專利名稱：抗cd20單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對人⑶20抗原的單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過基因重組產(chǎn) 生的嵌合抗⑶20單克隆抗體和人源化抗⑶20單克隆抗體，以及包含這些抗體中的任一種 作為活性成分的用于B細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤或免疫疾病的治療劑。
背景技術(shù)：
作為識別CD20抗原的單克隆抗體，已知B1、2B8(嵌合抗體名為rituximab)、1F5、 2H7等。首先，由美國IDEC Pharmaceuticals Corporation開發(fā)的嵌合抗CD20單克隆抗體 rituximab已經(jīng)被建立作為低惡性非霍奇金淋巴瘤(non_Hodgkin’ s lymphoma ；NHL)的標(biāo) 準(zhǔn)治療劑，并且發(fā)現(xiàn)對于許多B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫疾病具有治療效果。例如，除了慢性淋巴性 白血病等惡性腫瘤之外，據(jù)稱其對于自身免疫溶血性貧血癥、特發(fā)性血小板減少癥紫癜等 涉及病原性自身抗體的自身免疫疾病，和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥等炎癥性疾病 是有效的(非專利文獻(xiàn)14-17)。CD20是存在于B淋巴細(xì)胞表面的分子，發(fā)現(xiàn)它存在于外周血、脾臟、扁桃體、骨髓 等的正常B細(xì)胞中，以及大多數(shù)惡性腫瘤的B細(xì)胞中。該分子包含297個氨基酸殘基，穿透 細(xì)胞膜四次，在細(xì)胞內(nèi)同時具有C末端和N末端二者，并且在第三和第四跨膜域之間具有無 糖鏈的由43個氨基酸殘基組成的唯一曝露于細(xì)胞外的環(huán)(非專利文獻(xiàn)1和9)。CD20分子 被認(rèn)為通常作為四聚物存在，并且與其它小量成分一起進(jìn)一步形成異源復(fù)合物(雜絡(luò)物； heterocomplex)(非專利文獻(xiàn)18)。由于⑶20蛋白不分泌至細(xì)胞外并且不被切割，除此之 外，其幾乎不通過抗體結(jié)合被吸納進(jìn)入細(xì)胞，所以能夠預(yù)見基于抗體而針對靶細(xì)胞的細(xì)胞 毒性機(jī)制可有效地發(fā)揮作用(非專利文獻(xiàn)1至3)。盡管CD20的分子尺寸小，其表現(xiàn)出多樣化的表位，一部分原因來自它們作 為細(xì)胞外復(fù)合物的表達(dá)形式產(chǎn)生的影響，以及與其結(jié)合的抗體介導(dǎo)多種不同的生物 應(yīng)答。例如，B細(xì)胞受體的負(fù)調(diào)節(jié)、MHC類II抗原和粘著分子表達(dá)的增加、在超交聯(lián) (hyper-cross-linking)存在下Ca2+釋放的活化、與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原1非依賴性同 型粘著的抑制、凋亡的誘導(dǎo)或相反的對細(xì)胞增殖的促進(jìn)等活性變化顯著(非專利文獻(xiàn)4至 13)。代表性抗⑶20抗體rituximab、Bl、lF5和2H7也具有不同的特性和生物學(xué)功能，僅提 及“結(jié)合于CD20的單克隆抗體”無法指定其生物學(xué)性質(zhì)。構(gòu)成CD20胞外域的分子是不溶性的。盡管能夠通過使用表面活性劑或強(qiáng)堿將源 自細(xì)胞溶解物或作為基因重組蛋白的⑶20分子溶解，在這種處理條件下保持天然的三維 結(jié)構(gòu)卻是困難的。因此，將CD20陽性B細(xì)胞株用作為了獲得抗體的免疫原，然而，其免疫刺 激性質(zhì)弱，獲得成熟抗體產(chǎn)生細(xì)胞的克隆并不容易。2005年至今，小鼠/人嵌合抗體rituximab是唯一經(jīng)認(rèn)可作為治療劑的抗⑶20單克隆抗體。由于與異源分子的嵌合分子具有抗原性，通常不優(yōu)選它們作為治療劑。然而， 抗CD20抗體具有靶向和消除包括正常細(xì)胞在內(nèi)的所有B細(xì)胞的性質(zhì)，因此可以說它們基本 上不具抗原性。然而，盡管僅占幾個百分比，但已經(jīng)報導(dǎo)了在處理期間中和抗體被誘導(dǎo)的實 例，誘導(dǎo)將更有可能依賴于給藥劑量和給藥期間。因此，有望開發(fā)出具有與人相近的序列的 人源化抗體或人抗體。嵌合抗體的另一缺點是血內(nèi)半衰期短，并且β半衰期僅為3或4天。 在美國的臨床研究中，單獨投予rituximab對于低惡性度NHL復(fù)發(fā)的有效率略低于50%，說 明rituximab對50%以上的患者無效或效果差。對患有中惡性度NHL的患者的有效率更 低，僅為大約30% (非專利文獻(xiàn)14)。因此，有必要研究患者中不同反應(yīng)的原因和背景，并 且同時有望開發(fā)出具有優(yōu)良效果的抗體。非專禾丨J文獻(xiàn) 1 Leukocyte Fact Book 2nd Edition, Academic Press非專利文獻(xiàn) 2 =Stashenko P et al.，J. Immunol.，1980，125 1678-85非專利文獻(xiàn)3 =Anderson KC et al.，Blood, 1984,63 1424-33非專利文獻(xiàn)4 =Shan D et al. , Blood, 1998,91 1644-52非專利文獻(xiàn)5 =Flieger D et al.，Cell Immunol.，2000，204 :55_63非專利文獻(xiàn) 6 =Mathas S et al.，Cancer Res.，2000，60 :7170_6非專利文獻(xiàn) 7 :Cardarelli PM et al.，Cancer Immunol. Immunother.，2002，51 15-24非專利文獻(xiàn)8 =Pedersen IM et al.，Blood，2002，99 1314-9非專利文獻(xiàn)9 =Deans JP et al.，Imminol.，2002，107 176-82非專利文獻(xiàn)10 =Golay JT et al.，J. Immunol.，1992，149 :300_8非專利文獻(xiàn) 11 =Bourger I et al.，Eur. J. Immunol.，1993,23 :768_71非專利文獻(xiàn)12 =White MW et al.，J. Immunol.，1991，146 :846_53非專利文獻(xiàn) 13 =Shan D et al.，Cancer Immunol. Immnother.，2000，48 :673_83非專利文獻(xiàn)14 =Coiffier B et al.，Blood, 1998,92 :1927_32非專利文獻(xiàn) 15 =Edward JC et al.，Rheumatology (Oxford), 2001,40 :205_11非專利文獻(xiàn) 16 =Zaja F et al.，Heamatologica, 2002,87 189-95非專利文獻(xiàn) 17 =Perrotta S et al.，Br. J. Haematol.，2002，116 :465_7非專利文獻(xiàn)18 =Polyak MJ et al.，Blood, 2002,99 :3256_6
