chǎn)生明顯減少。圖23的圖表顯示⑶147( 〃 TCISM#1)的siRNA擊倒導(dǎo)致的細(xì)胞因子(TNF α )產(chǎn)生的變化不明顯。圖24的圖表顯示在⑶3+細(xì)胞中⑶147(”TCISM#1〃 )的siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-32Y)有中等程度減少(接近45-50%)。圖25的圖表顯示在⑶3+細(xì)胞中FKBP52(〃 TCISM#2)的siRNA擊倒導(dǎo)致的細(xì)胞因子(TNFa)產(chǎn)生的變化不明顯。圖沈的圖表顯示在⑶3+細(xì)胞中FKBP52(〃 TCISM#2)的siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-32Y)有中等程度減少。圖 27 的圖表顯示在 CD3+細(xì)胞中 CD147(" TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(TNFa )有高度明顯(#P < 0. 001)的減少。圖沘的圖表顯示在 CD3+細(xì)胞中 CD147(" TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-32Y)有高度明顯(#P < 0. 001)的減少。圖四的圖表顯示在 Th22 細(xì)胞中 CD147(〃 TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(TNFa)有高度明顯(#P < 0. 001，顯著性在*，**，和之間匹配)的減少。圖 30 的圖表顯示在 Th22 細(xì)胞中 CD147(〃 TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 siRNA擊倒導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-32y)有高度明顯(**P < 0. 001，顯著性在*，**，和_ 之間匹配)的減少。圖 31 的圖表顯示在 Th22 細(xì)胞中 CD147(" TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 mAb阻滯導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(TNFa)有高度明顯(#P < 0. 001，顯著性在*，#，和之間匹配)的減少。圖 32 的圖表顯示在 Th22 細(xì)胞中 CD147(" TCISM#1")禾口 FKBP52(〃 TCISM#2)的 mAb阻滯導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-32Y)有高度明顯(**0. 001，顯著性在*，**，和***之間匹配)的減少。圖33顯示了牛皮癬皮損中的人類IL-32Y的免疫組織化學(xué)表達(dá)。用鼠抗人類 IL-32yMab染色人類牛皮癬活體解剖(N = 15) (A至C)和正常皮膚(N = 13) (F)。在牛皮癬皮膚中，在基礎(chǔ)層角質(zhì)細(xì)胞中存在大量細(xì)胞質(zhì)小粒染色，伴以強(qiáng)烈的核染色樹突狀細(xì)胞的隨遇亞群。對(duì)照抗體沒有顯示陽(yáng)性染色(D)。IL-32 γ竟?fàn)幮赞卓箘╇淖铚?IL-32 YMab 的染色，其證明了 IL-32 γ蛋白質(zhì)在該牛皮癬皮膚活體解剖中表達(dá)的特異性(E)。在正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞中核以及細(xì)胞質(zhì)IL-32Y染色明顯弱(F)。顯示的代表性數(shù)據(jù)來(lái)自總共三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)(以一式三份染色)，其中評(píng)定員不知曉每一個(gè)所觀看片的身份。圖34顯示IL-32及其它促炎細(xì)胞因子被表達(dá)于牛皮癬皮損活體解剖樣品中。用定量的“實(shí)時(shí)”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析在牛皮癬皮損的福爾馬林-固定的及石蠟包埋的(FFPE)活體解剖樣品中(N = 6)進(jìn)行促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)分析。健康的人類供體皮膚活體解剖樣品(N = 6)被用作陰性對(duì)照。用人類單核細(xì)胞-衍生的Mcp培養(yǎng)物作為陽(yáng)性對(duì)照組織(數(shù)據(jù)未示出)。測(cè)量用共有序列PCR探針評(píng)估的靶標(biāo)細(xì)胞因子的量，一式三份。qRT-PCR結(jié)果顯示IL-32 y、IL_1 β、TNF α和IL_8表達(dá)與在健康的對(duì)照皮膚組織中觀察到的類似細(xì)胞因子顯著(*)不同(P <0.01，根據(jù)ANOVAs)。結(jié)果表示單一實(shí)驗(yàn)，其中共進(jìn)行三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。每一個(gè)條表示平均+/-SD。圖35顯示人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞的IL-32 γ蛋白質(zhì)產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光(ECL)分析。人類初級(jí)角質(zhì)細(xì)胞(Hka)細(xì)胞培養(yǎng)液(顯示為黑色)和裂解液(顯示為白色)的ECL 分析表明IL32Y基本以細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞因子存在。ILlii (R&D系統(tǒng))和TNF α (R&D系統(tǒng))在 Hka培養(yǎng)物中有效引致明顯(* ；Ρ<0. 001，根據(jù)AN0VA)量的細(xì)胞質(zhì)IL32 γ蛋白質(zhì)。測(cè)量樣品一式兩份；結(jié)果表示為單一實(shí)驗(yàn)，其中用不同代的初級(jí)皮膚Hka細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行四個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)通過ECL測(cè)量時(shí)(數(shù)據(jù)未示出)，IL32y不引起誘導(dǎo)Hka組織培養(yǎng)液IL32 y， 或者Hka裂解液IL32 γ。每一個(gè)條均表示平均士 SD。圖36顯示促炎細(xì)胞因子在人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中增量調(diào)節(jié)IL-32 γ基因表達(dá)。用ILli3 (lng/ml),TNFa (lOng/ml)，或者這兩種細(xì)胞因子刺激人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hka)。在細(xì)胞因子刺激后，IL32 γ基因表達(dá)顯著(* ；P < 0. 001，根據(jù)AN0VA)增加。 這些反應(yīng)在體外通過 ILlra(Kineret ；AmgenThousand Oaks, CA) (Cohen 等人 2003)或者 P55-PEG(Pegsunercept ；AmgenThousand Oaks, CA) (Edwards, 1999)被逆轉(zhuǎn)。測(cè)量用 IL32 共有序列IL32探針評(píng)估的靶標(biāo)IL32Y的量一式三份。結(jié)果來(lái)自于單一的代表性實(shí)驗(yàn)(平均+/-SD)，其中進(jìn)行三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。圖37顯示重組人類IL32 α (rhuIL32 α )在初級(jí)人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子。優(yōu)化蛋白水平的rhuIL-32a (10pg/ml ；R&D系統(tǒng))在人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hka)中顯著(* ；P < 0. 05，根據(jù)AN0VA)誘導(dǎo)各種促炎細(xì)胞因子。通過ECL測(cè)量Hka細(xì)胞培養(yǎng)液和裂解液(數(shù)據(jù)未示出)中的細(xì)胞因子蛋白質(zhì)。此不含內(nèi)毒素的rhuIL32a的制備物沒有引起Hka細(xì)胞培養(yǎng)液或者裂解液IL32 γ的水平增加。測(cè)量樣品一式三份，所示數(shù)據(jù)來(lái)自單一的代表性實(shí)驗(yàn)，其中用不同的人類供體Hka培養(yǎng)基進(jìn)行四個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。每一個(gè)條表示平均+/-SD。圖38顯示重組人類IL32 γ改變?nèi)祟惓跫?jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞的表型外觀。用最佳活化水平的重組人類細(xì)胞因子處理人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hka)，其包括IL32 γ，并用蘇木精染色，以及12J4和48小時(shí)后曙紅(Η&Ε)染色。顯示在經(jīng)處理后48小時(shí)的Hka培養(yǎng)物(用 200倍共焦顯微鏡分析)。用標(biāo)記的重組細(xì)胞因子處理的單個(gè)Hka細(xì)胞培養(yǎng)物顯得散開，并包含許多具有暗染色核心的偽足。顯示來(lái)自單一實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)，其中總共進(jìn)行三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)(一式三份染色)。評(píng)定員不知曉所觀看的每一片的身份。圖39顯示重組IL32 α或者IL32 γ抑制人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖。在體外用增加量的rhuIL-32 α或者rhuIL32 γ處理人類初級(jí)皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hka)，并在12J4和48 小時(shí)后通過MTT測(cè)量增殖。該數(shù)據(jù)表現(xiàn)單個(gè)重復(fù)中的六的平均士SD。數(shù)據(jù)來(lái)自代表性的單一實(shí)驗(yàn)，其中用不同的人類供體Hka細(xì)胞進(jìn)行三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。和Hka未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)(*)都顯著不同( <0.001，根據(jù)六吣￥八)。圖40顯示了間接和直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸生物分析方法。在間接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸體外分析中(顯示于A中)，在被置于初級(jí)人類皮膚角質(zhì)細(xì)胞(Hka)上之前，非活化的或者活化的活人類⑶3+、H9或者Th22T-細(xì)胞被置于無(wú)菌的塑料轉(zhuǎn)移孔插件(trans well inserts)中。通過qRT-PCR測(cè)量促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)，并用ECL測(cè)量蛋白質(zhì)的生成，隨后在12 J4和48小時(shí)添加于轉(zhuǎn)移孔后，在收集的轉(zhuǎn)移孔T-細(xì)胞或者Hka細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)液Oml)和裂解液中測(cè)量。在該直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸分析(顯示于B中)，非活化的或者活化的活人類⑶3、H9或者Th22T細(xì)胞被直接置于活Hka細(xì)胞上。12J4或者48小時(shí)候，收集非粘連T-細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液(aiil)，離心，由此分離T-細(xì)胞，并且在-80°C冷凍或制備T細(xì)胞總RNA，用于qRT-PCR基因表達(dá)分析。用溫組織培養(yǎng)介質(zhì)小心洗滌粘連Hka細(xì)胞3次，用橡皮刮棒刮，收集，離心，以及等量分開，然后在-80°C冷凍或者制備Hka總RNA， 用于qRT-PCR基因表達(dá)分析?？梢杂肊CL測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)液和Hka細(xì)胞裂解液(用氚X 100 獲得)的促炎細(xì)胞因子水平。氚X 100的添加不干擾ECL分析。