專利名稱：結(jié)合人il-12的人抗體及其生產(chǎn)方法
結(jié)合人IL-12的人抗體及其生產(chǎn)方法本申請是申請日為2000年3月24日，申請?zhí)枮?0807783. 5，發(fā)明名稱為“結(jié)合人 IL-12的人抗體及其生產(chǎn)方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。相關(guān)申請本申請是要求1999年3月25日提交的美國臨時申請序號60/126，603的優(yōu)先權(quán) 的非臨時申請，所述臨時申請的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
人白細胞介素12(IL_12)最近鑒定為一種細胞因子，它具有獨特的結(jié)構(gòu)和多效 作用(Kobayashi 等(1989) J.Exp Med. 170 :827_845 ;Seder 等(1993) Pro. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ；Ling 等(1995)J. Exp Med. 154 :116_127 ；Podlaski 等(1992)Arch. Biochem. Biophys. 294 230-237)。IL-12在與若干涉及免疫和炎癥反應(yīng)的疾病有關(guān)的病理 學(xué)中起著重要的作用。一篇關(guān)于IL-12、其生物活性和在疾病中的作用的綜述可見Gately 等(1998)Ann Rev. Immunol. 16 :495_521。在結(jié)構(gòu)上IL-12是一種異源二聚體蛋白(稱為“p70亞單位”)，它包含通過二硫橋 將二者連接在一起的35kDa亞單位(p35)和40kDa亞單位(p40)。所述異源二聚體蛋白主 要由諸如單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞的抗原提呈細胞產(chǎn)生。這些細胞類型還分泌相對 于p70亞單位過量的p40亞單位。p40和p35亞單位在遺傳學(xué)上是不相關(guān)的，而且也沒有關(guān) 于它們具有生物活性的報道，盡管P40同源二聚體可能具有IL-12拮抗劑的作用。在功能上，IL-12在調(diào)節(jié)抗原特異性1型T輔助(Thl)淋巴細胞和2型T輔助(Th2) 淋巴細胞之間的平衡中起重要作用。Thl和Th2細胞控制自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展， IL-12在調(diào)節(jié)Thl淋巴細胞的分化和成熟中起重要的作用。Thl細胞釋放的細胞因子是炎癥 性細胞因子，包括Y干擾素(IFNy)、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2細胞分泌IL_4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL-13促進體液免疫、過敏反應(yīng)和免疫抑制。與Thl反應(yīng)在自身免疫性疾病中占優(yōu)勢以及IFN γ的促炎活性一致的是，IL-12可 能在與許多諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)和節(jié)段性回腸炎的自身免疫性疾 病和炎癥疾病有關(guān)的病理學(xué)中起主要作用。已經(jīng)證實MS病人的IL-12的表達增加，因為文獻證實急性MS斑中存在不同水平 的 p40 mRNAo (Windhagen 等，(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996)。另外，用 MS 患者表達 ⑶40L的T細胞體外刺激抗原提呈細胞使IL-12產(chǎn)生增加(與對照T細胞相比)，這與⑶40/ ⑶40L相互作用是IL-12的有效誘導(dǎo)劑的觀測結(jié)果一致.與健康對照相比，在RA患者滑液中觀測到IL-12 p70水平升高(Morita等 (1998) Arthritis and Rheumatism. 41 :306_314)。在 RA 滑液中細胞因子信使核酸 (mRNA)表達類型鑒定主要為 Thl 細胞因子。(Bucht 等，(1996)Clin. Exp. Immunol. 103 347-367)。IL-12似乎還在與節(jié)段性回腸炎(⑶)有關(guān)的病理學(xué)中起重要作用。在節(jié)段性 回腸炎患者的腸粘膜中觀測到IFNy和IL-12表達增加(Fais等(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Am. J. Path. 150 :823_832 ；Monteleone 等，(1997) Gastroenterology. 112 1169-1178 和 Berrebi 等，(1998) Am. J. Path. 152 :667_672)。CD 患者的粘膜固有層的T細胞的細胞因子分泌類型的特征是主要為Thl反應(yīng)，包括IFNy水平 明顯升高(Fuss等，(1996) J. Immunol. 157 1261-1270)。而且，CD患者的結(jié)腸組織切片顯示 豐富的表達IL-12的巨噬細胞和表達IFN γ的T細胞(Parronchi等(1997) Am. J. Path. 150 823-832)。因為人IL-12在各種人類疾病中的作用，因此設(shè)計了各種治療策略來抑制或中 和IL-12活性。尤其是尋找結(jié)合并中和IL-12的抗體用作抑制IL-12活性的手段。某些 最早期的抗體為小鼠單克隆抗體(mAb)，它由IL-12免疫小鼠的淋巴細胞制備的雜交瘤分 泌(參見例如Strober等的世界專利申請公布號WO 97/15327 ；Neurath ^ (1995) J.Exp. Med. 182 1281-1290 ；Duchmann 等(1996) J. Immunol. 26 :934_938)。這些小鼠 IL-12 抗體 的體內(nèi)應(yīng)用受到限制，因為存在將小鼠抗體給予人類的有關(guān)問題，例如血清半衰期短、不 能激發(fā)某些人類效應(yīng)物功能以及在人體內(nèi)誘發(fā)抗小鼠抗體的不需要的免疫反應(yīng)(“human anti-mouseantibody，，(HAMA)反應(yīng))。一般來說，試圖解決在人類使用完全小鼠抗體有關(guān)問題的措施包括通過遺傳工 程改進所述抗體使其成為更接近人類的抗體。例如制備了嵌合抗體，嵌合抗體中所述 抗體鏈的可變區(qū)是鼠源性的，而所述抗體鏈的恒定區(qū)是人源性的(Junghans等(1990) Cancer Res. 50 1495-1502 ；Brown 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :2663_2667 ； Kettleborough 等(1991) Protein Engineering. 4 :773_783)。但是因為這些嵌合抗體和人 源化抗體仍然保留部分鼠序列，所以它們?nèi)匀豢赡芗ぐl(fā)不需要的免疫反應(yīng)、人抗嵌合抗體 (HACA)反應(yīng)，當(dāng)長時間給予所述抗體時尤其如此。鼠抗體或其衍生物(例如嵌合抗體或人源化抗體)的優(yōu)選IL-12抑制劑應(yīng)該為完 全人抗IL-12抗體，因為這樣的抑制劑不會激發(fā)HAMA反應(yīng)，即使長期使用也不會激發(fā)HAMA。 然而，本領(lǐng)域沒有關(guān)于這類抗體的介紹，因此仍然需要這樣的抗體。發(fā)明概述本發(fā)明提供結(jié)合人IL-12的人抗體。本發(fā)明還涉及應(yīng)用本發(fā)明的人抗IL-12抗體 治療或預(yù)防其病理學(xué)涉及IL-12的急性或慢性疾病或病癥。一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人IL-12的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個實施方案中，本發(fā)明提供選擇性突變的人IL-12抗體，包括在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點選 擇性突變?nèi)丝贵w或其抗原結(jié)合部分，使得它結(jié)合人IL-12。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供選擇性突變的人IL-12抗體，包括在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點選擇性突變?nèi)丝贵w或其抗 原結(jié)合部分，使得它結(jié)合人IL-12。在另一個優(yōu)選實施方案中，在一個以上具有增強活性氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘 變位點、接觸或超突變位點選擇性突變所述選擇性突變的人IL-12抗體或其抗原結(jié)合部 分。在另一個優(yōu)選實施方案中，在3個以下優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸或超突變位點選擇性 突變選擇性突變的人IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個優(yōu)選實施方案中，在2個以 下的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸或超突變位點選擇性突變所述選擇性誘變的人IL-12抗體 或其抗原結(jié)合部分。在再一優(yōu)選實施方案中，選擇性突變所述選擇性突變的人IL-12抗體 或其抗原結(jié)合部分，以便獲得目標(biāo)特異性親和水平，相對于當(dāng)用噬菌體展示技術(shù)對相同抗原選擇抗體時獲得的水平，所述目標(biāo)水平提高。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述選擇性突變 的人IL-12抗體還保留了至少一個需要特性，例如保留與其他蛋白或人組織的非交叉反應(yīng) 性、保留表位識別、產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分它結(jié)合 人IL-12，并且根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，它以0. Is—1或0. Is"1以下的K。ff速率常數(shù)(rate constant)與人IL-12解離，或者它以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制體外植物凝集 素母細胞增殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖.更優(yōu)選所述分離的人抗體或 其抗原結(jié)合部分以IX ΙΟ、—1或IX ΙΟ、—1以下的K。ff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者以 1X10_7M或1X10_7M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞增殖.更優(yōu)選 所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以IXlO-3S-1或IXlO-3S-1以下的K。ff速率常數(shù)與人 IL-12解離，或者以IX 10、或IXlO-8M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母 細胞增殖。更優(yōu)選所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以IXlO-4S-1或IXlO-4S-1以下的 Koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC50抑制體外PHA測定 中的植物凝集素母細胞增殖。更優(yōu)選所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以IXlO-5S-1或 1 X IO-5S-1以下的Koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X KT10M或1 X KT10M以下的IC50 抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞增殖。甚至更優(yōu)選所述分離的人抗體或其抗原結(jié) 合部分以IXicr5iT1或IXicr5iT1以下的K。ff速率常數(shù)與人il-12解離，或者以ixio_"m或 1 X IO-11M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞增殖。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重鏈⑶R2 ；以及具有包含SEQ IDNO 4氨基酸序列的輕鏈⑶R2.在一個 優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO :5氨基酸序列 的重鏈⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO :6氨基酸序列的輕鏈⑶Rl。在一個優(yōu)選實施方案 中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO :7氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； 以及具有包含SEQ ID NO 8氨基酸序列的輕鏈可變區(qū).在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重鏈⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 12氨基酸序列的輕鏈⑶R2。在一 個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID N0:13氨基酸序列的重鏈⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO 14氨基酸序列的輕鏈⑶Rl。在一個優(yōu)選實施方 案中，所述分離的人抗體具有包含SEQ ID NO: 15氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；以及具有包含 SEQ ID NO: 16氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重鏈⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 20氨基酸序列的輕鏈⑶R2。在一 個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID N0:21氨基酸 序列的重鏈⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO 22氨基酸序列的輕鏈⑶R1。在一個優(yōu)選實施 方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO :23氨基酸序列的重鏈 可變區(qū)；以及具有包含SEQ ID NO :24氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個優(yōu)選實施方案中， 所述分離的人抗體包含選自Kabat等論述的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定 區(qū)或者它們的任何等位基因變異體的重鏈恒定區(qū)(Kabat，E.A.，等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國人類健康服務(wù)部(U. S. D印artment of Heath and HumanServices)，NIH公告第91-3242號)，通過引用包括在本文中。在一個更 優(yōu)選的實施方案中，所述抗體重鏈恒定區(qū)是IgGl。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人 抗體是Fab片段或F(ab，)2片段或單鏈Fv片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含選自SEQ ID NO :404_SEQ ID NO :469的氨基酸序列的重鏈CDR3 ；以 及c)具有包含選自SEQ ID NO :534_SEQ ID NO 579的氨基酸序列的輕鏈CDR3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含選自SEQ ID NO :335-SEQ ID NO :403的氨基酸序列的重鏈CDR2 ；以及具有包含選自SEQ ID N0: 506-SEQ ID N0:533的氨基酸序列的輕鏈⑶R2。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗 體或其抗原結(jié)合部分具有包含選自SEQ ID NO :288-SEQ ID NO :334的氨基酸序列的重鏈 CDRl ；以及具有包含選自SEQ ID NO :470_SEQ ID NO 505的氨基酸序列的輕鏈CDRl。在一 個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分包括含SEQ ID N0:23氨基酸序列 的重鏈可變區(qū)；以及包括含SEQ ID NO :24氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個優(yōu)選實施方 案中，所述分離的人抗體包含如上所述的重鏈恒定區(qū)或Fab片段或F(ab’)2片段或單鏈Fv 片段.在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及
