專利名稱：沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素在胎兒酒精相關(guān)性疾病干預(yù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素在胎兒酒精相關(guān)性疾病干預(yù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胎兒酒精相關(guān)性疾病(fetal alcohol spectrum disorders，F(xiàn)ASD)是指孕婦在 孕期攝入酒精對(duì)胎兒造成的發(fā)育障礙，其表現(xiàn)主要以中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙和頌面畸形為 主。雖然酒精對(duì)胎兒的不良作用是廣為人知的，孕婦酗酒的概率仍呈上升的趨勢(shì)，由此可見(jiàn) 酒精的胚胎毒性是一個(gè)危害社會(huì)健康的重要因素，研究預(yù)防和治療FASD的方法已迫在眉睫。現(xiàn)有的研究中，各種用于預(yù)防胎兒酒精相關(guān)性疾病的藥物，多數(shù)不可食用，需要通 過(guò)注射的方式給藥，而少數(shù)可食用的藥物，如維生素E、維生素C等，一般與食品混合，吸收 效果較差，使用量大，同樣不夠方便。同時(shí)，由于胎兒發(fā)育不完善，不能耐受較大的毒性。由于胎盤(pán)屏障的存在，能夠進(jìn) 入胎兒體內(nèi)的制劑并能預(yù)防胎兒酒精相關(guān)性疾病的制劑少之又少。目前缺乏少次口服就可預(yù)防酒精引起的胚胎發(fā)育遲緩的制劑。沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素((-)-epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是從中 國(guó)綠茶中提取的一種成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組 分，占綠茶毛重的9% 13%，因?yàn)榫哂刑厥獾牧Ⅲw化學(xué)結(jié)構(gòu)，EGCG具有非常強(qiáng)的抗氧化活 性，在抗癌和心血管疾病方面擔(dān)當(dāng)了重要的角色。此外，它也用作腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn) 劑，能夠改善癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性并減輕對(duì)心臟的毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素在胎兒酒精相關(guān)性疾病預(yù)防 中的應(yīng)用。在酗酒的動(dòng)物母親及其新生胎兒中有活性氧簇(reactive oxygen species, ROS) 的聚集，因?yàn)榕咛ンw內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化劑含量遠(yuǎn)低于成年生物的含量，胚胎比母體更容易 受到酒精的損傷，因此酗酒的母體沒(méi)有任何不正常表現(xiàn)時(shí)胎兒即可能已經(jīng)出現(xiàn)了 FASD。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠透過(guò)胎盤(pán)屏障，母體口服使用EGCG 400mg/ kg · d，即可有效地預(yù)防胎兒酒精相關(guān)性疾病，特別是能夠防止酒精引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā) 育障礙和腦損傷。EGCG毒性低，對(duì)胎兒的正常發(fā)育影響小。


圖1，不同劑量酒精對(duì)胚胎大小的影響圖； 圖2，各劑量酒精組Otxl、Sox2的表達(dá)水平圖3，EGCG對(duì)酒精引起的胚胎發(fā)育遲緩的抑制作用3圖4，EGCG抑制酒精所致Otxl、Sox2表達(dá)水平的下調(diào)； 圖5，不同處理組的ROS指標(biāo)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。1.酒精對(duì)胚胎發(fā)育的影響
1)對(duì)孕8 天(G8)的 C57BL/6J 小鼠腹腔注射 0,0. 005,0. 01,0. 015,0. 02ml/g 的 25% 的乙醇，每組3只孕鼠，在G10. 25取出胚胎在解剖顯微鏡下解剖并觀察其形態(tài)，測(cè)量頭長(zhǎng) (HL)、頭寬(冊(cè))和頭臀長(zhǎng)(CRL)；另外，同樣對(duì)孕8天(G8)的C57BL/6J小鼠腹腔注射0、 0. 005,0. 01,0. 015,0. 02ml/g的25%的乙醇，每組3只孕鼠，在G9. 25時(shí)取出胚胎并取腦組 織用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)；
