專利名稱：細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物的制備及其在艾滋病治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于艾滋病治療藥物領(lǐng)域，具體采用RNA干擾的方法進行艾滋病的治療。 提供高效、特異性的siRNA及作為運送載體的細(xì)胞微粒子。兩者的復(fù)合物可以作為藥物進行艾滋病及HIV感染者的治療。
現(xiàn)有技術(shù)艾滋病艾滋病的醫(yī)學(xué)名稱為"獲得性免疫缺陷綜合癥"(英文縮寫AIDS)，是一種病死率很高的嚴(yán)重傳染病。它是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的，以T細(xì)胞免疫功能缺陷為主的一種綜合免疫缺陷病。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)， 破壞T4淋巴細(xì)胞，從而使整個人體免疫系統(tǒng)遭到破壞。當(dāng)人體處于正常狀態(tài)時，體內(nèi)免疫系統(tǒng)可以有效抵抗各種病毒的襲擊。一旦艾滋病病毒侵入人體體內(nèi)，這種良好的防御體系便會土崩瓦解，各種病毒乘機通過血液、破損傷口長驅(qū)直入。此外，人體內(nèi)一些像癌細(xì)胞之類的不正常細(xì)胞，也會迅速生長、繁殖，最終發(fā)展成各類癌瘤。通俗地講，艾滋病病毒是通過破壞人的免疫系統(tǒng)和機體抵抗能力，最終導(dǎo)致人體喪失對各種疾病的抵抗能力而導(dǎo)致死亡的。HIV是帶有包膜的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，在分類上屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢病毒亞科，目前已發(fā)現(xiàn)HIV-I型和HIV-2型。HIV呈球型或卵型，直徑100-150nm，系雙層結(jié)構(gòu)。病毒的核心位于病毒體的中央或偏心，核心由RNA及核衣殼蛋白質(zhì)(P7、P9)、逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase,RT)、核糖核酸酶H(Ribo H)及整合酶(INT)所組成；核心外為病毒衣殼，呈 20面體立體對稱，由蛋白質(zhì)(P17/P18、P24/P2Q組成。病毒最外層為膜蛋白。包膜上有72 個刺突(Spike)，含糖蛋白gpl20，并在雙層脂質(zhì)中有g(shù)P41蛋白。艾滋病病毒侵入人體后直接侵犯人體免疫系統(tǒng)，攻擊和殺傷的是人體免疫系統(tǒng)中最重要、最具有進攻性的T4淋巴細(xì)胞，使機體一開始就處于喪失防御能力的地位。艾滋病病毒一旦進入人體，就寄生于T4淋巴細(xì)胞內(nèi)最核心的部位，并與細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)DNA整合為一體，并利用T4淋巴細(xì)胞進行自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制。病毒的繁殖和復(fù)制使免疫細(xì)胞遭到破壞和毀滅，并放出更多的病毒。新增殖病毒再感染更多的細(xì)胞。就這樣，病毒一代代地復(fù)制、繁殖，免疫細(xì)胞不斷死亡。艾滋病通過性、血液和母嬰三種接觸方式傳播，是一種嚴(yán)重危害健康的傳染性疾病。艾滋病從發(fā)現(xiàn)至今不過幾十年，但它在全球所引起的廣泛流行，已使3000多萬人受到感染，1000多萬人失去了生命，世界上每天有萬余人新感染上艾滋病病毒。艾滋病治療現(xiàn)狀目前，抗艾滋病病毒治療的藥物包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等。核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的作用是通過阻斷病毒RNA基因的逆轉(zhuǎn)錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去復(fù)制的模板。這些藥物首先進入被感染的細(xì)胞，然后磷酸化形成具有活性的三磷酸化合物。AZT和d4T是病毒核酸復(fù)制天然底物脫氧胸苷dT的類似物； ddC和3TC是脫氧胞苷dC的類似物，這些雙脫氧核苷三磷酸鹽是HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶競爭抑制劑，當(dāng)他們插入生長的DNA鏈時，可導(dǎo)致未成熟的DNA鏈終結(jié)，病毒DNA合成受阻并進而導(dǎo)致病毒復(fù)制受到抑制。非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是一組與核苷無關(guān)，化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同的特異性抑制 HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶的化合物，它們不是HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶底物競爭抑制劑，而是通過與酶活性點附近的P66疏水區(qū)結(jié)合而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶。蛋白酶抑制劑是基于肽類的化合物，它們或競爭性抑制蛋白酶活性，或作為互補蛋白酶活性點的抑制劑，能抑制蛋白酶的功能，使新產(chǎn)生的病毒不能成熟。目前流行的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，俗稱“雞尾酒療法”，是采用蛋白酶抑制劑加兩種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的方法治療感染者和病人的方法。此種藥物具有較強的抗病毒作用，經(jīng)使用后可在血漿中檢測不到病毒，并可長期維持這一療效。另外，它還可以使被艾滋病病毒破壞的人類免疫功能獲得恢復(fù)或部分恢復(fù)。但是這一療法有其本身的局限性，包括治療費用高昂及副作用明顯等缺點。干擾核糖核酸(smallinterfering RNA, siRNA)這是一類由20多個核苷酸組成的雙鏈RNA分子，可以通過特異性降解靶基因的信使核糖核酸(messager RNA, mRNA)起到沉默基因表達的作用。