專利名稱：具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物及其有效部位的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物和提取物有效部位 的制備方法，屬中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏，為世界珍貴的“活化石”植物，中國(guó)為銀杏之鄉(xiāng)。銀杏的果實(shí)又名白果，不但 營(yíng)養(yǎng)豐富，而且其入藥已有數(shù)千年歷史，是舉世聞名的藥食同源珍品。銀杏葉中含有黃酮和 萜內(nèi)酯類等化合物，德國(guó)的Schwabe公司率先建立了銀杏葉提取物(EGb)加工廠。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi) 外近40年的持續(xù)研究，目前銀杏葉制劑已廣泛用于治療心腦血管等疾病，這為銀杏資源的 綜合利用奠定了基礎(chǔ)。銀杏外種皮是白果最外層的肉質(zhì)皮，俗稱白果衣，約占其種實(shí)的3/4， 每到銀杏收獲的季節(jié)，產(chǎn)區(qū)就有大量的外種皮被當(dāng)作廢物而拋棄，不僅污染環(huán)境，而且造成 生物資源的極大浪費(fèi)。如何將臭烘烘的外種皮變廢為寶，更好地綜合開發(fā)利用銀杏資源，我 們課題組圍繞這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)進(jìn)行了十幾年的研究，曾從外種皮中提取多糖類化合物并進(jìn)行 了一系列基礎(chǔ)研究及臨床初步試用，取得了一系列研究成果。但采用以往的工藝制備的多 糖類化合物雖然也具有一定的生物活性，但由于其水溶性不太理想，只能制成固體劑型，限 制了一些癌癥病種的臨床應(yīng)用，又未分離其有效部位并進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究，從而影響了 新藥研發(fā)及申報(bào)的進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，第一個(gè)目的是提供一種具有抗腫瘤及 免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方法，第二個(gè)目的在于提供一種具有抗腫瘤及免 疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位的制備方法。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的 銀杏外種皮提取物的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)將銀杏外種皮采用90_99°C熱水煎煮，每次l_2h，共煎煮2_3次，料液比為 1 6-12 (V/W)，將煎煮液分別過(guò)濾并合并過(guò)濾液；(2)將過(guò)濾液減壓濃縮后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、碳酸鈉及硫酸鎂按 重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7. 0-7. 4，充分?jǐn)嚢韬箪o置 2_4h，再次過(guò)濾或按800-1200轉(zhuǎn)/分離心3-5分鐘去除水不溶物；(3)將去除了水不溶物的濃縮過(guò)濾液采用截留值為7000-10000的透析膜用 50-100倍體積的蒸餾水透析12-24h，將透析內(nèi)液減壓濃縮后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙 醇，使乙醇終濃度為60-85% (V/V)，靜置沉淀；(4)將沉淀物用90-98 %的乙醇洗滌2_4次后真空干燥或冷凍干燥，得到銀杏外種 皮提取物。所述的步驟(2)中的過(guò)濾液減壓濃縮至密度為1. 02-1. 08 ；
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所述的步驟(3)中的透析內(nèi)液減壓濃縮至密度為1. 09-1. 15 ；所述的步驟(4)中的銀杏外種皮提取物在(W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于 水，其多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于60%。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的 銀杏外種皮提取物有效部位的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)將銀杏外種皮采用90-99°C熱水煎煮，每次l_2h，共煎煮2-3次，料液比為 1 6-12 (V/W)，將煎煮液分別過(guò)濾并合并，將過(guò)濾液減壓濃縮至密度為1.02-1. 08后，加 入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶 液，使?jié)饪s過(guò)濾液的PH值為7. 0-7. 4，充分?jǐn)嚢韬箪o置2-4h，再次過(guò)濾或按800-1200轉(zhuǎn)/ 分離心3-5分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶物的濃縮過(guò)濾液采用截留值為7000-10000 的透析膜用50-100倍體積的蒸餾水透析12-24h，將透析內(nèi)液減壓濃縮至密度為1. 09-1. 15 后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60-85% (V/V)，靜置沉淀，將沉淀物用 90-98%乙醇洗滌2-4次后真空干燥或冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物；(2)將銀杏外種皮提取物溶于水，使水溶液的濃度為(W/V)；(3)將(W/V)銀杏外種皮提取物水溶液抽濾，將續(xù)濾液過(guò)大孔樹脂柱；(4)先用蒸餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)，用IOBV的65-95%的乙醇洗脫， 收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到銀杏外種皮提取物有效部位。所述的步驟(3)中所用大孔吸附樹脂層析柱的高度與直徑之比為20 1 ；所述的步驟(4)中所用的乙醇洗脫時(shí)流速為l_2BV/h ；所述的步驟(4)中所得到的銀杏外種皮提取物有效部位在2% (W/V)濃度下肉眼 觀察完全溶解于水，其多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于90%。本發(fā)明科學(xué)、合理、簡(jiǎn)單，在乙醇沉淀前加入含多種酸根的組合鹽溶液有利于除去 銀杏外種皮提取物中的水不溶物并進(jìn)行有效部位分離，將銀杏外種皮提取物水溶液過(guò)弱極 性大孔吸附樹脂并用不同極性的無(wú)毒溶劑洗脫，使分離得的有效部位含量高，安全性好。