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是提供具有優(yōu)于常規(guī)抗CD20單克隆抗體治療劑的生物學(xué)功能的單 克隆抗體。本發(fā)明人通過以任意組合使用兩種或兩種以上的⑶20抗原陽性B細(xì)胞株 、通過基 因工程制造的在其細(xì)胞膜上表達(dá)人CD20抗原的哺乳動物細(xì)胞、以及與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S-transferase ；GST)蛋白融合的人CD20蛋白作為免疫原，來獲得特異性結(jié) 合至人⑶20抗原的鼠源抗⑶20單克隆抗體。其中某些在無效應(yīng)細(xì)胞的體外⑶20表達(dá)細(xì) 胞培養(yǎng)中，具有包括凋亡等直接的細(xì)胞增殖抑制活性。此外，與凋亡等細(xì)胞增殖抑制活性的 存在與否無關(guān)，包括其它選擇的鼠源抗CD20單克隆抗體，通過嵌合化將這些抗體賦予有效 的補(bǔ)體依賴性或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。通過將其中具有最理想生物學(xué)活性的抗體的氨基酸序列人源化，制備出能夠用作治療劑的抗CD20單克隆抗體。由此完成本發(fā)明。本發(fā)明提供以下內(nèi)容。(1) 一種鼠源抗CD20單克隆抗體，其在不存在效應(yīng)細(xì)胞的CD20抗原表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng) 中，對人⑶20抗原表達(dá)細(xì)胞具有包括凋亡的細(xì)胞增殖抑制活性。(2)根據(jù)(1)的抗CD20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L鏈可 變區(qū)的氨基酸序列是 SEQ ID N0S :1 禾口 7、SEQ ID N0S :2 禾口 8 或 SEQID N0S 15 禾口 17。(3) 一種雜交瘤，其產(chǎn)生根據(jù)(1)或(2)的抗⑶20單克隆抗體。(4) 一種嵌合抗CD20單克隆抗體，其中將根據(jù)(2)的抗CD20單克隆抗體可變區(qū)的 氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列融合。(5) 一種抗⑶20單克隆抗體，其通過使用根據(jù)(2)的抗⑶20單克隆抗體可變區(qū)的 互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列人源化。(6)根據(jù)(5)的人源化抗CD20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L 鏈可變區(qū)的氨基酸序列的組合是SEQ ID N0S :19和23、SEQ ID N0S :19和24、SEQ ID NOS
19和 25、SEQ ID NOS 19 和 26、SEQ ID NOS :20 和 23、SEQ ID NOS :20 和 24、SEQ ID NOS
20和 25、SEQ ID NOS :20 禾口 26、SEQ ID NOS 21 和 23、SEQ ID NOS 21 和 24、SEQ ID NOS
21和 25、SEQID NOS 21 和 26、SEQ ID NOS 22 和 23、SEQ ID NOS 22 和 24、SEQ ID NOS 22和25或SEQ ID NOS 22和26的組合。(7)根據(jù)(4)_(6)任一項的抗CD20單克隆抗體，在人補(bǔ)體存在下，所述抗CD20單 克隆抗體對CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。(8) 一種哺乳動物細(xì)胞，其并入編碼根據(jù)(4)至(7)任一項的抗CD20單克隆抗體 氨基酸序列的堿基序列。(9)根據(jù)(8)的哺乳動物細(xì)胞，其為中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞。(10) 一種鼠源抗CD20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L鏈可變 區(qū)的氨基酸序列的組合是SEQ ID NOS :3和9、SEQ ID N0S 4和10、SEQ ID NOS :5和11、 SEQ ID N0S 6 禾口 12 或 SEQ ID N0S 16 禾口 18 的組合。(11) 一種雜交瘤，其產(chǎn)生根據(jù)(10)的抗⑶20單克隆抗體。(12) 一種嵌合抗CD20單克隆抗體，其中將根據(jù)(10)的抗CD20單克隆抗體可變區(qū) 的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列融合。(13) 一種抗⑶20單克隆抗體，其通過使用根據(jù)(10)的抗⑶20單克隆抗體可變區(qū) CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列來進(jìn)行人源化。(14)根據(jù)(12)或(13)的抗CD20單克隆抗體，在人補(bǔ)體存在下，所述抗CD20單克 隆抗體對CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。(15) 一種哺乳動物細(xì)胞，其并入編碼根據(jù)(12)至(14)任一項的抗CD20單克隆抗 體氨基酸序列的堿基序列。(16)根據(jù)(15)的哺乳動物細(xì)胞，其為CH0細(xì)胞。(17) 一種診斷劑，其包含根據(jù)(2)、(4)至(7)、(10)和(12)至(14)任一項的抗 CD20單克隆抗體作為有效成分。(18) 一種治療劑，其包含根據(jù)⑷至(7)和(12)至(14)任一項的抗CD20單克隆 抗體作為有效成分。