圖41是柱狀圖，其顯示了用H9T細(xì)胞直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸后Hka衍生的TNF α的產(chǎn)生。用非活化的或者PMA/洛諾霉素活化的人類Η9Τ細(xì)胞進(jìn)行直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸+48 小時(shí)后，以劑量相關(guān)方式測(cè)定來(lái)自Hka上清液的TNF α (由ELISA測(cè)量)。(A).Hka(總共僅 2. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞)；(B) · Hka (總共2. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞)與非活化的H9T細(xì)胞(總共5 X 105H9) 直接接觸；(C). Hka (總共2. 5 X IO5Hka)與活化的H9T細(xì)胞(總共10 X 105H9)直接接觸。測(cè)量進(jìn)行一式三份。每一個(gè)條表示平均士SD (N = 3次重復(fù))，其中僅相對(duì)于Hka*P < 0. 05， 并且其中僅相對(duì)于Hka紳P <0.001。所示代表性數(shù)據(jù)來(lái)自單一實(shí)驗(yàn)，其中共進(jìn)行四個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)，它們具有類似的結(jié)果。圖42是柱狀圖，其顯示了用H9T細(xì)胞直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸后Hka裂解液衍生的 IL32Y的產(chǎn)生。用非活化的或者PMA/洛諾霉素活化的人類H9T細(xì)胞進(jìn)行直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸+48小時(shí)后，以劑量相關(guān)方式測(cè)定來(lái)自Hka裂解液的IL-32 γ (由ECL測(cè)量)。(A)). Hka (總共僅2. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞)；⑶· Hka (總共2. 5 X IO5個(gè)細(xì)胞)與非活化的Η9Τ細(xì)胞(總共5 X 105Η9)直接接觸；(C) · Hka (總共2. 5 X IO5Hka)與活化的Η9Τ細(xì)胞(總共10 X 105Η9) 直接接觸。測(cè)量進(jìn)行一式三份。每一個(gè)條表示平均士SD(N = 3次重復(fù))，其中僅相對(duì)于 Hka^P < 0. 05，并且其中僅相對(duì)于Hka紳P < 0. 001。所示代表性數(shù)據(jù)來(lái)自單一實(shí)驗(yàn)，其中共進(jìn)行四個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)，它們具有類似的結(jié)果。圖43顯示了用活化的人類記憶效應(yīng)T細(xì)胞群體直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸后Hka裂解液-衍生的IL-32 Y , TNF α和ILl β的產(chǎn)生。Α)從健康的人類供體 leukopacs (Belle-Bonfils血液中心，UCD醫(yī)院，丹佛，科羅拉多州)獲得的PMA/洛諾霉素-活化的⑶3+Τ細(xì)胞被進(jìn)一步用記憶⑶4+、⑶45RA+和⑶45R0+T細(xì)胞分離試劑盒 (Miltenyi Biotec)純化。用 CD45R0-FITC、CD45RA-FITC、CD4-APC 和 CCR4_PE(全部從 Beckman Coulter獲得)在室溫下染色細(xì)胞20分鐘。然后在PBS中洗滌細(xì)胞，然后在2% 多聚甲醛中固定。在FC 500(BeckmanCoulter，Hialeah，佛羅里達(dá)州)上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品收集5000個(gè)事件。顯示的代表性的數(shù)據(jù)來(lái)自單一實(shí)驗(yàn)，其中用四個(gè)分離的 leukopacs共進(jìn)行總共四個(gè)分離實(shí)驗(yàn)。將1 %多聚甲醛固定的T細(xì)胞添加至Hka細(xì)胞誘導(dǎo)的Hka裂解液衍生的IL-32YmRNA和蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未示出)。B).直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸 +48小時(shí)后，將PMA/洛諾霉素-活化的人類Th22記憶效應(yīng)T細(xì)胞群體(⑶4+⑶45R0+CCR4+、 qD4+CD45R0+CCR4\CD4+CD45RA+CCR4+、CD4+CD45RA+CCR4-[總共 IOX IO5T 細(xì)胞，如以上所述純化)和Hka接觸。測(cè)量Hka裂解液的IL32 y (通過ECL)、TNF α、或者ILl β (通過ELISA ；R&D Systems) 0對(duì)每一細(xì)胞群體共進(jìn)行6次單獨(dú)測(cè)量。每一個(gè)條表示平均士SEM，其中(*) P <0.05 (ANOVA)，并且其中紳P < 0. 001 (ANOVA)。用分離的健康人類供體完成了總共三個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果類似。圖44的示意圖顯示了角質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的炎癥過程。圖45顯示純化的⑶147構(gòu)建物在沒有TM域的情況下在溶液中以單一的單體種類存在。(a)此研究中分析的這些構(gòu)建物的子集的尺寸-排阻色譜，以及在將100 μ 1的Img/ ml每一個(gè)樣品裝載至分析Superose-12柱(柱體積2細(xì)1)時(shí)它們的滯留體積。只有包含全部TM域的構(gòu)建物，如全長(zhǎng)蛋白質(zhì)CD14 722—269，可以誘導(dǎo)大低聚物的形成，如它們?cè)诳障度莘e ( 8ml)的的洗脫物所示。⑶14794_2°5和⑶14722,3洗出物的估算分子量接近單體的預(yù)計(jì)分子量，而⑶14 722—269 Δ 和⑶14722_2°5洗出物的估算分子量較高，這是由于它們的彈性區(qū)域和兩個(gè)Ig樣域之間的連結(jié)區(qū)域的彈性特性。(b)缺少和存在DTT時(shí)，含有兩個(gè)域(CD14722_2°5)， Igl (⑶14722,3)，和Ig2(⑶14794_2°5)的⑶147構(gòu)建物的變性凝膠。在每一個(gè)域內(nèi)的單一二硫鍵的減少導(dǎo)致較慢的遷移性能。(c)同樣構(gòu)建物的天然凝膠證實(shí)所有的構(gòu)建物以單一種類運(yùn)動(dòng)，并且Igl和Ig2不相互作用(右邊泳道)。圖46顯示CypA通過其活性位點(diǎn)特異性結(jié)合CD147。(a) 0.5 mM自由 15NCypA (黑)15N-TR0SY-HSQC譜和在ImM CD14722-214 (紅)存在下顯示只有CypA活性位點(diǎn)殘基(如Ser99和W!e60)的化學(xué)環(huán)境被該相互作用干擾。(b)在這些相同的譜內(nèi)，位于靠近該活性位點(diǎn)的短3，10- α -螺旋的15N-CypATrpl21Nal在CD14722_214存在下也展現(xiàn)化學(xué)位移波動(dòng)。(c)顯示了添加CD14722_2W后展現(xiàn)化學(xué)位移干擾的CypA殘基的兩個(gè)視圖，以及包含該靶向1的該Ig樣域的卡通延伸。如果它們各自的化學(xué)位移差大于0. 06ppm,則在我們先前的測(cè)定的CypA (蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)碼13(T)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)上將殘基染色(紅色)。在25 °C和900MHz進(jìn)行滴定。圖47顯示了 CypA和⑶147之間的結(jié)合相互作用的定量。(a)顯示了在添加對(duì)應(yīng) CD147殘基205-214的肽，CD1471(I·之后，15NCypA活化-位點(diǎn)酰胺和活化_位點(diǎn)Trpl21的單一的吲哚的結(jié)合等溫線。由此這些擬合中求出的Kd為4.2士0.2mM。(b)⑶14 722—214 (lmM， 紅色)和⑶1471(1胃#肽(8mM，黑色)滴定后比較15N_CypA的化學(xué)位移變化。(c)⑶1471(1· 肽的CypA化學(xué)位移變化被歸入活性位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兙哂休^大的CD147結(jié)構(gòu)。計(jì)算所有的化學(xué)位移變化，如圖46所示。在25°C和900MHz收集實(shí)驗(yàn)。圖48 顯示 CD147 是 CypA 的底物。(a)0. 5mM 游離 15N-CD14794—214(黑色)的 15N-TR0SY-HSQC譜和在100 μ M CypA (藍(lán)色)和ImM CypA (紅色)存在下顯示在酶滴定后， ⑶147 Gly214酰胺順式和反式共振會(huì)聚。因而，相對(duì)于⑶147 Gly214順式和反式構(gòu)象之間的CypA-結(jié)合的化學(xué)位移差異，CypA誘導(dǎo)的構(gòu)象交換速率是快速的。(b)數(shù)個(gè)CypA靶向的CD147殘基，諸如CD147Leu213，在亞化學(xué)計(jì)量濃度酶的存在下顯示強(qiáng)的譜線增寬而在化學(xué)計(jì)量濃度酶的存在下消失。因而，相對(duì)于CypA-結(jié)合的化學(xué)位移差異，CypA誘導(dǎo)的構(gòu)象構(gòu)象交換是在中間時(shí)標(biāo)上。(c)使用0.5mM 15N-⑶14794_214，在催化濃度CypA的存在下， 發(fā)現(xiàn)殘基207-214具有ZZ-交換交叉峰。此處顯示的是⑶147Phe212酰胺的相應(yīng)光譜，其中CypA為0. 05mM,混合時(shí)間為Oms (深藍(lán))和300ms (紅色)。(d)利用150-ms的混合時(shí)間的 0. 5mM15N-CD14794_214 和 0. OlmM CypA 的 3D-N0ESY-HSQC 也鑒定了 CD147 殘基 207-214 的交換峰，如Wie212所顯示的。在不存在CypA時(shí)，ZZ-交換或在3D-N0ESY-HSQC實(shí)驗(yàn)內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)這樣的交叉峰，指示在CD147順式和反式構(gòu)象之間慢得多的未催化的交換(數(shù)據(jù)未示出)。所有實(shí)驗(yàn)在25°C下進(jìn)行。在900MHz處獲得滴定，并且在720MHz處進(jìn)行ZZ-交換和 3DN0ESY-實(shí)驗(yàn)。圖49定量了 CypA-介導(dǎo)的CD147異構(gòu)化的交換的催化速率。表1中的表觀催化交換速率源自使用[CD1479棚]=0. 5mM 禾口 (a) [CypA] = 0. OlmM 或(b) [CypA] = 0. 05mM 的 ZZ-交換實(shí)驗(yàn)。顯示了 ZZ-交換數(shù)據(jù)連同相應(yīng)的適合值(fits)和來(lái)自每個(gè)⑶147Trp210NEl 實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)樣品譜。四次共振的每一次的強(qiáng)度同時(shí)與Eqs. (la), (lb), (Ic)和(Id) —致。 強(qiáng)度被標(biāo)準(zhǔn)化為最高強(qiáng)度的強(qiáng)度，即，在沒有混合時(shí)間時(shí)的反式共振的強(qiáng)度。圖50是CD147活性的不依賴于親環(huán)蛋白的和親環(huán)蛋白依賴的機(jī)制的示意圖。(a) 基于申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)顯示⑶147的胞外區(qū)沒有自締合，⑶147嗜同性相互作用可能由潛在地包括TM蛋白(即，共同受體)在內(nèi)的其它分子介導(dǎo)。(b)CypA介導(dǎo)的異構(gòu)化的直接觀測(cè)結(jié)果暗示這樣的機(jī)理，由此CypA可以改變⑶147Pro211固有順式反式平衡。 ⑶147Pro211的固有順式反式比從15NHSQC譜內(nèi)殘基207-214的酰胺的相對(duì)峰強(qiáng)度計(jì)算， 并且活性復(fù)合物中的順式反式比基于使用模型肽底物的先前研究(55)。圖51圖解說(shuō)明胞外EMMPRIN是MMP/細(xì)胞因子分泌的有效刺激物。A)重組EMMPRIN 胞外域靶向?qū)⒃诖髓b定的未知細(xì)胞蛋白質(zhì)。B)基于ELISA的分析測(cè)量TNF-α和IL-I β從 THP-I細(xì)胞以劑量依賴的方式的分泌。OMMP/細(xì)胞因子陣列數(shù)據(jù)提供了鑒定/比較U937 細(xì)胞由于5 μ g重組EMMPRIN而分泌的廣泛手段。