專利名稱：一種減毒活疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，尤其涉及一種減毒活疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(enterohermorrhangicE. coli，EHEC)0 157:H7 (EHEC0157)是 一種重要的人畜共患傳染病病原，其感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。自1982年該菌首 次被確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌以來，全球很多國家和地區(qū)包括中國都多次爆發(fā)流行。EHEC 0157感 染宿主可導(dǎo)致腹瀉、出血性腸炎、溶血尿毒綜合癥等疾病和嚴(yán)重并發(fā)癥。由于抗生素治療可 加劇感染病情的危險(xiǎn)，目前尚無有效的預(yù)防和控制措施。EHEC 0157菌培養(yǎng)容易、感染力強(qiáng)、 傳播途徑多樣，使其極有可能作為未來軍事斗爭的細(xì)菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑，EHEC 0157菌 的烈性致病因子還有可能用于基因武器的構(gòu)建。美國疾病控制中心已將其列為B類生物恐 怖病原體嚴(yán)加防范。因此，無論從公共衛(wèi)生還是生物反恐的需要出發(fā)，研制EHEC 0157疫苗， 加強(qiáng)其防控研究具有重大的戰(zhàn)略意義。EHEC 0157引起宿主嚴(yán)重的感染性疾病主要通過三個(gè)方面來實(shí)現(xiàn)的。1)志賀毒 素(Shiga toxin, Stx)志賀毒素在細(xì)胞表面受體結(jié)合介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞，抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的 合成，最終導(dǎo)致組織嚴(yán)重病理損傷，引發(fā)感染性疾?。?)EHEC0157通過表面抗原和炎癥刺 激因子(OmpA、intimin等)的作用，誘導(dǎo)腸道感染部位劇烈炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致電解質(zhì)平衡紊 亂；3)粘附與擦拭損傷(Attaching andeffacing lesions, A/E lesions):細(xì)菌緊密粘附 于腸上皮細(xì)胞表面，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的相互作用(intimin-Tir，Tir-Cortactin, TCCP-N-WASP等)，引起細(xì)菌粘附部位肌動(dòng)蛋白的聚集，導(dǎo)致微絨毛破壞、刷狀緣損傷等腸 上皮細(xì)胞特征性病例改變，細(xì)胞屏障功能破壞，引發(fā)感染性疾病。OmpA、htimin和Stx2B為腸出血性大腸桿菌0157:H7的重要致病因子，同時(shí) 也是細(xì)菌的保護(hù)性抗原，目前已經(jīng)有證據(jù)表明體內(nèi)的抗OmpACTorres AG, Kaper JB et al.Infect Immun 2003 Sep ；71 (9) :4985-95.)、抗intimin(Gu,J. , Y. Liu,etal. _Microbes Infect 2009 11(10-11) :835-841)禾口 抗 Stx2B(Ma，Y.，X. Mao，et al. Immunol Lett 2008121(2) :110-115.)的抗體能夠保護(hù)致死劑量的腸出血性大腸桿菌0157:H7的感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種減毒活疫苗，其保藏號(hào)為CCTCC M 2010185。所述減毒活疫苗，包含腸出血性大腸桿菌0157:H7的抗原。所述抗原具有抗原OmpA、Intimin和Mx2B。減毒活疫苗在制備預(yù)防腸出血性大腸桿菌0157:H7感染的制劑中的應(yīng)用。所述應(yīng)用中的減毒活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的抗OmpA、Intimin和Mx2B的抗體。EHEC 0157菌本身培養(yǎng)方便，經(jīng)濟(jì)。在經(jīng)保藏號(hào)為CCTCC M 2010185的減毒活疫苗 免疫的小鼠血清中檢測(cè)到明顯的抗腸出血性大腸桿菌0157:H7菌株的抗體，且小鼠經(jīng)過強(qiáng) 毒株攻毒時(shí)具有一定的保護(hù)性。