該 方法制得的銀杏外種皮提取物中多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于60%，符合國(guó)家相關(guān)質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)要求，制得的銀杏外種皮提取物有效部位中多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于90%，使 抗腫瘤及促進(jìn)免疫作用效價(jià)強(qiáng)度增高，也有利于對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)分析及抗腫瘤作用機(jī) 制研究。該方法制得的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物及其有效部位水溶 性好，既可以制成固體劑型，也可以制成液體劑型，制備工藝簡(jiǎn)便可行，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。1、肽多糖(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)含量的測(cè)定采用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量精密稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成 lmg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為30μ g/ml、60y g/ml、 90 μ g/ml,120 μ g/ml,150 μ g/ml, 180 μ g/ml 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0. 5ml 于 6 支 IOml 具塞 試管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml濃硫酸，混合均勻，沸水浴 15min,冷水浴30min。用紫外分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸光度，對(duì)葡萄糖溶液濃度和吸光 度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。取銀杏外種皮提取物(GBE)及其有效部位(GBEE)供試品 溶液0. 5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出多糖含量。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量精密稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水 配成100 μ g/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為20 μ g/ml、
540 μ g/ml、60 μ g/ml、80 μ g/mlUOO μ g/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 5ml分別于5支IOml具塞試管， 再加入2. 5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5 lOmin，待其充分反應(yīng)后，用紫外分 光光度計(jì)于595nm處測(cè)定吸光度，對(duì)牛血清白蛋白溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立 回歸方程。取GBE及GBEE供試品溶液0. 5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算 出蛋白質(zhì)含量。采用紅外光譜分析儀進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示GBE及GBEE皆含酰胺鍵，提示皆為 肽多糖。肽多糖含量％=(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)％GBE及GBEE肽多糖含量結(jié)果見表1。表IGBE及GBEE肽多糖含量 表1結(jié)果顯示，GBE的肽多糖含量大于60%，GBEE肽多糖含量大于90%。2、抗腫瘤活性測(cè)定取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，用胰蛋白酶消化、Hank’ s液洗滌后，用含 10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至IX 105/ml。向96孔培養(yǎng)板各孔中分別加入上 述細(xì)胞懸液ΙΟΟμ 1，在5% C02、37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入用含10%小牛 血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的不同濃度的GBE及GBEE各100 μ 1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培 養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT (終濃度5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入酸化異 丙醇，振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-藥物孔OD 值/對(duì)照孔OD值)X 100%",計(jì)算體外對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制率。結(jié)果見表2。表2GBE及GBEE對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用 表2結(jié)果顯示，GBE和GBEE在12. 5-200 μ g/ml劑量下對(duì)胃癌細(xì)胞株的抑制作用 具有量效關(guān)系，GBEE達(dá)到與GBE相似的抑制率所需劑量約為后者的50%，抗腫瘤作用效價(jià) 強(qiáng)度增高。