圖52是顯示在由牛皮癬Th22 (Psoriatic Th22)誘導(dǎo)的初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞，由抗EMMPRIN單克隆抗體、抗FKBP52單克隆抗體或阻斷FKBP52和EMMPRIN的雙單克隆抗體誘導(dǎo)的自體反應(yīng)T細(xì)胞中TNFa產(chǎn)生的顯著逆轉(zhuǎn)。分析下列組，它們對(duì)應(yīng)于其圖上的數(shù)字(1) 10X10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-EMMPRIN mAb 同種型 IgG+ 抗-H(BP52mAb 同種型 IgG+Hka ； (2) 10X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-EMMPRIN mAb+ 抗-H(BP52mAb+Hka ； (3) IOX 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-FKBP52mAb 同種型 IgG對(duì)照+Hka ； (4) IOX 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-H(BP52mAb+Hka ； (5) IOX 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-EMMPRIN mAb 同種型 IgG 對(duì)照 +Hka ； (6) 10 X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 + 抗-EMMPRIN mAb+Hka ； (7) 10 X 10+5CD3+T 細(xì)胞 +N. T. siTNF α +Hka ； (8) 10 X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +siTNF α +Hka ； (9) 10 X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +N. T. siIL32 y +Hka ； (10) 10X10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +siIL32 y +Hka ； (Il)IOX 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +Hka ； (12)7. 5X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +Hka ； (13) 5. OX 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +Hka ； (14) 2. 5 X 10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +Hka ； (15) 1. 0X10+5 牛皮癬 Th22T 細(xì)胞 +Hka ； (16) Hka+rhuIL22 (10ng/ml) ； (17)原代人角質(zhì)形成細(xì)胞(Hka) ； (18)THP-I Μφ +LPS(IOOng) ； (19)ΤΗΡ-1 Μφ;以及(20)空白。發(fā)明詳述本文提供了抑制慢性炎癥反應(yīng)的方法以及實(shí)施這種方法的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法涉及選擇性抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而不顯著影響先天免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，抑制慢性炎癥反應(yīng)的方法涉及抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生?？梢杂糜谶x擇性靶向適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一種方法是集中于與巨噬細(xì)胞(Μφ)通訊的活化τ細(xì)胞。當(dāng)活化T細(xì)胞與Μφ相互作用時(shí)，一系列促炎細(xì)胞因子響應(yīng)于細(xì)胞-細(xì)胞接觸在免疫突觸(1 處通過一種或多種共刺激分子而釋放。幾種促炎細(xì)胞因子涉及慢性炎癥，包括但不限于 IL-I α、IL-I β、IL-6, LIF、IFN- γ , OSM、CNTF, TGF-β、GM-CSF、IL-IU IL-12、IL-18、IL-8、IL-32 y和TNF α?？梢詼y(cè)量這些促炎細(xì)胞因子的一種或多種以確定免疫反應(yīng)是否被活化或被抑制。細(xì)胞因子TNF α、IL-I和IL-32 γ的產(chǎn)生在人初級(jí)Mcp和THP-1 Mcp中被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)，所述誘導(dǎo)通過與用ΡΗΑ/ΡΜΑ、ΡΜΑ/洛諾霉素(ionomycin)、α CD3/α⑶沘或IL-12/IL-18 刺激的初級(jí)人CD3+T細(xì)胞、人T細(xì)胞淋巴瘤HUT-78細(xì)胞或人T細(xì)胞Η9細(xì)胞的直接接觸進(jìn)行(參見，例如圖2)。然而，細(xì)胞因子產(chǎn)生在刺激的MolMm、Jurkat和Raji人T-細(xì)胞中幾乎不被誘導(dǎo)并且在靜止的初級(jí)人T細(xì)胞、未刺激的HUT-78、H9、Molt4、Jurkat或Raji細(xì)胞不被誘導(dǎo)(見，例如圖3)。因此，在慢性炎癥疾病如牛皮癬中，這些途徑似乎經(jīng)由直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸通過免疫突觸(1 機(jī)制介導(dǎo)。這些途徑顯示通過活化期間在T細(xì)胞表面上或附近上調(diào)的T細(xì)胞共刺激分子介導(dǎo)。由于這些分子只在或主要僅在T細(xì)胞活化期間上調(diào)，所以這些分子代表了選擇性抑制適應(yīng)性免疫系統(tǒng)同時(shí)允許先天免疫系統(tǒng)保持完整的有希望的靶標(biāo)?；罨腡-細(xì)胞表達(dá)多種膜-結(jié)合的共刺激蛋白，其有助于導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。這些分子被在本文中被稱為T細(xì)胞細(xì)胞因子誘導(dǎo)表面分子(T cell Cytokine Inducing Surface Molecules) (TCISMs)。TCISM 提供了在適應(yīng)性免疫反應(yīng)期間T細(xì)胞活化和ΜΦ-驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞因子上調(diào)之間的連接。根據(jù)公開的實(shí)施方式，選擇性抑制適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組合物可以包括TCISM抑制劑。TCISM的實(shí)例包括但不限于FKBP多基因家族的CD40配體(CD40L)成員(例如，F(xiàn)KBP52)、親環(huán)蛋白(例如，親環(huán)蛋白Α)和CD147(也稱為胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(Extracellular matrix metalloproteinaseinducer)或 EMMPRIN)。TCISM 的另外的實(shí)例可以在 2008 年 6 月 5 日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2008/065992中見到，其以其全部并入，如同在本文中全部描述一樣。⑶147，或〃 EMMPRIN"是EMMPRIN免疫球蛋白受體超家族的部分，是幾乎在所有細(xì)胞類型中表達(dá)的I型跨膜糖蛋白，所述細(xì)胞類型包括其中其生物學(xué)作用包括調(diào)節(jié)多種蛋白家族的成纖維細(xì)胞、血小板和T細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞。(1-；3)。例如，CD147刺激引起胞外基質(zhì)的重建的多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌G)，并且已經(jīng)顯示CD147刺激數(shù)種促炎細(xì)胞因子的分泌0，4)。CD147在炎性病癥如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中過度表達(dá)，其中CD147介導(dǎo)的MMP分泌導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的破壞(12，13)。盡管⑶147由于其刺激MMf3S分泌的能力而被熟知，其作為TCISM的作用以前是未知的(見，下面的實(shí)施例1)。此外，以前認(rèn)為CD147充當(dāng)其自身受體，由此，膜結(jié)合的或可溶的CD147參與與膜結(jié)合的CD147的嗜同性相互作用，以刺激細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(14，15)。然而，已經(jīng)發(fā)生了許多⑶147蛋白相互作用，暗示⑶147介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過其它蛋白質(zhì)配合。這種蛋白質(zhì)相互作用可以包括整聯(lián)蛋白、黏結(jié)蛋白聚糖-1和最近鑒定的CD147的酶配體肽基脯氨酰異構(gòu)酶的親環(huán)蛋白類(16-18)。⑶147的初級(jí)轉(zhuǎn)錄體包括兩個(gè)免疫球蛋白樣(Ig樣)結(jié)構(gòu)域，稱為EMMPRIN Igl-Ig2。如本文所討論的，CD147可以刺激促炎細(xì)胞因子釋放并且可以與抑免蛋白/親環(huán)蛋白超家族成員FKBP52、親環(huán)蛋白AO^ypA)和親環(huán)蛋白B(CypB)結(jié)合(締合，associate) (圖7)。EMMPRIN以幾種不同形式表達(dá)，包括全長(zhǎng)EMMPRIN——其連接于細(xì)胞膜，和兩種可溶形式微泡結(jié)合的可溶性EMMPRIN受體和修飾的可溶性EMMPRIN配體(圖4)。FK506-結(jié)合蛋白 52 (FKBP52)(也叫作 FKBP59、p59 或 Hsp56)，由 FKBP4 基因編碼， 是抑免蛋白的FKBP家族的成員。FKBI^s的特征在于由其催化順式-肽基脯氨酰鍵的順反異構(gòu)化的能力以及其對(duì)免疫抑制藥物Π(-506的強(qiáng)親和力。FKBP52顯示了與作為蛋白質(zhì)NH2 末端部分屬性的蛋白質(zhì)的抑免蛋白特征(character)的模塊組織。親環(huán)蛋白是抑免蛋白超家族的成員，與CD147結(jié)合并且是催化肽基脯氨酰鍵異構(gòu)化和調(diào)節(jié)多種不同蛋白質(zhì)功能的廣泛表達(dá)的酶。例如，類似于甲基化和磷酸化，親環(huán)蛋白介導(dǎo)的異構(gòu)化被認(rèn)為是幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基本調(diào)節(jié)現(xiàn)象(19)。類似于其CD147受體，親環(huán)蛋白在多種癌癥和炎性病癥諸如RA中高度表達(dá)(20-21)。在RA患者的滑液中首次鑒定作為胞外蛋白的典型親環(huán)蛋白家族成員，親環(huán)蛋白A (CypAM22)。隨后的研究顯示CD147作為胞外CypA以及另一親環(huán)蛋白——親環(huán)蛋白B(CypB)的信號(hào)受體轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用(23，對(duì))。胞外親環(huán)蛋白顯示出細(xì)胞因子樣性質(zhì)并且通過其與CD147受體的相互作用介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)事件(18，25)(圖1，機(jī)理2)。例如，CypA顯示依賴于其與⑶147的相互作用的有效趨化活性04)并且CypA/CD147相互作用的抑制大大減少了患有疾病諸如急性肺損傷、哮喘和RA 的小鼠模型中的免疫細(xì)胞到炎癥部位的遷移06- )。許多病毒利用宿主細(xì)胞CypA進(jìn)行感染，包括水泡性口炎病毒、牛痘病毒、人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)和嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)。然而，已經(jīng)顯示這些病毒的亞類(subset)依賴于宿主細(xì)胞病毒相關(guān)CypA，其從錨定在病毒膜內(nèi)的先前宿主細(xì)胞被“劫持(hijacked) ”，已被提議通過靶向新宿主細(xì)胞上的 ⑶147來(lái)增加感染09-32)。具體地，已經(jīng)顯示在細(xì)胞培養(yǎng)中阻斷性CypA/⑶147相互作用抑制感染支持了這種提議(32，33)。