專利名稱：F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腮腺炎減毒活疫苗，更具體地說，本發(fā)明涉及將腮腺炎患兒 咽漱液標(biāo)本中分離出腮腺炎病毒，適應(yīng)于人二倍體細(xì)胞(KMB17株)并進(jìn)行蝕 斑克隆及減毒傳代，得到的腮腺炎減毒毒種。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該毒種的 用途。
背景技術(shù)：
腮腺炎病毒(mumpsvirus,MuV)是引起流行性腮腺炎.的病原體。腮腺 炎病毒屬于副黏病毒科，基因組為不分節(jié)段的單負(fù)鏈核糖核酸(RNA)，含有 大約15500個(gè)核苷酸，在兩端序列之間按3' -NP-P-M-F-SH-HN-L-5'.的順序 排列著編碼7種病毒蛋白的基因。其中，SH基因的變異程度是最大的，因此 一般選用SH基因作為分型依據(jù)。依據(jù)SH抗原上核苷酸的差異，腮腺炎病 毒可分為A-L共12個(gè)基因型。我國(guó)作為一個(gè)大量使用腮腺炎減毒活疫苗的地區(qū)，其疫苗毒株除來自 國(guó)外的成品苗外，主要使用囯際通用Jeryl-Lynn株培育得到的S79株。因而 病毒基因型均屬于國(guó)外流行的A基因型。隨著近年來國(guó)內(nèi)在腮腺炎流行毒株 方面的分子流行病學(xué)分析的深入，曰益增加的資料均表明，目前在我囯流行 的腮腺炎病毒株主要為F基因型。國(guó)內(nèi)外的研究資料均表明，雖然不同基因 型的腮腺炎減毒活疫苗可針對(duì)其它基因型別的腮腺炎病毒產(chǎn)生交叉性抗原 護(hù)作用，但這種基因型之間的抗原交叉性是有限的，有時(shí)即可表現(xiàn)為不能抵 抗其它基因型別病毒的感染，從而再次感染腮腺炎病毒。同時(shí)，在許多針對(duì) 該疫苗使用后副反應(yīng)的分析資料及該病毒的流行病學(xué)資料亦提示，某些毒株 和基因型具有神經(jīng)毒性，例如，已報(bào)道的資料表明C、 D、 G、 H、 I、 J基因型具有明確的神經(jīng)毒性，但F基因型至今尚無報(bào)道涉及其神經(jīng)毒性。因此，從 這兩個(gè)意義上看，針對(duì)我國(guó)目前腮腺炎流行發(fā)病率仍然屬于丙類傳染病前列的實(shí)際情況，分離及研究開發(fā)具有主要流行傾向并具有較好免疫原性的F基因型減毒疫苗毒株，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。其次，目前常規(guī)使用的S79株及Jeryl - Lynn株減毒活疫苗均為雞胚細(xì)胞 上制備，在使用過程中，有引起由于異源性細(xì)胞基質(zhì)所帶來過敏反應(yīng)等副作 用的可能。同樣，無論從理論上還是應(yīng)用上看，使用人源性細(xì)胞基質(zhì)(人二 倍體細(xì)胞)進(jìn)行適應(yīng)性傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)而制備的腮腺炎減毒毒種，可以避免釆 用雞胚細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)可能帶來的危害，將具有更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)目前使用的腮腺炎減毒活疫苗基因型(A基因型) 與流行株基因型(F基因型)不相匹配的不足之處，提供一種F基因型腮腺 炎減毒毒種。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。在對(duì)國(guó)內(nèi)多年腮腺炎流行毒株分析的工作基礎(chǔ)之上，收集了發(fā)生在云南 省紅河州石屏縣牛街鎮(zhèn)他臘希望小學(xué)學(xué)生群體中的腮腺炎流行的患兒咽漱 液，利用常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)方法，采用Vero細(xì)胞從腮腺炎患兒咽漱液標(biāo) 本中分離腮腺炎病毒，經(jīng)常規(guī)RT-PCR方法全基因測(cè)序后，明確其為當(dāng)前 流行基因型一一F基因型。之后將該分離毒種按常規(guī)方法適應(yīng)于人二倍體細(xì) 胞(KMB17株)并進(jìn)行蝕斑克隆及減毒傳代，得到F基因型腮腺炎減毒毒 種一一SP-A株。并按國(guó)家及WHO相關(guān)規(guī)程要求對(duì)其進(jìn)行了全面的檢定， 明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的安全性，并且具有優(yōu)于普通腮腺 炎減毒毒種的免疫效力。適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發(fā)。本發(fā)明還提供了上述F基因型腮腺炎減毒毒種一一SP-A株的基因序 列，該序列具有序列表所述的核苷酸序列。


