專利名稱：包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的制劑及其制備和應(yīng)用方法，具體是一種包載硫酸 長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
長春新堿為夾竹桃科植物長春花中提取的有效成分。其游離形式極不穩(wěn)定，因此 常以其硫酸鹽形式(vincristine sulfate, VCR)存在。抗腫瘤作用靶點(diǎn)是微管，在細(xì)胞周 期S期，VCR與微管蛋白結(jié)合，從而使中期細(xì)胞分裂停止，導(dǎo)致有絲分裂中的細(xì)胞群體明顯 增加，使細(xì)胞分裂停止于M期，因此是M期細(xì)胞周期特異性藥物。還可干擾蛋白質(zhì)代謝及抑 制RNA多聚酶的活力，并抑制細(xì)胞膜類脂質(zhì)的合成和氨基酸在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)。臨床上主 要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤，也用于乳腺癌、支氣管肺癌、 軟組織肉瘤及神經(jīng)母細(xì)胞等，但VCR對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及注射局部正常組織刺激性大，劑量限制 性毒性是神經(jīng)系統(tǒng)毒性，在臨床上需嚴(yán)格控制給藥劑量，因而大大限制了其在臨床上的使 用。諸多研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于目前的VCR注射液，載VCR的脂質(zhì)體可明顯減輕VCR的毒副 作用，如通過提高VCR對(duì)腫瘤細(xì)胞的被動(dòng)靶向作用，減小對(duì)正常組織的損傷，從而達(dá)到提高 抗腫瘤療效的目的。但是這些脂質(zhì)體缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用，因而毒副作用依然 明顯。葉酸受體是一種在多種癌細(xì)胞中廣泛過量表達(dá)且能和葉酸分子高度識(shí)別并結(jié)合的物 質(zhì)。利用葉酸和葉酸受體特有的相互作用，人們將葉酸作為常用的靶向分子修飾在納米尺 寸的抗腫瘤藥物載體表面，以期達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的高度靶向作用，從而提高藥物的抗腫瘤 效果。本發(fā)明的目的之一即以葉酸作為靶向基團(tuán)，修飾在PLGA-PEG納米粒的表面，達(dá)到主 動(dòng)靶向的目的。然而，細(xì)胞膜作為細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障，在保證細(xì)胞 內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，使各種生化反應(yīng)能夠有序運(yùn)行的同時(shí)，卻阻止了細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì) 胞，比如將抗腫瘤藥物排斥在細(xì)胞膜外，是導(dǎo)致這類藥物抗腫瘤療效不佳的一個(gè)重要原因。 為了解決這一難題，人們在給藥系統(tǒng)中引入了細(xì)胞穿透肽。實(shí)驗(yàn)表明，在納米粒給藥系統(tǒng)的 聚合物載體表面修飾以細(xì)胞穿透肽，如寡聚精氨酸后，可顯著增強(qiáng)藥物的吸收。雖然人們對(duì) 細(xì)胞穿透肽如何攜帶納米粒穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但是細(xì)胞穿 透肽這種特殊的功能越來越弓I起了人們的重視。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，有幾種PEG化的硫酸長春新堿脂質(zhì)體(Rodriguez Μ. Α. ， Pytlik R. ， Kozak Τ. ， et al. Cancer 2009,115 3475-3482 ；Thomas D.Α. ， Sarris Α. H.，Cortes J.，et al. Cancer 2006，106 :120_127)已進(jìn)入臨床前實(shí)驗(yàn)階段，雖然該類脂 質(zhì)體在體內(nèi)能達(dá)到長循環(huán)的效果，但是粒徑較大，一般在500nm以上，有的粒子粒徑高達(dá)幾 十乃至上百微米，而且粒徑分布很寬。如此大的顆粒進(jìn)入體內(nèi)后，由于缺乏血管通透性，很 容易直接被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而難以到達(dá)腫瘤部位，導(dǎo)致其靶向性不高，因而相對(duì)于傳統(tǒng) 的硫酸長春新堿注射液，療效并無顯著提高(Tokudome Y.，Oku N.，Doi K.，et al. Biochim. Biophys. Acta. 1996，1279 :70_74)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種包載硫酸長春新堿的雙功能納米 粒制劑的制備和應(yīng)用方法，采用復(fù)乳法制備包載硫酸長春新堿的PLGA-PEG納米粒，制備的 葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG雙功能納米粒粒徑287. 2士0. 8nm，具有較高載藥量和包 封率，以及良好的穩(wěn)定性。與硫酸長春新堿水溶液，非修飾的PLGA-PEG納米粒及葉酸修飾 的PLGA-PEG納米粒相比，該雙功能納米粒在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的性能。因而，葉酸/細(xì)胞穿 透肽修飾的PLGA-PEG雙功能納米載體是一種較為理想的藥物載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，通過復(fù)乳法 將硫酸長春新堿包封于葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG聚合物載體中，制得雙功能納米 粒制劑。