3、免疫促進(jìn)活性測(cè)定取ICR小鼠6只，20 士 2g，雌雄各半，脫頸椎處死，體表75 %酒精消毒后無(wú)菌條件下 取出脾臟，按常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，溶解紅細(xì)胞后用Hank’ s液洗滌數(shù)次，用含10%小 牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至1 X 107ml。取上述細(xì)胞懸液100 μ 1加入96孔培養(yǎng) 板各孔中，再加入Con A (終濃度為5 μ g/ml)和用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配 制的不同濃度的GBE及GBEE各100 μ 1。將培養(yǎng)板置于5% C02、37°C飽和濕度的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h從各孔中吸出100 μ 1上清棄去，加入MTT (終濃度5mg/ml)，繼續(xù) 培養(yǎng)4h后加入酸化異丙醇，振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值。OD值的高 低與脾淋巴細(xì)胞的多少成正相關(guān)。結(jié)果見表3。表3GBE及GBEE對(duì)小鼠免疫細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用
劑量(μ g/ml)OD 值(； GBE士S) GBEEO0. 186±0. 0210. 186±0. 0212000. 293±0.0120. 338±0. 0151000. 281±0. 0150. 301±0. Oll500. 250±0.0100. 293±0. 014250. 219±0. 0120. 261±0. 01612. 50. 197±0. Oll0. 223±0. 013表3結(jié)果顯示，GBE和GBEE在12. 5-200 μ g/ml劑量下對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，GBEE達(dá)到與GBE相似的促進(jìn)效應(yīng)時(shí)所需劑量約為GBE的 50%,促進(jìn)免疫作用效價(jià)強(qiáng)度增高。4、水溶性測(cè)定 GBE及GBEE分別在1 % (V/W)和2 % (V/W)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。
具體實(shí)施例方式具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方法實(shí)施例1將新鮮外種皮IOOkg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 8(V/W)。將煮提鍋內(nèi) 溫度保持在90-99°C 1.5h后倒出煎煮液，重復(fù)1次，共煎煮2次。將煎煮液分別過(guò)濾后合 并過(guò)濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.02后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、 碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7.0， 充分?jǐn)嚢韬箪o置2h，再次過(guò)濾或按800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶 物的過(guò)濾液采用截留值為10000的透析膜用50倍體積的蒸餾水透析24h，將透析內(nèi)液減 壓濃縮至密度為1.09后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60% (V/V)，靜 置沉淀，將沉淀物用90%乙醇洗滌2次后真空干燥，得銀杏外種皮提取物，該提取物在
7(W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)多糖及 蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為37. 6%及24.8%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為 62. 4%。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外 種皮提取物可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用具有量效關(guān)系，在終濃度為200μ g/ml， 100 μ g/ml, 50 μ g/ml, 25 μ g/ml, 12. 5 μ g/ml 下其抑制率(% )分別為 50，38，21，11，5。采 用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用Con A(終濃度為5 μ g/ ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值，OD值的高低與脾淋巴細(xì)胞的多少成正相 關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn) 作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞 對(duì)照組OD值為0. 173士0. 018，銀杏外種皮提取物終濃度在200 μ g/ml, 100 μ g/ml，50 μ g/ ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml 下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 OD 值分別為 0. 303士0. 015,0. 290士0. 012， 0. 231 士0. 017,0. 223士0. 009,0. 201 士0. 016。實(shí)施例2將新鮮外種皮200kg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 6(V/W)。將煮提鍋 內(nèi)溫度保持在90_99°C Ih后倒出煎煮液，重復(fù)2次，共煎煮3次。將煎煮液分別過(guò)濾后合 并過(guò)濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.04后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、 碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7. 2， 充分?jǐn)嚢韬箪o置3h，再次過(guò)濾或按1000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘去除水不溶物，將去除了水不 溶物的過(guò)濾液采用截留值為8000的透析膜用80倍體積的蒸餾水透析12h，將透析內(nèi)液減 壓濃縮至密度為1. 15后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為70% (V/V)，靜 置沉淀，將沉淀物用95%乙醇洗滌3次后真空干燥，得銀杏外種皮提取物，該提取物在 (W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)多糖及 蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為40. 及21. 1%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為 61. 