圖1是分離毒株基因序列的系統(tǒng)分析。圖2是所述的第4代以后的病毒已適應(yīng)于KMBn細(xì)胞，接種5 - 6天后 出現(xiàn)典型病變效果的圖。其中，A為分離毒株在KMB—17細(xì)胞上的病變情 況，B為KMB—17細(xì)胞對(duì)照。圖3是不同代次，不同免疫劑量病毒免疫后的中和抗體反應(yīng)情況。
具體實(shí)施方式
在下面的實(shí)施例中，將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作具體詳細(xì)的描述，但這并不 是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。*除非另有說明，本發(fā)明中所釆用的百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。 實(shí)施例1一一咽漱液標(biāo)本的采集在患者感染的7 ~ 14天之內(nèi)，使用咽拭子收取腮腺炎患者口腔頰壁粘膜 的分泌物及咽漱液，懸于pH7.2無菌磷酸鹽溶液中。將該收集物經(jīng)4'C保存 運(yùn)輸，在24小時(shí)內(nèi)保證其存活；若置于-20'C，可保持病毒在3個(gè)月內(nèi)存活。 *本發(fā)明所描述的腮腺炎病毒的分離方法為常規(guī)傳統(tǒng)的腮腺炎病毒分 離方法，可適用于任意腮腺炎患者的病毒分離，為常用的經(jīng)典病毒分離方法。 從任意一例腮腺炎患者中均可分離到腮腺炎病毒，所屬基因型可能不同，但 由于國(guó)內(nèi)流行基因型為F型，因而分離到的腮腺炎病毒應(yīng)以F基因型為主。所有分離到的任意腮腺炎病毒基因型都具有如下生物學(xué)特征a.在被感染者出現(xiàn)癥狀的7-14天之內(nèi)，腮腺炎病毒均在患者的口腔大量存在。因此使用咽拭子收取口腔頰壁粘膜的分泌物(懸于無菌磷酸鹽溶液(pH7.2)中)及口腔漱液(其為磷酸鹽平衡液(PHL2))均可獲取。同時(shí)， 該收集物經(jīng)4。C保存運(yùn)輸，在24小時(shí)內(nèi)保證存活；若置于-20'C，可保持病 毒在3個(gè)月內(nèi)存活。b.各種基因型的腮腺炎病毒在從患者口腔分離后，按上述方法保存移至 實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過孔徑為0.2jLim的除菌濾器除菌后，均可用于細(xì)胞培養(yǎng)物上增 殖。所有基因型的腮腺炎病毒均具有在Vero細(xì)胞、人胚肺細(xì)胞等細(xì)胞上適 應(yīng)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，并可以在這些細(xì)胞上穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)。 一般經(jīng)3-5代 的傳代生長(zhǎng)，即可達(dá)到105°CCID50/ml的產(chǎn)量。并通常在接種量達(dá) 1(TCCID50/ml/25cm2細(xì)胞生長(zhǎng)物時(shí)，可在7-8天之內(nèi)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、腫脹、壞死等)。 實(shí)施例2一一采用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)腮腺炎病毒 將收集的腮腺炎患者咽漱液經(jīng)過孔徑為0.2 Mm的除菌濾器除菌后，接 種于Vero細(xì)胞。具體操作如下采用0.25。/。胰酶-0.01。/。EDTA消化已形成單 層的P148代Vero細(xì)胞，待細(xì)胞經(jīng)消化形成單個(gè)后，以DMEM-8%BCS重懸 細(xì)胞，稀釋至1()S。細(xì)胞/ml。按"10"細(xì)胞/瓶接種小方瓶，37。C培養(yǎng)3-4天 后，將腮腺炎患兒咽漱液接種于細(xì)胞單層，37。C吸附30分鐘，隨后加入含1。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，3:rc培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變(表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、腫脹、壞死等)。