2)取1 μ g 總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成為 cDNA，反應(yīng)為 37°C 15min, 85°C 5 秒。cDNA 用 Premix Taq進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR。Otxl的引物為正義5，GCAGAGCGGGAATGGAAC3，(SEQ ID NO: 1)，反義5，AGATGGACGAAGCAGTAGGC3，(SEQ ID NO 2) (PCR 產(chǎn)物 239bp) ;Sox2 的引物為: 正義5‘AACCAGCGCATGGACAGC3‘ (SEQ ID NO :3)，反義5，CGGACTTGACCACAGAGCC3，(SEQ ID NO 4) (PCR 產(chǎn)物 281bp)；內(nèi)參 β -actin 引物為正義5，ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3，(SEQ ID NO :5)，反義5，AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3，(SEQ ID NO 6) (PCR 產(chǎn)物 517bp)。PCR 反 應(yīng)程序94°C 3min，28 個(gè)循環(huán)(94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec),72°C 7min。PCR 產(chǎn) 物上樣到含有SYBR Safe DNA染料(0. 1 μ g/ml)的1. 0 %瓊脂糖上，在TBE中以IOOv的電 壓跑40min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果；
3)取15μ g總蛋白100°C變性5min，加入等體積2X SDS蛋白電泳上樣緩沖液，混勻 上樣，并加蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker —起電泳(200V，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部或進(jìn)入電 泳槽)；電轉(zhuǎn)膜，70V，lh，可見(jiàn)預(yù)染Marker亦轉(zhuǎn)至PVDF膜上；TBST洗膜，5minX 3次；封閉 液室溫封閉，2h (封閉完不洗膜)；加一抗(1:1000)孵育，4°C振蕩過(guò)夜；TBST洗膜，5minX6 次；加HRP標(biāo)記的二抗(1 1000)，室溫孵育Ih ；TBST洗膜，5minX6次；暗室曝光現(xiàn)配發(fā)光 液，將ECL試劑盒的A液和B液按1 1混合的，滴加至膜上，在暗室進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean 士 SEM表示。結(jié)果用 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 12. 0分析，數(shù)據(jù)的多重比較用one-way AN0VA，變量的相關(guān)性用Pearson 分析，P <0.05表示具有顯著差異。2. EGCG對(duì)FASD的預(yù)防作用:
在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，孕鼠在G8的10:30時(shí)腹腔注射25%乙醇0. 02ml/g,并在G7和G8的 10:00和14:00用EGCG灌胃，劑量分別為0,100,150和200mg/kg (相當(dāng)于0、200、300和 400mg/kg*d)，在G10. 25取出胚胎在解剖顯微鏡下解剖并觀察其形態(tài)，測(cè)量頭長(zhǎng)(HL)、頭寬 (HW)和頭臀長(zhǎng)(CRL)。另外，在G9. 25時(shí)取出胚胎并取腦組織，按上述方法進(jìn)行RT-PCR和 Western blot 檢測(cè)。3.氧化應(yīng)激在FASD中的作用及EGCG的作用機(jī)制
動(dòng)物分為 4 組，每組 3 只孕鼠(1) LR (G8 時(shí) 0. 02ml/g)+ NS (G7、8 時(shí) 0. 02ml/g .d); (2) EtOH (G8 時(shí) 0. 02ml/g) + NS (G7、8 時(shí) 0. 02ml/g · d) ； (3) EtOH (G8 時(shí) 0. 02ml/g) + EGCG (G7、8 時(shí) 400mg/kg · d) ； (4) LR (G8 時(shí) 0. 02ml/g) + EGCG (G7、8 時(shí) 400mg/kg · d)。
4在G9. 25時(shí)取胚胎腦組織用試劑盒檢測(cè)H2O2和MDA。結(jié)果
1.乙醇引起明顯的胚胎發(fā)育遲滯