這一過程被稱為RNA干擾 (RNA interference, RNAi)。RNA干擾是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一種方式。siRNA可以對其靶基因進行特異性識別， 并能招募被稱為沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex, RISC)的蛋白質(zhì)復(fù)合體。 RISC包含核糖核酸酶等，可以通過靶向切割同源性mRNA的方式，特異、高效地抑制基因的表達。由于使用RNA干擾技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)實驗研究及各種疾病的治療領(lǐng)域。目前應(yīng)用RNA干擾方法治療艾滋病已成為艾滋病治療研究的熱點，通過設(shè)計針對 HIV病毒基因組的siRNA，可以特異性降解病毒基因組，從根本上殺滅病毒。研究已經(jīng)證明， siRNA能有效地抑制HIV病毒在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制。siRNA可以通過抑制HIV病毒自身基因(如ple，gag，rev，tat和env)或宿主基因(如HIV的主要受體CD4)達到阻止HIV 感染的目的。然而，應(yīng)用siRNA治療艾滋病還存在一些有待解決的問題，包括siRNA導(dǎo)入效率低及siRNA的穩(wěn)定性差等問題。目前，siRNA的導(dǎo)入主要采取載體運載或抗體偶聯(lián)的方式。載體包括脂質(zhì)體、納米膠襄、環(huán)糊精包含物等，雖然這些載體可以延長藥物在體內(nèi)的存留時間并一定程度上提高siRNA藥物的吸收率，但是其傳送藥物的靶向性和高效性仍然不足。雖然抗體偶聯(lián)的方式可以提高siRNA的靶向性，但siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性得不到保證。因此，RNA干擾方法作為治療艾滋病病人及HIV病毒感染人群的潛在藥物，目前還存在一些未解決的問題，遞送siRNA的特異性差及效率低是防妨礙其應(yīng)用的主要原因。細(xì)胞微粒子(Microvesicles)這是是一類大小在10-500nm之間，由細(xì)胞產(chǎn)生(例如分泌)的、具有脂質(zhì)雙層膜的生物(囊泡)結(jié)構(gòu)。早在1967年就有報道，其來源于血小板，包含囊泡，當(dāng)時被稱為"platelet dust”，具有促進凝結(jié)的作用。后來體外研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、 白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞等也都能釋放(細(xì)胞)微粒子。根據(jù)微粒子產(chǎn)生的途徑，又可以將微粒子區(qū)分為exosomes和shedding vesicles。Exosomes是細(xì)胞在被刺激的情況下，通過多囊泡小體(Multivesicular bodies,MVBs)胞吐到細(xì)胞外的，而shedding vesicles則是直接從細(xì)胞表面以出芽的方式分泌出來的。目前，不同細(xì)胞分泌的shedding vesicles 被命名為不同的名稱，比如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的被稱為ectosomes，而血小板分泌的則被稱為microparticles。細(xì)胞微粒子的膜成分取決于其來源的細(xì)胞，主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。我們研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微粒子來源于生物體，對生物體具有高親和性，是理想的藥物用載體，可用于RNA干擾方法中用于作為治療艾滋病人及HIV病毒感染人群中以高效、特異性地遞送siRNA。具體地，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞微粒子是一種在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運效率高，特異性強的生物囊泡載體，且不同細(xì)胞釋放的微粒子的膜表成分(包括特異性表面受體及膜脂結(jié)構(gòu))與對應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)膜成分相同，因此，細(xì)胞微粒子帶有來源細(xì)胞表面特有的受體蛋白或膜脂結(jié)構(gòu)，與對應(yīng)的靶細(xì)胞有高親和性；同時，由于細(xì)胞微粒子中還含有siRNA發(fā)揮作用所需的重要蛋白，因此，如果采用細(xì)胞微粒子作為運送siRNA的載體，就可以高效率、選擇性地遞送siRNA 到靶細(xì)胞/組織，從而大大提高siRNA調(diào)控細(xì)胞功能的作用。因此，由于細(xì)胞微粒子(包括所有具有細(xì)胞微粒子特征的膜脂囊泡結(jié)構(gòu)，比如exosome和shedding vesicles以及針對各種細(xì)胞分泌的shedding vesicles的特稱)可以提高siRNA運輸?shù)奶禺愋?、靶向性和穩(wěn)定性；以及可以促進siRNA作用效果等優(yōu)點，能夠有效用于艾滋病的治療中。因此，本發(fā)明提供一種應(yīng)用細(xì)胞微粒子運送針對HIV病毒基因組的siRNA的方法。 本發(fā)明還涉及細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性siRNA的復(fù)合物，其制備方法，及其在治療艾滋病及HIV感染者等方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種治療艾滋病的藥物復(fù)合物，可用于有效輸送治療艾滋病的藥物。 所述藥物復(fù)合物為siRNA和細(xì)胞微粒子的復(fù)合物，包括針對HIV病毒基因組的siRNA以及作為載體的細(xì)胞微粒子；所述HIV病毒包括HIV-I及HIV-2兩種類型。優(yōu)選的，所述HIV病毒為HIV-I型病毒。所述siRNA包括所有能針對HIV基因組，并能導(dǎo)致HIV基因組特異性降解的siRNA 序列。優(yōu)選的，所述siRNA序列為下列序列的一種或多種DHIV-Gl GCCCTTCAGACAGGATCAGAA2)HIV-G2 :AAGCAGCCATGCAAATGTTAA3)HIV-G3 TCCCAGTAGGAGAAATCTATA4)HIV-G4 GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA5)HIV-Tl :AGATCCTAGACTAGAGCCCTG6)HIV-T2 TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG