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本發(fā)明所述的減毒活疫苗菌株制備方便，本身帶有腸出血性大腸桿菌0157:H7的 全部抗原，能夠刺激系統(tǒng)性抗腸出血性大腸桿菌0157:H7免疫反應(yīng)，具有較好的保護(hù)性效果。本發(fā)明所述的減毒活疫苗已于2010年7月23日保藏，其保藏號(hào)為CCTCCN0 M2010185 ；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大 學(xué)；分類命名腸出血性大腸桿菌 EHEC0157:H700B015 (Enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC 0157:H700B015)
具體實(shí)施例方式下面提供的實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1腸出血性大腸桿菌0157:H7菌株00B015(保藏號(hào)為CCTCC M 2010185) 刺激的免疫反應(yīng)1實(shí)驗(yàn)方法1)腸出血性大腸桿菌0157:H7菌株00B015的分離鑒定腸出血性大腸桿菌0157:H7菌株00B015分離自江蘇疾控中心普通腹瀉病人，其分 離和鑒定的方法參照《全國腸出血性大腸桿菌0157:H7區(qū)監(jiān)測(cè)方案(試行)》執(zhí)行，菌種保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2010185。2)將20只6周齡Balb/c小鼠平均分為2組，每組10只，各組小鼠在口服接種前， 禁食一夜，禁水4h。先給予3%碳酸氫鈉溶液300ul灌胃，中和胃酸，防止胃酸對(duì)菌株的破 壞，20min后，取300ul上述制備好的菌液喂飼各組小鼠(約1 X IO9CFU/只)，30min后給小 鼠恢復(fù)進(jìn)食。0、14、28d各喂飼一次，共3次。分別在喂飼前，喂飼2次和喂飼3此后7天從 尾靜脈采取小鼠血清，保存-80°C備用。3)ELISA檢測(cè)喂飼后小鼠血清中抗腸出血性大腸桿菌主要免疫原OmpA、Intimin 和Mx2B的抗原特異性IgG水平按照文獻(xiàn)的方法制備純化的免疫原OmpA、Intimin和Stx2B (Torres AG, Kaper JB et al. Infect Immun 2003 Sep ；71 (9) :4985-95, Gu, J. , Y.Liu, et al. _MicrobesInfect 2009 11(10-11) :835-841)。從小鼠尾靜脈采集靜脈血，1 100開始以生理鹽水倍比稀釋 待檢血清，按100 μ 1/孔加入相應(yīng)抗原蛋白包被的ELISA板，37°C放置lh，PBS-Tween20洗4 次，100 μ 1/孔加入HR標(biāo)記的羊抗鼠IgG(l 20000)，37°C放置lh, PBS_Tween20洗4次， 加入OPD底物顯色液，室溫避光反應(yīng)15min，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，以PBS孔作空白對(duì)照， 492nm測(cè)定各孔OD值。OD樣品與OD _之比彡2. 1者為陽性。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果三次口服后小鼠血清抗OmpA抗體的變化
權(quán)利要求
1.一種減毒活疫苗，其保藏號(hào)為CCTCC M 2010185。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒活疫苗，其特征在于，包含腸出血性大腸桿菌0157:H7的 抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的減毒活疫苗，其特征在于，所述抗原具有抗原OmpA、Intimin 和 Stx2B0
4.權(quán)利要求1所述的減毒活疫苗在制備預(yù)防腸出血性大腸桿菌0157:H7感染的制劑中 的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的減毒活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的抗 OmpA、Intimin 禾口 Stx2B 的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種減毒活疫苗及其應(yīng)用。該減毒活疫苗的保藏號(hào)為CCTCC M2010185。其為無毒的腸出血性大腸桿菌O157:H7菌株，含有腸出血性大腸桿菌O157:H7的抗原。本發(fā)明所述的減毒活疫苗菌株可以用于制備預(yù)防腸出血性大腸桿菌O157:H7感染的制劑。本發(fā)明所述的減毒活疫苗菌株制備方便，本身帶有腸出血性大腸桿菌O157:H7的全部抗原，能夠刺激系統(tǒng)性抗腸出血性大腸桿菌O157:H7免疫反應(yīng)，具有良好的保護(hù)性效果。
文檔編號(hào)A61K39/02GK102114241SQ20101029214
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者朱鳳才, 毛旭虎, 鄒全明, 顧江 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)