如上定義的單克隆抗體氨基酸序列中的氨基酸可以用其它氨基酸置換，只要其二 級結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)沒有顯著改變，并且這些如上所述將氨基酸序列改變的單克隆抗體同 樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及1. 一種鼠源抗⑶20單克隆抗體，其特征為在無效應(yīng)細(xì)胞的⑶20抗原表達(dá)細(xì)胞培 養(yǎng)中，對人⑶20抗原表達(dá)細(xì)胞具有包括凋亡在內(nèi)的細(xì)胞增殖抑制活性。2.根據(jù)項1的抗CD20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L鏈可變 區(qū)的氨基酸序列是 SEQ ID N0S :1 禾口 7、SEQ ID N0S :2 禾口 8 或 SEQ ID N0S 15 禾口 17。3. 一種雜交瘤，其特征為產(chǎn)生根據(jù)項1或2的抗⑶20單克隆抗體。4. 一種嵌合抗⑶20單克隆抗體，其中將根據(jù)項2的抗⑶20單克隆抗體可變區(qū)的 氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列融合。5. 一種抗⑶20單克隆抗體，其特征為通過使用根據(jù)項2的抗⑶20單克隆抗體可 變區(qū)CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列將其人源化。6.根據(jù)項5的人源化抗CD20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L 鏈可變區(qū)的氨基酸序列的組合是SEQ ID N0S :19和23、SEQ IDN0S :19和24、SEQ ID NOS
19和 25、SEQ ID NOS 19 和 26、SEQ ID NOS 20 和 23、SEQID NOS 20 和 24、SEQ ID NOS
20和 25、SEQ ID NOS 20 和 26、SEQ ID NOS 21 和 23、SEQ ID NOS 21 和 24、SEQ ID NOS 21和 25、SEQ ID NOS 21 和 26、SEQ ID NOS :22和 23、SEQ ID NOS :22和 24、SEQIDN0S 22 和25或SEQ ID NOS 22和26的組合。7.根據(jù)項4或-6任一項的抗⑶20單克隆抗體，在人補(bǔ)體存在下，所述抗⑶20單 克隆抗體對CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。8. 一種哺乳動物細(xì)胞，其特征為并入編碼根據(jù)項4至7任一項的抗CD20單克隆抗 體氨基酸序列的堿基序列。9.根據(jù)項8的哺乳動物細(xì)胞，其為CH0細(xì)胞。10. 一種鼠源抗⑶20單克隆抗體，其中所述H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和L鏈可變 區(qū)的氨基酸序列的組合是SEQ ID N0S 3和9、SEQ ID N0S 4和10、SEQ ID NOS :5和11、 SEQ ID N0S 6 禾口 12 或 SEQ ID N0S 16 禾口 18 的組合。11. 一種雜交瘤，其特征為產(chǎn)生根據(jù)項10的抗⑶20單克隆抗體。12. 一種嵌合抗CD20單克隆抗體，其中將根據(jù)項10的抗CD20單克隆抗體可變區(qū) 的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列融合。13. 一種抗⑶20單克隆抗體，其特征為通過使用根據(jù)項10的抗⑶20單克隆抗體 可變區(qū)的CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列將其人源化。14.根據(jù)項12或13的抗⑶20單克隆抗體，在人補(bǔ)體存在下，所述抗⑶20單克隆 抗體對CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。15. 一種哺乳動物細(xì)胞，其特征為并入編碼根據(jù)項12至14任一項的抗⑶20單克 隆抗體氨基酸序列的堿基序列。16.根據(jù)項15的哺乳動物細(xì)胞，其為CH0細(xì)胞。17. 一種診斷劑，其特征為包含根據(jù)項2、4至7、10和12至14任一項的抗⑶20單 克隆抗體作為有效成分。
18. 一種治療劑，其特征為包含根據(jù)項4至7和12至14任一項的抗⑶20單克隆 抗體作為有效成分。附圖簡述[

圖1]重組抗體表達(dá)用載體pNOW-Ab的結(jié)構(gòu)。[圖2]蛋白表達(dá)用載體pNOW-Ag的結(jié)構(gòu)。[圖3]人⑶20基因克隆用引物的序列。[圖4]鼠源抗CD20單克隆抗體H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列。[圖5]使用鼠源抗CD20單克隆抗體的凋亡試驗的結(jié)果。[圖6]使用鼠源抗CD20單克隆抗體的細(xì)胞增殖抑制試驗的結(jié)果。[圖7]使用嵌合抗CD20單克隆抗體的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果。[圖8A]人源化抗CD20單克隆抗體H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其相應(yīng)的堿 基序列。[圖8B]人源化抗CD20單克隆抗體H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其相應(yīng)的堿
基序列。[圖9]使用人源化抗CD20單克隆抗體的細(xì)胞增殖抑制試驗的結(jié)果。實施本發(fā)明的最佳方式在本發(fā)明中，所用術(shù)語“抗體”的意思包含通常意義上的抗體、構(gòu)成它的H鏈和L 鏈，及其片段。本發(fā)明涉及結(jié)合至細(xì)胞膜上人⑶20抗原的、具有有望誘導(dǎo)出治療效果的生物學(xué) 活性的抗CD20單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式的抗體是特異性結(jié)合至細(xì)胞膜上人CD20抗原的單克 隆抗體，并且在無效應(yīng)細(xì)胞輔助的CD20抗原表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)中，所述單克隆抗體對人CD20抗 原表達(dá)細(xì)胞具有包括凋亡的細(xì)胞增殖抑制活性。所述單克隆抗體原為鼠源抗CD20單克隆 抗體，并且進(jìn)一步包括通過嵌合化或人源化該抗體而獲得的抗CD20單克隆抗體。在無效應(yīng) 細(xì)胞輔助的CD20抗原表達(dá)細(xì)胞體外培養(yǎng)中，這些抗體對人CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有包括凋 亡的直接的細(xì)胞增殖抑制活性。這些嵌合化或人源化的抗CD20單克隆抗體具有補(bǔ)體依賴 性和/或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。對于細(xì)胞膜上⑶20抗原的結(jié)合性，能夠通過Cell ELISA進(jìn)行調(diào)查，其中將SB細(xì) 胞和Raji細(xì)胞等CD20表達(dá)細(xì)胞附著于平板上，并且與待試驗的單克隆抗體反應(yīng)。然而， 由于這些細(xì)胞的CD20抗原表達(dá)水平不充分，所以反應(yīng)性不敏感。