2%。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外 種皮提取物可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用具有量效關(guān)系，在終濃度為200μ g/ml， 100 μ g/ml，50 μ g/ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml 下其抑制率(% )分別為 54，40，22，14，5。采 用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用Con A(終濃度為5 μ g/ ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值，OD值的高低與脾淋巴細(xì)胞的多少成正相 關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn) 作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞 對(duì)照組OD值為0. 169士0. 008，銀杏外種皮提取物終濃度在200 μ g/ml, 100 μ g/ml，50 μ g/ ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml 下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 OD 值分別為 0. 289士0. 011，0. 278士0. 014， 0. 259士0. 013,0. 199士0. 010,0. 186士0. 012。實(shí)施例3將新鮮外種皮500kg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 12(V/W)。將煮提鍋 內(nèi)溫度保持在90-99°C 2h后倒出煎煮液，重復(fù)2次，共煎煮3次。將煎煮液分別過(guò)濾后合 并過(guò)濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.08后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、 碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7. 4， 充分?jǐn)嚢韬箪o置4h，再次過(guò)濾或按1200轉(zhuǎn)/分離心3分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶物的過(guò)濾液采用截留值為7000的透析膜用100倍體積的蒸餾水透析18h，將透析內(nèi)液 減壓濃縮至密度為1. 12后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為85% (V/V)， 靜置沉淀，將沉淀物用98 %乙醇洗滌4次后冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物，該提取物在 1% (W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)多糖 及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為43. 9%及20. 4%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為 64. 3%。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外 種皮提取物可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用具有量效關(guān)系，在終濃度為200μ g/ml， 100 μ g/ml, 50 μ g/ml, 25 μ g/ml, 12. 5 μ g/ml 下其抑制率(% )分別為 52，37，24，16，7。采 用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用Con A(終濃度為5 μ g/ ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值，OD值的高低與脾淋巴細(xì)胞的多少成正相 關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn) 作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞 對(duì)照組OD值為0. 192士0. 019，銀杏外種皮提取物終濃度在200 μ g/ml, 100 μ g/ml, 50 μ g/ ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml 下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組 OD 值分別為 0. 301 士0. 019,0. 290士0. 016， 0. 266士0. 011,0. 248士0. 018,0. 208士0. 014。具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位的制備方法實(shí)施例4將新鮮外種皮500kg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 12(V/W)。將煮提鍋 內(nèi)溫度保持在90-99°C 2h后倒出煎煮液，重復(fù)2次，共煎煮3次。將煎煮液分別過(guò)濾后合 并過(guò)濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.08后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、 碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7. 4， 充分?jǐn)嚢韬箪o置4h，再次過(guò)濾或按1200轉(zhuǎn)/分離心3分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶 物的過(guò)濾液采用截留值為7000的透析膜用100倍體積的蒸餾水透析18h，將透析內(nèi)液減壓 濃縮至密度為1. 12后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為85% (V/V)，靜置 沉淀，將沉淀物用98%乙醇洗滌4次后冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物。將該提取物復(fù)溶 于水，使水溶液的濃度為1 %，抽濾，將續(xù)濾液過(guò)直徑為20cm高為400cm的大孔吸附樹脂層 析柱，先用蒸餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)改用IOBV 65%的乙醇洗脫，乙醇洗脫時(shí) 流速為2BV/h。