7)HIV-T3 GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA8)HIV-T4 TCAAAGCAACCCACCTCCCAA所述細(xì)胞微粒子包括各種大小在10-500nm之間、由細(xì)胞分泌，例如以出芽或胞吐形式分泌的、具有脂質(zhì)雙層膜的天然生物囊泡，包括被稱為exosoimshedding vesicles的結(jié)構(gòu)以及各種細(xì)胞分泌的shedding vesicles。所述細(xì)胞微粒子與SiRNA以包裹與被包裹的關(guān)系存在；所述細(xì)胞微粒子-SiRNA復(fù)合物為表達有SiRNA的宿主細(xì)胞分泌產(chǎn)生；所述宿主細(xì)胞包括現(xiàn)有所有細(xì)胞系、細(xì)胞株、以及正常人或疾病患者自身組織/ 細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。本發(fā)明還提供一種制備上述細(xì)胞微粒子-SiRNA復(fù)合物藥物的方法。所述復(fù)合物藥物包括針對HIV病毒基因組的SiRNA以及作為載體的細(xì)胞微粒子；所述制備藥物的方法包括將SiRNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞及從細(xì)胞中提純出載有SiRNA的細(xì)胞微粒子的步驟。所述將siRNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法包括1)應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人工合成的成熟體 siRNA ；2)應(yīng)用脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染攜帶siRNA表達序列的病毒載體或質(zhì)粒；以及3) 建立siRNA永久表達細(xì)胞株等三種方法。優(yōu)選的，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人工合成的成熟體SiRNA的方法包括以下步驟1)設(shè)計針對HIV病毒基因組的siRNA序列；所述siRNA包括所有能針對HIV基因組，并能導(dǎo)致HIV基因組特異性降解的siRNA 序列。設(shè)計方法參見本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)方法。優(yōu)選的，所述siRNA序列為下列序列的一種或多種i. HIV-Gl GCCCTTCAGACAGGATCAGAAii. HIV-G2 :AAGCAGCCATGCAAATGTTAAiii. HIV-G3 TCCCAGTAGGAGAAATCTATAiv. HIV-G4 GCAAGCTTCACAGGAGGTAAAv. HIV-Tl :AGATCCTAGACTAGAGCCCTGvi. HIV-T2 TGGAAGCATCCAGGAAGTCAGvii. HIV-T3 GCATCCAGGAAGTCAGCCTAAviii. HIV-T4 TCAAAGCAACCCACCTCCCAA2)依照設(shè)計好的序列人工合成siRNA ；3)應(yīng)用脂質(zhì)體將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選的，應(yīng)用脂質(zhì)體或電穿孔轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染攜帶siRNA表達序列的病毒載體或質(zhì)粒的方法包括以下步驟1)設(shè)計針對HIV病毒基因組的siRNA表達序列；所述表達序列包括任一種或多種針對HIV基因組的siRNA的反向互補序列。2)依照設(shè)計好的序列人工合成表達序列；3)將表達序列插入到適合其表達的病毒載體或質(zhì)粒中；4)將重組的病毒載體或質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)染方法，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)；5)使siRNA表達載體在細(xì)胞內(nèi)表達siRNA。
優(yōu)選的，建立SiRNA永久表達細(xì)胞株的方法包括1)設(shè)計針對HIV病毒基因組的SiRNA表達序列；2)構(gòu)建SiRNA表達載體；優(yōu)選的，所述載體為慢病毒載體；3)對于測序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；4)使用高效重組載體(脂質(zhì)體)和重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；5)濃縮、純化病毒液；6)采用GFP熒光法檢測病毒滴度；7)用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；8)檢測基因功能或者SiRNA的沉默效率；9)使用抗生素進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選；10)采用單克隆培養(yǎng)，建立永久表達的轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株。所述宿主細(xì)胞包括現(xiàn)有所有細(xì)胞系、細(xì)胞株、以及正常人或疾病患者自身組織/ 細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。所述提純載有SiRNA的細(xì)胞微粒子的方法包括以下步驟1)收集siRNA導(dǎo)入后的細(xì)胞的培養(yǎng)液；2)采用一定方法分離提純其中的細(xì)胞微粒子。所述提純細(xì)胞微粒子的方法包括差速離心法、免疫吸附法及超濾法中的一種或多種。優(yōu)選地，所述制備方法為差速離心法，例如包括以下步驟的差速離心法(1)先將細(xì)胞或組織于300g離心5分鐘，取上清；(2)將上清于1500g離心20分鐘，取上清；(3)將上清于IOOOOg離心30分鐘，取上清。(4)將上清于IlOOOOg離心70分鐘，取沉淀即為細(xì)胞