至7 ~ 8天出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收獲培養(yǎng)物后繼續(xù)同法接種Vera細(xì)胞傳代 至第5代。微量滴定表明，在1 5代病毒傳代過程中，病毒的滴度范圍在4.2-5.21ogCCID5。之間。呈上升趨勢(shì)。 實(shí)施例3一一病毒全基因測(cè)序確定基因型采用常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、CDNA質(zhì)粒構(gòu)建。具體方法如下 Vero細(xì)胞上培養(yǎng)的第2代病毒基因組的核酸按Qiagen標(biāo)準(zhǔn)試劑盒說明書進(jìn) 行。病毒基因RNA逆轉(zhuǎn)錄使用華美公司RT-PCR試劑盒，按說明書操作。 并根據(jù)腮腺炎病毒基因序列設(shè)計(jì)合成19個(gè)交叉片段的引物，并分段以 RT-PCR方法獲得19個(gè)CDNA基因片段，克隆入PMD18-T載體中，并逐一測(cè) 序。得到所分離毒株的全基因序列(基因庫登錄號(hào)為DQ649478)(見圖-1 )。 之后使用VectorNT16.0軟件對(duì)所分離腮腺炎病毒的SH基因及旁側(cè)核苷酸 序列進(jìn)行分析，并與囯內(nèi)上海地區(qū)分離株(Wshl和Wsh2基因登錄號(hào)分別 為Z77160和Z81005 )、蘭州地區(qū)分離株(Wlzl、 Wlz2、 Wlz3基因登錄號(hào)分 別為Z77158， Z77161, Z77159 )和英國(guó)分離株(UK99-102 x 13、 UK99-190 基因登錄號(hào)分別為AY380065、 AY380068 )的序列作同源性分析。其結(jié)果明 確顯示，所分離毒株與上述這些分離株均屬于F基因型，如圖1所示，為國(guó) 內(nèi)流行基因型。實(shí)施例4一一病毒在KMB，7細(xì)胞上的適應(yīng)傳代將上述第5代的腮腺炎病毒收獲物接種于KMB,7細(xì)胞。采用0.25%胰酶 -O. 01%EDTA消化已形成單層的廳17細(xì)胞，并以DMEM-8%BCS重懸細(xì)胞，按 106。細(xì)胞/小方瓶接種，37'C靜止培養(yǎng)至形成致密細(xì)胞單層后，接種原Vero 細(xì)胞收獲的病毒液lml (約為103-104CCID50/ml), 37。C繼續(xù)培養(yǎng)。首代僅在8-10天后出現(xiàn)少量不明顯的細(xì)胞變圓情況，待至第4代以后，病毒已適應(yīng) 于KMBn細(xì)胞，接種5-6天后即可出現(xiàn)典型病變(見圖-2)。其感染性滴度 為5. 0 1ogCCID5o/ml左右。 實(shí)施例5一一病毒的克隆純化在KMB^細(xì)胞上已適應(yīng)傳代到第5代的腮腺炎病毒收獲液，稀釋至10—3、 10—4、 10—5三個(gè)稀釋度，接種于已形成單層的KMBn細(xì)胞(六孔板)，37。C吸附 30分鐘，加入DMEM-1。/。BCS， 48小時(shí)后去除培養(yǎng)液，加入含0.8%瓊脂-DMEM,待瓊脂固化后，反置培養(yǎng)于37匸。3天后于鏡下觀察蝕斑形成情況， 并標(biāo)記相應(yīng)區(qū)域后，用巴氏管吸取蝕斑塊，置于1. 5ml離心管中，加入0. 5ml DMEM培養(yǎng)液，吹打使瓊脂塊破碎后，隨即接種于KMBn細(xì)胞單層細(xì)胞(24孔 板)，37°C培養(yǎng)7-8天。待細(xì)胞完全病變后，收獲病毒，同法再行一次純化 過程，收獲病毒繼續(xù)接種于KMBn生長(zhǎng)傳代。實(shí)施例6一一減毒毒種的制備將上述克隆純化后的病毒繼續(xù)在扁17細(xì)胞上連續(xù)傳代至30代。從而得 到適應(yīng)于KMB17細(xì)胞生長(zhǎng)的F基因型腮腺炎減毒毒種，命名為SP-A株。 隨后對(duì)相關(guān)代次的病毒收獲物按常規(guī)方法進(jìn)行減毒性狀、免疫原性、安全性 的全面分析，并與現(xiàn)行使用的A基因型腮腺炎減毒活疫苗進(jìn)行比較。實(shí)施例7一一病毒減毒性狀觀察選取減毒適應(yīng)傳代至15、 20、 30代病毒進(jìn)行致腮腺炎發(fā)病能力的觀察分析。各代次病毒按4.51ogCCID50/100ul/側(cè)劑量直接注射恒河猴腮腺，每 代次實(shí)驗(yàn)組用猴2只。同時(shí)，使用該病毒在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增至第二代的病 毒做為野毒株對(duì)照。注射病毒后，逐曰觀察動(dòng)物體溫，臨床體征等情況，并 于第11天時(shí)，活體取動(dòng)物腮腺組織進(jìn)行病理檢查。