收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物有效部位，該有 效部位在2% (W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別 檢測(cè)多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物多糖及蛋白質(zhì)含量分別為38. 1%及 23.5%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為61.6%，銀杏外種皮提取物有效部位 多糖及蛋白質(zhì)含量分別為61. 8%及33. 3%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為 95. 1 %。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外種 皮提取物及其有效部位皆可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在所給劑量范圍內(nèi)，其抑制作用具有 量效關(guān)系，且銀杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的抑制效應(yīng)時(shí)所需 劑量約為后者的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的抑制腫瘤作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏 外種皮提取物，在終濃度為 200 μ g/ml，100 μ g/ml，50 μ g/ml，25 μ g/ml,12. 5 μ g/ml 下的 抑制率(％ )，銀杏外種皮提取物分別為52，39，23，13，8，銀杏外種皮提取物有效部位分別 為69，57，35，23，14。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用
9Con A (終濃度為5 u g/ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的0D值，0D值的高低與脾 淋巴細(xì)胞的多少成正相關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物及其有效部位對(duì)Con A誘導(dǎo)的小 鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用 逐漸增強(qiáng)，且銀杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的促進(jìn)效應(yīng)時(shí)所需 劑量約為后者的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的免疫促進(jìn)作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏 外種皮提取物。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞對(duì)照組0D值為0. 178士0. 011，終濃度在200 u g/ ml, 100 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 12. 5 u g/ml下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組0D值，銀杏外種皮提 取物分別為 0. 291 士0. 016,0. 274士0. 010,0. 222士0. 016,0. 203士0. 011,0. 188士0. 015， 銀杏外種皮提取物有效部位分別為0. 311 士0. 017,0. 299士0. 008,0. 276士0. 012， 0. 253士0. 012,0. 200士0. 009。實(shí)施例5將新鮮外種皮200kg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 6(V/W)。將煮提鍋內(nèi) 溫度保持在90-99°C lh后倒出煎煮液，重復(fù)2次，共煎煮3次。將煎煮液分別過(guò)濾后合并過(guò) 濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.04后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、碳酸 鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7. 2，充分?jǐn)?拌后靜置3h，再次過(guò)濾或按1000轉(zhuǎn)/分離心4分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶物的過(guò) 濾液采用截留值為8000的透析膜用80倍體積的蒸餾水透析12h，將透析內(nèi)液減壓濃縮至密 度為1. 15后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為70% (V/V)，靜置沉淀，將沉 淀物用95%乙醇洗滌3次后真空干燥，得銀杏外種皮提取物。將該提取物復(fù)溶于水，使水溶 液的濃度為1%，抽濾，將續(xù)濾液過(guò)直徑為15cm高為300cm的大孔吸附樹脂層析柱，先用蒸 餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)改用10BV 95%的乙醇洗脫，乙醇洗脫時(shí)流速為1BV/ h。收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物有效部位，該有效部位在2% (W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)多糖及蛋 白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物多糖及蛋白質(zhì)含量分別為38. 3%及27.0%，肽多 糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為65.3%，銀杏外種皮提取物有效部位多糖及蛋白質(zhì) 含量分別為62.0%及34.2%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為96.2%。采用 MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物及其 有效部位皆可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在所給劑量范圍內(nèi)，其抑制作用具有量效關(guān)系，且銀 杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的抑制效應(yīng)時(shí)所需劑量約為后者 的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的抑制腫瘤作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏外種皮提取 物，在終濃度為 200 u g/ml, 100 u g/ml，50 u g/ml，25 u g/ml, 12. 