微粒子?；蛘邇?yōu)選地，所述制備方法為免疫吸附法，例如包括以下步驟的免疫吸附法(1) 先將細(xì)胞或組織于3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心30分鐘，取上清；( 將吸附在組織培養(yǎng)皿上的細(xì)胞特異性的抗體或免疫磁珠與上清溫育30 60分鐘，回收被吸附的細(xì)胞微粒子?；蛘邇?yōu)選地，所述制備方法為超濾法，例如包括以下步驟的超濾法(1)先將細(xì)胞或組織于3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心30分鐘，取上清；( 將上清放入帶有一定孔徑濾膜的濃縮離心管，于4000轉(zhuǎn)/分鐘進行離心，濃縮即得。本發(fā)明還提供一種該復(fù)合物藥物在艾滋病及HIV病毒攜帶者治療中的應(yīng)用。用本發(fā)明的藥物復(fù)合物治療艾滋病或HIV病毒攜帶者可以采用以下方法實現(xiàn)1)將上述復(fù)合體藥物注入受體或加入受體細(xì)胞；2)通過siRNA介導(dǎo)的沉默作用阻斷HIV病毒的擴張；3)任選地，檢測HIV病毒含量的變化，即復(fù)合藥物治療艾滋病的效果；所述受體包括艾滋病患者和/或HIV病毒感染者。所述受體細(xì)胞包括所有被HIV感染的細(xì)胞系、細(xì)胞株、以及艾滋病患者及HIV感染者自身組織/細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。所述檢測HIV含量的方法包括病毒核酸檢測法、P24抗原檢測法等。優(yōu)選的，所述病毒核酸檢測方法為應(yīng)用熒光實時定量PCR法(Real-timePCR)檢測HIV病毒核酸含量。具體包括以下步驟1)提取病毒RNA ；幻對HIV RNA進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)， 然后對其產(chǎn)物cDNA進行PCR擴增。根據(jù)PCR反應(yīng)中的得到的CT值，推導(dǎo)出最初參與反應(yīng)的病毒cDNA的模板數(shù)，進而得到病毒含量。優(yōu)選的，PM抗原檢測法為應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測PM抗原通常采用夾心法ELISA，即將純化的已知抗體包被在固相反應(yīng)板孔底，當(dāng)加入待測血清后，若血清中含有pM抗原，則與包被抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶(HRP)標(biāo)記的抗體，加底物顯色后，在酶標(biāo)儀上檢測反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度(0D值)。由于在一定范圍內(nèi)，OD值的大小和 P24抗原的含量成線性相關(guān)，因此OD值就可以直觀反映病毒含量的多少。


圖1 一例瞬時表達載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2 —例永久表達載體的結(jié)構(gòu)圖。圖3電子顯微鏡下觀察細(xì)胞微粒子。圖4轉(zhuǎn)染過熒光標(biāo)記的siRNA的細(xì)胞。圖5流式細(xì)胞方法檢測的細(xì)胞微粒子-SiRNA復(fù)合體。圖6復(fù)合物藥物和相應(yīng)對照對假病毒的影響。圖7八種siRNA序列對應(yīng)的復(fù)合物藥物對假病毒的抑制率。圖8復(fù)合物藥物HIV-T3對HIV病毒的抑制率。
實施例可以理解的是，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，其并不作為對本發(fā)明的限制。在不偏離于本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會意識到或能夠確認(rèn)，使用常規(guī)實驗，許多等同物都能應(yīng)用于本文所描述的特定步驟中。這些等同物被認(rèn)為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。實施例1轉(zhuǎn)染人工合成的siRNA成熟體本實施例將人工合成的成熟體siRNA轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，具體包括以下步驟1)設(shè)計針對HIV-I病毒基因組的siRNA序列，具體地，我們針對HIV-I基因組的 gag和tat基因的保守區(qū)域設(shè)計了 8條干擾RNA序列HIV-Gl GCCCTTCAGACAGGATCAGAAHIV-G2 :AAGCAGCCATGCAAATGTTAAHIV-G3 TCCCAGTAGGAGAAATCTAT
HIV-G4 GCAAGCTTCACAGGAGGTAAAHIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTGHIV-T2 TGGAAGCATCCAGGAAGTCAGHIV-T3 GCATCCAGGAAGTCAGCCTAAHIV-T4 TCAAAGCAACCCACCTCCCAA2)人工合成上述成熟體siRNA。3)應(yīng)用脂質(zhì)體(采用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)將 siRNA 轉(zhuǎn)染進入胚腎上皮細(xì)胞系細(xì)胞(美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，American Type Culture