c)具有包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶R2 ；以及具有包含SEQID NO 28的氨基酸序列的輕鏈⑶R2。 在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID N0:29的氨 基酸序列的重鏈⑶Rl ；以及具有包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl。在一個優(yōu) 選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID N0:31氨基酸序列的 重鏈可變區(qū)；以及具有包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在一個優(yōu)選實施方 案中，所述分離的人抗體包含如上所述的重鏈恒定區(qū)或Fab片段或F(ab’)2片段或單鏈Fv 片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO :1氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重 鏈⑶R2和含SEQ ID NO 5氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在接觸位點或超突變位點存 在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO: 3氨基酸序列的重鏈⑶R2和含SEQ ID N0:5氨基 酸序列的重鏈CDRl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的輕 鏈CDR2和含SEQ ID NO :6氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在接觸位點或超突變位點存 在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的輕鏈⑶R2和含SEQ ID NO :6氨 基酸序列的輕鏈CDRl的抗體高10倍以下。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的 重鏈CDR2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重鏈CDRl，或者為其在接觸位點或超突變位 點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重鏈⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重鏈CDRl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ IDNO 12氨基酸序列的輕 鏈CDR2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在接觸位點或超突變位點存 在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO 12氨基酸序列的輕鏈⑶R2和含SEQ ID NO 14 氨基酸序列的輕鏈CDRl的抗體高10倍以下。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ IDNO 19氨基酸序列的重鏈⑶R2和含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重 鏈⑶R2和含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ IDNO 20氨基酸序列的 輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :20氨基酸序列的輕鏈 ⑶R2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的核酸分子。一種優(yōu)選的分離 核酸編碼包含SEQ ID N0:17氨基酸序列的重鏈CDR3。所述分離的核酸編碼抗體重鏈可變 區(qū)。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO: 19氨基酸序列的抗體重 鏈可變區(qū)的⑶R2。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ IDN0:21氨基酸序 列的抗體重鏈可變區(qū)的⑶R1。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO 23氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID N0:18氨基酸序列的輕鏈CDR3。所述分離的核酸編碼抗體輕鏈可變區(qū)。在另一個實施方案 中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO :20氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的⑶R2。在另 一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO :22氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)的 CDR1。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO :24氨基酸序列的抗體輕 鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ IDNO 27氨基酸序列的 重鏈⑶R2和含SEQ ID NO 29氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO :27氨基酸序列的重鏈 ⑶R2和含SEQ ID NO 29氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ IDNO 28氨基酸序列的 輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :28氨基酸序列的輕鏈 ⑶R2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。一種優(yōu)選的分離核酸編碼包含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重鏈⑶R3。所述分離 的核酸編碼抗體重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO 27氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)的CDR2。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含 SEQ IDNO :29氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)的⑶R1。在另一個實施方案中，所述分離的核 酸編碼包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，所述分離 的核酸編碼包含SEQ ID N0:26氨基酸序列的輕鏈⑶R3。所述分離的核酸編碼抗體輕鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO :28氨基酸序列的抗體輕 鏈可變區(qū)的⑶R2。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID N0:30氨基酸序 列的抗體輕鏈可變區(qū)的⑶R1。在另一個實施方案中，所述分離的核酸編碼包含SEQ ID NO 32氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有以下特性a)它結(jié)合人IL-12，并且根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝 集素母細胞增殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含選自Vh3種系家族成員的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可 變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突 變。c)具有包含選自νλ 1種系家族成員的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈 可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在 突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)它結(jié)合人IL-12，并且根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝 集素母細胞增殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含選自SEQ ID NO :595_667的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈 可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在 突變。c)具有包含選自SEQ ID NO :669_675的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈 可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在 突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)它結(jié)合人IL-12，并且根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 k。ff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者它以IXlCT6M或1X10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝 集素母細胞增殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含C0S-3種系氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)在具有增 強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。c)具有包含DPL8種系氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)在具有增 強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)它結(jié)合人IL-12，并且根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，它以0. Is—1或0. Is—1以下的 koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者它以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝 集素母細胞增殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。
b)具有包含選自Vh3種系家族成員的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可 變區(qū)包含結(jié)構(gòu)類似于其他VH3種系家族成員CDR2的CDR2和結(jié)構(gòu)類似于其他VH3種系家族 成員CDRl的CDR1，而且其中所述重鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性 誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。c)具有包含選自νλ 1種系家族成員的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈 可變區(qū)包含結(jié)構(gòu)類似于其他ν λ 1種系家族成員⑶R2的⑶R2和結(jié)構(gòu)類似于其他V λ 1種系 家族成員CDRl的CDR1，而且其中所述輕鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選 擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈CDR3存在 突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈CDR3存在突 變.在另一個實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈CDR2存在突變。在 另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈CDR2存在突變。在 另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈CDRl存在突變。在另 一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈CDRl存在突變。另一方面，本發(fā)明提供帶有本發(fā)明抗體編碼核酸的重組表達載體以及這種載體導(dǎo) 入其中的宿主細胞，本發(fā)明還包括通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞制備本發(fā)明的抗體的方法。再一方面，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它中和人IL-12的 活性和至少一種選自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、彌猴(cynomolgus) IL-12和恒河 猴IL-12的其他靈長類IL-12的活性，但是它不中和小鼠IL-12的活性。再一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分和藥學(xué)上可接受的載體 的藥用組合物。再一方面，本發(fā)明提供包含所述抗體或其抗原結(jié)合部分和其他藥物如治療藥物的 組合物。再一方面，本發(fā)明提供抑制人IL-12活性的方法，包括使人IL-12與本發(fā)明的抗體 如J695接觸，從而抑制人IL-12活性。再一方面，本發(fā)明提供抑制罹患其中IL-12活性有害的疾病的病人的人IL-12活 性的方法，包括給予所述病人本發(fā)明的抗體如J695，從而抑制所述病人的人IL-12活性。所 述疾病可為例如節(jié)段性回腸炎、多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。再一方面，本發(fā)明的特征為改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性以獲得預(yù)定目標(biāo)活 性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)從 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、