所述的葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG聚合物載體由PLGA_mPEG、葉酸修飾的 PLGA-PEG(PLGA-PEG-folate)以及七聚精氨酸修飾的 PLGA-PEG(PLGA-PEG-R7)組成。所述的七聚精氨酸的化學(xué)式為r7-nh2,即末端羧基以氨基封閉。所述的葉酸修飾的PLGA-PEG以及七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG中，PEG的重均分 子量1000 5000Da，PLGA的重均分子量8000 50000Da。所述的葉酸修飾的PLGA-PEG以及七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG分別通過以下方式 制備得到從HO-PEG-OH出發(fā)，合成聚合物PEG 二氨基化物(nh2-PEG-nh2)；以三氯甲烷為溶 齊IJ，N-羥基琥珀酰亞胺(nhs)為活化試劑，加入縮合劑，使nh2-PEG-nh2與PLGA-C00H軛合， 得到 PLGA-PEG-Nh2 ；將丁二酸酐(succinic anhydride)與 PLGA_PEG_nh2 縮合，所得產(chǎn)物丁 二酸修飾的PLGA-PEG(PLGA-PEG-succinate)，再與R7-nh2縮合，得到細(xì)胞穿透肽修飾的載 體PLGA-PEG-R7。以三氯甲烷為溶劑，nhs為活化試劑，加入縮合劑，使PLGA-PEG-Nh2與葉酸 軛合，得到 PLGA-PEG-folate ο所述的PLGA-C00H、NHS以及縮合劑的摩爾比為1/5/5 1/10/10 ；所述的復(fù)乳法是指將硫酸長春新堿溶于三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)緩沖液后，在超聲冰浴條件下，滴加到含有PLGA-mPEG、PLGA-PEG-folate和 PLGA-PEG-R7的有機(jī)溶劑中得到初乳，在超聲冰浴條件下，將初乳滴加至含PVA的Tris-HCl 緩沖液中得到復(fù)乳，經(jīng)過攪拌旋蒸后離心低溫凍干，得到包載硫酸長春新堿的雙功能納米 粒。所述的縮合劑為n，n' - 二異丙基碳二亞胺(DIC), n, n' - 二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)或1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)；所述的硫酸長春新堿的投藥量為4 9% (w/w)；所述的PLGA-PEG-folate的質(zhì)量為PLGA-PEG-R7質(zhì)量的2倍，PLGA_mPEG的質(zhì)量為 PLGA-PEG-R7質(zhì)量的6 15倍；所述的TriS-hcl緩沖液的pH為5 7. 4 ；所述的初乳中有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯；所述的初乳中的Tris-HCl緩沖液與有機(jī)溶劑的體積比為1/10 1/30。所述的含聚乙烯醇(PVA)的Tris-HCl緩沖液是指含有0. 6 2. 5% PVA (w/v)且pH為5 7. 4的Tris-HCl緩沖液；所述的離心低溫凍干是指以15000 50000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理30分鐘后低溫
凍干；所述的低溫凍干是指添加蔗糖或山梨醇D作為凍干保護(hù)劑。本發(fā)明涉及上述納米粒的應(yīng)用方法，通過將所述納米粒的溶液放置于透析袋后置 于釋放介質(zhì)中，經(jīng)恒溫?fù)u床震蕩實(shí)現(xiàn)藥物釋放。所述的透析袋截留分子量為5000 IOOOODa ；所述的釋放介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液；所述的恒溫是指37 士 0. 5°C。


圖 1 聚合物 PLGA-PEG-folate 和 PLGA-PEG-R7 的合成路線。圖 2 聚合物 PLGA-mPEG、PLGA-PEG-folate 和 PLGA-PEG-R7 的 1HNMR 圖譜。圖3雙功能納米粒的掃描電鏡圖。圖4四種硫酸長春新堿劑型的體外釋放行為(pH 6. 8) (A)在磷酸緩沖液中的釋 放；(B)在含有EDTA的磷酸緩沖液中的釋放；(C)在Tris-HCl緩沖液中的釋放。圖5四種硫酸長春新堿劑型在大鼠體內(nèi)的血藥濃度_時(shí)間曲線。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。實(shí)施例1聚合物PLGA-PEG-folate和PLGA-PEG-R7的合成，如圖1所示，具體包括以下步 驟1)從ho-PEG-oh出發(fā)，經(jīng)過三步，合成聚合物NH2-PEG-NH2 ；2)以三氯甲烷為溶劑，nhs為活化試劑，dic為縮合劑，使nh2-peg-nh2與 PLGA-C00H軛合，得到PLGA-PEG-NH2,以上合成過程見圖IA ；3)以三氯甲烷為溶劑，DIC為縮合劑，4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，使丁二 酸酐與 PLGA-PEG-Nh2 縮合，得到 PLGA-PEG-SUCCinate ；4)以DMF為溶劑，使末端羧基以氨基封閉的七聚精氨酸(R7-NH2)與 PLGA-PEG-succinate 反應(yīng)，得到細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG (PLGA-PEG-R7) ；1HNMR見圖 2C。 在第2)步反應(yīng)中，PLGA-C00H/NHS/DIC的摩爾比為1/5/5 1/10/10。第3)和4)步合成 過程見圖IB。5)聚合物PLGA-PEG-folate的合成采用與上述相似的方法在得到PLGA_PEG_NH2 后，以三氯甲烷為溶劑，NHS為活化試劑，DIC為縮合劑，使PLGA-PEG-NH2與葉酸軛合，即得 產(chǎn)物；1HNMR見圖2B。實(shí)施例2葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG雙功能納米粒的制備，包括以下步驟