因此，理解親環(huán)蛋白/⑶147相互作用的分子機(jī)理可能對(duì)于慢性炎癥疾病(包括癌癥)和病毒感染的治療具有治療價(jià)值。如上所述以及在以下實(shí)施例中進(jìn)一步所述，親環(huán)蛋白不僅僅是配體，其也是在親環(huán)蛋白/CD147信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起催化作用的酶。這些活性酶/受體復(fù)合物可以在催化期間被探測(cè)以直接鑒定親環(huán)蛋白誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化被賦予到對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵的CD147 受體上，與從靜態(tài)結(jié)構(gòu)推斷它們的結(jié)果相反。因而，能夠確定引起其配體獨(dú)立活性的CD147 結(jié)構(gòu)區(qū)并且能夠探測(cè)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的親環(huán)蛋白誘導(dǎo)的構(gòu)象變化。根據(jù)公開的實(shí)施方式，抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)或抑制促炎細(xì)胞因子的方法可以通過施用這樣的組合物來(lái)完成，所述組合物可以包括下述靶標(biāo)的一種或多種抑制劑CD147、 FKBP52或CypA。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可以包括用于獨(dú)立抑制⑶147的一種或多種抑制劑。在另一實(shí)施方式中，組合物可以包括用于同時(shí)雙重抑制⑶147和FKBP52或⑶147和 CypA的兩種或更多種抑制劑。抑制可以通過施用導(dǎo)致抑制靶的活性或表達(dá)降低的任何合適的抑制劑。圖4示出了 CD147或FKBP52的代表性抑制劑的可能靶位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，促炎細(xì)胞因子釋放的抑制可以通過如下完成使細(xì)胞與小的核酸分子接觸的RNA干擾(RNAi)，所述RNA干擾如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、 雙鏈 RNA (dsRNA) ,micro-RNA (miRNA)或短發(fā)夾 RNA (shRNA)分子，或調(diào)節(jié)小干涉 RNA (siRNA) 的表達(dá)以提供降低表達(dá)水平的⑶147、FKBP52和CypA的一種或多種(例如，通過降低mRNA 水平和/或降低多肽水平)。在另一實(shí)施方式中，促炎細(xì)胞因子釋放的抑制可以通過使細(xì)胞與抗體或其功能片段接觸來(lái)完成?？贵w或其功能抗體片段是指特異結(jié)合特定抗原或或與特定抗原進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體和單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)抗體包括遺傳工程或以另外方式修飾的免疫球蛋白形式，如胞內(nèi)抗體(1 )、嵌合抗體、完全人抗體、人源化抗體和異源偶聯(lián)抗體(heteroconjugateantibodies)(例如，雙特異抗體(127)、雙抗體、三抗體和四抗體)。術(shù)語(yǔ)功能抗體片段包括抗體的抗原結(jié)合片段，包括例如Fab'、F(ab' )2、Fab、Fv、 rlgG和scFv片段。術(shù)語(yǔ)scFv指其中傳統(tǒng)兩鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)已經(jīng)結(jié)合形成一條鏈的單鏈Fv抗體。如圖5所示，可以用于本文描述方法的雙特異抗體(bsAb)可以識(shí)別(圖5A)或阻斷(圖5B)人CD4+細(xì)胞表面上的FKBP52和CD147相互作用。圖6示出了這種哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的bsAbs的一個(gè)實(shí)例以及它們可以如何被產(chǎn)生。在另一實(shí)施方式中，促炎細(xì)胞因子釋放的抑制可以通過使細(xì)胞與融合蛋白接觸完成。融合蛋白是由2個(gè)或更多個(gè)相關(guān)或不相關(guān)融合基因或其功能片段編碼的蛋白質(zhì)。其它適合的抑制劑可以包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、肽體(ρ印tibodies)、嵌合蛋白和其它生物制劑。在一些實(shí)施方式中，小分子可以用作抑制劑。小分子的實(shí)例可以在2008年6月5日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2008/065992中見到，其以其全部并入，如同在本文中全部描述一樣。根據(jù)公開的實(shí)施方式，本文提供了治療與慢性炎癥相關(guān)的狀況的方法。與慢性炎癥相關(guān)的狀況包括但不限于自身免疫性疾病、癌癥、某些感染疾病和心血管疾病。具體而言，與慢性炎癥有關(guān)或相關(guān)的狀況和疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化、克羅恩病、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、格雷夫斯氏病、狼瘡、硬皮病、血管炎、斯耶格倫綜合征、多皮肌炎和皮肌炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征、遺傳性蛋白尿綜合征 (hereditaryproteinuria syndrome) ,1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、 自身免疫性甲狀腺炎、肝炎、獲得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同種異體移植物病、哮喘、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、慢性炎性腸疾病、腹部疾病、慢性盆腔炎性疾病、慢性炎性多發(fā)性神經(jīng)病、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、晶狀體后纖維組織形成、眼色素層炎、早產(chǎn)兒黃斑變性視網(wǎng)膜病(retinopathy of premature macular degeneration)、角膜移植片新血管形成、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-I-相關(guān)的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-II-相關(guān)的淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、黑素瘤、動(dòng)脈硬化、主動(dòng)脈瓣狹窄、胰腺炎、變態(tài)反應(yīng)和充血性心力衰竭。在一個(gè)實(shí)施方式中，治療方法涉及由慢性炎癥介導(dǎo)的自身免疫性疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病(CPPs)和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎(PsA)。這些慢性炎癥疾病的特征是成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞(在RA中)以及角質(zhì)形成細(xì)胞(在CPI^s/PsA中) 的高度增殖和活化T細(xì)胞、ΜΦ和其它免疫細(xì)胞到損傷皮膚和/或關(guān)節(jié)的浸潤(rùn)。促炎細(xì)胞因子——包括腫瘤壞死因子-a (TNFa)、白介素-1β (IL-1 β )和白介素-32 γ (IL-32 γ ) 在這些患者中產(chǎn)生并且誘導(dǎo)和維持慢性炎癥。由活化免疫系統(tǒng)細(xì)胞引起的這些因子的上調(diào)包括ΜΦ驅(qū)動(dòng)這些病癥的發(fā)病機(jī)理。已經(jīng)在相關(guān)活化和動(dòng)物模型中顯示，T細(xì)胞在自身免疫性疾病的ΜΦ發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用。除了自身免疫性疾病，慢性炎癥也在多種癌癥和心血管疾病中起作用。治療與慢性炎癥相關(guān)的狀況的方法可以包括施用同時(shí)抑制FKBP52和CD147的活性和/或表達(dá)的藥物組合物。藥物組合物可以包括但不限于FKBP52抑制劑、⑶147抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以按照制備藥用組合物的已知方法配制。而且，如本文使用的，短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”意指任何標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體可以包括稀釋劑、佐劑和媒介物以及植入載體和惰性的無(wú)毒固體或液體填充劑、稀釋劑或不與本發(fā)明的活性成分反應(yīng)的封裝材料。實(shí)例包括但不限于磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、水和乳液，如油/水乳液。載體可以是包含例如乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇和類似物)、其合適的混合物和植物油的溶劑或分散介質(zhì)。描述了包含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并且容易得到的多種來(lái)源的藥學(xué)上可接受載體的制劑。例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences(Martin E W[1995]Easton Pa. ， MackPublishing Company，第 19版)描述了可以與本發(fā)明聯(lián)合使用的制劑。適合用于腸胃外施用的制劑包括，例如，水性無(wú)菌注射液，其可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使得制劑與意圖受體的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單位劑量或多劑量容器例如密封的安瓿和小瓶提供，并且可以被儲(chǔ)存在冷凍干燥(凍干的)條件下， 在使用前，只需要無(wú)菌液體載體例如，注射用水的條件。即用注射溶液和懸浮液可以從無(wú)菌粉末、顆粒、片劑等制備。應(yīng)該理解，除了上面特別提到的成分之外，鑒于討論中的制劑的類型，本發(fā)明的制劑可以包括在本領(lǐng)域中常規(guī)其它的劑。按照良好的臨床實(shí)踐，考慮個(gè)體患者的臨床狀況，施用的部位和方法，施用的程序表，患者年齡、性別、體重，和醫(yī)療從業(yè)者已知的其它因素，施用和給藥上述的藥物組合物。 用于本文目的的治療有效量因而根據(jù)這樣的考慮進(jìn)行確定，如本領(lǐng)域已知的。例如，藥物組合物的有效量是提供治療上有效的促炎細(xì)胞因子減少所必需的量。藥物組合物的量對(duì)于獲得改善必須是有效的，所述改善包括但不限于完全的預(yù)防或提高的生存率或更加快速的痊愈，或改善或消除與被治療的慢性炎癥狀況有關(guān)的癥狀以及被選作本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行適當(dāng)測(cè)量的指示劑。按照本發(fā)明，合適的單一劑量大小是在合適的期間內(nèi)施用一次或多次時(shí)能夠防止或減輕(減少或消除)患者的癥狀的劑量?；诨颊叩臓顩r大小和施用途徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于全身施用的合適單一劑量大小。⑶147和FKBP52協(xié)同抑制促炎細(xì)胞因子釋放的雙重抑制在當(dāng)前的公開中，已顯示來(lái)自細(xì)胞系和健康人類志愿者的活化T細(xì)胞以及得自患有銀屑病患者的T細(xì)胞以細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的方式誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞(ΜΦ)上調(diào)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致慢性炎癥表型。在PMA/洛諾霉素刺激后，F(xiàn)KBP52在活化的T細(xì)胞中上調(diào)。 此外，通過FACS測(cè)量的⑶147/EMMPRIN表達(dá)也在相同的T細(xì)胞群體中增加。使用NMR在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示兩種蛋白質(zhì)之間的生理學(xué)聯(lián)系。