L94選擇優(yōu)選選擇性誘變位點。c)分別使選定的優(yōu)選選擇性誘變位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲 得第一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價第一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定單一選擇性誘變位點的 突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分；e)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形 成組合抗體或其抗原結(jié)合部分。
f)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性。g)如果步驟d)或f)沒有獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分，或者 獲得只具有部分活性的抗體，則使選自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96
的其他氨基酸殘基突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得第二組突變抗體或其抗原結(jié) 合部分；h)評價第二組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定選自H35、H50、H53、 H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的單個氨基酸殘基的突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性 或部分活性的抗體或其抗原結(jié)合部分；i)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的步驟g)的各 個突變，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；j)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性；k)如果步驟h)或j)沒有獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分，或者 獲得只具有部分活性的抗體，則使選自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸殘基突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得第三組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；1)評價第三組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定選自H33B、H52B和L31A 的單一氨基酸殘基的突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分活性的抗體或其抗原結(jié)合部 分；m)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的步驟k)的各 個突變，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；η)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性，由此獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。另一方面，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；e)對至少一個其他接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟b)至d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形成組 合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié) 合部分。在一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括
a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超 突變位點，由此鑒定選定的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；e)對至少一個其他接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟b)至d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形成組 合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié) 合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94*L96。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、 H3IB、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53和L93。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇性誘 變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、 L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和 L94。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽?2個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，而且以合適表達系統(tǒng)表達 所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為所述抗體需要保留的特性；直到獲得相對于所述親 代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu) 選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位 識別，即優(yōu)選識別p70p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合 干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇 性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組 織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表 位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在 一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自1)保留與 其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二 聚體情況下的P40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球 蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為需要保留的特性；直到獲得相對于所述親代抗體或 其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分；f)對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟a)至 e)；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性和至少 一種保留特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特 性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位 識別，即優(yōu)選識別P70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合 干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇 性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組 織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表 位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體.在 一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自1)保留與其 他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚 體情況下的P40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋 白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的接觸位點或超突變位點，由此鑒定選定 的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由 此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為所述抗體需要保留的特性；直到獲得相對于所述親 代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。
0144]在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu) 選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位 識別，即優(yōu)選識別P70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合 干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇 性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織 的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表 位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在 一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚 體情況下的P40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋 白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為需要保留的特性；直到獲得相對于所述親代抗體或 其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分；f)對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟a)至 e)；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性和至少 一種保留特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特 性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu) 選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位 識別，即優(yōu)選識別P70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合 干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇 性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、 L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組 織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表 位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在 一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自1)保留與其 他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的P40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋 白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至d)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性的增強 活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部 分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 以外的位點選擇 用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定接觸或超突變位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得 一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至d)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性的增 強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和其他特性；直到獲得相對于所述親代抗體或其 抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；