圖1所示，在G8對(duì)孕鼠腹腔注射25%乙醇0. 005,0. 01,0. 015和0. 02ml/g,正常對(duì)照 組注射LR 0. 02ml/g，在G10. 25時(shí)觀察胚胎的形態(tài)。爐<0. 05，與正常對(duì)照組相比較有明顯 差異。分別從5個(gè)組的3只孕鼠得到23、23、22、20和19個(gè)胚胎。ANOVA分析各酒精組的 HL、HW和CRL均較正常對(duì)照組明顯減小。Pearson分析得到HL、HW和CRL與酒精劑量成負(fù) 相關(guān)，/X0. 01。正常組的 HL、冊(cè)和 CRL 為 2. 4 士 0.04 mmU. 54 士 0.02 mm 和 5. 00 士 0.06 mm，而 EtOH 0. 02ml/g 組的 HL、HW 和 CRL 為 1. 86 士 0.05 mm、1.16 士 0.02 mm 和 4.12 士 0.08 mm。圖中的照片是各組胚胎的典型圖片，從圖中也可直觀地看出各組的形態(tài) 大小變化。圖2所示為正常對(duì)照組和各劑量酒精組的RT-PCR和Western blot結(jié)果及灰度分 析結(jié)果。由圖可見(jiàn)，當(dāng)酒精劑量達(dá)0. 015ml/g時(shí)可出現(xiàn)Otxl和Sox2的表達(dá)水平明顯下調(diào)。 Otxl和Sox2是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要標(biāo)志，在G8到G9. 5期間它們的表達(dá)水平是逐漸增加 的，用酒精處理后其出現(xiàn)下調(diào)，從另一方面說(shuō)明了酒精引起了胚胎發(fā)育遲緩。2. EGCG抑制乙醇所致胚胎發(fā)育遲滯
圖3中的柱狀圖顯示了各處理組的HL、冊(cè)和CRL。爐<0. 05與正常對(duì)照組比較。從酒精 對(duì)照組、EGCG預(yù)防組、藥物對(duì)照組和正常對(duì)照組分別得到19、18、21、18、18和23個(gè)胚胎?？?見(jiàn)注射酒精引起的胚胎發(fā)育遲緩可不同程度地由EGCG緩解，當(dāng)EGCG用量達(dá)到400mg/kg-d 時(shí)，胚胎的形態(tài)指標(biāo)和正常對(duì)照組已無(wú)明顯差異。單用EGCG 400mg/kg*d的胚胎大小和正 常對(duì)照組比亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用Pearson法分析使用了酒精的4個(gè)組的EGCG劑量和胚胎 大小，結(jié)果HL、冊(cè)和CRL均和EGCG的劑量呈正相關(guān)。圖中的照片是各組胚胎的典型圖片。圖4為各處理組的RT-PCR和Western blot結(jié)果，用EGCG不同劑量時(shí)可對(duì)抗酒精 引起的Otxl和Sox2下調(diào)，當(dāng)EGCG劑量為400mg/kg · d時(shí)，Otxl和Sox2的表達(dá)水平已非 常接近正常對(duì)照組。3. EGCG抑制酒精引起的ROS聚集
在G8時(shí)給孕鼠腹腔注射25%Et0H 0. 02ml/g,G9. 25時(shí)取胚胎的腦組織檢測(cè)H2O2和MDA 濃度。酒精組的H2O2和MDA水平較正常對(duì)照組明顯升高(/X0. 05)，而在G7、8時(shí)給予400mg/ kg ·(!的EGCG的胚胎，這2項(xiàng)指標(biāo)則沒(méi)有明顯的變化。單給EGCG而沒(méi)有給酒精的胚胎也沒(méi) 有出現(xiàn)氧化應(yīng)激指標(biāo)的異常。(圖5)可見(jiàn)，EGCG對(duì)胚胎的正常發(fā)育也無(wú)明顯副作用。EGCG作為預(yù)防性用藥，通過(guò)少次口服即可成功地抑制酒精引起的胚胎發(fā)育遲緩。
權(quán)利要求
沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素在胎兒酒精相關(guān)性疾病干預(yù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了沒(méi)食子酸表沒(méi)食子酸兒茶素在胎兒酒精相關(guān)性疾病干預(yù)中的應(yīng)用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，EGCG能夠透過(guò)胎盤(pán)屏障，母體口服使用EGCG400mg/kg·d，即可有效地預(yù)防胎兒酒精相關(guān)性疾病，特別是能夠防止酒精引起的神經(jīng)損傷。EGCG毒性低，對(duì)胎兒的正常發(fā)育影響小。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101983627SQ20101022516
公開(kāi)日2011年3月9日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日
發(fā)明者何蕾, 彭英, 李藝, 龍玲 申請(qǐng)人:中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院