8Collection, ATCC)，具體方法如下(1093T細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，美國)的高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco，美國)中，5% C02、37°C培養(yǎng)。(2)將 30 μ 1 Iipofectamine 2000 和 600pmol 的陰性對照 siRNA(隨機合成的非特異性siRNA序列)分別與Iml OPTI-MEM(Gibco，美國)混合，形成混合物A和混合物B， 室溫下放置5min。(3) 30 μ 1 lipofectamine 2000 禾口 600pmol 的 siRNA 分另Ij 與 ImlOPTI-MEM(Gibco，美國)混合，形成混合物C和混合物D，室溫下放置5min。(4)將混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。(5)將混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。 (6)將混合物E和F分別加入對照組和實驗組細(xì)胞中，補足OPTI-MEM到15ml。5 % C02、37°C 培養(yǎng)。(7)6小時后更換成正常培養(yǎng)液。(8) 24h 4 后轉(zhuǎn)染結(jié)束，收集樣品。實施例2轉(zhuǎn)染針對HIV病毒基因組的siRNA的瞬時表達載體本實施例采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建siRNA的瞬時表達載體，用于在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達siRNA，具體包括以下步驟1)設(shè)計實施例1中針對HIV病毒基因組的siRNA的表達序列；2)人工合成上述siRNA表達序列，并將合成的序列插入到siRNA真核表達載體 pcDNA6. 2GW/EmGFP-miR(invitrogen美國)中，構(gòu)建重組載體。表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖 1所示；3)將重組載體采用脂質(zhì)體法或電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進入宿主細(xì)胞細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type Culture Collection，ATCC)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的具體步驟包括(1)轉(zhuǎn)染前Mh，用胰蛋白酶消化收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞加入12孔板內(nèi)，每個孔內(nèi)加aiil已調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，使每個孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)為3X105f，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱孵育；O) 24h后細(xì)胞密度達80%左右，可以用來轉(zhuǎn)染；(3)按照Lipo-fectamindOOO脂質(zhì)體使用說明書，取3. 0 μ g用于轉(zhuǎn)染的載體加入100μ 1無血清、無抗生素的Opti-MEM液，輕輕混勻；(4)取2μ 1脂質(zhì)體加入100μ lOpti-MEM，輕輕混勻，室溫下孵育5min ； 將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的 Lipofectamine2000混合，輕輕混勻，室溫下孵育20min ； (6)將混合物加到12孔板的每個孔內(nèi)，每個孔內(nèi)加入混合物的體積為100μ 1，輕輕混勻；(7)37°C，5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 他后將含有脂質(zhì)體和質(zhì)粒的培養(yǎng)液換掉，代之以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于 37V,5% CO2，培養(yǎng)箱孵育；(8)利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，計數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為80%。電穿孔轉(zhuǎn)染法的具體步驟包括(1)細(xì)胞生長到對數(shù)期，用胰酶消化，4°C，IOOOg 離心5min ； (2)用0. 5倍體積的電穿孔液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)至3 X IO6細(xì)胞/毫升；(3) 將400 μ 1的細(xì)胞懸液(IO6-IO7細(xì)胞)內(nèi)加入30 μ 1的載體DNA，用吸管將細(xì)胞和DNA輕輕混勻；(4)將混合物加入電轉(zhuǎn)化池中，冰浴。將電轉(zhuǎn)化池移至電極間放電，1 aiiin后，取出電轉(zhuǎn)化池，冰浴，立即進行下一步操作；( 用滅菌的吸頭將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞完全培養(yǎng)液，置于含5% C02、37°C培養(yǎng)箱孵育，用于轉(zhuǎn)染效率觀察；(6)利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，并計數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，為75%。實施例3建立能夠永久表達SiRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株為了得到穩(wěn)定表達的，針對HIV病毒基因組的siRNA，本實施例通過構(gòu)建siRNA永久表達載體，將其轉(zhuǎn)染進入宿主細(xì)胞，同時通過篩選，選擇載體插入到宿主細(xì)胞基因組的永久表達克隆，將其單克隆培養(yǎng)，從而建立能永久表達siRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。具體步驟包括1)人工合成實施例1中針對HIV病毒基因組的siRNA的表達序列；2)構(gòu)建慢病毒載體將人工合成的序列分別插入慢病毒載體pLenti6. 3/ V5-DEST(inVitr0gen，美國)，構(gòu)建重組載體。載體結(jié)構(gòu)示意圖如2所示；幻慢病毒包裝將重組載體轉(zhuǎn)染四31~細(xì)胞，包裝病毒。具體包括以下步驟 1J93T細(xì)胞的培養(yǎng)；2.將合適數(shù)量的細(xì)胞接種入4X IOcm培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)；3.用包裝質(zhì)粒(Invitrogen，美國)和病毒載體共轉(zhuǎn)染；4.