b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；f)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至e)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性但不影 響至少一種其他特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和至少一種其他特性的保留情況；直到獲得相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié) 合部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的親和力的方法， 包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性的變化；f)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至e)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性但是不 影響至少一種其他特性的增強活性的氨基酸殘基，形成具有至少一種保留特性的組合抗體 或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和至少一種特性的保留情況；直到獲得相對于所 述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部 分·所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性而不影響其 他特性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、HlOl、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 并保留其他特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性和至少一種其他特性的保留情況，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至d)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示改進活性而且不影響 至少一種其他特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和至少一種其他特性的保留情況，直到獲得相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種其他保留特性的抗體或其抗 原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。附圖簡述

圖1A-1B顯示一系列結(jié)合人IL-12的人抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與種系序 列Cos-3/JH3和Dpll8 Lvl042的排列對比。Kabat編碼用來指示氨基酸位置。顯示了 Joe 9野生型的全長序列。而其他抗體，只顯示了與Joe 9野生型不同的氨基酸位點。圖1C-1D顯示一系列結(jié)合人IL-12的人抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的對比。 Kabat編碼用來指示氨基酸位置。顯示了 Joe 9野生型的全長序列。而其他抗體，只顯示 了與Joe 9野生型不同的氨基酸位點。圖2A-2E顯示通過定點誘變突變的Y61抗體的重鏈⑶R位點和各位點的相應(yīng)氨基 酸取代。圖2A-2E分別為Y61重鏈⑶R Hl誘變、Y61重鏈⑶R H2誘變、Y61重鏈⑶R H2誘 變、Y61重鏈⑶R H3誘變，和Y61重鏈⑶R H3誘變。圖右側(cè)的條形圖顯示取代抗體解離速 率(實心條)與非突變Y61解離速率(空心條)的比較。圖2F-2H顯示通過定點誘變突變的Y61抗體的輕鏈⑶R位點和各位點的相應(yīng)氨基 酸取代。圖2F-2H分別為Y61輕鏈⑶R Ll誘變、Y61輕鏈⑶R L2誘變，和Y61輕鏈⑶R L3 誘變。圖右側(cè)的條形圖顯示取代抗體解離速率(實心條)與非突變Y61解離速率(空心 條)的比較。圖3證實人抗IL-12抗體J695對彌猴血漿新蝶呤水平的體內(nèi)效力。圖4顯示用膠原免疫小鼠后不同天數(shù)的關(guān)節(jié)炎平均評分的曲線圖，證實與用大鼠 IgG治療相比，用C17. 15治療顯著減輕關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀。發(fā)明詳述為了更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。術(shù)語“增強活性的氨基酸殘基”包括增強所述抗體活性的氨基酸殘基。當(dāng)然增強 活性的氨基酸殘基可取代接觸位點、超突變位點或優(yōu)選選擇性誘變位點的氨基酸殘基，進 而在一個或多個CDR中可能存在一個以上的增強活性的氨基酸殘基。增強活性的氨基酸殘 基包括增強抗體的結(jié)合特異性/親和性例如增強抗人IL-12抗體與人IL-12的結(jié)合的氨基酸殘基。增強活性的氨基酸殘基還包括增強抗體例如抑制人IL-12的人IL-12抗體的中和 效價的氨基酸殘基。術(shù)語“抗體”包括4個多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，4個多肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^二硫鍵內(nèi) 部連接的2個重鏈(H)和2個輕鏈(H).重鏈由1個重鏈可變區(qū)(本文簡稱為HCVR或VH) 和1個重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。輕鏈由1個輕鏈 可變區(qū)(本文簡稱為LCVR或VL)和1個輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由1個結(jié)構(gòu)域CL 組成。VH和VL區(qū)可進一步分為超變區(qū)(稱為互補決定區(qū)(CDR))和更保守區(qū)(稱為構(gòu)架區(qū) (FR))，超變區(qū)位于構(gòu)架區(qū)之間。各VH和VL由3個CDR和4個FR組成，從氨基末端至羧基 末端的排列順序如下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或“抗體部分”)包括保持特異性結(jié)合抗原(例如 hIL-12)能力的抗體片段。曾經(jīng)證實抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體片段完成。屬于術(shù) 語抗體的“抗原結(jié)合部分”的結(jié)合片段實例包括(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH 1結(jié)構(gòu) 域組成的一價片段；(ii)F(ab’)2片段，它是包括通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的2個Fab片段 的二價片段；(iii) VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)抗體單臂VL和VH結(jié)構(gòu)城組成的 Fv 片段；(v)VH 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的 dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341 :544_546)；以及(vi) 分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個結(jié)構(gòu)城VL和VH由獨立的基因編碼， 但是它們可利用重組方法以合成接頭連接在一起，合成接頭使它們能夠制成其中VL和VH 區(qū)成對形成一價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(ScFv)；參見例如Bird等(1988) Science 242 :423-426 和 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這種單鏈 抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。也包括其他形式的單鏈抗體例如雙體分子 (diabodies)。雙體分子是雙價、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達在單一多肽鏈上， 但是采用短到允許同一鏈上的這2個結(jié)構(gòu)域成對的接頭，由此驅(qū)使所述結(jié)構(gòu)域與另一條 鏈的互補結(jié)構(gòu)域成對，而產(chǎn)生2個抗原結(jié)合位點(參見例如Holliger，P.等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 ；Poljak,R. J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。進 而抗體或其抗原結(jié)合部分可以成為所述抗體或其抗原結(jié)合部分與一個或多個其他蛋白或 肽通過共價或非共價結(jié)合形成的更大免疫粘附分子的組成部分.這樣的免疫粘附分子的 實例包括利用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)制成四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及利用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C-末端 多組氨酸標(biāo)記制成雙價生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。可采用常規(guī)技術(shù)例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，由完整抗 體制備諸如Fab和F(ab，)2片段的抗體部分。而且如本文所述，可采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù) 獲得抗體、抗體部分和免疫粘附分子。優(yōu)選的抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或成對的完整結(jié) 構(gòu)城。術(shù)語“回復(fù)突變”是指人抗體的部分或全部體細胞突變的氨基酸被同源種系抗體 序列的相應(yīng)種系殘基取代的過程。本發(fā)明的人抗體的重鏈序列和輕鏈序列分別與VBASE數(shù) 據(jù)庫中的種系序列對比，鑒定具有最高同源性的序列。使本發(fā)明的人抗體的差異通過突變 編碼該不同氨基酸的確定核苷酸位置而恢復(fù)為種系序列。研究由此鑒定為回復(fù)突變的候選 對象的各氨基酸的作用是直接還是間接影響抗原結(jié)合，而突變后發(fā)現(xiàn)影響所述人抗體任何 需要特性的任何氨基酸不納入最終的人抗體；例如選擇性誘變方法鑒定的增強活性的氨基酸不進行回復(fù)突變。為了使回復(fù)突變的氨基酸數(shù)目最少，可保留與最接近種系序列不同、 但是與第二種種系序列相應(yīng)氨基酸相同的氨基酸位置，前提是對于所述氨基酸兩側(cè)至少10 個、優(yōu)選12個氨基酸，第二種種系序列與本發(fā)明人抗體的序列相同而且共線性。可在優(yōu)化 抗體的任何階段進行回復(fù)突變；但是優(yōu)選正好在選擇性誘變方法之前或之后進行回復(fù)突 變。更優(yōu)選正好在選擇性誘變方法之前進行回復(fù)突變。本文使用的術(shù)語“人白細胞介素IL-12” (本文簡稱為hIL-12或IL-12)包括主 要由巨噬細胞和樹突細胞分泌的人細胞因子。該術(shù)語包括一種異源二聚體蛋白，該蛋白包 含通過二硫鍵將二者結(jié)合在一起的35kD亞單位(p35)和40kD亞單位(p40)。所述異源二 聚體蛋白稱為“P70亞單位”.例如以下文獻進一步介紹了人IL-12的結(jié)構(gòu)=Kobayashi等 (1989)J. Exp Med. 170 :827_845 ；Seder 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ； Ling 等(1995) J.Exp Med. 154 116-127 ；Podlaski 等(1992) Arch. Biochem. Biophys. 294 230-237。術(shù)語人IL-12包括重組人IL_12(rh IL-12)，它可利用標(biāo)準(zhǔn)重組表達方法制得。術(shù)語“Kabat編碼”、“Kabat定義”和“Kabat標(biāo)記”在本文中交互使用。本領(lǐng)域公 知的這些術(shù)語是指編碼比抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的其他氨基 酸殘基更易變(即超變)的氨基酸殘基的系統(tǒng)(Kabat等(1971)Arm.NY Acad. Sci. 190 382-391 禾口 Kabat,Ε· Α·等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,第 五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。對于重鏈可變區(qū)而言，超變區(qū)為⑶Rl 的第31-35位氨基酸、⑶R2的第50-65位氨基酸和⑶R3的第95-102位氨基酸。對于輕鏈 可變區(qū)而言，超變區(qū)為⑶Rl的第24-34位氨基酸、⑶R2的第50-56位氨基酸和⑶R3的第 89-97位氨基酸。Kabat編碼在本文中用來指示對本發(fā)明抗體進行修飾的氨基酸位置。例如可使 Y61抗IL-12抗體重鏈CDRl位置31的絲氨酸(S)突變?yōu)楣劝彼?E) (H31S — E)，或者可使 輕鏈CDR3位置94的甘氨酸(G)突變?yōu)槔野彼?Y) (L94G — Y)。術(shù)語“人抗體”包括具有相當(dāng)于Kabat等介紹的人種系免疫球蛋白序列的可變 區(qū)禾口'恒定區(qū)的抗體(參見 Kabat 等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。本發(fā)明的人抗體可包 含例如不是由CDR(尤其是CDR3)的人種系免疫球蛋白序列(例如體外隨機誘變或定點誘 變或體內(nèi)體細胞突變導(dǎo)入的突變)編碼的氨基酸殘基。優(yōu)選用本文介紹的“選擇性誘變方 法”導(dǎo)入所述突變。所述人抗體可具有至少一個被氨基酸殘基例如由非人種系免疫球蛋白 序列編碼的增強活性的氨基酸殘基取代的位點。所述人抗體可具有高達20個被不是人種 系免疫球蛋白序列組成部分的氨基酸殘基取代的位點。在其他實施方案中，取代最高達10 個、最高達5個、最高達3個或最多2個位點。在一個優(yōu)選實施方案中，這些取代位于以下 更詳細介紹的CDR區(qū)。然而，本文使用的術(shù)語“人抗體”不包括其中另一種哺乳動物(例如 小鼠)種系來源的CDR序列移植到人構(gòu)架序列上的抗體。術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的人抗體，例如利 用轉(zhuǎn)染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體(在以下部分II中進一步介紹)、從重組組 合人抗體文庫分離的抗體(在以下部分III中進一步介紹)、從人免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)基因 動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如(Taylor, L. D.等(1992)Nucl. Acids Res. 20 6287-6295)或者涉及人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有人種系免疫球蛋白序列來源的可變區(qū)和恒 定區(qū)(參見 Kabat，E. A.等(1991) Sequence of Protein of Immunological Interest，第 五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。然而，在某些實施方案中，使這樣的 重組人抗體進行體外誘變(或者當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，進行體內(nèi)體細胞誘變)， 因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列可能不是體內(nèi)人抗體種系所有組成成分中天然 存在的序列，盡管所述序列得自人種系VH和VL序列并與人種系VH和VL序列有關(guān)。但是， 在某些實施方案中，這樣的重組抗體得自選擇性誘變方法或回復(fù)突變或這兩種方法?！