使用證實(shí)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸生物測(cè)定， 由此，人CD3+T-細(xì)胞(得自白細(xì)胞庫(kù)(leukopack))和單核細(xì)胞來(lái)源的ΜΦ (得自白細(xì)胞庫(kù))以細(xì)胞-細(xì)胞接觸的方式結(jié)合，在培養(yǎng)的48小時(shí)時(shí)間期間，相對(duì)大量的TNF α ,IL-I β 和IL-32由活化ΜΦ產(chǎn)生。如上面所提到的，F(xiàn)KBP52是具有順/反-脯氨酰異構(gòu)酶活性的抑免蛋白，其作為包含脯氨酸殘基的蛋白質(zhì)的蛋白折疊伴侶起作用。其也結(jié)合用于治療患有自身免疫性疾病的免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus)。通過使用針對(duì)人FKBP52制備的特異性DHARMAC0N siRNA smart pool探針沉默F(xiàn)KBP52沒有導(dǎo)致任何明顯的T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的ΜΦ細(xì)胞因子抑制。 同樣地，當(dāng)針對(duì)人⑶147制備的特異性DHARMACON siRNA smart pool探針被轉(zhuǎn)染到人T細(xì)胞中時(shí)，隨后的T細(xì)胞介導(dǎo)的ΜΦ活化和細(xì)胞因子釋放僅僅稍微減少。然而，在體外在T細(xì)胞活化之前沉默F(xiàn)KBP52和⑶147兩者在48小時(shí)期間內(nèi)導(dǎo)致幾乎90%的T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)ΜΦ細(xì)胞因子釋放的減少。這些數(shù)據(jù)指示，這兩種蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)于免疫突觸形成、促炎細(xì)胞因子釋放以及慢性炎癥和自身免疫性建立期間的T細(xì)胞:ΜΦ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是重要的。此外，使用雙抑制劑如RNAi分子(例如，SiRNA分子)、抗體(例如，單一特異性或雙特異性抗體)、功能抗體片段、肽、融合蛋白、嵌合蛋白、肽體、胞內(nèi)抗體、小分子和/或其它生物制劑抑制這兩種蛋白質(zhì)可以被用于控制適應(yīng)性免疫而不顯著影響先天免疫。在下面的實(shí)施例1中進(jìn)一步描述了上述研究。FKBP52是可能與T細(xì)胞膜蛋白 ⑶147相互作用以隨后通過ΜΦ上的⑶147受體介導(dǎo)ΜΦ活化的T細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白質(zhì)。 FKBP52可以從細(xì)胞質(zhì)易位到T細(xì)胞膜或其附近。使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，包括多反應(yīng)監(jiān)測(cè)、 串聯(lián)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，被用于闡明在T細(xì)胞刺激和隨后的與ΜΦ細(xì)胞-細(xì)胞接觸之后的分泌蛋白譜。此外，從與ΜΦ接觸后活化T細(xì)胞分泌的可溶性蛋白質(zhì)充當(dāng)牛皮癬和其它炎性皮膚病中的高度特異藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)并且是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的靶標(biāo)，同時(shí)使先天免疫反應(yīng)基本上不受影響。親環(huán)蛋白-介導(dǎo)的EMMPRIN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的表征EMMPRIN 二級(jí)結(jié)構(gòu)和與親環(huán)蛋白A的相互作用。⑶147是I型膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其包含兩個(gè)稱為Igl和Ig2的胞外免疫球蛋白樣(Ig)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短的大約30個(gè)殘基的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外親環(huán)蛋白-A(CypA)和親環(huán)蛋白-B(CypB)靶向CD147并且通過未知機(jī)制刺激包括ERK1/2在內(nèi)的幾種胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化。如同⑶147，親環(huán)蛋白配體在癌組織中高度表達(dá)。⑶147上的親環(huán)蛋白靶位點(diǎn)已經(jīng)被鑒定并且已經(jīng)顯示受體被其親環(huán)蛋白酶配體催化(見，實(shí)施例4)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白介導(dǎo)的CD147信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的催化作用。首先， CypA通過目前鑒定的至少兩種蛋白質(zhì)相互作用——白介素-2酪氨酸激酶和Crk，涉及數(shù)個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些蛋白質(zhì)的下游相互作用顯示由CypA誘導(dǎo)的構(gòu)象變化調(diào)控并且因此，相似的機(jī)制可能適用于細(xì)胞外面的親環(huán)蛋白/CD147相互作用。其次，脯氨酰-異構(gòu)化通常涉及許多生物學(xué)過程。例如，在絲狀噬菌體中，外被蛋白的順式至反式脯氨酰-異構(gòu)化充當(dāng)允許病毒進(jìn)入的“定時(shí)器”，而脯氨酰-異構(gòu)化也涉及陰離子通道的打開。第三，失活的親環(huán)蛋白突變體不能激活ERKI/2磷酸化。第四，⑶147上的兩個(gè)親環(huán)蛋白靶殘基，ProlSO 和Pro211，也可以充當(dāng)?shù)孜?，因?yàn)橛H環(huán)蛋白催化肽基脯氨酰異構(gòu)化。胞外親環(huán)蛋白可以到達(dá)⑶147上的兩個(gè)親環(huán)蛋白靶位點(diǎn)，Prol80和ftx)211。胞外 CD147區(qū)的ftx)180位于胞外Ig2結(jié)構(gòu)域內(nèi)，而其突變破壞親環(huán)蛋白相互作用，這被認(rèn)為是由于改變了受體的結(jié)構(gòu)完整性。相反地，Pro211位于胞外Ig2結(jié)構(gòu)域和TM結(jié)構(gòu)域之間的界面處。兩種胞外親環(huán)蛋白，CypA和CypB，容易跨過膜，暗示這種殘基的催化作用能夠誘導(dǎo)導(dǎo)致胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的構(gòu)象變化。有趣的是，也通過Cyp60利用使受體穿梭至細(xì)胞表面， 并且因此，⑶147在胞內(nèi)和胞外與親環(huán)蛋白相互作用。然而，⑶147細(xì)胞表面表達(dá)存在多種機(jī)理，因?yàn)閺V譜的親環(huán)蛋白抑制劑導(dǎo)致細(xì)胞表面CD147的減少而不是完全消除。在親環(huán)蛋白/CD147復(fù)合物形成和催化之后發(fā)生的構(gòu)象變化可以使用本文公開的方法以原子分辨力 (atomic resolution)進(jìn)行鑒定。已知靶向⑶147和/或親環(huán)蛋白對(duì)轉(zhuǎn)移有作用。例如，在黑素瘤和卵巢癌中⑶147 的RNA干擾(RNAi)減少了體外細(xì)胞侵襲以及在小鼠模型中減小了腫瘤大小?？笴D147抗體阻斷胰腺癌細(xì)胞增殖而CypA的RNAi減少了非小細(xì)胞肺癌的腫瘤生長(zhǎng)。考慮到CD147存在于大多數(shù)腫瘤中，在這些腫瘤中，其誘導(dǎo)多種MMI3S和促炎細(xì)胞因子的分泌，阻斷⑶147可能抑制腫瘤發(fā)展。因而，CD147可以用作多種癌癥的治療靶標(biāo)。EMMPRIN刺激細(xì)胞因子釋放并且可以在溶液中進(jìn)行研究。多種⑶147構(gòu)建物已經(jīng)被以毫克量表達(dá)和純化，全長(zhǎng)蛋白質(zhì)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且是可溶的和具有活性。簡(jiǎn)而言之，僅缺少信號(hào)肽的重組⑶14 722—269的活性通過其增加包括TNF α和IL_1 β的細(xì)胞培養(yǎng)物中促炎細(xì)胞因子分泌的能力來(lái)證實(shí)(圖8Α)。盡管全長(zhǎng)⑶147是可溶的，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)大聚集體的形成，如通過凝膠過濾所評(píng)價(jià)的。CD147的這種可溶形式是生物學(xué)相關(guān)的，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞在存在和不存在微泡下以整體分泌⑶147。如同膜結(jié)合的⑶147，已經(jīng)確定可溶的⑶147通過誘導(dǎo)MMPs和促炎細(xì)胞因子分泌而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)(圖8Α)。此外，已經(jīng)確定控制MMP和促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD147殘基。全部胞外區(qū)(CD14722—214)和單獨(dú)的Ig2結(jié)構(gòu)域(CD14794-214)被良好地折疊，如由 NMR溶液譜所示出的(圖8B)。沒有觀察到濃度依賴的化學(xué)位移，其暗示缺少分子間相互作用并且這由下面詳述的動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)一步探測(cè)。這種分子間相互作用的缺少也暗示細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)CD147嗜同性相互作用可以由其它分子調(diào)節(jié)如，例如，鈣黏著蛋白二聚作用，鈣黏著蛋白二聚作用被由肝素介導(dǎo)的鈣或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體相互作用所調(diào)節(jié)。對(duì)于 CD147，這些小分子沒有引起明顯的自締合(數(shù)據(jù)未示出)，但是這些發(fā)現(xiàn)是鑒定控制MMP和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD147表面的重要步驟。因而，本文公開的方法可以用作工具以鑒定造成在腫瘤發(fā)展期間起關(guān)鍵作用的活性的特定殘基。單獨(dú)的CD147胞外區(qū)沒有自締合。NMR溶液研究的益處是大分子的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)可以同時(shí)研究并且可以被用于探測(cè)CD147自締合。已經(jīng)暗示，CD147充當(dāng)類似于其它細(xì)胞黏著受體的其自身受體并且這種相互作用可能具有弱的親和力。NMR弛豫實(shí)驗(yàn)可以用作在多個(gè)時(shí)標(biāo)上這種蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的敏感標(biāo)記并且因此非常適于探測(cè)具有各種親和力的相互作用。具體而言，Rl (縱向)和R2(橫向)弛豫速率提供每種殘基動(dòng)力學(xué)的高分辨力詳細(xì)資料，并且因此，如果CD147的胞外區(qū)以毫摩爾親和力(或更緊)進(jìn)行自締合， 那么這將通過NMR溶液研究觀察到。NMR弛豫測(cè)量指示兩個(gè)⑶147胞外結(jié)構(gòu)域，Igl和Ig2，既沒有彼此相互作用也沒有以任何顯著的量自締合。使用定義每種酰胺的關(guān)聯(lián)時(shí)間的R2/R1比，發(fā)現(xiàn)CD147殘基 22-101和殘基105-205是展示幾乎有3ns不同的關(guān)聯(lián)時(shí)間的獨(dú)立旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)域，這與它們的大小差異相一致(圖9A)。這在平均R2率中是直接顯而易見的，對(duì)于殘基22-101 (Igl)其為大約22Hz，對(duì)于殘基104-205 (Ig2)，其為35Hz。盡管這些動(dòng)力學(xué)研究與在近來(lái)的X-射線晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)獨(dú)立折疊結(jié)構(gòu)域一致，但是事實(shí)是這些結(jié)構(gòu)域的不同關(guān)聯(lián)時(shí)間混亂 (tumble)也提供了溶液內(nèi)沒有保持晶體接觸的直接證據(jù)。與這些動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)相一致，在用 ⑶14722,滴定15N-⑶14794_2°5后，沒有觀察到顯著的化學(xué)位移變化，由此證明這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域沒有作為單獨(dú)的實(shí)體(部分，entities)相互作用(數(shù)據(jù)未示出)。