換液，繼續(xù)培養(yǎng)；5.收集病毒液；2000g，離心 IOmin去細(xì)胞及碎片，并過0. 45 μ m濾膜，獲得病毒原液，濃縮病毒液，重懸于400 μ 1培養(yǎng)基。6.病毒活性滴度的測定將ΗΕΚ293細(xì)胞接種96孔板，梯度稀釋病毒液，加入ΗΕΚ293細(xì)胞中，72小時后觀察帶GFP熒光細(xì)胞，計算病毒活性滴度。ΗΕΚ293細(xì)胞采用添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在5% CO2, 37°C下培養(yǎng)。4)病毒侵染及單克隆陽性克隆篩選。具體包括以下步驟1.培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)期；2.將合適數(shù)量的細(xì)胞接種入培養(yǎng)皿，過夜培養(yǎng)；3.用前期制備的慢病毒侵染細(xì)胞；4.換液，繼續(xù)培養(yǎng)；5.加抗性篩選(必要時采用流式分選陽性細(xì)胞)；挑多個單克隆篩選陽性克??；6.擴增細(xì)胞至足夠數(shù)量。實施例4分離純化載有siRNA的細(xì)胞微粒子細(xì)胞內(nèi)的siRNA可以被細(xì)胞分泌的細(xì)胞微粒子包裹，近而分泌到細(xì)胞外。通過收集細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過一系列的分離純化，就可以得到載有siRNA的細(xì)胞微粒子，即細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物。本實施例分別采用以下方法分離已轉(zhuǎn)入siRNA的細(xì)胞分泌出的載有siRNA的細(xì)胞微粒子(1)差速離心法先將培養(yǎng)細(xì)胞依次通過300g、1500g及IOOOOg離心，除去各類細(xì)胞及碎片，然后將上清超速離心IlOOOOg離心70分鐘，取沉淀便是細(xì)胞分泌的載有SiRNA 的細(xì)胞微粒子。(2)免疫吸附法將細(xì)胞特異性的抗體吸附在組織培養(yǎng)皿上或直接用免疫磁珠，將除去各類細(xì)胞及碎片后的血清/血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液直接和培養(yǎng)皿或免疫磁珠溫育(30分鐘或1小時)，不同細(xì)胞的細(xì)胞微粒子可直接被吸附和回收。(3)過濾法將除去各類細(xì)胞及碎片后的血清/血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液直接放在帶有100KD濾膜的濃縮離心管，在4000轉(zhuǎn)/分鐘進行離心，細(xì)胞微粒子將留在離心管內(nèi)被濃縮獲得。將分離得到的細(xì)胞微粒子在透射電鏡下觀察，具體包括細(xì)胞微粒子沉淀用 2. 5%戊二醛固定液在4°C固定過夜，PBS漂洗三遍，每遍10分鐘。之后用的四氧化鋨室溫固定60分鐘。固定后的樣品用10%的明膠包埋，然后在4°C用戊二醛再固定后，將樣品切成小塊(體積小于1立方毫米)。樣品用依次增高濃度的乙醇溶液脫水(30%，50%， 70%，90%，95%和100% X3)。用環(huán)氧樹脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片機切片，最后用FEI Tecnai T20透射電子顯微鏡在120kV條件下觀察。采用差速離心法分離得到的細(xì)胞微粒子的透射電鏡圖如圖3所示，顯示從培養(yǎng)細(xì)胞中分離到的細(xì)胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范圍。實施例5細(xì)胞微粒子及其載有的SiRNA組成的藥物復(fù)合物的檢定本實施例通過一系列方法檢定細(xì)胞微粒子及其載有的SiRNA組成的藥物復(fù)合物的存在。1)通過實施例1所述方法將熒光標(biāo)記的SiRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。結(jié)果如圖4所示，在熒光顯微鏡下觀察可見熒光標(biāo)記的siRNA(箭頭所指亮點)已經(jīng)轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞?；猛ㄟ^實施例4所述方法分離鑒定轉(zhuǎn)染過熒光標(biāo)記的siRNA的供體細(xì)胞分泌的細(xì)胞微粒子。結(jié)果如圖3所示，可見分離得到的細(xì)胞微粒子從形態(tài)、大小、膜結(jié)構(gòu)等方面均符合細(xì)胞微粒子的特點(所述特點參見Thery，C.，Zitvogel，L.，and Amigorena，S. (2002). Exosomes !composition, biogenesis andfunction.Nat Rev Immunol 2,569-579. Cocucci,E.，Racchetti,G. & Meldolesi,J. Shedding microvesicles :artefacts no more. Trends Cell Biol 19，43-51 (2009))。3)通過流式細(xì)胞方法檢測分離純化并鑒定為細(xì)胞微粒子的顆粒中是否包裹有 siRNA,即是否組成了細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物，結(jié)果如圖5所示。由于siRNA是被熒光標(biāo)記的，如果細(xì)胞微粒子中含有siRNA，那么，細(xì)胞微粒子也一定能被熒光標(biāo)記。因此，我們采用流式細(xì)胞方法檢測細(xì)胞微粒子所帶的熒光狀況。由圖5可見，有大量細(xì)胞微粒子攜帶有熒光(圖5豎線以右部分)，證明細(xì)胞微粒子中包裹有siRNA，也即證明了細(xì)胞微粒子-siRNA藥物復(fù)合物的存在。實施例6應(yīng)用細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物在體外抑制HIV假病毒HIV假病毒為用其他低危害病毒外殼蛋白包裹HIV病毒基因組而構(gòu)成的模擬HIV 病毒作用方式，但危害性遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低的仿HIV病毒。一般制造HIV假病毒的方法包括構(gòu)建表達HIV基因的重組表達質(zhì)粒和表達其他低危害病毒，如皰疹性口炎病毒的殼G糖蛋白基因的重組表達質(zhì)粒，將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，獲得假型慢病毒。