胺蛛x抗體”包括基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如基本不含 特異性結(jié)合非hIL-12抗原的抗體、特異性結(jié)合hIL-12的分離抗體)。特異性結(jié)合hIL-12 的分離抗體可結(jié)合其他物種的IL-12分子(下文更詳細討論)。此外，分離抗體可基本不含 其他細胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)?！爸泻涂贵w”(或“中和hIL-12活性的抗體”)包括其與hIL-12的結(jié)合抑制hIL_12 的生物活性的抗體。這種對hIL-12生物活性的抑制作用可通過檢測hIL-12生物活性的一 個或多個指標(biāo)評價，所述指標(biāo)例如為對植物凝集素母細胞增殖測定(PHA)中的人植物凝集 素母細胞增殖的抑制作用，或?qū)θ薎L-12受體結(jié)合測定中的受體結(jié)合的抑制作用(參見實 施例3-γ干擾素誘導(dǎo)測定).這些hIL-12生物活性指標(biāo)可通過本領(lǐng)城已知的若干標(biāo)準(zhǔn)體 外或體內(nèi)測定中的一個或多個測定評價(參見實施例3)。術(shù)語“活性”包括各種活性，例如抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和性如結(jié)合IL-12 抗原的抗hIL-12抗體；和/或抗體的中和效價如其與hIL-12的結(jié)合抑制hIL_12的生物活 性的抗hIL-12抗體，例如對PHA母細胞增殖的抑制作用或?qū)θ薎L-12受體結(jié)合測定中的受 體結(jié)合的抑制作用(參見實施例3)。術(shù)語“表面胞質(zhì)團共振”包括例如采用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway，NJ)通過檢測生物傳感器基體(matrix)中的蛋白濃 度改變而可分析實時生物特異性作用的光學(xué)現(xiàn)象。關(guān)于其進一步的介紹參見實施例5和 Jonsson, U.等(1993)Ann. Biol. Clin. 51 :19_26 Jonsson，U.等(1991)Biotechniques 11 620-627 ;Johnsson，B.等(1995) J. Mol. Recognit. 8 125-131 和 Johnnson，B.等(1991) Anal. Biochem. 198 :268_277。本文使用的術(shù)語“K。ff”是用以指抗體與抗體/抗原復(fù)合物解離的解離速率常數(shù) (off rate constant)0本文使用的術(shù)語“Kd”是指一種具體抗體抗原相互作用的解離常數(shù)(dissociation constant)0術(shù)語“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈核酸或雙鏈核 酸，但是優(yōu)選為雙鏈DNA。關(guān)于編碼結(jié)合IL-12的抗體(包括“分離抗體”)或抗體部分(例如VH、VL、⑶R3) 的核酸，本文使用的術(shù)語“分離核酸分子”包括其中編碼所述抗體或抗體部分的核苷酸序列 不含其他編碼結(jié)合非hIL-12抗原的抗體或抗體部分的核苷酸序列的核酸分子，所述其他 序列可能天然鄰接人類基因組DNA中的所述核酸。因此，例如編碼抗IL-12抗體的VH區(qū)的 本發(fā)明分離核酸不含其他編碼結(jié)合非IL-12抗原的其他VH區(qū)的序列.術(shù)語“分離核酸分 子”還包括編碼雙價、雙特異性抗體的序列，所述雙價雙特異性抗體例如為雙體分子，其中VH和VL區(qū)不含其他非所述雙體分子序列。術(shù)語“載體”包括能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸分子的核酸分子。一種類型的 載體是“質(zhì)?！?，質(zhì)粒是額外DNA節(jié)段可連接入其中的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是病毒 載體，在病毒載體中額外DNA節(jié)段可連接入病毒基因組中。某些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主 細胞中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體 (例如非附加型哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細胞時整合入宿主細胞的基因組中，因此與 宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠控制與其有效連接的基因的表達。這樣的載體 在本文中稱為“重組表達載體”(或者簡稱為“表達載體”)。一般來說，重組DNA技術(shù)中應(yīng) 用的表達載體通常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可交互使用，因為質(zhì)粒是 最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括同類的其他形式表達載體，例如具有同等功能的病毒 載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)包括重組表達載體已經(jīng)導(dǎo)入其中 的細胞。當(dāng)然這類術(shù)語不僅指具體對象的細胞，而且也指這種細胞的子代細胞。因為突變 或環(huán)境的影響連續(xù)傳代時可能發(fā)生某些改變，所以這樣的子代細胞可能事實上與親代細胞 不完全相同，但是仍然包括在本文使用的術(shù)語“宿主細胞”范疇內(nèi)。本文使用的術(shù)語“改變”是指抗體或其抗原結(jié)合部分中的一個或多個氨基酸的改 變。可通過在一個或多個位點添加、取代或缺失氨基酸而產(chǎn)生這樣的改變。應(yīng)用已知技術(shù) 如PCR誘變可引起所述變化。術(shù)語“接觸位點”包括抗體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或⑶R3中的氨 基酸位點，這些位點被以26種已知抗體抗原結(jié)構(gòu)之一接觸抗原的氨基酸占據(jù)。如果CDR氨 基酸以26種已知抗體抗原復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的任一種接觸所述抗原，則可認為該氨基酸占據(jù) 了接觸位點.與非接觸位點相比，接觸位點被接觸抗原的氨基酸占據(jù)的可能性更高。接觸 位點最好為含有以26種結(jié)構(gòu)中的3種以上結(jié)構(gòu)(>11.5%)接觸抗原的氨基酸的CDR位 點。接觸位點最優(yōu)選為含有以25種結(jié)構(gòu)中的8種以上結(jié)構(gòu)(> 32% )接觸抗原的氨基酸 的CDR位點。術(shù)語“超突變位點”包含占據(jù)抗體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或⑶R3 區(qū)中的位點的氨基酸殘基，這些殘基被認為在所述抗體的體內(nèi)親和力成熟過程中體細胞超 突變的頻率或概率高。“體細胞超突變的高頻率或高概率”包括所述殘基在所述抗體的體內(nèi) 親和力成熟過程中發(fā)生體細胞超突變的5-約40%機會的頻率或概率。當(dāng)然在該規(guī)定范圍 的所有范圍值也是本發(fā)明的一部分，例如5-約30%、5_約15%、15-30約％。術(shù)語“優(yōu)選選擇性誘變位點”包括占據(jù)重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或 CDR3區(qū)的位點的氨基酸殘基，可認為優(yōu)選選擇性誘變位點既可是接觸位點又可是超突變位 點ο術(shù)語“選擇性誘變方法”包括通過選擇和單獨突變在至少一個優(yōu)選選擇性誘變位 點、超突變位點和/或接觸位點的CDR氨基酸而改進抗體活性的方法。“選擇性誘變的”人抗 體為含有應(yīng)用選擇性誘變方法在所選定位點產(chǎn)生的突變的抗體。在另一個實施方案中，所 述選擇性誘變方法用來提供優(yōu)選突變抗體重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2或CDR3 (此后分別稱為 H1、H2和H3)或輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或⑶R3(此后分別稱為L1、L2和L3)的各選定氨 基酸殘基的方法。氨基酸殘基可選自優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點。根據(jù)各個氨基酸在輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)的位置選擇各個氨基酸。當(dāng)然超突變位點也可以是接 觸位點。在一個實施方案中，選擇性誘變方法是“靶向方法”。表述“靶向方法”包括以靶向 方式優(yōu)選突變抗體重鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或⑶R3或者輕鏈可變區(qū)的⑶R1、⑶R2或⑶R3 的各個選定氨基酸殘基的方法，例如“逐組靶向方法(Group-wise targeted approach) ”或 “逐個CDR靶向方法(CDRii setargeted approach) ”。在“逐組靶向方法，，中，針對具體各 組的各氨基酸殘基進行選擇性突變，包括組I (包括L3和H3)、組II (包括H2和Li)和組 III (包括L2和Hl)，所列各組的順序為優(yōu)選靶向順序。在“逐個⑶R靶向方法”中，以以下 優(yōu)選靶向順序針對各⑶R的各個氨基酸殘基進行選擇性突變H3、L3、H2、Li、Hl和L2。使 選定的氨基酸殘基突變?yōu)槔缰辽?個其他氨基酸殘基，并測定突變對抗體活性的影響。 以抗體的結(jié)合特異性/親和性和/或抗體的中和效價的變化檢測活性。當(dāng)然，選擇性誘變 方法可用來優(yōu)化任何來源的任何抗體，包括噬菌體展示、人IgG種系基因的轉(zhuǎn)基因動物、從 人B細胞分離的人抗體。選擇性誘變方法優(yōu)選用于不能用噬菌體展示技術(shù)進一步優(yōu)化的抗 體。應(yīng)該指出的是，任何來源包括噬菌體展示、人IgG種系基因的轉(zhuǎn)基因動物、從人B細胞 分離的人抗體的各種抗體可在選擇性誘變方法之前或之后進行回復(fù)突變。術(shù)語“增強活性的氨基酸殘基”包括增強抗體活性的氨基酸殘基。當(dāng)然增強活性 的氨基酸殘基可取代優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點的氨基酸殘基，進而在 一個或多個CDR中可能存在1個以上的增強活性的氨基酸殘基。增強活性的氨基酸殘基包 括增強抗體(例如結(jié)合人IL-12的抗人IL-12抗體)的結(jié)合特異性/親和性的氨基酸殘 基。增強活性的氨基酸殘基還包括增強抗體中和效價的氨基酸殘基，所述抗體例如為抑制 人IL-12的人IL-12抗體。本發(fā)明各方面在以下各小節(jié)中更詳細地介紹。I.結(jié)合人IL-12的人抗體本發(fā)明提供結(jié)合人IL-12的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分.本發(fā)明的人抗體優(yōu)選 為重組中和性人抗hIL-12抗體。例如通過用實施例1所述的噬菌體展示技術(shù)篩選hIL-12 的一個或多個人\和VhcDNA文庫，從而可選擇結(jié)合人IL-12的本發(fā)明抗體。最初篩選人 Vl*VhcDNA文庫鑒定了一系列的抗IL-12抗體，其中一種本文稱為“Joe 9”(或“Joe 9野 生型”)，選定其用于進一步研制。Joe 9是一種親和力較低的人IL-12抗體(例如1(。 約 0. lsec—1)，但它仍可用于特異性結(jié)合和檢測hIL-12。可如下提高Joe 9抗體的親和力對 重鏈⑶R和輕鏈⑶R進行誘變，產(chǎn)生一組“混合及匹配”而且可進一步突變的輕鏈可變區(qū)和 重鏈可變區(qū)序列，最終獲得對hIL-12的親和力增強的無數(shù)其他抗hIL-12抗體(參見實施 例1、表2 (見附件A)和圖IA-D的序列對比)。在這些抗體中，在本文中稱為Y61的人抗hIL-12抗體證實，結(jié)合親和力顯著改善 (例如Koff約2 X Kr4sec-1)。選擇Y61抗hIL-12抗體通過分別突變重鏈CDR和輕鏈CDR中 的具體氨基酸殘基進一步成熟親和力。根據(jù)占據(jù)優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點和/或超 突變位點的氨基酸殘基選擇用于位點特異性突變(選擇性誘變方法)的Y61的氨基酸殘 基。關(guān)于重鏈CDR和輕鏈CDR選定位點的取代的總結(jié)見圖2A-2H。本文稱為J695的本發(fā)明 優(yōu)選重組中和抗體產(chǎn)生于Y61輕鏈⑶R2位置50的Gly取代為Tyr以及Y61輕鏈⑶R3位 置94的Gly取代為Tyr。關(guān)于Joe 9野生型至J695譜系(lineage)的一組本發(fā)明抗IL-12抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列對比示于圖1A-1D。關(guān)于Joe 9至J695譜系，這些序列的對比 可鑒定結(jié)合hIL-12的本發(fā)明抗體的優(yōu)選重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的共有序列以及CDR3、 ⑶R2和⑶Rl的共有序列。此外，總結(jié)于圖2A-2H的Y61誘變分析對于包含修飾Y61但仍然 保持良好hIL-12結(jié)合特性的序列的Y61至J695譜系，可鑒定結(jié)合hIL_12的重鏈可變區(qū)和 輕鏈可變區(qū)的共有序列以及結(jié)合hIL-12的⑶R3、⑶R2和⑶Rl共有序列。在后附的序列表 中以鑒定序列鑒定的本發(fā)明優(yōu)選CDR、VH和VL序列(包括共有序列)總結(jié)如下。