(1)將硫酸長春新堿溶于pH(5 7. 4)的Tris-HCl緩沖液中，配成濃溶液(稱為 相 I)。將三種聚合物載體 PLGA-mPEG，PLGA-PEG-folate 和 PLGA-PEG-R7 (質(zhì)量比 7/2/1)溶 解于有機(jī)溶劑(二氯甲燒，或三氯甲燒，或乙酸乙酯)中(稱為相II)。緩沖液與有機(jī)溶劑 的比例為1/10 1/30。理論上硫酸長春新堿的投藥量為4 9% (w/w)；(2)超聲，冰水浴條件下，將相I滴加到相II中，得到初乳；(3)超聲，冰水浴條件下，將上述初乳滴加到含0.6 2. 5% PVA (w/v)，pH 5 7. 4 的Tris-HCl緩沖液中，得到w/o/w的復(fù)乳；(4)室溫下攪拌，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去復(fù)乳中有機(jī)溶劑；(5)對(duì)上述(4)得到的溶液進(jìn)行高速離心(15000 50000rpm) 30分鐘，除去游離 的VCR，得到帶有藍(lán)色乳光的納米粒溶液；(6)將納米粒溶液低溫凍干，即得包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒NP3。用SEM 檢測，形貌見圖3;(7)采用相似的方法，制備PLGA-mPEG納米粒NP1，葉酸修飾的PLGA-PEG納米粒 NP2。并對(duì)以上納米粒粒徑，Zeta電位，藥物支載量和包封率進(jìn)行表征。表1為所得到的結(jié) 果?？梢?，所制備的三種納米粒粒徑在200 300nm之間，Zeta電位低于_15mV，顯示了納 米粒良好的穩(wěn)定性。表 1 實(shí)施例3葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG雙功能納米粒的釋放取雙功能納米粒的溶液0. 5mL,置于透析袋(5000 IOOOODa)，于體積為30mL釋 放介質(zhì)中(磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液)，37°C恒溫?fù)u床震蕩，定時(shí)取樣用高效液相測 定釋放介質(zhì)中VCR的含量，計(jì)算累計(jì)釋放百分率。釋放曲線見圖4。通過對(duì)樣品在兩種釋放介質(zhì)的釋放性質(zhì)的研究，結(jié)果表明，前8h，VCR在磷酸鹽緩 沖液(pH 6. 8)出現(xiàn)突釋；在8 20h，VCR呈現(xiàn)平穩(wěn)釋放；但是超過20h后，由于VCR在磷 酸鹽緩沖液中穩(wěn)定性欠佳，濃度反而緩慢下降，累計(jì)釋放隨之下降(圖4A)。但是向磷酸鹽 緩沖液中加入EDTA后，可顯著提高VCR的穩(wěn)定性，VCR在8 60h內(nèi)可平穩(wěn)釋放(圖4B)。 當(dāng)緩沖液換為Tris-HCl時(shí)，VCR也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，前期出現(xiàn)突釋，在接下來的時(shí)間內(nèi) 呈良好的釋放特性。累計(jì)釋放率達(dá)80%以上(圖4C)。這說明VCR在不同的釋放介質(zhì)中， 顯示出不同的釋放過程。實(shí)施例4體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)將不同濃度的NP3，NPl, NP2, VCR水溶液(F-VCR)分別與三種細(xì)胞株人白血病 細(xì)胞毒，人乳腺癌細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞株共孵化24h，然后用MTT檢測細(xì)胞成活率，ORIGINv8. 0 (OriginLab Corp.)軟件計(jì)算其 IC5O 值。表2為NP3，NPl, NP2, F-VCR體外對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株的IC50值。比較得到，相同 濃度下，三種納米粒形式的VCR的細(xì)胞毒性均強(qiáng)于VCR水溶液；而且，雙功能納米粒NP3具 有最低的IC5tl值，表現(xiàn)出最強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。表 2 *p < 0. 05，采用t檢驗(yàn)納米粒組與F-VCR比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析廣ρ < 0. 01，采用 t檢驗(yàn)納米粒組與F-VCR比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)施例5體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)將16只SD大鼠(200 250g)按雌雄各半隨機(jī)分為四組，尾靜脈注射VCR納米溶 液(NP1，NP2，NP3)或F-VCR溶液，給藥劑量0. 6mg/kg (以VCR計(jì))。分別于以下時(shí)刻給藥 前，5，15，30，60，120，240和480min,眼眶采血0. 25ml，肝素抗凝。全血經(jīng)肝素抗凝，3000rpm 離心15min分離血漿。乙腈沉淀處理后，HPLC檢測。血藥濃度-時(shí)間曲線如圖5，體內(nèi)藥代 動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4。表 4 *p < 0. 05，采用t檢驗(yàn)納米粒組與F-VCR比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由表4可見，納米粒組與F-VCR的主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)AUC、Cmax, Tmax, MRT和等均具有 顯著性差異(P < 0. 05)。雖然NP3，與NPl和NP2納米粒溶液的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間并沒有顯著性差異，但是，相對(duì)于F-VCR，這三種納米粒溶液卻表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)行為。在 同等劑量下，由于VCR被包載于納米粒內(nèi)核，呈緩慢釋放，因而納米粒溶液的AUC和Cl明顯 低于對(duì)照制劑F-VCR，而分布相半衰期和消除相半衰期均明顯長于F-VCR。這說明葉酸和細(xì) 胞穿透肽修飾的雙功能納米粒NP3有著良好的開發(fā)前景。