而且，對(duì)于⑶14722_2°5， 沒有觀察到濃度依賴的化學(xué)位移變化——如果恰好存在弱的相互作用(即，Kd > ImM)，預(yù)期這將發(fā)生。最后，每個(gè)結(jié)構(gòu)域R2/R1來(lái)源的關(guān)聯(lián)時(shí)間和觀察到的線寬度與單體蛋白完全一致。因此，如果⑶147的這些結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)自締合，那么這可能在共同受體或小分子的存在下發(fā)生。動(dòng)力學(xué)研究也提供了對(duì)殘基94-101的重要了解，所述殘基包括兩種主要的⑶147同種型，占 98%的CD147的同種型-2(包含Igl和Ig2的殘基1-269)和同種型_3(殘基 94-269，僅包含Ig^。即，在Igl的情況下，僅殘基94-101形成β-鏈，而這些殘基在自然發(fā)生的同種型-3的較短胞外區(qū)內(nèi)是雜亂的(圖9Β)。因此，⑶147的生物物理研究已允許探測(cè)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在癌進(jìn)程中起作用的兩種主要同種型的胞外區(qū)。親環(huán)蛋白通過其活性位點(diǎn)結(jié)合CD147。為了確定親環(huán)蛋白如何與其受體相互作用， 使用NMR溶液研究，已經(jīng)鑒定了親環(huán)蛋白相互作用表面(圖10)。最后，使用標(biāo)準(zhǔn)NMR方法， 已經(jīng)確定了全部的CypB主鏈共振指認(rèn)(backboneresonance assignments)。滴定實(shí)驗(yàn)已顯示，CypA (圖10A)和CypB (圖10B)通過它們的活性位點(diǎn)唯一地靶向⑶147，從而支持在親環(huán)蛋白/⑶147細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的催化作用。而且，在這些滴定期間單個(gè)平均組的親環(huán)蛋白共振的觀察結(jié)果指示親環(huán)蛋白/CD147親和力在高的微摩爾范圍之內(nèi)。許多配體/受體相互作用比此處表征的親環(huán)蛋白/CD147結(jié)合弱得多(例如，醇以毫摩爾親和力結(jié)合其受體)。⑶147存在于緩慢互變的平衡內(nèi)并且被親環(huán)蛋白A催化。⑶147殘基 206-214存在于由控制的順式反式平衡內(nèi)并且這種平衡在CypA催化后改變。盡管幾個(gè)以前的報(bào)道已假定⑶147 ftx)180和都可以被親環(huán)蛋白靶向，但是這些結(jié)合位點(diǎn)僅在小肽的情況下被探測(cè)到并且在折疊蛋白內(nèi)部不被探測(cè)到。本公開提供了顯示親環(huán)蛋白唯一靶向⑶147 Pro211而不是ftx)180，并且CypA只催化這種靶位點(diǎn)肽基-脯氨酰異構(gòu)化的第一個(gè)直接證據(jù)。⑶147殘基206-214位于跨膜結(jié)構(gòu)域的近側(cè)并且顯示兩組共振，所述共振指示該區(qū)正在在兩種構(gòu)象之間以秒時(shí)標(biāo)進(jìn)行互變。顯示了 W210的兩種共振中一種這樣觀察到的組的實(shí)例，其直接先于催化的ftx)211(圖11A)。中心脯氨酸突變?yōu)楸彼?即，P211A)導(dǎo)致只有一組共振，即，反式共振，證實(shí)的順式反式平衡是這種觀察到的構(gòu)象異質(zhì)性(heterogeneity)的根本原因。脯氨酸殘基是可以采用順式和反式構(gòu)象的唯一氨基酸， 而這種現(xiàn)象只在兩種構(gòu)象之間緩慢互變的蛋白質(zhì)的亞組(subset)中觀察到。因此，⑶147 是獨(dú)特的受體，獨(dú)特性在于其顯示了臨近跨膜區(qū)的兩種主要構(gòu)象。而且，相對(duì)的共振強(qiáng)度指示所取樣的相對(duì)密度(relative population)并且因此，基于這種強(qiáng)度，在沒有其親環(huán)蛋白酶配體的情況下，CD147殘基206-214顯示33% 67% (順式 33%、反式67%，Ke(1,ftee = 33/67 = 0. 5)的順式反式比。CypA增強(qiáng)的順反互變，如通過只在酶的存在下觀察到的“互換峰”的出現(xiàn)所證明的(圖11B，黑色箭頭)。只有在NMR實(shí)驗(yàn)的時(shí)標(biāo)內(nèi)具有足夠的時(shí)間來(lái)取樣順式和反式構(gòu)象異構(gòu)體時(shí)，這些互換峰才會(huì)出現(xiàn)。換言之，在沒有酶存在下時(shí)這種順/反互變非常緩慢而不能觀察到互換峰，但是CypA介導(dǎo)的催化增加其互變，首次直接證明親環(huán)蛋白催化其 CD147受體。因此，CD147再一次顯示獨(dú)特性質(zhì)，所述獨(dú)特性質(zhì)在于其配體也是催化它們的靶位點(diǎn)的脯氨酸異構(gòu)化的酶。這些結(jié)果暗示⑶147順反比被其親環(huán)蛋白配體改變，并且這可以連接胞外親環(huán)蛋白和⑶147胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于此的證據(jù)在加入CypA后⑶147的順式共振強(qiáng)度相對(duì)于反式共振強(qiáng)度損失增加中見到(圖IlC和D)。這稱為“線增寬”，其由于結(jié)合和催化引起。實(shí)際上，⑶147類似于“容量控制(volumecontrol)”，其調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本模型中，⑶147 總是通過增加順式構(gòu)象，即，“構(gòu)象轉(zhuǎn)變”，打開(即，低水平信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))親環(huán)蛋白“開大容量” (turnup the volume)(增加信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))。
表征CypA/⑶147結(jié)合和催化。本公開超出了結(jié)構(gòu)研究以表征CypA/⑶147復(fù)合物內(nèi)的結(jié)合和催化。已經(jīng)顯示親環(huán)蛋白在其對(duì)于模型底物的催化活性方面存在不同，并且如果生物物理表征顯示對(duì)其CD147受體底物催化的不同，那么預(yù)期在細(xì)胞培養(yǎng)中的比較研究反映這種不同。換言之，如果不同的親環(huán)蛋白顯示它們的CD147P211靶位點(diǎn)的不同平衡常數(shù)，那么，在其胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化中將存在不同。當(dāng)然，這也依賴于它們的相對(duì)親和力。為了定量CypA與⑶147 P211的結(jié)合，產(chǎn)生了模擬這種靶位點(diǎn)的肽。產(chǎn)生這種 CD147肽的原因是在CD147構(gòu)建物的情況下不可能測(cè)定CypA對(duì)該位點(diǎn)的親和力，這是由于毫摩爾親和力需要這種高濃度的受體。這證明了表征親環(huán)蛋白相互作用的一般性問題，由于瞬時(shí)特征和對(duì)于其底物的低親和力通常使得更加難以鑒定多個(gè)親環(huán)蛋白靶標(biāo)。這在其中多種病毒依賴于感染的宿主細(xì)胞親環(huán)蛋白的病毒世界中得到說(shuō)明，而鑒定靶向宿主細(xì)胞親環(huán)蛋白的特定病毒蛋白已經(jīng)證明是迷惑人的(即，對(duì)于毫摩爾親和力“蛋白質(zhì)相互作用”實(shí)驗(yàn)(“pull-down” experiment)是困難的)。這種肽在CypA的活性位點(diǎn)內(nèi)結(jié)合，正如其在較大的⑶147構(gòu)建物的情況下以結(jié)合Kd 5mM所進(jìn)行的(圖12A)。因而，CypA微弱但特異地結(jié)合(engage) CD147。親環(huán)蛋白介導(dǎo)的⑶147的催化通過使用稱為“ZZ-交換”的記述進(jìn)行定量(圖 12B)。簡(jiǎn)言之，以催化量的CypA觀察到的CD147的交換峰可以被用于定量催化，因?yàn)檫@分別提供了清楚的順式-反式和反式-順式互變速率常數(shù)，k。t*kt。。不同的混合時(shí)間(即， 32個(gè)馳豫期)被排列并且包括順式、反式、順式一反式以及反式一順式峰在內(nèi)的所有峰強(qiáng)度的調(diào)節(jié)同時(shí)適合于推導(dǎo)出表觀催化速率。盡管可以使用上述CD147肽，但是更精確代表受體的CD147構(gòu)建物，CD14794_214被用于本文描述的實(shí)驗(yàn)。ZZ-交換不需要上面所需要的較高濃度來(lái)獲得完全的結(jié)合等溫線(isotherm)，并且僅存在幾次與觀察到的由CypA介導(dǎo)的催化產(chǎn)生的交換峰交迭的共振。使用1 10的CypA CD147比，兩種催化速率被確定為 kct = 40s—1和kt。= 20s—1，注意到NMR提供了具有高精度的這兩種速率，而經(jīng)典UV-分析不能提供。這些測(cè)量結(jié)果的小于k—1的不確定性通過獨(dú)立地?cái)M合四個(gè)峰中的每一個(gè)獲得并且圖解說(shuō)明了該數(shù)據(jù)的高質(zhì)量。盡管具有依賴于相對(duì)酶濃度的表觀催化速率，但是ZZ-交換測(cè)量結(jié)果在多個(gè)CypA ⑶147處收集以推斷在飽和濃度下的真正催化速率常數(shù)。這種數(shù)據(jù)已經(jīng)提供CypA對(duì)⑶147的催化功效的有價(jià)值地研究，如下所述。從ZZ-交換數(shù)據(jù)，可以看出CypA介導(dǎo)的CD147的催化對(duì)于模型肽底物是非常有效的。當(dāng)描述可逆的過程如親環(huán)蛋白介導(dǎo)的異構(gòu)化時(shí)，總的互變速率是比較催化功效的有用參數(shù)并且被定義為kex( = kct+ktc)。使用從肽結(jié)合(圖12A)確定的計(jì)算的Kd 5mM和在上面用于ZZ-交換的亞化學(xué)計(jì)量的CypA濃度下的kex 60s—1 (圖12B)，可以粗略地外推出化學(xué)計(jì)量條件下的kex。在這些條件下只有的⑶14794_214與CypA結(jié)合，并且因此對(duì)于1 1 復(fù)合物來(lái)說(shuō)，kex為 6000^( = 100*60^)。這種異構(gòu)化速率稍微高于以前測(cè)量的模型肽底物的速率并且對(duì)應(yīng)于大約四個(gè)數(shù)量級(jí)的未催化交換速率的CypA介導(dǎo)的速率增加。利用多個(gè)CypA ⑶14794_214比和CypB介導(dǎo)的催化的比較分析，更精確地外推出顯示速率增加。 可以看出，⑶147被其主要的親環(huán)蛋白酶配體，CypA，有效地催化?？赡艿氖?，親環(huán)蛋白介導(dǎo)的肽基-脯氨?！皹?gòu)象轉(zhuǎn)換”是普遍的現(xiàn)象。例如。目前研究的唯一其它人親環(huán)蛋白底物是胞內(nèi)白介素-2酪氨酸激酶(Itk)，并且其也顯示類似于 CD147的相似內(nèi)在順式反式平衡。因此，親環(huán)蛋白介導(dǎo)的催化可以通過共同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。而且，親環(huán)蛋白、其胞內(nèi)Itk靶標(biāo)或其胞外CD147靶標(biāo)的下調(diào)都導(dǎo)致癌癥發(fā)展。因此，本發(fā)明的一些方面顯示這種途徑的原子分辨力的詳細(xì)資料以弄清這些蛋白如何相互作用以及提供用于合理治療干預(yù)的基礎(chǔ)。CD147和FKBP52的雙重抑制抑制了促炎細(xì)胞因子從角質(zhì)形成細(xì)胞釋放牛皮癬是增生性角質(zhì)形成細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和Μφ之間的復(fù)雜相互作用的結(jié)果(圖44)。IL-32(最初稱為自然殺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體4(ΝΚ4))是被公認(rèn)與人類炎癥相關(guān)的促炎細(xì)胞因子并且已經(jīng)顯示與疾病諸如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、RA、C0PD和牛皮癬的疾病嚴(yán)重性相關(guān)。IL-32活化核因子KB(NF-KB)和p38促分裂原活化蛋白激酶的典型細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以誘導(dǎo)11^-13、11^-6、11^-8、11^-12和1咿0。IL-32和NODl/ N0D2(核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域)配體激活胱天蛋白酶1途徑用于誘導(dǎo)IL-I β和IL.6。另外， IL-32與蛋白酶3誘導(dǎo)ΜΙΡ2和IL-8。