專利名稱：具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的來(lái)自奇果菌的低分子量物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從“舞茸(Maitake)”菇(奇果菌(Grifola))的菌絲體或子實(shí)體 中提取和分級(jí)的具有提高的免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的低分子量的蛋白質(zhì)-葡聚糖復(fù) 合物。
背景技術(shù)：
一種從奇果菌的菌絲體或子實(shí)體中提取的具有β-1，6-連接的葡萄糖作為主 鏈，以β_1，3-連接的葡萄糖作為支鏈的多糖(葡聚糖)和以β-1，3-連接的葡萄糖 作為主鏈，以β_1，6-連接的葡萄糖作為支鏈的多糖(葡聚糖)已知具有免疫增強(qiáng)活 性(日本專利公開(kāi)(Kokai)No. 59-210901Α(1984)(專利文獻(xiàn)1)；日本專利公開(kāi)(Kokai) No. 9-238697Α(1997)(專利文獻(xiàn) 2)) 此外，制備抗癌物質(zhì)的方法也是已知的，其中“舞茸”(貝葉奇果菌(Grifola frondosa)) ,"Tonbimaitake"(巨大奇果菌(Grifola gigantea))，或者"Masutake”(硫磺 多孔菌(Laetiporus sulphureus))用熱水來(lái)提取，提取物減壓濃縮，以使得產(chǎn)物經(jīng)歷用有 機(jī)溶劑的沉淀步驟、除去低分子量物質(zhì)的透析步驟和用脂溶性有機(jī)溶劑提取的除去雜質(zhì)步 驟的組合(日本專利公開(kāi)(Kokoku)No. 43-16047B(1968)(專利文獻(xiàn)3))。由專利文獻(xiàn)1、2和3公開(kāi)的傳統(tǒng)技術(shù)獲得的葡聚糖_蛋白質(zhì)復(fù)合物的實(shí)例是高分 子量葡聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其分子量為大約1，000，000。當(dāng)在細(xì)胞水平上考察其詳細(xì)的 免疫增強(qiáng)活性機(jī)理時(shí)，復(fù)合物具有大分子量的事實(shí)意味著其主要的活性結(jié)構(gòu)不能被明確說(shuō) 明。此外，由于這種葡聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有高分子量，它們不能經(jīng)靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明人以前進(jìn)行的研究目的是在舞茸的熱水提取物中找到具有例如免疫增強(qiáng) 活性、抗癌活性等活性的低分子量物質(zhì)。結(jié)果，他們成功的得到了一種具有10，000-150，000 分子量的葡聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(日本專利公開(kāi)(Kokai)No. 2007-31665A(專利文獻(xiàn)4))。但是處理這樣的具有10，000-150，000的分子量的非常大的葡聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合 物很不方便。專利文獻(xiàn)1 日本專利公開(kāi)(Kokai)No. 59-210901A (1984)專利文獻(xiàn)2 日本專利公開(kāi)(Kokai) No. 9-238697A (1997)專利文獻(xiàn)3 日本專利公開(kāi)(Kokoku) No. 43-16047B (1968)專利文獻(xiàn)4 日本專利公開(kāi)(Kokai)No. 2007-31665A

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種具有卓越的免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的低分子量的 來(lái)自舞茸的物質(zhì)，其優(yōu)選被用作藥品、食品或飲料、和飼料的原料。解決技術(shù)問(wèn)題的手段