權(quán)利要求
一種包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特征在于，通過復(fù)乳法將硫酸長春新堿包封于葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA PEG聚合物載體中，制得雙功能納米粒制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特 征是，所述的葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG聚合物載體由PLGA-mPEG、葉酸修飾的 PLGA-PEG以及七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特 征是，所述的葉酸修飾的PLGA-PEG以及七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG分別通過以下方式 制備得到從HO-PEG-OH出發(fā)，合成聚合物PEG 二氨基化物；以三氯甲烷為溶劑，N-羥基 琥珀酰亞胺為活化試劑，加入縮合劑，使聚合物PEG 二氨基化物與PLGA-C00H軛合，得到 PLGA-PEG-NH2 ；將丁二酸酐與PLGA-PEG-NH2縮合，所得產(chǎn)物丁二酸修飾的PLGA-PEG，再與 R7-NH2縮合，得到七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG ；最后以三氯甲烷為溶劑，NHS為活化試劑，加 入縮合劑，使PLGA-PEG-NH2與葉酸軛合，得到葉酸修飾的PLGA-PEG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特征 是，所述的三氯甲烷、N-羥基琥珀酰亞胺以及縮合劑的摩爾比為1/5/5 1/10/10。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特征 是，所述的復(fù)乳法是指將硫酸長春新堿溶于三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液后，在超 聲冰浴條件下，滴加到含有葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG聚合物載體的有機(jī)溶劑中得 到初乳，在超聲冰浴條件下，將初乳滴加至含聚乙烯醇的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖 液中得到復(fù)乳，經(jīng)過攪拌旋蒸后離心低溫凍干，得到包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特征 是，所述的縮合劑為N，N' - 二異丙基碳二亞胺，N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法， 其特征是，所述的硫酸長春新堿的投藥量為4 9% (w/w)；所述的葉酸修飾的PLGA-PE的 質(zhì)量為七聚精氨酸修飾的PLGA-PEG質(zhì)量的2倍，PLGA-mPEG的質(zhì)量為七聚精氨酸修飾的 PLGA-PEG質(zhì)量的6 15倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，其特征 是，所述的含聚乙烯醇的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液是指含有0. 6 2. 5%聚乙 烯醇(w/v)且pH為5 7. 4的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液。
9.一種包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑，其特征在于，根據(jù)上述任一權(quán)利要求 所述方法制備得到。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至8種任一所述方法制備得到的雙功能納米粒制劑的應(yīng)用方 法，其特征在于，通過將所述納米粒的溶液放置于透析袋后置于釋放介質(zhì)中，經(jīng)恒溫?fù)u床震 蕩實(shí)現(xiàn)藥物釋放。
全文摘要
一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的包載硫酸長春新堿的雙功能納米粒制劑的制備方法，通過復(fù)乳法將硫酸長春新堿包封于葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG聚合物載體中，制得雙功能納米粒制劑。本發(fā)明在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)行為，制備的葉酸/細(xì)胞穿透肽修飾的PLGA-PEG雙功能納米粒粒徑287.2±0.8nm，具有較高載藥量和包封率，以及良好的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K47/42GK101926775SQ20101027473
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者李紹順, 沈琦, 陳家念 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)