5 u g/ml 下的抑制率(%), 銀杏外種皮提取物分別為53，36，24，12，5，銀杏外種皮提取物有效部位分別為71，59，41， 21,17.采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用Con A(終濃 度為5 y g/ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的0D值，0D值的高低與脾淋巴細(xì)胞的 多少成正相關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物及其有效部位對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋 巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，且 銀杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的促進(jìn)效應(yīng)時(shí)所需劑量約為后 者的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的免疫促進(jìn)作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏外種皮提取 物。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞對(duì)照組0D值為0. 208士0. 018，終濃度在200 u g/ml, 100 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 12. 5 u g/ml下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組0D值，銀杏外種皮提取物分別 為 0. 290士0. 018,0. 277士0. 017,0. 249士0. 015,0. 231 士0. 010,0. 219士0. 013，銀杏外種 皮提取物有效部位分別為 0. 344士0. 015,0. 303士0. 012,0. 281 士0. 007,0. 260士0. 010， 0. 233 士 0. 011。實(shí)施例6將新鮮外種皮100kg置于煮提鍋內(nèi)，加水使料液比約為1 8(V/W)。將煮提鍋內(nèi) 溫度保持在90-99°C 1.5h后倒出煎煮液，重復(fù)1次，共煎煮2次。將煎煮液分別過(guò)濾后合 并過(guò)濾液，將過(guò)濾液70°C減壓濃縮至密度為1.02后，加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、 碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7.0， 充分?jǐn)嚢韬箪o置2h，再次過(guò)濾或按800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶 物的過(guò)濾液采用截留值為10000的透析膜用50倍體積的蒸餾水透析24h，將透析內(nèi)液減壓 濃縮至密度為1.09后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60% (V/V)，靜置 沉淀，將沉淀物用90%乙醇洗滌2次后真空干燥，得銀杏外種皮提取物。將該提取物復(fù)溶 于水，使水溶液的濃度為1%，抽濾，將續(xù)濾液過(guò)直徑為10cm高為200cm的大孔吸附樹脂層 析柱，先用蒸餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)改用10BV 85%的乙醇洗脫，乙醇洗脫時(shí) 流速為1.5BV/h。收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物有效部位，該 有效部位在2% (W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解于水。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分 別檢測(cè)多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物多糖及蛋白質(zhì)含量分別為39.6% 及22. 9%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為62. 5%，銀杏外種皮提取物有效部 位多糖及蛋白質(zhì)含量分別為63. 2%及33. 8%，肽多糖總含量(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)為 97.0%。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，銀杏外種 皮提取物及其有效部位皆可直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在所給劑量范圍內(nèi)，其抑制作用具有 量效關(guān)系，且銀杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的抑制效應(yīng)時(shí)所需 劑量約為后者的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的抑制腫瘤作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏 外種皮提取物，在終濃度為 200 u g/ml, 100 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 12. 5 u g/ml 下的 抑制率(％ )，銀杏外種皮提取物分別為55，40，20，15，6，銀杏外種皮提取物有效部位分別 為68，60，39，24，14。采用MTT法體外培養(yǎng)48h檢測(cè)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，采用 Con A (終濃度為5 u g/ml)誘導(dǎo)，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的0D值，0D值的高低與脾 淋巴細(xì)胞的多少成正相關(guān)。結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物及其有效部位對(duì)Con A誘導(dǎo)的小 鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用，在所給劑量范圍內(nèi)，隨著劑量增加其促進(jìn)作用 逐漸增強(qiáng)，且銀杏外種皮提取物有效部位達(dá)到與銀杏外種皮提取物相似的促進(jìn)效應(yīng)時(shí)所需 劑量約為后者的50%，顯示銀杏外種皮提取物有效部位的免疫促進(jìn)作用效價(jià)強(qiáng)度高于銀杏 外種皮提取物。該實(shí)施例不加處理的細(xì)胞對(duì)照組0D值為0. 189士0. 015，終濃度在200 u g/ ml, 100 u g/ml, 50 u g/ml, 25 u g/ml, 12. 5 u g/ml下處理的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組0D值，銀杏外種皮提 取物分別為 0. 311 士0. 020,0. 289士0. 009,0. 251 士0. 015,0. 230士0. 017,0. 211 士0. 016， 銀杏外種皮提取物有效部位分別為0. 341 士0. 014,0. 309士0. 003,0. 294士0. 010， 0. 264士0. 019,0. 236士0. 008。