本發(fā)明人將舞茸的熱水提取物分級(jí)，從而新得到一種包含蛋白質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物 (其中蛋白質(zhì)的比例要大于葡聚糖的比例)的具有5000或更低的分子量的物質(zhì)，其在結(jié)構(gòu) 上不同于常規(guī)所知的葡聚糖_蛋白質(zhì)復(fù)合物(其中葡聚糖的比例要大于蛋白質(zhì)的比例)。然 后，他們發(fā)現(xiàn)，這樣的物質(zhì)具有促進(jìn)建立的T輔助1型人細(xì)胞系(THP-I)和小鼠脾細(xì)胞體外 生長(zhǎng)和增殖的活性。由此，本發(fā)明人完成了包含具有免疫增強(qiáng)活性的低分子量蛋白質(zhì)-葡 聚糖復(fù)合物的物質(zhì)的純化，其在分子量和蛋白質(zhì)含量方面明顯不同于專利文獻(xiàn)1，2，3和4 所公開(kāi)的物質(zhì)。本發(fā)明涉及以下(1)-(7)(1) 一種具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的物質(zhì)，其包含蛋白質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物， 所述復(fù)合物在蒽酮反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)中顯示陽(yáng)性結(jié)果，所述物質(zhì)通過(guò)包含下列1)_4)的步 驟來(lái)制備1)用水熱提取奇果菌的菌絲體或子實(shí)體的步驟；2)將醇加入到得到的水溶性提取物級(jí)分至終體積濃度為10 % -80 %，將得到的溶 液在1°C -40°c的溫度下靜置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物質(zhì) 以及其中形成的沉淀物的步驟；3)從經(jīng)步驟2)后得到的包含醇的水溶性級(jí)分中除去醇，并經(jīng)陰離子交換柱層析 從得到的水溶性級(jí)分中收集被吸附的級(jí)分的步驟；4)經(jīng)將吸附的級(jí)分進(jìn)行分子篩分離，收集分子量為5000或更低的級(jí)分的步驟；(2)根據(jù)(1)所述的具有免疫增強(qiáng)活性和/或抗腫瘤活性并包含蛋白質(zhì)_葡聚糖 復(fù)合物的物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)與葡聚糖的比為85 15-99.5 0.5；(3)根據(jù)(1)或⑵所述的具有免疫增強(qiáng)活性和/或抗腫瘤活性并包含蛋白 質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)，其中的奇果菌為“舞茸”(貝葉奇果菌(Grifola frondosa)), "Shiromaitake(Grifola albicans Imaz.), 或 者“豬 茶，，(Dendropolyporus umbellatus)；(4) 一種免疫增強(qiáng)劑或抗腫瘤劑，其包含(1)、(2)和(3)中任一項(xiàng)所述的包含蛋 白質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)作為活性成分；(5) 一種化療佐藥，其包含⑴、(2)和(3)中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)_葡聚糖 復(fù)合物的物質(zhì)作為活性成分；(6) 一種食品或飲料，其包含(1)、(2)和(3)中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)_葡聚 糖復(fù)合物的物質(zhì)；以及(7) 一種寵物食品、牲畜飼料或者寵物食品或牲畜飼料的添加劑，其包含(1)、(2) 和(3)中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)。以下更詳細(xì)的描述本發(fā)明。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物”涉及一種包含蛋白質(zhì)和葡聚糖的物質(zhì)。 該物質(zhì)包含主要由蛋白質(zhì)組成，并且蛋白質(zhì)和葡聚糖的比為如上述(2)所述的99.5 0.5 的物質(zhì)。本發(fā)明中，可以使用所有類型的奇果菌，包含“舞茸”(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))、“Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz.)，“豬 等” (Dendropolyporus umbellatus)等。新鮮的奇果菌可以直接使用或者必要的時(shí)候?qū)⑵淝袎K后使用。干的奇果菌也可以直接使用，或者必要時(shí)切塊后使用，或者以粉末的形式使用。用水熱提取處理在50°C _135°C下進(jìn)行，時(shí)間為15分鐘_3小時(shí)。對(duì)于快速提取， 提取可以在壓力下于100°c或更高的溫度下進(jìn)行，例如，在1-2個(gè)大氣壓、約110°C到125°C 的壓力罐中進(jìn)行15-60分鐘。