因此，在本發(fā)明中開發(fā)的 Cell ELISA方法，將通過基因重組大量表達(dá)⑶20的CH0細(xì)胞(⑶20/CH0細(xì)胞)附著于平 板上，并且與待試驗的單克隆抗體反應(yīng)。在本發(fā)明的預(yù)備試驗中，確認(rèn)在單克隆抗體反應(yīng)性 試驗中，使用⑶20/CH0細(xì)胞的Cell ELISA顯示出類似于使用SB細(xì)胞或Raji細(xì)胞的Cell ELISA中的相同圖式(pattern)，并且顯示高敏感性(參見實施例⑶20/CH0 Cell ELISA篩 選方法的確立，表1)。在無效應(yīng)細(xì)胞的人CD20抗原表達(dá)細(xì)胞體外培養(yǎng)中的直接的細(xì)胞增殖抑制活性能 夠通過常規(guī)方法測定(Miyamoto T et al. , Avian Dis.，Vol. 46 (1)，10-16)。此外，凋亡誘 導(dǎo)能力能夠通過使用流式細(xì)胞術(shù)(膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠(propidium iodide ；PI)染色) 的試驗來測定。
根據(jù)第一實施方式的抗體的實例包括具有H鏈可變區(qū)氨基酸序列和L鏈可變區(qū) 氨基酸序列SEQ ID N0S :1和7、SEQ ID N0S :2和8或SEQ ID N0S :15和17所規(guī)定氨基酸 序列的組合的小鼠抗CD20單克隆抗體，以及通過嵌合化或人源化這些抗體獲得的抗CD20 單克隆抗體。在無效應(yīng)細(xì)胞輔助的CD20抗原表達(dá)細(xì)胞體外培養(yǎng)中，這些抗體對人CD20抗 原表達(dá)細(xì)胞呈現(xiàn)包括凋亡的直接的細(xì)胞增殖抑制活性。這些抗體還具有補(bǔ)體依賴性和/或 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。本發(fā)明還包括產(chǎn)生鼠源抗體的雜交瘤，和并入相應(yīng)于任 一嵌合抗體或人源化抗體氨基酸序列的堿基序列的哺乳動物細(xì)胞(實施例中的CH0細(xì)胞)。嵌合化通過將鼠源單克隆抗體H鏈可變區(qū)的氨基酸序列和人免疫球蛋白H鏈恒定 區(qū)的氨基酸序列、L鏈可變區(qū)的氨基酸序列和人免疫球蛋白L鏈恒定區(qū)的氨基酸序列融合 來進(jìn)行(Ishida T et al.，Nippon Rinsho, Vol. 60, No 3，439_444)。將人源化抗體設(shè)計 成通過使用鼠源單克隆抗體可變區(qū)CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列。優(yōu)選 作為治療劑的人源化抗CD20單克隆抗體通過比較各種設(shè)計的抗體的特性來選擇(Padlan EA,Mol. Immunol.，Vol. 28，No 4/5，489-498 ；ffu TT and Kabat EA,Mol. Immunol.，Vol. 29， No 9，1141-1146 ；Padlan EA et al.，F(xiàn)ASEB J.，Vol. 9，133-139)。嵌合化或人源化抗CD20單克隆抗體還具有補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (complement-dependent cytotoxicity ；CDC)，以及在效應(yīng)細(xì)胞存在下具有抗體依賴性細(xì)
(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ;ADCC)。胃 關(guān)這些CDC和ADCC的試驗方法，可參照通常使用的方法(Manches 0 et al.，Blood，2003， 101(3),949-54 ；Idusogie EE et al.，J. Immunol.，2000，164，4178-4184)。人源化抗CD20單克隆抗體的具體實例包括，具有H鏈可變區(qū)氨基酸序列和L鏈可 變區(qū)氨基酸序列 SEQ ID N0S :19 和 23、SEQ ID N0S 19 和 24、SEQ ID N0S 19 禾口 25、SEQ ID N0S 19 和 26、SEQ ID N0S 20 和 23、SEQID N0S 20 和 24、SEQ ID N0S 20 和 25、SEQ ID N0S 20 禾口 26、SEQ ID N0S 21 禾口 23、SEQ ID N0S 21 禾口 24、SEQ ID N0S 21 禾口 25、SEQ ID N0S :21 禾口 26、SEQ ID N0S :22 和 23、SEQ ID N0S :22 和 24、SEQ ID N0S :22 和 25 或 SEQ ID N0S 22和26所示氨基酸序列的組合的那些抗體。根據(jù)本發(fā)明的第二實施方式的抗體是特異性結(jié)合至細(xì)胞膜上人CD20抗原的鼠源 單克隆抗體，并且不呈現(xiàn)包括凋亡的細(xì)胞增殖抑制活性，或以不高的水平呈現(xiàn)這些活性。然 而，這些鼠源抗體能夠通過嵌合化或人源化獲得⑶C或ADCC活性。這些細(xì)胞毒性活性也是 重要的生物學(xué)活性，并且因此第二實施方案的抗CD20單克隆抗體也能夠作為治療劑的良 好候選。根據(jù)第二實施方式的抗體的實例包括具有H鏈可變區(qū)氨基酸序列和L鏈可變區(qū) 氨基酸序列 SEQ ID N0S :3 禾口 9、SEQ ID N0S 4 禾口 10、SEQ ID N0S :5 禾口 11、SEQ ID N0S 6 和12或SEQ ID N0S: 16和18的組合的鼠源抗⑶20單克隆抗體，以及通過嵌合化或人源 化這些抗體獲得的抗⑶20單克隆抗體。本發(fā)明還包括產(chǎn)生鼠源抗體的雜交瘤，和并入相應(yīng) 于任一嵌合抗體或人源化抗體氨基酸序列的堿基序列的哺乳動物細(xì)胞(實施例中的CH0細(xì) 胞)。用于測定對于細(xì)胞膜上CD20抗原的結(jié)合性的方法，用于測定細(xì)胞增殖抑制、凋 亡、ADCC、CDC等的各種試驗方法，和嵌合抗體或人源化抗體的制備方法，與用于第一實施方 式的抗體時提及的方法類似。