1權(quán)利要求
一種具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)將銀杏外種皮采用90 99℃熱水煎煮，每次1 2h，共煎煮2 3次，料液比為1∶6 12(V/W)，將煎煮液分別過(guò)濾并合并過(guò)濾液；(2)將過(guò)濾液減壓濃縮后，加入濃度為25％(W/V)的由氯化鈉、碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8∶1∶1組合而成的鹽溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的pH值為7.0 7.4，充分?jǐn)嚢韬箪o置2 4h，再次過(guò)濾或800 1200轉(zhuǎn)/分離心3 5分鐘去除水不溶物；(3)將去除了水不溶物的濃縮過(guò)濾液采用截留值為7000 10000的透析膜用50 100倍體積的蒸餾水透析12 24h，將透析內(nèi)液減壓濃縮后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60 85％(V/V)，靜置沉淀；(4)將沉淀物用90 98％的乙醇洗滌2 4次后真空干燥或冷凍干燥，得到銀杏外種皮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方 法，其特征是所述的步驟(2)中的過(guò)濾液減壓濃縮至密度為1.02-1.08。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方 法，其特征是所述的步驟(3)中的透析內(nèi)液減壓濃縮至密度為1.09-1. 15。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物的制備方 法，其特征是所述的步驟(4)中的銀杏外種皮提取物在(W/V)濃度下肉眼觀察完全溶解 于水，其多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于60%。
5.一種具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位的制備方法，其特征 是包括以下步驟(1)將銀杏外種皮采用90-99°C熱水煎煮，每次l_2h，共煎煮2-3次，料液比為 1 6-12作/1)，將煎煮液分別過(guò)濾后合并，將過(guò)濾液701減壓濃縮至密度為1.02-1.08后， 加入濃度為25% (W/V)的由氯化鈉、碳酸鈉及硫酸鎂按重量比為8 1 1組合而成的鹽 溶液，使?jié)饪s過(guò)濾液的PH值為7. 0-7. 4，充分?jǐn)嚢韬箪o置2-4h，再次過(guò)濾或按800-1200轉(zhuǎn)/ 分離心3-5分鐘去除水不溶物，將去除了水不溶物的濃縮過(guò)濾液采用截留值為7000-10000 的透析膜用50-100倍體積的蒸餾水透析12-24h，將透析內(nèi)液減壓濃縮至密度為1. 09-1. 15 后，向濃縮的透析內(nèi)液中加入乙醇，使乙醇終濃度為60-85% (V/V)，靜置沉淀，將沉淀物用 90-98%乙醇洗滌2-4次后真空干燥或冷凍干燥，得銀杏外種皮提取物；(2)將銀杏外種皮提取物溶于水，使水溶液的濃度為(W/V)；(3)將(W/V)銀杏外種皮提取物水溶液抽濾，將續(xù)濾液過(guò)大孔吸附樹脂層析柱；(4)先用蒸餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)，用IOBV的65-95%的乙醇洗脫，收集 乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到銀杏外種皮提取物有效部位。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位 的制備方法，其特征是所述的步驟(3)中所用大孔吸附樹脂層析柱的高度與直徑之比為 20 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位 的制備方法，其特征是所述的步驟(4)中所用的乙醇洗脫時(shí)流速為l_2BV/h。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物有效部位的制備方法，其特征是所述的步驟(4)中所述的銀杏外種皮提取物有效部位在2% (W/V)濃 度下肉眼觀察完全溶解于水，其多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于90%。全文摘要
具有抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性的銀杏外種皮提取物及其有效部位的制備方法，屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域。將銀杏外種皮用熱水煎煮2-3次，煎煮液分別過(guò)濾，向減壓濃縮后的過(guò)濾液中加入組合鹽溶液，過(guò)濾或離心去除水不溶物后用蒸餾水透析；將透析內(nèi)液濃縮后，用乙醇沉淀，將沉淀物干燥，得銀杏外種皮提取物；將銀杏外種皮提取物溶于水后抽濾，將續(xù)濾液過(guò)大孔樹脂柱，先用蒸餾水洗脫，待洗脫液糖試驗(yàn)為陰性時(shí)再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，得銀杏外種皮提取物有效部位。該提取物及其有效部位的多糖及蛋白質(zhì)含量之和分別大于60％及90％，水溶性好，抗腫瘤及免疫促進(jìn)活性強(qiáng)，可以制成固體劑型和液體劑型，制備工藝簡(jiǎn)便可行，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P37/04GK101912425SQ201010251050
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者吳倩, 李俊, 楊茜, 許愛華, 陳華圣 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)