本實施例通過檢測細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物對于HIV假病毒的抑制作用， 為復(fù)合物藥物對艾滋病的治療效果提供支持。具體實驗步驟包括1)按照實施例3的方法構(gòu)建永久表達siRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株；2)按照實施例4的方法分離純化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌的載有siRNA的細(xì)胞微粒子，即細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物；3)將復(fù)合物藥物加入到感染了 HIV假病毒的Hela(CD4-LTR/ β -Gal)細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type Culture Collection,ATCC)中。 Hela細(xì)胞采用添加了 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，在5% C02，37°C下培養(yǎng)；4)檢測病毒滴度，分析復(fù)合物藥物對HIV假病毒的抑制作用。結(jié)果如圖6所示，縱坐標(biāo)顯示了 HIV假病毒在四31~細(xì)胞中的含量。將完全不加病毒的空白細(xì)胞作為對照(橫軸1代表的柱子)，將其值設(shè)為1 ；單加入病毒而不采取任何治療措施的細(xì)胞(橫軸2代表的柱子)中的假病毒含量是對照細(xì)胞的16倍多。然而，加入細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物作為治療手段，宿主細(xì)胞內(nèi)的假病毒含量就大量減少。從結(jié)果可見，加入藥物(橫軸5、6代表的柱子)后，宿主細(xì)胞內(nèi)的假病毒已降低到40%左右(橫軸 6代表的柱子)。更重要的是，增加藥物的用量(橫軸5代表的柱子)，宿主細(xì)胞內(nèi)的HIV假病毒甚至被完全抑制，HIV假病毒的含量下降到和不加假病毒組(橫軸1代表的柱子)相同的水平。另外，為了確定細(xì)胞微粒子-SiRNA復(fù)合物藥物對HIV假病毒的抑制作用是由于siRNA，而不是細(xì)胞微粒子造成的，我們還向HIV假病毒感染的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了不含 siRNA的細(xì)胞微粒子作為另一個對照(橫軸3代表的柱子)。從結(jié)果可以看出，僅細(xì)胞微粒子無法對HIV假病毒產(chǎn)生抑制作用，也證明了產(chǎn)生病毒抑制作用不是細(xì)胞微粒子而是 siRNA本身。同時，我們還加入了一種短肽類的抗艾滋病藥物作為陽性對照(橫軸4代表的柱子)。由結(jié)果可以看出，這種藥物也只能將HIV假病毒含量降低到50%左右。因此，可以看出細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物與常規(guī)治療艾滋病的藥物相比，其作用效率更高，抑制假病毒的效果更好。實施例1中所有8種siRNA序列對應(yīng)的復(fù)合體藥物對HIV假病毒的抑制效果如圖 7所示。由圖可見，所有藥物對HIV假病毒的抑制率都達到60%以上，有的甚至達到86%。 同時，所有藥物對假病毒的抑制率都隨著藥物濃度的降低而下降。這一結(jié)果證明了，本實施例中8種細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物對HIV假病毒有非常強的抑制作用，同時這一作用是濃度依賴性的，并不是偶然和隨機的現(xiàn)象。實施例7應(yīng)用細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物在體外抑制HIV-I病毒本實施例檢測了 siRNA序列HIV-T3對應(yīng)的復(fù)合物藥物對HIV-I病毒的抑制作用。具體實驗步驟包括1)按照實施例3的方法構(gòu)建永久表達siRNA序列HIV-T3的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株；2)按照實施例4的方法分離純化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌的載有siRNA的細(xì)胞微粒子，即細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物；幻將復(fù)合物藥物加入到感染了 HIV-I病毒的T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞(ATCC)中，Jurkat細(xì)胞采用添加了 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基 (Gibco，美國)，在5% C02，37°C下培養(yǎng)；4)檢測病毒滴度，分析復(fù)合物藥物對HIV病毒的抑制作用。結(jié)果如圖8所示。由結(jié)果可見，siRNA序列HIV-T3對應(yīng)的復(fù)合物藥物對HIV-I病毒有非常強的抑制作用。當(dāng)加入藥物原液時(橫軸1所對應(yīng)的柱子)，藥物對HIV-I病毒的抑制率可以達到95. 95%，而當(dāng)藥物以2倍梯度稀釋(橫軸2-6對應(yīng)的柱子)時，其對HIV-I 病毒的抑制率也隨之降低。本結(jié)果更進一步證明了細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物藥物在細(xì)胞外對HIV病毒的抑制作用，為該藥物的后期開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)上述方法，本發(fā)明人證明上述細(xì)胞微粒子-siRNA復(fù)合物可以作為藥物，對 HIV病毒起到抑制作用。其作用原理為針對HIV病毒基因組的siRNA可以通過細(xì)胞微粒子高效、特異性的進入受到HIV病毒感染的靶細(xì)胞，通過siRNA介導(dǎo)的，對病毒基因組特異性的切割作用，從而起到抑制病毒的作用。運用siRNA進行疾病治療的優(yōu)勢在于siRNA是通過和其靶基因配對作為識別信號，招募沉默復(fù)合體對其目的基因進行特異性切割而發(fā)揮作用的。