測(cè)量來(lái)自人全血的刺激和未刺激T細(xì)胞亞群在與初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞(Hka)間接和直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸后刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。在用rhuTNF α或rhuIL_l β刺激后，在Hka裂解物而不是上清中，檢測(cè)到IL-32 γ及其同種型IL_32y的誘導(dǎo)，而qRT-PCR 結(jié)果顯示，與健康人皮膚相比，在牛皮癬皮膚中，IL-32Y以及TNFa和IL-I β顯著增加(P < 0. 05)。進(jìn)一步，人Η9和CLA+抗原陽(yáng)性的CD4+CD45R0+CCR4+Th22T細(xì)胞通過直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制刺激Hka，從而以與未刺激的H9T細(xì)胞或⑶4+⑶45R0+CCR4-、 CD4+CD45RA+CCR4+和CD4+CD45RA+CCR4-記憶T細(xì)胞相比顯著增加的水平(P < 0. 05)上調(diào)IL-32Y、TNFa和IL_1 β。這些發(fā)現(xiàn)(在下面的實(shí)施例2中進(jìn)一步討論)首次顯示，在 T細(xì)胞Hka細(xì)胞-細(xì)胞接觸后，在HKa中，促炎細(xì)胞因子IL-32 γ上調(diào)并且可能涉及牛皮癬發(fā)病機(jī)理的早期階段。進(jìn)一步，當(dāng)單克隆抗體被用于阻斷牛皮癬Th22細(xì)胞中的FKBP52和/⑶147時(shí)，初級(jí)人角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生被明顯抑制，如圖52所示。這顯示單一抑制和雙重抑制都可以對(duì)牛皮癬、風(fēng)濕病和其他炎性疾病具有重要的治療應(yīng)用。參考實(shí)施方式和說(shuō)明性實(shí)施例描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對(duì)如所描述和說(shuō)明的發(fā)明的改變，其不背離在說(shuō)明書中公開的本發(fā)明精神和范圍。描述實(shí)施例以幫助理解本發(fā)明而不是意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍，以及不應(yīng)該被解釋為以任何方式限制其范圍。例如，本文描述的許多個(gè)實(shí)施例涉及慢性斑塊的病理生理學(xué)和治療，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，實(shí)施例也適用于與慢性炎癥相關(guān)的其他狀況例如上面討論的那些狀況。實(shí)施例不包括常規(guī)方法的詳細(xì)描述。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的并且在大量的出版物中進(jìn)行了描述。進(jìn)一步，上面引用的所有參考文獻(xiàn)和下面的實(shí)施例都通過引用并入本文，如同在本文中全部描述。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 同時(shí)沉默F(xiàn)KBP52和EMMPRIN顯著減少細(xì)胞因子產(chǎn)生用PMA/洛諾霉素刺激人T-細(xì)胞淋巴瘤H9細(xì)胞。溶解細(xì)胞并且使用商業(yè)可得的膜蛋白提取試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)，然后通過2D凝膠電泳進(jìn)行分離。切除顯示在刺激樣品和未刺激樣品之間大于2倍變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)，用胰蛋白酶消化并通過納米LC/MS/MS分析。 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡、siRNA擊倒(敲除，knockdown)和細(xì)胞-細(xì)胞接觸生物分析來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)鑒定、定量和功能。材料和方法患者，材料和方法。聲明研究得到相關(guān)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及所有人類參與者提供書面的知情同意。細(xì)胞系的培養(yǎng)。人細(xì)胞系培養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10% (v/v) FCS血清、2mM L-谷胺酰胺、100單位/ml青霉素和100單位/ml鏈霉素的RPMI 1640 (Biochrom, Berlin，德國(guó))組成。Hut78、H9、Molt4、Jurkat, Raji 和 THP-I 細(xì)胞系得自 ATCC。外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的細(xì)胞分離。通過Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs。 獲得的PBMCs的生存力總是> 95%，如通過臺(tái)盼藍(lán)染色所測(cè)定的?；畹募?xì)胞在Neubauer室 (Zeiss, OberkochendIH )中定量并且儲(chǔ)存在液氮中。⑶3+T細(xì)胞。再次在1，500rpm下離心解凍的PBMC 5分鐘，然后棄去上清。然后將小球(細(xì)胞團(tuán)，pellet)重懸于MACS緩沖液中并且將細(xì)胞打亂成單一的細(xì)胞懸浮液。每IO8 細(xì)胞懸浮在0.8ml緩沖液中。每IO8細(xì)胞加入0.2ml半抗原-抗體混合物。細(xì)胞和抗體混合物充分混合并且在冰上溫育20分鐘。然后通過加入20X標(biāo)記體積(volume)洗滌細(xì)胞， 離心并且除去上清。細(xì)胞球重懸于0. 8ml緩沖液中(每IO8細(xì)胞)。每IO8細(xì)胞加入0. 2ml MACS抗-半抗原微珠(MicroBead)以通過磁力標(biāo)記細(xì)胞，然后充分混合混合物并且在冰上溫育15分鐘。用20 X體積洗滌混合物(如果使用來(lái)自白細(xì)胞電泳包(Leukophoresispack) 的冷凍細(xì)胞，則使細(xì)胞通過45um的網(wǎng)孔濾器以除去群集的死細(xì)胞)，離心，然后全部除去上清。然后將細(xì)胞重懸于Iml MACS緩沖液(每IO8細(xì)胞)。將LS+柱置于適當(dāng)?shù)腗ACS分離器的磁場(chǎng)中并且通過用3ml緩沖液洗滌來(lái)預(yù)備柱。細(xì)胞懸浮液被施加至柱上，使得未標(biāo)記的細(xì)胞通過。收集流出物作為陰性部分，代表富集的T細(xì)胞部分。用4X3ml的緩沖液沖洗柱，收集流出物。然后離心柱并且除去上清，將細(xì)胞球重懸于50ml組織培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)細(xì)胞并且制備IO6細(xì)胞/ml的懸浮液。這些懸浮液是具有大于95%純度的純化T細(xì)胞。細(xì)胞純度可以通過⑶3-FITC標(biāo)記和FACS分析來(lái)測(cè)定。對(duì)于單核細(xì)胞，方法與上面討論的對(duì)于 ⑶3+T細(xì)胞分離的方法相同。細(xì)胞的免疫分型。收獲的細(xì)胞在FACS介質(zhì)[含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)]中洗滌并且通過與異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)直接結(jié)合的抗體在4°C下染色20分鐘。此后，用PBS洗滌細(xì)胞三次并且使用CellQuest軟件(Becton Dickinson)通過 FAC^can (Becton Dickinson，Heidelberg，德國(guó))進(jìn)行分析?？贵w是下述 PE-標(biāo)記的抗小鼠IgG、抗人⑶40L和⑶147。細(xì)胞-細(xì)胞接觸分析。用冷PBS洗滌初級(jí)T細(xì)胞或H9細(xì)胞并且以5X IO6細(xì)胞/ ml將細(xì)胞球重懸于新鮮制備的多聚甲醛中。在冰上保持細(xì)胞固定2小時(shí)，然后用20X 體積的冷PBS洗滌三次。在第三次洗滌之后，將在4°C細(xì)胞保持在PBS中過夜以使任何痕量的多聚甲醛漏出細(xì)胞。次日早晨再次離心細(xì)胞并且再一次洗滌。以IXlO7細(xì)胞/ml將固定的T細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中。將IXlO6Ail THP-I細(xì)胞分配到96孔U形底板中，每孔 100 μ 1。加入8Χ、4Χ和2Χ106細(xì)胞/ml初級(jí)T細(xì)胞或Η9細(xì)胞，每孔100μ 1。將板置于濕潤(rùn)的37°C ,5% CO2溫箱中48小時(shí)。以1，500 rpm離心板5分鐘并且小心地將120 μ 1的上清轉(zhuǎn)移到新的板中。將上清保持在-20°C冰箱中直至使用。
固定的T細(xì)胞以大約5X IO5細(xì)胞/100 μ 1的密度鋪平板，然后以5Χ IO4細(xì)胞 /100 μ 1加入THP Μφ。然后在37°C下將細(xì)胞溫育M小時(shí)和48小時(shí)(圖53)。然后分析上清的 TNF α、IL-I β 和 IL-32 γ。SiRNA0通過轉(zhuǎn)染siRNA (Nucleofection，amaxa)以特異地敲掉T細(xì)胞中候選基因的表達(dá)來(lái)進(jìn)行RNA干擾。通過FACS分析來(lái)測(cè)量候選基因表達(dá)。RNA 樣品制備和雜交。使用 RNeasy MinElute 試劑盒 ^iagen)，Qiagen MiniRNeasy試劑盒，根據(jù)制造商的方案提取總RNA并且純化。使用每種樣品的IOOng總 RNA，如表達(dá)分析技術(shù)手冊(cè)中所述的進(jìn)行cDNA合成(Affymetrix，two-cycle protocol)。使用 BioArray High-Yield Transcript Labeling 試劑盒(Enzo)，進(jìn)行 cRNA 反應(yīng)。15 微克的標(biāo)記cRNA被片段化并且按照廠商的用法說(shuō)明順序地與GAPS Slides(Corning)雜交。微陣列數(shù)據(jù)分析。所有陣列都被標(biāo)準(zhǔn)化并且使用PerfectMatch程序Ghang等人， 2003)進(jìn)行分析。對(duì)野生型和異位無(wú)眼觸角、腿和翅原基(wing discs)進(jìn)行雙因素方差檢驗(yàn)。為了調(diào)節(jié)多個(gè)檢驗(yàn)，計(jì)算假發(fā)現(xiàn)率并且確定具有在0.001處的截止組(cutoff set)的總計(jì)956個(gè)基因和在一個(gè)樣品中至少兩倍誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步減少假陽(yáng)性，不在最高40百分點(diǎn)中表達(dá)的基因被認(rèn)為是沒有的并且被排除用于進(jìn)一步分析。而且，只有以高于野生型腿、 翅或觸角原基中表達(dá)水平在野生型眼原基中表達(dá)的基因被包括在內(nèi)，用以進(jìn)一步分析。雙向凝膠電泳和分析。使用可得自Pierce的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的膜蛋白2D樣品制備試劑盒從對(duì)照和刺激的H9細(xì)胞提取膜蛋白。在提取和沉淀之后，在離液序列高的溶解緩沖液(7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、50mM DTT、0. 2%載體兩性蛋白質(zhì)(pH 4_7)、1%蛋白酶抑制劑混合物)中溶解蛋白質(zhì)，并且使用改良的Bradford assay (BioRad)進(jìn)行定量。通過用包含IOOOmg蛋白質(zhì)的450mL離液序列高的溶解緩沖液再水化Mcm長(zhǎng)的pH 4-7 Immobiline DryStrips (GE Healthcare)，進(jìn)行第一向的等電聚焦。在12小時(shí)的活性再水化之后(50V， 20°C )，使用Protean IEF cell (Bio-Rad)，用每帶50mA的最高電流分離蛋白質(zhì)并且以 70，000伏特-小時(shí)(Vh)在IOkV下結(jié)束伏特梯度。在第一向分離之后，將帶置于-80°C至少2小時(shí)。在第二向分離(SDS-PAGE)之前，解凍的帶首先用平衡緩沖液((20%甘油、20% SDS、1.5M Tris pH 8. 8和6M尿素)中的10mg/mL DTT溫育15分鐘，然后用在相同緩沖液中的25mg/mL碘代乙酰胺溫育。使用Ettan DALT-12系統(tǒng)用12. 5%預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠(26X20cm)和DALT緩沖液試劑盒(GEHealthcare)進(jìn)行第二向分離。使用60W 30分鐘和180W大約5小時(shí)并且保持在15°C下通過分子量分離蛋白質(zhì)。按照廠商說(shuō)明書用考馬斯亮藍(lán)(Bio-SafeTM，Bio-Rad Laboratories, CA, USA)染色蛋白質(zhì)過夜。在 Lal^can(GE Healthcare)上以每英寸(dpi) 300點(diǎn)成像，之后用水脫色。蛋白質(zhì)豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化通過 IMAGE-Master platinum II software 5. 0 版(GE Healthcare)確定。每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的強(qiáng)度(3維的量)被標(biāo)準(zhǔn)化為凝膠上檢測(cè)的所有點(diǎn)的總強(qiáng)度。在比較M塊凝膠(6個(gè)組， 每組η = 4)之前，單獨(dú)地調(diào)節(jié)產(chǎn)生每個(gè)凝膠平均1500個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測(cè)閾值。聚集對(duì)塊膠中的至少23塊中出現(xiàn)的點(diǎn)。使用軟件的相對(duì)量(％ Vol)選項(xiàng)確定蛋白表達(dá)的差異。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的點(diǎn)(與對(duì)照相比，學(xué)生T檢驗(yàn)ρ < 0. 05)被人工地研究以確保兩個(gè)點(diǎn)沒有融合或所述點(diǎn)被錯(cuò)誤地分組。與對(duì)照相比平均密度大于士40%平均點(diǎn)量的變化是用于切除隨后通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行鑒定的點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。