能夠預(yù)期如第一實施方式和第二實施方式的抗體所描述的嵌合抗CD20單克隆抗 體和人源化抗CD20單克隆抗體二者均呈現(xiàn)作為治療劑的優(yōu)良效果，用于B細(xì)胞介導(dǎo)的惡性 腫瘤和涉及B細(xì)胞或涉及由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的免疫性疾病，并且本發(fā)明的目的是將它們 使用在治療劑的開發(fā)中，所述治療劑包含嵌合抗CD20單克隆抗體或人源化CD20單克隆抗 體中的任一、優(yōu)選人源化抗CD20單克隆抗體作為有效成分。目標(biāo)疾病的實例包括非霍奇金 淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免 疫溶血性貧血癥、特發(fā)性血小板減少癥紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、舍格倫 綜合征(Sjogren's syndrome)、克羅恩氏病(Crohn，sdisease)、硬皮病(scleroderma)、多 發(fā)性硬化癥、I型糖尿病等。本發(fā)明的鼠源單克隆抗體能夠通過以下方法制備。作為用于致敏的免疫原，可組合使用作為表達(dá)人⑶20抗原的細(xì)胞株的SB細(xì)胞、 Raj i細(xì)胞和表達(dá)人⑶20抗原的CH0細(xì)胞。此外，可將與GST融合的人⑶20蛋白(GST-⑶20) 用作補(bǔ)充性敏化抗原。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤能夠通過一系列步驟制備，其包括(1)待免疫動物(小 鼠)的免疫，(2)從免疫動物制備淋巴細(xì)胞，(3)制備親本細(xì)胞，(4)淋巴細(xì)胞和親本細(xì)胞的 細(xì)胞融合，(5)篩選和(6)克隆(Biochemistry Experiment Method 單克隆抗體，written by Ailsa M. Campbell,translated by Toshiaki Osawa,Tokyo Kagaku Dozin Co. ,Ltd., 1989)。特異結(jié)合至細(xì)胞表面CD20抗原的抗CD20單克隆抗體能夠通過將待試驗的單克隆 抗體與Cell ELISA體系反應(yīng)來克隆，所述Cell ELISA體系中將⑶20/CH0細(xì)胞固定化在平 板上。同樣能夠使用商業(yè)上可以獲得的表達(dá)載體。然而，因為⑶20抗原需要在CH0細(xì)胞上 高密度表達(dá)，可以使用哺乳動物細(xì)胞高表達(dá)載體pN0W(日本專利號3582965)。單克隆抗體 的選擇標(biāo)準(zhǔn)是呈現(xiàn)出相當(dāng)于或高于陽性對照的反應(yīng)性。嵌合化或人源化抗體可根據(jù)常規(guī)基因重組方法制備。例如，包含串聯(lián)的2套多克 隆位點的用于產(chǎn)生抗體的pN0W-Ab可用作表達(dá)載體，并且事先將編碼人H鏈和L鏈恒定區(qū) 的基因并入該載體(圖1)。
實施例實施例1針對CD20抗原的單克隆抗體的制備、嵌合化和人源化以及所得抗體特性的試驗 將參考實施例在下面進(jìn)一步說明。(1)敏化小鼠用免疫抗原的制備通過使用SEQ ID NO 13的5，引物和SEQ ID NO 14的3，引物，從cDNA文庫獲 得人⑶20基因，所述引物對于編碼人⑶20完整分子的基因是特異性的(Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc.,6Taft Court, Suite 100， Rockville, MD 20850)。具體而言，使用圖3所示引物。將CD20基因并入作為哺乳動物細(xì)胞用高表達(dá)載 體的pN0W-Ag(圖2)，并且轉(zhuǎn)染至作為宿主細(xì)胞的CH0細(xì)胞中。通過FACS分析確立在細(xì)胞 表面高水平表達(dá)⑶20分子的重組CH0細(xì)胞(⑶20/CH0細(xì)胞)。在使用FITC標(biāo)記的抗⑶20 單克隆抗體的染色中，將與SB細(xì)胞相比顯示出5倍或更高熒光密度的細(xì)胞定義為顯示高表 達(dá)的細(xì)胞。通過使用 PGEX-4T2 載體(G et al. AM, Electrophoresis, Vol. 20(2) 344-348)將GST融合至⑶20胞外域43氨基酸殘基的N末端來制備補(bǔ)充性免疫原GST-⑶20。(2)免疫原的制備將SB細(xì)胞或Raji細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將 CD20/CH0 細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 800ii tg/ml G418 的 CHO-S-SFM II 培養(yǎng)基中(GIBCO，Cat. No. 12052-098)。將這些培養(yǎng)物離心(llOOrpm，5分鐘)，隨后向細(xì)胞添加Dulbecco，s PBS(-)并且將細(xì)胞懸浮，將懸液再次離心。將此洗滌步驟重復(fù)一次，將通過向細(xì)胞添加生 理鹽水制備的懸液(細(xì)胞計數(shù)(cell count) :1至3x 107/ml)用于免疫。將并入pGEX_4T2 的GST-CD20引入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在培養(yǎng)后溶解(lyse)所述感受態(tài)細(xì)胞，并且從溶 解的細(xì)胞粗制純化GST-CD20，隨后通過添加0. 1N氫氧化鈉溶解(solubilized)。(3)免疫和細(xì)胞融合使用7周齡至11周齡Balb/c雌性小鼠作為待免疫動物。將SB細(xì)胞、Raji細(xì)胞 或CD20/CH0細(xì)胞以不同天數(shù)間隔重復(fù)施用兩次或三次，隨后選擇不同的細(xì)胞抗原(SB細(xì) 胞、Raji細(xì)胞或CD20/CH0細(xì)胞)并且用于最終免疫。所施用的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞類型無關(guān)，為 每只小鼠1至3x 107。進(jìn)一步通過對部分小鼠使用GST-⑶20進(jìn)行補(bǔ)充性免疫。在最終免 疫的三天之后，從小鼠提取脾臟細(xì)胞，在RPMI培養(yǎng)基中懸浮，并且在PEG-1500存在下進(jìn)行 與小鼠骨髓瘤(NS-1)的融合反應(yīng)(0i，VT et. Herzenberg, 1980, in Selected Methods in Cellular Immunology ；Mishell B et al. (Freeman and Co. ,San Francisco,CA)p. 351)。(4) CD20/CH0 Cell ELISA 篩選方法的確立通過使用SB細(xì)胞、Raji細(xì)胞、⑶20/CH0細(xì)胞和⑶20的CH0親本細(xì)胞系附著于其 上的96孔平板，使幾種鼠源抗⑶20單克隆抗體和2B8與之反應(yīng)。在這些Cell ELISA試驗 中確認(rèn)，對于抗體濃度觀察到相似的趨勢，并可知抗體之間的相對比較以及與對照的比較 也是可能的。由于在⑶20/CH0Cell ELISA中附著于平板表面細(xì)胞抗原的高密度，觀察到的吸光率水平足以使得 相對低濃度的試驗抗體樣品也能被檢出，并且將其認(rèn)為是一種靈敏測量體系。具體測量結(jié) 果示于表1。