使用蒸餾水，純凈水，離子交換水，自來(lái)水等作為水。每重量份干奇果菌，使用約 2-50體積份的水。如果使用新鮮的奇果菌，每重量份奇果菌，使用約2-20體積份的水。作為加入到用水熱提取得到的提取物中的醇，可使用甲醇，乙醇，丙醇等。這樣的 醇被加入到提取物中直至終體積濃度為10-80%。而且，可以使用含有0-50%水的醇。在 加入醇之后，得到的溶液被靜置1-25小時(shí)，由此出現(xiàn)了浮在溶液上或溶液中或附著到容器 壁表面的物質(zhì)。隨后經(jīng)過(guò)濾，移液，離心或用網(wǎng)狀材料濾出從溶液收集這些物質(zhì)。經(jīng)上述步驟之后，將醇從得到的包含醇的水溶性級(jí)分中除去。通過(guò)陰離子交換柱 層析，從得到的水溶性級(jí)分中收集被吸附的級(jí)分。為了進(jìn)行陰離子交換層析，使用通常所用 的陰離子交換樹(shù)脂，如強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂和弱堿性離子交換樹(shù)脂。然而，優(yōu)選使用化學(xué)和 物理穩(wěn)定的且具有大的離子交換容量的高滲透性樹(shù)脂。將吸附的級(jí)分通過(guò)常規(guī)方法洗脫并進(jìn)行分子篩分離。由此，可以收集到一種具有 5000或更低分子量的低分子量級(jí)分。作為分子篩分離的手段，可以使用凝膠過(guò)濾層析、超 濾、透析等。作為凝膠過(guò)濾材料，可以使用廣泛用于常規(guī)目的的材料，如葡聚糖基、瓊脂糖 基、纖維素基或丙烯酰胺基材料。同樣，對(duì)于超濾、透析等，多種裝置是可商業(yè)上獲得的?？?以使用適當(dāng)?shù)难b置。希望選擇本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的具有5000或更低分子量的級(jí)分。然而，取決于裝置，可 接受的分子量變化范圍可以是士20%。在這個(gè)范圍內(nèi)，能夠達(dá)到期望的目標(biāo)。此外，分子量 的下限優(yōu)選500或更高。通過(guò)上述得到的本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物描述如下。外觀無(wú)色至微黃色液體溶解性溶于水、醇溶液、堿溶液、酸溶液和二甲亞砜水性溶液的性質(zhì)中性至弱酸性顯色反應(yīng)在蒽酮反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)中呈陽(yáng)性分子量5，000或更低經(jīng)柱層析純化的結(jié)果表明，本發(fā)明中得到的具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的物 質(zhì)中蛋白質(zhì)與葡聚糖的比在85 15-99.5 0.5的范圍內(nèi)。該比例會(huì)隨用作起始原料的 奇果菌的質(zhì)量以及提取和純化的條件而發(fā)生適量的變化。本發(fā)明的蛋白質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物是一種具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的物質(zhì)。 因此，它可以作為免疫增強(qiáng)劑或抗腫瘤劑施用給人類或動(dòng)物，或者可以與化療劑例如抗腫 瘤劑或抗生素聯(lián)合使用(即，以化療佐藥的方式)以給人類或動(dòng)物施用。此外，這種物質(zhì)還 可以添加到食品或飲料、寵物食物、牲畜飼料等中。當(dāng)本發(fā)明的物質(zhì)用作藥品或獸藥時(shí)，由于具有低分子量并能溶于水或醇中，其可 以制備成多種劑型。劑型的實(shí)例包括用于口服的溶液、糖漿、片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊和藥 丸；用于腸胃外給藥的腸胃外注射劑、滴液、栓劑、外用制劑、滴鼻劑和滴眼劑。本發(fā)明的物 質(zhì)顯著有利于藥品的開(kāi)發(fā)。