以測定Kd速率和K。ff速率的表面胞質(zhì)團共振分析功能性表征Joe9野生型親和力 成熟產(chǎn)生的抗體。獲得了一系列K。ff速率在以下范圍內(nèi)的抗體約0. Is-1至約IX ΙΟ、、 更優(yōu)選K。ff約1 X IO-4S"1至約1 X IO-5S-1或1 X IO-5S-1以下。如實施例3所述，還體外表征 了抗體抑制植物凝集素(PHA)母細胞增殖的能力。獲得了一系列IC5tl值在以下范圍內(nèi)的抗 體約1 X ICT6M至約1 X 10_"M、更優(yōu)選約1 X IiT10M至1 X IiT11M或更低。因此，在一個方面，本發(fā)明提供這樣的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合人 IL-12并以0. Is"1或以0. Is"1以下的表面胞質(zhì)團共振測定的K。ff速率常數(shù)與人IL-12解 離，或者它以ixio_6m或ixio_6m以下的ic5(l抑制體外植物凝集素母細胞增殖測定(pha 測定)的植物凝集素母細胞增殖。在優(yōu)選的實施方案中，分離的人IL-12抗體或其抗原結(jié) 合部分以IXicr2iT1或IXicr2iT1以下的K。ff速率常數(shù)與人il-12解離，或者以ixio_7m或 IXlO-7M以下的IC5tl抑制體外PHA測定的植物凝集素母細胞增殖。在更優(yōu)選的實施方案 中，分離的人IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分以IXicr3iT1或IXicr3iT1以下的1(。 速率常數(shù) 與人IL-12解離，或者以1 X IO-8M或1 X 10、以下的IC5tl抑制體外PHA測定的植物凝集素 母細胞增殖。在更優(yōu)選的實施方案中，分離的人IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分以1Χ10ΛΓ1 或1 X IO-4S-1以下的K。ff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X 10_9M或1 X 10_9M以下的IC5tl 抑制體外PHA測定的植物凝集素母細胞增殖。在更優(yōu)選的實施方案中，分離的人IL-12抗 體或其抗原結(jié)合部分以1 X IO-5S-1或1 X IO-5S-1以下的K。ff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者 以1 X IO-10M或1 X IO-10M以下的IC5tl抑制體外PHA測定的植物凝集素母細胞增殖。在甚至 更優(yōu)選的實施方案中，分離的人IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分以IXicr5iT1或IXicr5iT1以 下的Koff速率常數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X IO-11M或1 X IiT11M以下的IC50抑制體外PHA 測定的植物凝集素母細胞增殖?？捎帽砻姘|(zhì)團共振測定IL-12抗體的解離速率常數(shù)(K。ff)(參見實施例5)。一 般來說，表面胞質(zhì)團共振分析應(yīng)用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensor，Piscataway，NJ)通 過表面胞質(zhì)團共振(SPR)檢測配體(固定在生物傳感器基體上的重組人IL-12)和分析物 (抗體溶液)之間的實時結(jié)合作用。也可以通過固定分析物(生物傳感器基體上的抗體) 而提供配體(重組IL-12溶液)進行表面胞質(zhì)團共振?？捎萌舾珊线m體外測定中的一種或 多種測定評價IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分的中和活性(參見實施例3)。 本領(lǐng)域眾所周知，抗體重鏈CDR和抗體輕鏈CDR在抗體與抗原的結(jié)合特異性/親 和性中起重要作用。因此本發(fā)明包括具有Joe 9的輕鏈⑶R和重鏈⑶R的人抗體以及具 有經(jīng)修飾增強抗體的結(jié)合特異性/親和性的CDR的其他抗體。如實施例1所證實，對所述 輕鏈⑶R和重鏈⑶R的一系列修飾可使人抗hIL-12抗體的親和力成熟。結(jié)合人IL-12的 Joe 9野生型至J695的人抗體系列的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列對比見圖1A-1D。根 據(jù)序列對比(見上表的總結(jié))確定抗體CDR的共有序列基序。例如Joe 9至J695譜系的 VH CDR3的共有基序包含氨基酸序列(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID N0:1)，該氨基 酸序列包含SEQ ID NO 7所示共有HCVR的位置95-102的氨基酸。VIXDR3的共有基序包 含氨基酸序列Q- (S/T) -Y- (D/E) - (S/R/K) - (S/G/Y) - (L/F/T/S) - (R/S/T/ff/H) - (G/P) - (S/ T/A/L) - (R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEQ ID NO :2)，該氨基酸序列包含 SEQ ID NO :8 所示共有 LCVR的位置89-97的氨基酸。 因此，另一方面，本發(fā)明提供一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有以下特性a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 1氨基酸序列的重鏈CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3.在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體還包括含氨基酸序列F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y -A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO :3)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO 7的共有HCVR的位置50-65 的氨基酸)的VHCDR2以及還包括含氨基酸序列(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S(SEQ ID NO: 4)(它包括含氨基酸序列SEQ ID NO 8的共有LCVR的位置50-56的氨基酸)的VL⑶R2。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體還包括含氨基酸序列F-T-F-S_(S/ Ε) -Y-G-M-H (SEQ ID NO 5)(它包括含氨基酸序列SEQ IDNO 7的共有HCVR的位置27-35的 氨基酸)的VH CDRl以及還包括含氨基酸序列(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/ A)-(N/G/Y)-(T/D) -V-(K/H) (SEQ ID NO 6)(它包括含氨基酸序列 SEQ ID NO 8 的共有 LCVR的位置24-34的氨基酸)的VL CDRl。在再一優(yōu)選實施方案中，所述本發(fā)明抗體包括含SEQ ID NO 7氨基酸序列的HCVR 和含SEQ ID NO 8氨基酸序列的LCVR0根據(jù)對產(chǎn)生J695抗體的Y61進行的突變分析可確定其他共有基序(總結(jié)于圖 2A-2H)。如圖2A-2H所示的條形圖所證實，Y61的重鏈和輕鏈⑶R的某些殘基可取代而不 會顯著減弱所述抗體的hIL-12結(jié)合特性。例如以12個不同氨基酸殘基對CDR Hl的位置 30的各個取代不會顯著降低所述抗體的K。ff速率，說明該位置可用各種不同氨基酸殘基取 代。因此根據(jù)突變分析(即可用其他氨基酸殘基取代的Y61中的位置)，確定共有基序。重 鏈和輕鏈⑶R3的共有基序分別示于SEQ ID NO 9和10，重鏈和輕鏈⑶R2的共有基序分別 示于SEQ IDNO 11和12，而重鏈和輕鏈⑶Rl的共有基序分別示于SEQ ID N0:13禾口 14。VH 和VL區(qū)的共有基序分別示于SEQ ID NO 15和16。因此，在一個方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具 有以下特性a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重鏈CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈CDR3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體還包括含SEQ ID NO 11氨基酸序列的VH⑶R2 以及還包括含SEQ ID NO 12氨基酸序列的VIXDR2。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體還包括含SEQ ID NO 13氨基酸序列的VH CDRl以及還包括含SEQ ID NO 14氨基酸序列的VLCDRl。在再一優(yōu)選實施方案中，所述本發(fā)明抗體包括含SEQ ID NO 15氨基酸序列的 HCVR和含SEQ ID NO 16氨基酸序列的LCVR。本發(fā)明的一種優(yōu)選抗體是人抗hIL-12抗體Y61，它是通過PCR誘變⑶R3使Joe 9 野生型的親和力成熟而制得(如實施例1所述)。根據(jù)表面胞質(zhì)團共振和體外中和測定， Y61的特異性/結(jié)合親和性改善。Y61的重鏈和輕鏈⑶R3分別示于SEQ ID NO 17和18，Y61的重鏈和輕鏈⑶R2分別示于SEQ ID NO 19和20，而Y61的重鏈和輕鏈⑶Rl分別示于 SEQ ID NO :21和22。Y61的VH具有SEQ IDNO 23的氨基酸序列，而Y61的VL具有SEQ ID NO 24的氨基酸序列(這些序列也示于圖1A-1D，與Joe9對比)。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞 增殖；b)具有包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈CDR3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重鏈⑶R2，以及具有包含SEQID NO 20氨基酸序列的輕鏈⑶R2。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO :21氨基酸序列的重鏈⑶R1，以及具有包含SEQID NO 22氨基酸序列的輕鏈⑶R1。在再一優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 23氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及具有包含SEQID NO 24氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述全長抗體包含重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定區(qū)，以及它們的任何同種異型變異體，正如Katbat所論述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，美國人類健 康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。所述抗體重鏈恒定區(qū)最好是IgGl重鏈恒定區(qū)?；蛘撸?所述抗體部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或單鏈Fv片段。對Y61各個殘基的修飾產(chǎn)生一批圖2A-2H所示的抗體.以表面胞質(zhì)團共振和/或 體外中和測定測定各抗體的特異性/結(jié)合親和性。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含選自SEQ ID NO :404_SEQ ID NO 469的氨基酸序列的重鏈CDR3 ；以 及c)具有包含選自SBQ ID NO :534_SEQ ID NO 579的氨基酸序列的輕鏈CDR3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含選自SEQ ID NO :335-SEQ ID NO :403的氨基酸序列的重鏈CDR2 ；以及具有包含選自SEQ ID N0: 506-SEQ ID NO :533的氨基酸序列的輕鏈CDR2。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含選自 SEQ ID NO :288-SEQ ID NO :334的氨基酸序列的重鏈CDRl ；以及具有包含選自SEQ ID N0: 470-SEQ ID NO 505的氨基酸序列的輕鏈CDRl。在再一優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分包括含SEQ ID NO 23氨基酸序列的重鏈可變區(qū)以及含SEQ ID NO :24氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述全長抗體包含重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定區(qū)，以及它們的任何同種異型變異體，正如Katbat所論述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，美國人類健 康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。所述抗體重鏈恒定區(qū)最好是IgGl重鏈恒定區(qū)?；蛘撸隹贵w部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或單鏈Fv片段。本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的重組中和抗體J695是通過對抗體Y61的接觸和超突變 氨基酸殘基進行定點誘變而制得(參見實施例2和以下部分III)。J695與Y61的不同之 處在于Y61輕鏈⑶R2位置50的Gly取代為Tyr以及Υ61輕鏈⑶R3位置94的Gly取代 為Tyr。J695的重鏈和輕鏈CDR3分別示于SEQ ID NO 25和26，J695的重鏈和輕鏈CDR2 分別示于SEQ ID NO 27和28，而J695的重鏈和輕鏈CDRl分別示于SEQ ID NO 29和30。 J695的VH具有SEQ ID NO 31的氨基酸序列，而J695的VL具有SEQ ID NO 32的氨基酸 序列(這些序列也示于圖1A-1D，與Joe9對比)。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)具有包含SEQ ID NO 25的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及c)具有包含SEQ ID NO 26的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶R2，以及具有包含SEQID NO 28的氨基酸序列的輕鏈⑶R2。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重鏈CDRl，以及具有包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1。在再一優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及具有包含SEQID NO 32氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方案中，所述全長抗體包含重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定區(qū)，以及它們的任何同種異型變異體，正如Katbat所論述(Kabat， Ε· Α·,等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，美國人類 健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。所述抗體重鏈恒定區(qū)最好是IgGl重鏈恒定區(qū)。或 者，所述抗體部分可是Fab片段或F(ab’ 2)片段或單鏈Fv片段。可使Joe 9至J695的譜系抗體或Y61至J695的譜系抗體的CDR3、CDR2和CDRl 的優(yōu)選共有序列產(chǎn)生其他突變，以獲得本發(fā)明的其他抗IL-12抗體?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物 學(xué)技術(shù)，例如PCR誘變，針對輕鏈和/或重鏈CDR的各個接觸氨基酸殘基或超突變氨基酸殘 基進行這樣的修飾方法，然后如本文所述對修飾抗體進行動力學(xué)和功能分析(例如實施例 3所述的中和測定和實施例5所述的BIAcore分析)。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT6M或1 X ICT6M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO :1氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ ID NO :3氨基酸序列的重 鏈⑶R2和含SEQ ID NO :5氨基酸序列的重鏈⑶R1，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點或超 突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含 SEQID NO :1氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ ID NO 3氨基酸序列的重鏈CDR2和含SEQ ID NO 5氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的輕 鏈CDR2和含SEQ ID NO :6氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含 SEQID NO 2氨基酸序列的輕鏈CDR3、含SEQ ID NO :4氨基酸序列的輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 6氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 9氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的 重鏈⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO :9氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 11氨基酸序列的重鏈 ⑶R2和含SEQ ID NO 13氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈CDR3、含SEQ IDNO 12氨基酸序列的 輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點、 接觸位點或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率 較所述包括含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :12氨基酸序列的輕鏈 ⑶R2和含SEQ ID NO 14氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。一般技術(shù)人員還知道，可對本發(fā)明抗體例如Y61或J695的⑶R區(qū)進行其他突變， 以獲得本發(fā)明的其他抗IL-12抗體。如上所述，可用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進行這樣的修飾 方法。分別如實施例3和5所述，可對修飾抗體進行功能和動力學(xué)分析。對Y61各個殘基 進行達到與J695相同的修飾示于圖2A-2H，見實施例2介紹。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞
增殖；b)包括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ IDNO 19氨基酸序列的 重鏈⑶R2和含SEQ ID NO :21氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點 或超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包 括含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SEQ ID NO 19氨基酸序列的重鏈⑶R2和 含SEQ ID NO 21氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈CDR3、含SEQ IDNO 20氨基酸序列的 輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 22氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點或 超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的< 速率較所述包括 含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO 20氨基酸序列的輕鏈⑶R2和含 SEQ ID NO 22氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它a)以1 X ICT9M或1 X ICT9M以下的IC5tl抑制體外PHA測定中的植物凝集素母細胞 增殖；b)包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重鏈CDR3、含SEQ IDNO 27氨基酸序列的 重鏈⑶R2和含SEQ ID NO :29氨基酸序列的重鏈⑶Rl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點或 超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的k。ff速率較所述包括含SEQ ID NO 25氨基酸序列的重鏈⑶R3、含SFQ ID NO ,21氨基酸序列的重鏈⑶R2和含 SEQ ID NO 29氨基酸序列的重鏈⑶Rl的抗體高10倍以下；以及c)包括含SEQ ID NO 26氨基酸序列的輕鏈CDR3、含SEQ IDNO 28氨基酸序列的 輕鏈CDR2和含SEQ ID NO 30氨基酸序列的輕鏈CDRl，或者為其在優(yōu)選選擇性誘變位點或 超突變位點存在一個或多個氨基酸取代的突變體，其中所述突變體的< 速率較所述包括 含SEQ ID NO 26氨基酸序列的輕鏈⑶R3、含SEQ ID NO :28氨基酸序列的輕鏈⑶R2和含 SEQ ID NO 30氨基酸序列的輕鏈⑶Rl的抗體高10倍以下。在再一實施方案中，本發(fā)明提供分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它中和人IL-12 活性以及中和至少一種選自以下的其他靈長類IL-12活性狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩 IL-12、彌猴IL-12和恒河猴IL-12，但其不中和小鼠IL-12活性。II.詵擇重組人抗體可通過篩選重組組合抗體文庫、優(yōu)選scFv噬菌體展示文庫分離獲得本發(fā)明的 重組人抗體，所述文庫用從得自人淋巴細胞的mRNA制備的人VL和VHcDNA制得。制備 和篩選這樣的文庫的方法學(xué)是本領(lǐng)域已知的。除了市售用于制備噬菌體展示文庫的試 劑盒(倒如 PharmaciaRecombinat Phage Antibody System，目錄號 27-9400—01 ；以及 StratageneSurfZAP 噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)之外，具體適用于制備和篩選抗 體展示文庫的方法和試劑實例可參見例如Kang等的PCT公布號WO 92/18619 ；Winter等的 PCT 公布號 WO 92/20791 ；Breitling 等的 PCT 公布號 WO 93/01288 ；McCafferty 等的 PCT 公 布號 W092/01047 ；Garrard 等的 PCT 公布號 WO 92/09690 ；Fuchs 等(1991) Bio/Technology 2:1370-1372 ；Hay 等(1992)Hum Antibody Hybridomas 2:81_85 ;Huse 等(1989)Science 246:1275-1281 ；McCafferty 等，Nature(1990)348 552~554 Griffiths 等(1993)EMB0 J U :725-734 ;Hawkins 等(1992) J Mol Biol 226 889~896 :Clackson 等(1991)Nature 352 624-628 ；Gram 等(I992)PNAS 89 3576-3580 ；Garrad 等(1"1)Bio/Technology 9 1373-1377 ;Hoogenboom 等(1991) Nuc Acid Res 邊4133_4137 和 Barbas 等(1991) PNAS 88 :7978-7982o用于該方法的抗體文庫優(yōu)選為用人VL和VH cDNA制備的scFv文庫。優(yōu)選用重組 人IL-12作為抗原篩選scFv抗體文庫，以選擇具有對IL-12的結(jié)合活性的人重鏈和輕鏈序 列.為了選擇對IL-12的p35亞單位或p70異源二聚體特異性的抗體，在存在過量游離 P40亞單位情況下進行篩選測定。例如應(yīng)用實施例1所述的micro-Friguet滴定法可確定 亞單位優(yōu)選抗體。在選定初始的人VL和VH節(jié)段后，進行其中篩選不同成對的選定VL和VH節(jié)段的 IL-12結(jié)合的“混合和匹配”實驗以選擇優(yōu)選VL/VH對組合(參見實施例1)。另外，為了進 一步提高hIL-12結(jié)合的親和力和/或降低解離速率常數(shù)，可用類似于天然免疫反應(yīng)過程中 與抗體親和力成熟有關(guān)的體內(nèi)體細胞突變過程的方法，優(yōu)選在VH和/或VL的CDR3區(qū)中 隨機突變所述優(yōu)選VL/VH對的VL和VH節(jié)段。這種體外親和力成熟可通過應(yīng)用分別與VH ⑶R3或VL⑶R3互補的PCR引物擴增VH和VL區(qū)而完成，所述引物在某些位置已經(jīng)“摻入 了”( “spiked”)4種核苷酸堿基的隨機混合物，使得獲得的PCR產(chǎn)物編碼隨機突變已經(jīng)導(dǎo) 入VH和/或VL⑶R3區(qū)的VH和VL節(jié)段?？稍龠x擇和再篩選這些隨機突變VH和VL節(jié)段 對hIL-12的結(jié)合，可選定對IL-12結(jié)合具有高親和力和低解離速率的序列。表2(參見附件A)顯示了因為體外親和力成熟而產(chǎn)生的結(jié)合特異性/親和力改變的抗體。在從重組免疫球蛋白展示文庫選擇、分離和篩選了本發(fā)明的抗hIL-12抗體后，可 從噬菌體顆粒(例如噬菌體基因組)回收編碼選定抗體的核酸，并將其用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技 術(shù)亞克隆入其他表達載體。必要時，可進一步操作所述核酸以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗體形式 (例如與編碼額外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(例如額外恒定區(qū))的核酸連接).為了表達通過篩選 組合文庫分離的重組人抗體，使編碼所述抗體的DNA克隆入重組表達載體中，并將其導(dǎo)入 哺乳動物宿主細胞中，見以下部分IV的更詳細介紹。在實施例1更詳細地介紹了應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)選擇人IL-12結(jié)合抗體的方法以 及通過隨機誘變或定點誘變CDR區(qū)使選定抗體親和力成熟。如實施例1所述，篩選人VL和VH cDNA文庫鑒定一系列抗IL- 12抗體，其中選定 Joe 9抗體用于進一步研制。比較Joe 9的重鏈可變區(qū)與從VBASE數(shù)據(jù)庫選擇的重鏈種系 序列，顯示Joe 9與C0S-3種系序列相似。C0S-3屬于種系序列的VH3家族。Vh3家族是人VH種系所有組成成分的一部分，VH種系所有組成成分可根據(jù)核苷酸 序列同源性分為 7 個家族，即 VH1-VH7 (Tomlinson 等(1992) J. Mol. Biol.，227，776-798 和 Cook等(1995) Immunology Today，16，237-242)。VH3家族的成員最多，在種系所有組成成 分中占的比例最大。對于任何給定的人VH3種系抗體序列，在整家族中的氨基酸序 列同一性是最高的(參見例如 Tomlinson 等(1992) J. Mol. Biol.，227，776-798 和 Cook 等
(1995)Immunology Today, 16，237-242)。任何2個VH3家族種系VH序列之間的氨基酸序 列同一性變化范圍為約100個VH殘基中的69-98個殘基(即任何2個種系VH序列之間的 氨基酸序列同源性為69-98% )。對于大多數(shù)種系序列對，具有至少80個或80個以上的相 同氨基酸殘基(即至少80%氨基酸序列同源性)。VH3家族成員間的高度氨基酸序列同源 性使某些氨基酸殘基位于VH鏈CDR和構(gòu)架區(qū)的關(guān)鍵位點。這些氨基酸殘基賦予CDR以結(jié) 構(gòu)特征。 抗體結(jié)構(gòu)研究表明，根據(jù)占據(jù)CDR和構(gòu)架區(qū)某些位置的關(guān)鍵氨基酸殘基，可將CDR 構(gòu)象分為各種家族的正則CDR結(jié)構(gòu)。因此，在具有正則結(jié)構(gòu)和相同關(guān)鍵氨基酸殘基的不同 抗體中存在相似的局部 CDR 構(gòu)象(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol.，196，901-917 和 Chothia 等(1989) Nature，342，877-883)。在VH3家族中，在CDRl和CDR2正則結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點存在 保守的氨基酸殘基同一性(Chothia 等(1992) J. Mol. Biol.，227，799-817)。C0S-3種系VH基因是VH3家族成員之一，而且是3-30(DP_49)種系VH等位基因 的一種變異體。C0S-3只在位置5與Joe 9 VH氨基酸序列不同。Joe9 VH和C0S-3之間 以及Joe 9 VH和其他VH3家族成員之間的高度氨基酸序列同源性賦予高度CDR結(jié)構(gòu)同源 性(Chothia 等(1992)J. Mol. Biol.，227，799-817 ；Chothia 等(1987)J. Mol. Biol.，196， 901-917 和 Chothia 等(1989)Nature,342,877-883)。技術(shù)人員知道，鑒于與Joe 9的高度氨基酸序列相似性和正則結(jié)構(gòu)相似性，其他 VH3家族成員也可用來獲得結(jié)合人IL-12的抗體。例如可如下達到此目的通過鏈改組技術(shù) 選擇合適的VL(Winter等(1994) Annual Rev. Immunol.，12，433-55)或者將嚙齒動物抗體 或其他人抗體的CDR(包括本發(fā)明抗體的CDR)移植到VH3家族構(gòu)架上。根據(jù)核苷酸序列同源性，人Va種系所有組成成分可分為10個家族(Williams等
(1996)J. Mol. Biol.，264，220-232)。比較Joe 9的輕鏈可變區(qū)與從VBASE數(shù)據(jù)庫選擇的輕鏈種系序列，顯示Joe 9與DPL8 λ種系相似。Joe 9VL與DPL8序列僅在4個構(gòu)架位置上不 同，而且與其他VaI家族成員的構(gòu)架序列高度同源。鑒于與Joe 9的高度氨基酸序列同源 性和正則結(jié)構(gòu)相似性，其他VaI家族成員也可用來獲得結(jié)合人IL-12的抗體。例如可如下 達到此目的通過鏈改組技術(shù)選擇合適的VL (Winter等同上)或者將嚙齒動物抗體或其他 人抗體的CDR(包括本發(fā)明抗體的CDR)移植到Va 1家族構(gòu)架上。本發(fā)明方法包括結(jié)合hIL-12的重組抗體，它包含得自種系序列的VH3家族成員之 一的重鏈可變區(qū)和得自種系序列的Va 1家族成員之一的輕鏈可變區(qū)。此外，技術(shù)人員知道， 任何Vh3家族重鏈序列成員可與任何Va 1家族輕鏈序列成員組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道，在一個群體(例如人類群體)中存在導(dǎo)致種系氨基酸序 列變化的DNA序列多態(tài)性。這樣的種系序列遺傳多態(tài)性可因為天然等位基因變異而存在于 群體中的個體之間。這樣的天然等位基因變異通?？蓪?dǎo)致1-5%的基因核苷酸序列變異。 天然等位基因變異所致的任何以及全部這樣的核苷酸變異以及由此產(chǎn)生的種系序列氨基 酸多態(tài)性均屬于本發(fā)明范疇。因此，一個方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)結(jié)合人IL-12，并根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝集素母細胞增 殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含選自Vh3種系家族成員之一的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重 鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的接觸位點或超突變位點存在突變。c)具有包含選自νλ 1種系家族成員之一的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述 輕鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點 存在突變。在一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在重鏈CDR3中存