體而言，將附著于聚L-賴氨酸涂覆的96孔平板(Asahi Techno Glass Corporation，目 錄號11-023-018)的CD20/CH0細(xì)胞或CH0細(xì)胞(親本細(xì)胞系)用于Cell_ELISA。向每 個孔添加150 u 1體積的封閉溶液(0. 2%明膠和0. 5% BSA的PBS溶液)并且在37°C放 置1小時。然后，將所述平板用150mM NaCl和0. 05% Tween 20水溶液洗滌5次，并且將 100 yl的各樣品(培養(yǎng)物上清液的稀釋溶液)添加至每個孔中以在37°C進(jìn)行1小時的1 次反應(yīng)。洗滌之后，將100 ill標(biāo)記的抗體[HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG(H+L)兔抗體(Jackson Lab.，Code No. 315-035-003)或 HRP 標(biāo)記的抗小鼠 IgG(Fc y )兔抗體(Jackson Lab.，Code No. 315-035-008)]的稀釋溶液添加至每個孔以在37°C進(jìn)行1小時的2次反應(yīng)。對于制備1 次和2次反應(yīng)的反應(yīng)混合物，使用與封閉溶液相同的溶液。洗滌之后，將100 yl顯色溶液 (0PD)添加至各孔，30分鐘后，添加50 ill的4N H2S04以終止反應(yīng)，并且測量492nm的吸光 率(A492)。隨后，選擇顯示的反應(yīng)性相當(dāng)于或顯著高于2B8的反應(yīng)性的孔。(6)克隆通過有限稀釋方法(limited dilution method)來進(jìn)行克隆。將細(xì)胞接種至96 孔平板并培養(yǎng)，隨后對包含1個集落的孔的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行用于CD20/CH0細(xì)胞的Cell ELISA，以選擇產(chǎn)生特異性抗體的克隆。(7)純化抗體的制備將產(chǎn)生特異性抗體的克隆培養(yǎng)在添加了 10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞 密度變成大約5x 105/ml時，將所述培養(yǎng)基用無血清培養(yǎng)基ASF-104N(AjinOmotO Co. Inc.) 取代，繼續(xù)培養(yǎng)。然后在2至4天之后，將培養(yǎng)基離心，收集培養(yǎng)物上清液并使用G蛋白 柱(protein G column)對其進(jìn)行純化。將洗提的(eluted)單克隆抗體溶液相對于150mM NaCl進(jìn)行透析。對所述溶液使用具有0. 2 y m孔大小的濾器進(jìn)行過濾除菌并且用作試驗抗 體(抗人CD20小鼠單克隆抗體)。通過⑶20/CH0 Cell ELISA選擇顯示出相當(dāng)于陽性對照的結(jié)合親和性(binding affinity)的單克隆抗體克隆。測定這些抗體可變區(qū)的基因序列，并且由此確定他們的氨基 酸序列。典型抗體H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的序列示于SEQ ID N0S:1和7、SEQ ID N0S 2 和 8、SEQ ID N0S 3 和 9、SEQ ID N0S 4 和 10、SEQ ID N0S 5 禾口 11、SEQ ID N0S 6 禾口 12、 SEQ ID N0S 15和17，和SEQ ID N0S :16和18(圖4)。進(jìn)一步研究了這些克隆的生物學(xué)特 性。生物學(xué)特性試驗(1)凋亡誘導(dǎo)試驗試驗抗體的凋亡誘導(dǎo)能力通過流式細(xì)胞術(shù)(膜聯(lián)蛋白V/PI染色)來測定。將2B8 用作陽性對照，并且將針對人CD3的小鼠單克隆抗體(BD PharMingen)用作陰性對照。方 法如下。使用MEBCYT0 Apoptosis Kit(MBL, Cat. No. 4700，Lot. 20)。將Raji細(xì)胞離心，隨后在包含10% FCS (失活的)的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基(ICN， Cat. No. 2916754，Lot 8005C)中懸浮，將lml密度為5x 105細(xì)胞/ml的懸液添加至12孔平 板的各個孔中。對于每個抗體使用12個孔，并且將各個抗體以2 u g/ml或4 u g/ml的終濃 度添加(3個孔x 2種不同的濃度x 2個時間點，總共12個孔)。在培養(yǎng)開始后的第一天和第二天，收集包含大約2xl05細(xì)胞的培養(yǎng)基，并將其離 心，隨后將細(xì)胞用PBS洗滌一次。接下來，將85 yl的結(jié)合緩沖液添加至細(xì)胞以將細(xì)胞懸浮在該緩沖液中。此外，向懸液添加10iU膜聯(lián)蛋白V-FITC和5iU PI，充分混合，并且使其 在室溫避光反應(yīng)15分鐘。測量通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS Calibur,Becton Dickinson)進(jìn)行， 并且使用 CellQuest(Becton Dickinson)分析結(jié)果。8種典型鼠源抗CE20單克隆抗體、陽性對照(2B8)和陰性對照(抗CD3抗體)的測 量結(jié)果示于圖5。通常而言，認(rèn)為2B8的凋亡誘導(dǎo)能力是高的。即使與此相比，H鏈可變區(qū)和 L鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID N0S :2和8的克隆(1K1791)仍顯示出顯著較高的凋亡 誘導(dǎo)活性。還在H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的氨基酸是SEQ ID N0S :1和7的克隆(1K1422) 以及是SEQ ID N0S:15和17的克隆(1K0924)中，觀察到明顯歸因于凋亡的細(xì)胞死亡。生物學(xué)特性試驗(2)細(xì)胞增殖抑制試驗使用添加了 10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基來制備5x 104細(xì)胞/ml的Raji細(xì)胞 懸液，以100 ill/孔的體積添加至96孔平板，并進(jìn)行培養(yǎng)。24小時之后，以0. 01 y g/ml、 0. 1 U g/ml或1 y g/ml的抗體濃度添加50 u 1/孔的各抗體溶液，繼續(xù)培養(yǎng)?？贵w添加的72 小時之后，添加10 ill/孔的顯色溶液Cell CountingKit-8 (Dojindo Laboratories,目錄號 343-07623, Lot SG076)，再將細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行4小時，隨后測量492nm的吸光率。典型的8種 鼠源抗CD20單克隆抗體和陽性對照(2B8)的活細(xì)胞計數(shù)作為基于陰性對照(100%)的百 分?jǐn)?shù)示于圖6?；谂c陰性對照比較所減少的活細(xì)胞計數(shù)的比率，能夠估計出細(xì)胞增殖抑制 效果。在1K0924、1K1422、1K1791和作為陽性對照的2B8中觀察到明顯的細(xì)胞增殖抑制，并 且所述抑制在1K1791中尤其顯著。這種趨勢與凋亡誘導(dǎo)試驗的結(jié)果一致。