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本發(fā)明的物質(zhì)來(lái)自奇果菌，其已經(jīng)用作食品多年，因此具有很高的安全性。因此， 本發(fā)明的物質(zhì)可以食品或飲料的形式使用或者與食品或飲料混合。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ) “食品或飲料”不僅限于日常消費(fèi)的飲料如牛奶和果汁以及加工食品。這樣的食品或飲料的 實(shí)例包括所有類型的食品，其中包括普通的食品和飲料如所謂的健康食品、保健功能食品 如有營(yíng)養(yǎng)功能聲明的食品和特種保健用途的食品，藥用輔助食品，特殊用途食品如老年人 食品和病人食品。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明所述的通過(guò)分級(jí)奇果菌的熱水提取物得到的，具有5000或更低分子 量的新的蛋白質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物，顯示了免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性。它可以用作免疫增 強(qiáng)劑、抗腫瘤劑或用于包括抗生素或抗腫瘤劑的化療用佐藥。此外，這樣的來(lái)自奇果菌的高安全性的物質(zhì)是一種非常常見(jiàn)的食品，不但可被用 于藥品和獸藥，也可以被用于食品或飲料、飼料和寵物食品?；蛘撸c它們進(jìn)行混合。本說(shuō)明書(shū)包含了本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件日本專利申請(qǐng)No. 2008-032935的說(shuō)明書(shū)和 /或附圖中所公開(kāi)的部分或全部?jī)?nèi)容。


圖1顯示了細(xì)胞增殖活化檢測(cè)的結(jié)果。細(xì)胞增殖活化率通過(guò)以下公式得到 細(xì)胞增殖活化率(％ )=處理組的吸光度(Abs. 450nm/Abs. 650nm) /對(duì)照組的吸光度 (Abs. 450nm/Abs. 650nm)X100圖2顯示了產(chǎn)生的IL-12和IFN-γ的量。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下文中，本發(fā)明將參考以下實(shí)施例進(jìn)行具體描述。(1)提取方法用1. 5L蒸餾水在110 °C -125 ！下熱提取干舞茸(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))的子實(shí)體(150g) 15-60分鐘。將乙醇加入到500ml得到的可溶級(jí)分中，直至終 體積濃度為10% -80%。將得到的溶液在1°C -40°C下靜置12小時(shí)左右，由此產(chǎn)生了粘性 的褐色物質(zhì)漂浮在溶液上或溶液中或粘附在容器壁表面上。在通過(guò)移液等收集所述物質(zhì)之 后，收集通過(guò)更進(jìn)一步的離心步驟除去沉淀物質(zhì)得到的包含醇的水溶性級(jí)分。通過(guò)除去醇， 從溶液中得到水溶性級(jí)分。然后通過(guò)陰離子交換柱層析(DEAE-Sephadex)收集被吸附的級(jí) 分。通過(guò)將溶液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(S印hadex或者Cellulofine)得到一種具有THP-I細(xì) 胞增殖活性的級(jí)分。這種物質(zhì)在蒽酮反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)中顯示陽(yáng)性結(jié)果。然后，將這種物 質(zhì)通過(guò)柱色譜純化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與葡聚糖的比(在復(fù)合物中)為85 15-99.5 0.5。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析對(duì)分子量進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子量為5，000或更低。由本 發(fā)明得到的物質(zhì)顯示了紫外吸光度而沒(méi)有可見(jiàn)光吸光度。(2)細(xì)胞增殖活化測(cè)試(體外)小鼠脾細(xì)胞在5% CO2的條件下在37°C用所述物質(zhì)培養(yǎng)18小時(shí)。圖1顯示了細(xì) 胞增殖活化率(％)。用上述(1)中得到物質(zhì)處理的組顯示了比對(duì)照組更強(qiáng)的小鼠脾細(xì)胞 增殖促進(jìn)效果。(3)抗腫瘤測(cè)試
上述(1)中得到的物質(zhì)和作為對(duì)照的普通鹽溶液，分別對(duì)Balb/cA小鼠腹膜內(nèi)施 用七次，在Balb/cA小鼠中已經(jīng)以250μ Ι/kg體重的量植入結(jié)腸26癌。檢測(cè)該物質(zhì)對(duì)腫瘤 的生長(zhǎng)活性。得到的結(jié)果列在表1中。表 權(quán)利要求