siRNA藥物作用的靶點只有其靶基因，而不會干擾生物體內(nèi)其他基因的正常表達，因此，其具有較高的特異性和較小的副作用。應(yīng)用SiRNA治療艾滋病更具有其特有的優(yōu)勢，由于HIV病毒基因組為外源進入人體的核糖核酸，因此，SiRNA藥物對HIV病毒的抑制完全不會影響到人體其他細(xì)胞的正常生理功能，因此不會對人體造成傷害。 同時，應(yīng)用細(xì)胞微粒子作為載體運送SiRNA的優(yōu)勢在于首先，細(xì)胞微粒子來源于細(xì)胞，是生物體本身存在的，從而可以克服目前人工合成的藥物載體對細(xì)胞的毒性以及對身體的損害；其次，將siRNA包裹進入細(xì)胞微粒子的過程中所應(yīng)用的各種技術(shù)手段都很容易實現(xiàn)，同時包裹效率很高，這在一定程度上加大了其實際應(yīng)用的潛力；更重要的是細(xì)胞微粒子是具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)，外膜和細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)類似，可以通過和細(xì)胞膜融合、 胞吞作用進入細(xì)胞。同時，由于細(xì)胞微粒子也攜帶有一些有助于RNA干擾作用的蛋白質(zhì)，因此可以提高siRNA的作用效率。如果應(yīng)用病人自身組織或細(xì)胞的原代培養(yǎng)物分泌的細(xì)胞微粒子包裹siRNA還可減少免疫排斥并進一步提高細(xì)胞微粒子攜帶siRNA進入生物體的效率?；谝陨蟽?yōu)勢，細(xì)胞微粒子作為載體運送siRNA作為藥物將會在藥物開發(fā)及臨床疾病的預(yù)防和治療中起到重要的作用。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性SiRNA的復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述細(xì)胞微粒子來自人或動物的供體細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述供體細(xì)胞包括細(xì)胞系、原代細(xì)胞培養(yǎng)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述細(xì)胞微粒子為生物囊泡結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中抗HIV特異性siRNA包裹于細(xì)胞微粒子中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中細(xì)胞微粒子的平均粒徑為10-500納米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中細(xì)胞微粒子包括exosome和sheddingvesicle。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中抗HIV特異性siRNA包括針對HIV基因組，并能導(dǎo)致 HIV基因組特異性降解的siRNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的復(fù)合物，其中抗HIV特異性siRNA的序列選自i.HIV-Gl :GCCCTTCAGACAGGATCAGAAii.HIV-G2 :AAGCAGCCATGCAAATGTTAAiii.HIV-G3 TCCCAGTAGGAGAAATCTATAiv.HIV-G4 :GCAAGCTTCACAGGAGGTAAAv.HIV-Tl :AGATCCTAGACTAGAGCCCTGvi.HIV-T2 TGGAAGCATCCAGGAAGTCAGvii.HIV-T3 :GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA ；禾口viii.HIV-T4 :TCAAAGCAACCCACCTCCCAA。
10.細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性siRNA的復(fù)合物在制備用于治療艾滋病或HIV感染的藥物中的用途。
11.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-9中任一項所述的細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性 siRNA復(fù)合物。
12.制備權(quán)利要求1-9中任一項所述的細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性siRNA復(fù)合物的方法，包括下列步驟將抗HIV特異性siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，優(yōu)選應(yīng)用轉(zhuǎn)染成熟體siRNA方法或轉(zhuǎn)染siRNA瞬時表達載體方法或建立siRNA永久表達細(xì)胞株方法；分離細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性siRNA復(fù)合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多種分離細(xì)胞微粒子-抗HIV特異性siRNA復(fù)合物。
14.一種治療艾滋病的方法，包括將權(quán)利要求1-9中任一項所述的細(xì)胞微粒子-抗 HIV特異性siRNA復(fù)合物引入受體或受體細(xì)胞內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述受體包括艾滋病患者或HIV病毒感染者。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，所述受體細(xì)胞包括被HIV感染的細(xì)胞系或細(xì)胞株或艾滋病患者及HIV感染者自身組織/細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療艾滋病的藥物，其在細(xì)胞微粒子上攜有抗HIV特異性的siRNA。本發(fā)明還涉及所述藥物的制備方法。
文檔編號A61P31/18GK102260667SQ20101060150
公開日2011年11月30日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者張辰宇, 曹鳴輝, 曾科, 李麗明, 顧宏偉 申請人:張辰宇