嵌合抗體的制備將編碼各鼠源抗體的H鏈和L鏈可變區(qū)的基因并入用于CH0細(xì)胞的高表達(dá)載 體pN0W-Ab，所述載體已經(jīng)將編碼人免疫球蛋白H鏈和L鏈(k)恒定區(qū)的基因作為盒 (cassette)包含在內(nèi)。使各表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入CH0細(xì)胞，并且對于各抗體選擇出顯示高生產(chǎn) 率(productivity)的克隆。對嵌合抗體的CD20抗原的結(jié)合性試驗通過⑶20/CH0 Cell ELISA檢驗制備的8種嵌合抗⑶20單克隆抗體對人⑶20抗 原的反應(yīng)性。將Rituximab(C2B8)用作陽性對照。試驗結(jié)果示于表2。Cell ELISA中的測 量值(A492)反映結(jié)合性的強(qiáng)度。這些抗體顯示出基本上相當(dāng)于或高于對照的親和性，除了 C1K0924和C1K1422傾向于顯示出稍低于對照的親和性。表2 抗 CD20 嵌合抗體的 CD20/CH0 Cell ELISA 試驗 嵌合抗體的⑶C試驗檢驗制備的8種嵌合抗⑶20單克隆抗體的⑶C活性。將RituXimab(C2B8)用作陽 性對照。將RC-K8 (從Kochi Medical School獲得)用作靶細(xì)胞。制備并且使用RHB (基 礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640，添加劑0. 1% BSA、20mMHEPES(pH 7. 2)、2mM 谷氨酰胺、100 單位 /ml 青霉素G、100i!g/ml鏈霉素)作為所使用的培養(yǎng)基。使用RHB洗滌靶細(xì)胞并且以106細(xì)胞 /ml重懸。將體積為50 u 1的不同濃度的各試驗嵌合抗體和rituximab溶液、50 u 1商業(yè)上 可以獲得的人補(bǔ)體(Quidel，San Diego, CA，Cat. A 113)的4倍稀釋溶液和50 u 1含有106 細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液添加至平底96孔組織培養(yǎng)平板(黑色)的各孔中。將150 u 1/孔的混 合物中的抗體濃度設(shè)為0. 1、1和10ii g/ml。為了促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解，將所述混合物 在37°C和5% C02的條件下溫育2小時。向所述混合物添加50 u 1 Alamar blue (未稀釋， AccuMed International的配方，Biosource，Cat. DAL1100)，并且使反應(yīng)在相同的條件下過 夜。將平板置于室溫10分鐘以冷卻，使用熒光微平板閱讀器(fluorescence microplate reader)，在530nm激發(fā)，測量在590nm發(fā)射的熒光。結(jié)果以熒光強(qiáng)度(RFU)表示。⑶C活性 的比率根據(jù)以下方程式計算%cdc活性=100x{RFU(未添加抗體)-RFU(添加了抗體)}/{RFU(未添加抗 體]-RFU(添加了 Triton X-100)}結(jié)果示于圖7。除了 C1K1712，抗體顯示出基本上相當(dāng)于或高于作為陽性對照的 C2B2的CDC活性。人源化抗體的制備將人源化抗體基于鼠源抗⑶20單克隆抗體1K1791的可變區(qū)⑶R來設(shè)計。通過 進(jìn)行基于氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析并且進(jìn)一步改變設(shè)計方法，對于每種H鏈和L鏈各制備4 種人源化序列(Padlan EA, Mol. Immunol.，Vol. 28，No4/5，489-498 ；ffu TT and Kabat EA, Mol. Immunol.，Vol.29，No 9，1141-1146 ；Padlan EA et al.，F(xiàn)ASEB J.，Vol.9，133-139)。 使用各種H鏈和L鏈的所有4種可能的組合來制備抗體。這些氨基酸序列示于SEQ ID N0S 19 禾口 23、SEQ ID
N0S :19 和 24、SEQ ID N0S 19 和 25、SEQ ID NOS :19 和 26、SEQ ID N0S:20 禾口 23、 SEQ ID NOS 20 和 24、SEQ ID NOS 20 和 25、SEQ ID NOS 20 和 26、SEQ ID NOS 21 和 23、 SEQ ID NOS 21 和 24、SEQ ID NOS 21 和 25、SEQ ID NOS 21 和 26、SEQ ID NOS 22 和 23、 SEQ ID NOS 22 和 24、SEQID NOS 22 和 25 以及 SEQ ID NOS 22 和 26 (圖 8A 和 8B)。將這4種H鏈可變區(qū)和4種L鏈可變區(qū)的氨基酸序列使用最頻繁用于人基因序 列中的密碼子轉(zhuǎn)化成DNA (堿基)序列，考慮到在宿主CH0細(xì)胞中的適應(yīng)性，在不改變原始 氨基酸殘基的前提下，改變這些堿基中的某些(Kim CHet al. , Gene, 1997,15 ；199 (1-2) 293-301)。具體而言，作為相應(yīng)于氨基酸序列使用的堿基序列是相應(yīng)于SEQ ID N0:19的 SEQ ID N0:27、相應(yīng)于 SEQ IDN0:20 的 SEQ ID N0:28、相應(yīng)于 SEQ ID N0:21 的 SEQ ID NO: 29、相應(yīng)于 SEQ ID N0:22 的 SEQ ID NO :30、相應(yīng)于 SEQ ID NO :23 的 SEQ ID NO :31、相應(yīng) 于 SEQ ID NO: 24 的 SEQ ID NO: 32、相應(yīng)于 SEQ ID NO: 25 的 SEQ IDN0 :33 和相應(yīng)于 SEQ ID NO 26的SEQ ID NO 34(圖8A和圖8B)。在這些堿基序列中，只要不改變相應(yīng)的氨基酸序 列，所述堿基可用其它堿基取代。合成H鏈可變區(qū)的堿基序列(SEQ ID NOS :27至30)和L鏈可變區(qū)的堿基序列(SEQ ID N0S 31至34)總共8種(Takara Shuzo Co.，Ltd.)之后，并入包含多克隆位點的用于 哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體pN0W-Ab。使并入了這些人源化抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入CH0 細(xì)胞，并且對于各個抗體選擇出顯示高生產(chǎn)率的克隆。人源化抗體的生物特性和細(xì)胞增殖抑制試驗用添加了 10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基制備包含5x 104/ml Raji細(xì)胞的懸液，并 且以100 i! 1/孔的體積添加至96孔平板進(jìn)行培養(yǎng)。