結(jié)果可見，Vero細(xì)胞上的第二代病毒組在進(jìn)行了腮腺致病性實(shí)驗(yàn)之后， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)了體溫升高， 一般狀況較差，腮腺腫大等腮腺炎病毒感染相關(guān) 的臨床癥狀體征，并且腮腺病理檢查也表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)，體現(xiàn)了腮 腺炎病毒感染的指征。15、 20、 30代三個(gè)代次實(shí)驗(yàn)組在進(jìn)行了腮腺致病性實(shí) 驗(yàn)之后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫、 一般狀況均無異常，也無腮腺腫大癥狀，腮腺病理 檢查表現(xiàn)為每組各有一只實(shí)驗(yàn)猴一側(cè)腮腺腺泡間見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，余無 異常，這應(yīng)為注射刺激后的局部反應(yīng)；綜合以上實(shí)驗(yàn)資料可見，SP-A株傳 代至第15代次，病毒已無致腮腺炎發(fā)病能力。實(shí)施例8——不同代次減毒株免疫原性分析選取第20、25、 30代的病毒收獲物，每代次設(shè)置3.5、4.5、 5.51ogCCID50/ml 三個(gè)劑量，每個(gè)劑量皮下注射3只恒河猴(體重3kg土0.5kg,年齡2-3歲， 公母各半)，同時(shí)使用麻-腮聯(lián)合疫苗(購自北京所，其腮腺炎疫苗滴度按 規(guī)程為> 4.2 1ogCCID50 )做為陽性對(duì)照，注射同樣恒河猴2只，陰性對(duì)照3 只注射DMEM0.5ml。免疫后2、 4、 8、 12周取血分離血清進(jìn)行中和抗體測(cè) 定以確定體液免疫效應(yīng)，如圖3所示。結(jié)果表明，第20代及第25代組的中 和效價(jià)優(yōu)于第30代組及麻-腮疫苗組，即具有比現(xiàn)行的A基因型雞胚細(xì)胞 生產(chǎn)的腮腺炎減毒活疫苗更好的免疫效果。篩選腮腺炎抗體陰性的恒河猴進(jìn)行免疫原性分析，于免疫后2、 4、 8周取血分離血清進(jìn)行中和抗體效價(jià)的檢測(cè)。圖中數(shù)值均為GMT土SD。如圖3 所示各組動(dòng)物的中和抗體效價(jià)均隨著免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增高趨勢(shì)；在 3個(gè)代次的實(shí)驗(yàn)組及麻-腮疫苗組中，第20代及第25代組的中和效價(jià)優(yōu)于 第30代組及麻-腮疫苗組；而在每個(gè)代次組的3個(gè)劑量組中，均表現(xiàn)為隨 著劑量的增高，中和抗體效價(jià)亦呈增高趨勢(shì)。 實(shí)施例9——病毒安全性分析釆用猴體神經(jīng)毒力方法，選取第20及25代病毒收獲物，微量法測(cè)定病 毒滴度后，按5.21ogCCID50/0.5ml/側(cè)劑量腦內(nèi)注射恒河猴，每只猴分注射 左右側(cè)注射，每代次病毒使用IO只恒河猴，陰性對(duì)照組2只恒河猴，按生 物制品規(guī)程要求進(jìn)行搡作。注射后逐日觀察實(shí)驗(yàn)猴神經(jīng)反射體征。取腦各部 位組織、進(jìn)行病理檢查。檢查內(nèi)容主要針對(duì)炎細(xì)胞分布情況和神經(jīng)元有否損 傷。結(jié)果可見，全部實(shí)驗(yàn)猴均無麻痹、嗜睡、昏迷、驚厥、上下肢震顫等神 經(jīng)系統(tǒng)癥狀。腦部各組織病理檢查也無神經(jīng)細(xì)胞損傷。因而，SP-A毒株不 具有損傷神經(jīng)細(xì)胞的毒力效應(yīng)，為安全有效的腮腺炎減毒毒株。實(shí)施例10一一病毒基因序列比較將KMBn細(xì)胞上的25代、Vero細(xì)胞上的第2代分離病毒的SH基因及其 旁側(cè)序列進(jìn)行比較，結(jié)果見表l 。雖然至今為止，尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可由明 確的基因序列變化決定腮腺炎病毒的減毒代次。但從序列比較結(jié)果而言，還是可見有5個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了基因序列的改變。因而本實(shí)驗(yàn)與以上三個(gè)實(shí)驗(yàn)(病 毒減毒性狀觀察、不同代次減毒株免疫原性分析、病毒安全性分析)共同作 為驗(yàn)證腮腺炎減毒毒種的指征。表l.