使用改良的Havlis和Jimenez的方法，消化凝膠點(diǎn)中的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，組合來(lái)自至少兩個(gè)重復(fù)樣本的點(diǎn)并且用1/1乙腈和IOOmM碳酸氫銨脫色兩至三次，然后用100%乙腈濃縮并且真空干燥。用25ng/ml胰蛋白酶再水化點(diǎn)并且在37°C下溫育過夜。收集上清并且使用蟻酸(含水的)和30%乙腈另外提取2次匯集。所匯集的提取物真空濃縮為大約10 μ L并儲(chǔ)存在-80°C直至使用。通過反相納米噴射(nan0Spray)LC-MS/MS (Agilent 1100 HPLC, 75 mm IDX15cm柱，hrbax C18)分析約30%的凝膠內(nèi)消化的樣品。緩沖液A 0. 蟻酸。利用增加的緩沖液B(90% ACN,0. 蟻酸)的梯度以300nl/min的流速?gòu)姆蛛x柱洗脫肽至質(zhì)譜儀中。在350-1800D的m/z范圍內(nèi)收集光譜(Agilent LC/MSDTrap XCT Ultra)。收集了六種最豐富m/z值的三個(gè)MS/MS光譜，然后從分析中排除這些質(zhì)量1分鐘， 接下來(lái)選擇下面的六種最豐富m/z值，用以破碎。利用 Mascot (Matrix Science)禾口 Spectrum Mill (Agilent)程序，通過搜索 NCBInr.IPI human和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定蛋白質(zhì)。對(duì)于Mascot，使用10，000的密度閾值和以5次掃描分組的0. 2%相對(duì)豐度的最小值生成所得到的光譜的化合物列表。以.mgf 文件輸出化合物列表并且利用人類的分類學(xué)篩選再次搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(每周更新)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索中使用的參數(shù)如下單一同位素質(zhì)量、2. 4Da的肽質(zhì)量公差(ρ印tide mass tolerance), 0. 7Da的片段離子質(zhì)量公差(fragmention mass tolerance)、僅允許2個(gè)遺漏分裂的胰蛋白酶肽、由于固定修飾的Cys脲基甲基化(carbamidomethylation)和由于可變修飾的脫酰胺(N，Q)和乙酰化作用(K)。類似的參數(shù)被用于SpectrumMill搜索。SpectrumMill蛋白質(zhì)分值高于13，其中肽分值超過10并且記分的百分比強(qiáng)度(SPI)超過70%是初級(jí)擊打 (hit)確認(rèn)的截止值(cutoff)。FKBP52在刺激的⑶3+T細(xì)胞中上調(diào)與在獲自健康捐贈(zèng)者的血液的T細(xì)胞中相比，促炎細(xì)胞因子TNF α在取自牛皮癬患者的血液的T細(xì)胞中上調(diào)(圖13)。已經(jīng)顯示促炎細(xì)胞因子通過活化的巨噬細(xì)胞(ΜΦ) 的上調(diào)驅(qū)動(dòng)慢性銀屑病的發(fā)病機(jī)理，最可能通過皮膚中的免疫突觸(1 機(jī)理經(jīng)由直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，提供了 T細(xì)胞和Mcp蛋白質(zhì)，其在該系統(tǒng)中介導(dǎo)適應(yīng)性免疫。刺激的和未刺激的人T細(xì)胞的差示雙向凝膠電泳被用于選擇上調(diào)的蛋白質(zhì)候選物用于隨后通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定?；陔p向凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)是用于鑒定響應(yīng)于一些觸發(fā)物改變其表達(dá)或修飾狀態(tài)的蛋白質(zhì)的廣泛接受的方法。研究了這種方法用于刺激的人T細(xì)胞系H9細(xì)胞的差異表達(dá)分析。蛋白質(zhì)分離的PH范圍通過電荷和丙烯酰胺百分比進(jìn)行優(yōu)化，用于使用全細(xì)胞裂解提取物通過大小分離蛋白質(zhì)。這些條件(11 cmIPG帶，pH 104-6，10. 5-14%梯度SDS-PAGE 凝膠)被應(yīng)用到刺激的和未刺激的H9細(xì)胞的制備。刺激樣品的蛋白質(zhì)分離示于圖14中。 切除標(biāo)記的點(diǎn)——代表至少1. 5倍的表達(dá)變化，使用胰蛋白酶消化并且然后在安捷倫超高容量離子阱(Agilent Ultra high capacity ion trap)上通過 nanoLC/MS/MS 進(jìn)行分析。 用Spectrum Mill的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索被用于鑒定蛋白質(zhì)。獲得所有點(diǎn)的高的分值、驗(yàn)證的蛋白質(zhì)鑒定。使用串聯(lián)質(zhì)譜，號(hào)碼為13的點(diǎn)被鑒定為FKBP52(圖15)。蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)FKBP52的表達(dá)在刺激的H9細(xì)胞中稍微增加(數(shù)據(jù)未示出)， 而在刺激的⑶3+T細(xì)胞中顯著增加(圖16)。
總結(jié)在表1中的微陣列分析顯示在H9細(xì)胞中FKBP52和FKBP12的增加的上調(diào)(與未刺激的對(duì)照相比)，而在牛皮癬損傷皮膚中具有顯著的上調(diào)，這支持了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)^ ο
權(quán)利要求
1.抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，所述方法包括施用有效量的抑制CD147的活性和/ 或表達(dá)的組合物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括同時(shí)抑制⑶147和Π(ΒΡ52的活性和/或表達(dá)的組合物。
3.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括同時(shí)抑制CD147和CypA的活性和/或表達(dá)的組合物。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物包括使CD147和FKBP52表達(dá)沉默的兩種或更多種siRNA分子。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包括抑制CD147活性的抗體。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物包括抑制CD147和FKBP52活性的兩種或更多種抗體或其功能片段。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物包括抑制⑶147和FKBP52活性的雙特異性抗體。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物包括抑制CD147和FKBP52活性或表達(dá)的兩種或更多種小分子。
9.選擇性抑制對(duì)象中的適應(yīng)性免疫反應(yīng)而不明顯影響先天免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括抑制所述對(duì)象中CD147和FKBP52蛋白的活性和/或表達(dá)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)包括施用包含使⑶147和 FKBP52表達(dá)沉默的組合物。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)包括施用包含阻斷⑶147和 FKBP52活性的兩種或更多種抗體或其片段的組合物。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)包括施用包含阻斷⑶147和 FKBP52活性的雙特異性抗體的組合物。
13.權(quán)利要求2所述的方法，其中抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)包括施用包含抑制⑶147和 FKBP52的活性和/或表達(dá)的兩種或更多種小分子的組合物。
14.治療慢性炎性疾病的方法，所述方法包括將治療上有效量的藥物組合物施用給對(duì)象，所述藥物組合物抑制所述對(duì)象中FKBP52和CD147的活性和/或表達(dá)，所述藥物組合物包括i.CD147抑制劑；ii.FKBP52抑制劑；和iii.藥學(xué)上可接受的載體。
15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述慢性炎性疾病是牛皮癬或自身免疫病。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疾病是牛皮癬。
17.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述CD147和FKBP52抑制劑包括兩種或更多種 siRNA分子以使CD147和FKBP52表達(dá)沉默。
18.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述⑶147和FKBP52抑制劑包括阻斷EMMPRIN和 FKBP52活性的兩種或更多種抗體或其功能片段。
19.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述⑶147和FKBP52抑制劑包括阻斷FKBP52和 ⑶147活性的雙特異性抗體。
20.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述⑶147和FKBP52抑制劑包括阻斷⑶147和 FKBP52活性或表達(dá)的兩種或更多種小分子。
21.抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，所述方法包括施用有效量的抑制FKBP52的活性和 /或表達(dá)的組合物。
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了通過調(diào)節(jié)抑免蛋白/親環(huán)蛋白家族成員和EMMPRIN免疫球蛋白受體超家族成員的組合，用于在對(duì)象中調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而不顯著影響先天免疫反應(yīng)的方法和組合物。本發(fā)明還提供通過調(diào)節(jié)抑免蛋白/親環(huán)蛋白家族成員和EMMPRIN免疫球蛋白受體超家族成員用于治療各種臨床癥狀的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102573906SQ201080016239
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者A·仁加薩米, C·K·愛德華茲三世, D·A·諾瑞斯, E·Z·艾森麥瑟, K·R·瓊斯哲, L·李, M·福吉塔 申請(qǐng)人:西部國(guó)家生物制藥公司