一種具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤活性的物質(zhì)，其包含蛋白質(zhì) 葡聚糖復(fù)合物，所述復(fù)合物在蒽酮反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)中顯示陽(yáng)性結(jié)果，所述物質(zhì)通過(guò)包含下列1) 4)的步驟來(lái)制備1)用水熱提取奇果菌(Grifola)的菌絲體或子實(shí)體的步驟；2)將醇加入到得到的水溶性提取物級(jí)分至終體積濃度為10％ 80％，將得到的溶液在1℃ 40℃的溫度下靜置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物質(zhì)以及其中形成的沉淀物的步驟；3)從經(jīng)步驟2)后得到的包含醇的水溶性級(jí)分中除去醇，并經(jīng)陰離子交換柱層析從得到的水溶性級(jí)分中收集被吸附的級(jí)分的步驟；4)經(jīng)將吸附的級(jí)分進(jìn)行分子篩分離，收集分子量為5000或更低的級(jí)分的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有免疫增強(qiáng)活性和/或抗腫瘤活性并包含蛋白質(zhì)_葡聚糖 復(fù)合物的物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)與葡聚糖的比為85 15-99.5 0.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫增強(qiáng)活性和/或抗腫瘤活性并包含蛋白 質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)，其中的奇果菌為“舞茸(Maitake) ”(貝葉奇果菌(Grifola frondosa))，“Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz·)，或者“豬等(Choreimaitake)，，( Dendropolyporus umbellatus)。
4.一種免疫增強(qiáng)劑或抗腫瘤劑，其包含權(quán)利要求1、2和3中任一項(xiàng)所述的包含蛋白 質(zhì)_葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)作為活性成分。
5.一種化療佐藥，其包含權(quán)利要求1、2和3中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)-葡聚糖復(fù)合 物的物質(zhì)作為活性成分。
6.一種食品或飲料，其包含權(quán)利要求1、2和3中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)_葡聚糖復(fù) 合物的物質(zhì)。
7.一種寵物食品、牲畜飼料或者寵物食品或牲畜飼料的添加劑，其包含權(quán)利要求1、2 和3中任一項(xiàng)所述的包含蛋白質(zhì)-葡聚糖復(fù)合物的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)自舞茸菇(Maitake mushroom)的物質(zhì)，所述物質(zhì)與常規(guī)糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物相比較低的分子量，以及與常規(guī)糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物不同的結(jié)構(gòu)，而且還具有免疫刺激活性和抗癌活性。這種來(lái)自舞茸菇的低分子量物質(zhì)通過(guò)以下步驟1)-4)來(lái)制備1)用熱水提取舞茸菇的菌絲體或子實(shí)體；2)將醇加入到步驟1)提取的水溶性級(jí)分中使得醇的終濃度按體積計(jì)為10％-80％，將得到的混合物在1℃-40℃下靜置，除去浮在溶液表面或溶液中的物質(zhì)，粘附在容器壁表面的物質(zhì)以及在溶液中形成的沉淀物；3)從前述步驟產(chǎn)生的含醇的水溶性級(jí)分中除去醇以獲得水溶性級(jí)分，并將水溶性級(jí)分進(jìn)行陰離子交換層析，并收集被吸附的級(jí)分；以及4)將被吸附的級(jí)分經(jīng)歷分子篩分離，并收集分子量為5000或更低的級(jí)分。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101981060SQ20098011047
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2009年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者兒玉典子, 難波宏彰 申請(qǐng)人:株式會(huì)社雪國(guó)舞茸