腮腺炎病毒基因序列比較SH基因病毒代次61806297637064156483Vero2代TAGCGKMB17 25代AGATA實(shí)施例11一一三級(jí)種子代次的確定和種子庫的建立根據(jù)《中國(guó)藥典》三部通則"生物制品生產(chǎn)和檢定用菌毒種管理規(guī)程"要求，將在KMB^細(xì)胞上克隆純化后，并繼續(xù)傳代至第18代的腮腺炎病毒做 為F基因型腮腺炎減毒活疫苗原始毒種，名為SP-A株。第20代病毒做為 主種子庫，第24代病毒做為工作種子分別建庫。三級(jí)種子庫均按《腮腺炎 減毒活疫苗(SP-A株)制造及檢定規(guī)程》(草案)的要求進(jìn)行全面檢定，凍 存于-7(TC冰箱。優(yōu)勢(shì)比較結(jié)果如表2所示。表2.優(yōu)勢(shì)比較:流行基因型細(xì)胞基質(zhì)免疫原性安全性SP-A株是(F基因型)人二倍體細(xì)胞優(yōu)安全現(xiàn)行使用株否(A基因型)雞胚細(xì)胞(異源性)良安全根據(jù)《中國(guó)藥典》的要求檢測(cè)明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的 安全性，并且其具有優(yōu)于優(yōu)于目前國(guó)內(nèi)使用的腮腺炎減毒毒種的免疫效力， 適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發(fā)的新型毒種。序列表 SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所<120> F基因型腮腺炎減毒毒種SP-A株SH基因及旁側(cè)序列<130> 1<140> 20071227 <141> 2007-12-27<160> 1< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 455<212> DNA<213> Mumps virus<400> 1tcaacacaat atcaagtagt gtcgatgatc tcatcaggta ctaatcctaa cattgtgatt 60cttcctacat tgagaaaaga tttagaaaaa aaccaaatta agaatgaagc tcctggggtc 120gtaacgtctc gtgaccctgc cgttgcacta tgccggcaat ccaccctccc ttctacctaa 180 catttctatt gctaattctt cttcatctga tcataacttt gtatgtctgg attatgttaa 240ccattactca cgagactgcg gtgcaacatg cagcattgta ccagagatcc ctctttcgtt 300ggagtttcga tcactcactc tagaacgatc tccaacccgg acaagtccca atccatcatg 360 ggaggacaag ctgcattcaa atgatgctgc tcaatcatga gacataaaga aaaaagcagg 420 ccagaacaaa ctcaggatca caatacaaca cagaa 45權(quán)利要求
1.一種F基因型腮腺炎減毒毒種，其特征在于該毒種具有序列表所述的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述的F基因型腮腺炎減毒毒種在制備腮腺炎減毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途。本發(fā)明收集腮腺炎流行地區(qū)的患兒咽漱液，利用常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)方法，采用Vero細(xì)胞從腮腺炎患兒咽漱液標(biāo)本中分離腮腺炎病毒，經(jīng)常規(guī)RT-PCR方法全基因測(cè)序后，明確其為當(dāng)前流行基因型——F基因型之后，將該分離毒種按常規(guī)方法適應(yīng)于人二倍體細(xì)胞(KMB17株)并進(jìn)行蝕斑克隆及減毒傳代，得到F基因型腮腺炎減毒毒種——SP-A株。并按國(guó)家及WHO相關(guān)規(guī)程要求對(duì)其進(jìn)行了全面的檢定，明確SP-A株具備普通腮腺炎減毒毒種的安全性，并且具有優(yōu)于普通腮腺炎減毒毒種的免疫效力。適宜作為腮腺炎減毒疫苗研究開發(fā)。
文檔編號(hào)C12N7/04GK101215552SQ20081005803
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日
發(fā)明者劉龍丁, 史長(zhǎng)軍, 崔平芳, 李琦涵, 燕 梁, 王麗春, 董承紅, 謝忠平, 馬紹輝 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所