24小時之后，以0. 5 i! g/ml的抗體濃度 添加50 yl/孔的各種抗體溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)。抗體添加的72小時后，添加10 yl/孔的顯 色溶液 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories,目錄號 343-07623，Lot SG076)，再 將細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行4小時，隨后測量492nm的吸光率。源自1K1791的16種人源化抗體中的 15種(27個克隆)和作為陽性對照的c2B8(ritUXimab的別稱)的活細(xì)胞計數(shù)作為基于陰 性對照(100%)的百分?jǐn)?shù)示于圖9?；谂c陰性對照比較所減少的活細(xì)胞計數(shù)的比率，能 夠估計出細(xì)胞增殖抑制效果，并且對本試驗中所有克隆的增殖抑制效果進(jìn)行了觀察。本說明書和附圖中描述的單克隆抗體的名稱和序列編號總結(jié)如下表3
鼠源抗體名H鏈可變區(qū)L鏈可變區(qū)嵌合抗體名人源化可變區(qū)(H鏈/L鏈)1K1422SEQ ID NO 1SEQ ID NO 7clK1422 將產(chǎn)生這些單克隆抗體的雜交瘤基于由其產(chǎn)生的抗體名稱來命名，并且在布 達(dá)佩斯條約規(guī)定下，在2006年3月28日，國際化地保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合 ^fuPfi'Wl^^.^UM^ ^^ (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary ；Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,305-8566, Japan),并 ii ■ ■ {呆 藏號 FERM BP-10587(1K1422)、FERM BP-10591 (1K1791)、FERM BP-10588 (1K1712)、 FERM BP-10586 (1K1402)、FERMBP-10589 (1K1736)、FERM BP-10590 (1K1782)、FERM BP-10584(1K0924)和 FERM BP-10585(1K1228)。工業(yè)適用性本發(fā)明提供適合作為治療劑使用的具有生物學(xué)活性的單克隆抗體。
權(quán)利要求
一種鼠源抗CD20單克隆抗體，其在無效應(yīng)細(xì)胞的CD20抗原表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)中，對人CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有包括凋亡的細(xì)胞增殖抑制活性，其中H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NOS1和7。
2.一種雜交瘤，其產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1的抗CD20單克隆抗體。
3.一種嵌合抗CD20單克隆抗體，其中將根據(jù)權(quán)利要求1的抗CD20單克隆抗體可變區(qū) 的氨基酸序列和人免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列融合。
4.一種抗CD20單克隆抗體，其通過使用根據(jù)權(quán)利要求1的抗CD20單克隆抗體可變區(qū) CDR的氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列人源化。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的抗CD20單克隆抗體，在人補(bǔ)體或效應(yīng)細(xì)胞存在下，所述抗 CD20單克隆抗體對CD20抗原表達(dá)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
6.一種哺乳動物細(xì)胞，其并入編碼根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項的抗CD20單克隆抗體氨 基酸序列的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的哺乳動物細(xì)胞，其為CHO細(xì)胞。
8.—種診斷劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1、3至5中任一項的抗CD20單克隆抗體作為有效 成分。
9.一種治療劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的抗CD20單克隆抗體作為有效成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的抗CD20單克隆抗體在制備藥物中的用途，所述藥 物用于治療B細(xì)胞介導(dǎo)的惡性腫瘤和涉及B細(xì)胞或涉及由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的免疫性疾病。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的抗CD20單克隆抗體在制備藥物中的用途，所述藥 物用于治療選自下組的一種或多種疾病非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血 病、急性淋巴性白血病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫溶血性貧血癥、特發(fā)性血小板減少癥 紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂抗體綜合征、舍格倫綜合征、克羅恩氏病、硬皮病、多發(fā)性硬 化癥和I型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CD20單克隆抗體，更具體地，本發(fā)明公開的單克隆抗體能夠通過將其結(jié)合至細(xì)胞表面的CD20抗原來誘導(dǎo)特異性生物反應(yīng)?？寺×藢D20抗原的胞外表位具有高結(jié)合親和性并且還具有包括細(xì)胞生長抑制活性的生物學(xué)活性的單克隆抗體。將所述單克隆抗體嵌合化或人源化以開發(fā)用于涉及B細(xì)胞的疾病的治療劑。
文檔編號A61K39/395GK101870730SQ201010209079
公開日2010年10月27日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者中村徹雄, 埃杜阿多·A·帕德蘭, 沼崎正德, 臼田定和 申請人:生物醫(yī)藥股份有限公司