在突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在輕鏈CDR3中
存在突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在重鏈CDR2中
存在突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在輕鏈CDR2中
存在突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在重鏈CDRl中
存在突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分在輕鏈CDRl中
存在突變?！慵夹g(shù)人員知道，鑒于Vh3種系家族成員之間或輕鏈V λ 1種系家族成員之間的 高度氨基酸序列相似性，所以種系序列突變可獲得結(jié)合人IL-12的其他抗體.表1 (參見附 件Α)顯示了 VH3家族成員的種系序列，而且證實了家族成員中的顯著序列同源性。表1還 顯示了 νλ 家族成員的種系序列。提供Joe 9的重鏈序列和輕鏈序列作為比較.例如可在本發(fā)明抗體發(fā)生突變的相同氨基酸位置(例如Joe 9中的突變)，或νλ 家族成 員的種系序列發(fā)生突變?？捎脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，例如PCR誘變，針對種系序列中的各個 氨基酸殘基進行修飾，然后如本文所述對修飾抗體進行動力學(xué)和功能分析(例如實施例3 所述的中和測定和實施例5所述的BIAcore分析)。因此，一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有以 下特性a)具有包含選自SEQ ID NO :595_667的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈 可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在 突變。b)具有包含選自SEQ ID NO :669_675的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈 可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在 突變。一般技術(shù)人員知道，鑒于Joe 9和C0S-3重鏈種系序列之間以及Joe 9和DPL8 λ 種系序列之間的高度氨基酸序列相似性，所以這些種系序列CDR區(qū)的其他突變可獲得結(jié)合 人IL-12的其他抗體?？捎萌缟纤龅臉?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進行這樣的修飾方法。因此，在一個方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具 有以下特性a)結(jié)合人IL-12，并根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝集素母細胞增 殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含C0S-3種系氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)在具有增 強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。c)具有包含DPL8種系氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)在具有增 強活性的氨基酸殘基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變.由于某些氨基酸殘基占據(jù)輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的CDR和構(gòu)架區(qū)的關(guān)鍵位點， 所以結(jié)構(gòu)特征存在于這些區(qū)中。具體來說，⑶R2和⑶Rl區(qū)是正則結(jié)構(gòu)分類的依據(jù)。因為 家族成員之間存在高度氨基酸序列同源性，所以這些正則特性存在于家族成員之間。技術(shù) 人員知道，在賦予這些正則結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基的修飾可產(chǎn)生結(jié)合IL-12的其他抗體?？刹?用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進行所述修飾。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它具有 以下特性a)結(jié)合人IL-12，并根據(jù)表面胞質(zhì)團共振測定，以0. Is—1或0. Is—1以下k。ff速率常 數(shù)與人IL-12解離，或者以1 X IO-6M或1 X 10_6M以下的IC5tl抑制體外植物凝集素母細胞增 殖測定(PHA測定)中的植物凝集素母細胞增殖。b)具有包含選自Vh3種系家族成員之一的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，其中所述重 鏈可變區(qū)包括與其他VH3種系家族成員的CDR2結(jié)構(gòu)相似的CDR2以及與其他VH3種系家族 成員的CDRl結(jié)構(gòu)相似的CDR1，而且其中所述重鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘基的 優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變；c)具有包含選自νλ 1種系家族成員之一的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括與其他V λ 1種系家族成員的⑶R2結(jié)構(gòu)相似的⑶R2以及與其他V λ 1種系 家族成員的CDRl結(jié)構(gòu)相似的CDR1，而且其中所述輕鏈可變區(qū)在具有增強活性的氨基酸殘 基的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點存在突變。本發(fā)明重組人抗體具有與選自VBASE數(shù)據(jù)庫的人種系免疫球蛋白序列同源的可 變區(qū)和恒定區(qū)。重組人抗體的突變(例如隨機誘變或PCR誘變)產(chǎn)生不是由人種系免疫球 蛋白序列編碼的氨基酸。此外，得自人類提供者的重組抗體文庫將包括由于發(fā)生于B細胞 發(fā)育期間的正常體細胞突變過程而不同于其相應(yīng)種系序列的抗體序列。值得注意的是，如 果PCR擴增獲得的“種系”序列編碼不同于真正種系構(gòu)型的構(gòu)架區(qū)的氨基酸(即與真正種 系序列相比擴增序列發(fā)生改變)，則最好使這些氨基酸不同變回真正種系序列(即構(gòu)架殘 基“回復(fù)突變”為種系構(gòu)型)。因此本發(fā)明可任選包括回復(fù)突變步驟。為此，首先比較所述 種系編碼的重鏈和輕鏈氨基酸序列與突變免疫球蛋白重鏈和輕鏈構(gòu)架氨基酸序列，鑒定與 最接近種系序列不同的突變免疫球蛋白構(gòu)架序列的氨基酸殘基。然后，利用遺傳密碼確定 應(yīng)該使哪個核苷酸改變，從而使突變免疫球蛋白序列的合適核苷酸回復(fù)突變?yōu)橄鄳?yīng)的種系 序列。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法如PCR介導(dǎo)的誘變(其中突變核苷酸摻入PCR引物，使得PCR產(chǎn)物存 在所述突變)或定點誘變對突變免疫球蛋白構(gòu)架序列進行誘變。研究鑒定為回復(fù)突變侯選 對象的各氨基酸的作用，以了解在抗原結(jié)合中的作用是直接作用還是間接作用，而最終的 人抗體不應(yīng)有突變后發(fā)現(xiàn)影響人抗體任何需要特性的任何氨基酸；舉例來說，使用選擇性 誘變方法鑒定的增強活性的氨基酸不易發(fā)生回復(fù)突變。測定誘變獲得的抗體特性的測定可 包括ELISA、競爭性ELISA、體外和體內(nèi)中和測定和/或(參見例如實施例3)各種來源(包 括人、靈長類和/或其他物種)的組織切片的組織化學(xué)。為了使回復(fù)突變的氨基酸數(shù)目最少，可保留與最接近種系序列不同、但是與第二 種種系序列相應(yīng)氨基酸相同的氨基酸位置，前提是第二種種系序列的所述氨基酸兩側(cè)至少 10個、優(yōu)選12個氨基酸與本發(fā)明人抗體的序列相同而且共線性。這保證用本發(fā)明的人抗體 治療個體的?；乖岢始毎岢式o免疫系統(tǒng)的任何肽表位都不是外源性的，而是與自身 抗原相同，即所述第二種種系序列編碼的免疫球蛋白?？稍趦?yōu)化抗體的任何階段進行回復(fù) 突變；但是優(yōu)選正好在選擇性誘變方法之前或之后進行由復(fù)突變。更優(yōu)選正好在選擇性誘 變方法之前進行回復(fù)突變。III.對優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點和/或超突變位點的修飾通?？捎靡陨喜糠諭I所述的噬菌體展示方法選擇親和力提高的抗體?？梢酝ㄟ^ CDR殘基的隨機突變組合以及產(chǎn)生包含不同序列抗體的大文庫達到此目的。然而，對于有 效選擇方法，抗體抗原反應(yīng)必須處于平衡，以便高親和力抗體在不同時間優(yōu)選結(jié)合所述抗 原。在達到某一水平的親和力(即抗體Υ61的親和力)后，當(dāng)噬菌體展示方法用來提高選 定抗IL-12抗體的親和力時，不能確定建立平衡的選擇條件(推測由于抗原和噬菌體顆粒 之間的額外非特異性作用所致)。因此，不能用噬菌體展示方法選擇更高親和力的抗體。因 此，對于至少部分抗體或抗原，噬菌體展示方法受限于其選擇具有高度改善的結(jié)合特異性 /親和性的抗體的能力。所以，建立了克服了這些限制的稱為選擇性誘變方法(Selective Mutagenesis Approach)的方法，它不需要抗體的噬菌體展示的親和力成熟，該方法由本發(fā) 明提供。盡管研制了該選擇性誘變方法，用以克服使用噬菌體展示系統(tǒng)的缺陷，但是應(yīng)該指 出的是，該方法也可用于噬菌體展示系統(tǒng)。而且，選擇性誘變方法可用來增強任何抗體的活性。為了增強抗體的活性(例如親和力活性或中和活性)，人們最好使重鏈和輕鏈的 各CDR位點突變?yōu)橄鄳?yīng)的其他可能氨基酸殘基。但是，因為抗體內(nèi)平均存在70個CDR位點， 所以這種方法是非常費時的而且操作繁復(fù).因此，本發(fā)明方法使人們可通過只突變重鏈和 /或輕鏈CDR中的某些選定殘基而增強抗體的活性。此外，本發(fā)明方法可增強抗體活性，而 不影響其他需要抗體特性.根據(jù)一級序列或其在可變區(qū)中的位置，不能精確預(yù)測確定抗體可變區(qū)的什么氨 基酸殘基接觸抗原。盡管如此，Kabat等通過對不同特異性抗體進行序列對比，已經(jīng)鑒定 了為抗體之間顯著不同的可變區(qū)局部區(qū)域的CDR(Kabat等(1971)Ann. NY Acad. Sci. 190 382-393, Kabat, Ε. Α.等(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,第 五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)。結(jié)構(gòu)研究表明，抗原結(jié)合表面由CDR 中存在的氨基酸殘基形成。還知道CDR外面的其他氨基酸殘基在抗原結(jié)合中起結(jié)構(gòu)性作用 或直接參與抗原結(jié)合。所以，對于各抗原抗體對，CDR內(nèi)以及CDR外面的氨基酸殘基可能 是重要的。Tomlison等進行了序列對比研究，在重鏈和輕鏈⑶Rl和⑶R2中以及在為體細胞 突變高頻位點的部分κ鏈CDR3中鑒定了許多位點。(Tomlison等(1996) J. Mol. Biol. 256 813-817)。具體來說，位置 H31、H31B、H33、H33B、H52B、H56、H58、L30、L31、L31A、L50、L53、 L91、L92、L93和L94鑒定為體細胞突變高頻位點。然而，該分析不包括重要重鏈⑶R3區(qū) 以及已知位于抗體結(jié)合位點中心而且潛在與抗原產(chǎn)生重要作用的輕鏈⑶R3部分。此外， Tomlison等提出單獨的體細胞多樣性不一定能預(yù)測特定氨基酸在抗原結(jié)合中的作用，而 且他們認為保守氨基酸殘基接觸抗原，而非保守氨基酸殘基不接觸抗原。該結(jié)論進一步 得到關(guān)于體細胞突變對抗體親和力的影響的突變研究的支持(Sharon，(1990), PNAS,84 4814-7)。高親和力抗對苯偶氮基胂酸鹽(Ars)抗體的19個體細胞突變同時被其相應(yīng)的種 系殘基取代，產(chǎn)生種系形式的活性喪失200倍的抗Ars抗體。只恢復(fù)19個體細胞突變中的 3個突變就可恢復(fù)抗Ars抗體的全部親和力，證實允許發(fā)生許多體細胞突變而不影響抗原 結(jié)合活性。該結(jié)果的部分原因在于抗體多樣性特性本身。未成熟B細胞最初可產(chǎn)生識別許多 自我抗原或非自我抗原的低親和力抗體。而且，抗體可能發(fā)生引起自身反應(yīng)的親和力成熟 序列變化過程。所述低親和力抗體的超突變可用來消除自身反應(yīng)性(“負性選擇”)并增加 對外源抗原的親和力。所以，分析無數(shù)抗體的一級和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不能提供以下目的的預(yù)測方 法(1)體細胞超突變位點在親和力成熟過程與降低對不需要抗原的親和力的過程中的作 用；或者(2)特定氨基酸如何影響特定抗原抗體對的特性。通過分析許多抗原抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)進行了闡明特定氨基酸殘基在抗原識 別中的作用的其他努力(MacCallum等(1996) J. Mol. Biol. 262 :732_745)。指出位于CDR中 和CDR外的位點的潛在作用。在26個分析的結(jié)構(gòu)中的10個以上結(jié)構(gòu)中參與抗原結(jié)合的 CDR 位點包括重鏈 H31、H33、H50、H52、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98 和 HlOO 以及 輕鏈L30A、L32、L91、L92、L93、L94、L96。但是，所述作者指出，應(yīng)用這些數(shù)據(jù)和其他結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)預(yù)測抗原接觸可或多或少預(yù)測接觸位點，因此推測不同策略可能適用于不同抗原。Pini等介紹了在大噬菌體展示文庫的抗體CDR序列中隨機化多個殘基，以快速增加抗體親和力(Pini 等(1998) J. Biol. Chem. 273 :21769_21776)。然而，Pini 等所論述的 高親和力抗體在總共8個位置具有突變，而對增強抗體親和力必須哪些變化進行簡化分析 (reductionaryanalysis)不可行，因為需要測試無數(shù)可能組合所需要的最小數(shù)目的氨基酸。此外，隨機化多個殘基不一定能夠保留抗體的其他需要特性。需要的抗體特性是 本領(lǐng)域已知的，包括例如保留非交叉反應(yīng)性，例如與其他蛋白或人組織的非交叉反應(yīng)性，以 及保留與改善中和效價的人種系免疫球蛋白序列密切相關(guān)的抗體序列.其他需要特性包 括保留物種交叉反應(yīng)性的能力、保留表位特異性的能力和保留在哺乳動物細胞中高水平表 達蛋白的能力?？捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)觀測或測量所述需要特性，所述技術(shù)包括但不限于 ELISA、競爭性ELISA、體外和體內(nèi)中和測定(參見例如實施例3)、根據(jù)需要對包括人、靈長 類或其他來源的不同來源的組織切片的免疫組織化學(xué)分析以及利用瞬時表達或穩(wěn)定表達 研究在哺乳動物細胞中的表達。另外，Pini等的方法可導(dǎo)入比增強親和力實際需要的最小數(shù)目更多的變化，而且 可產(chǎn)生在人體內(nèi)引發(fā)抗人抗體(HAMA)形成的抗體。此外，如其他地方所論述，本文證實的 噬菌體展示或其他相關(guān)方法，包括核糖體展示，在抗體和抗原之間親和力達到一定水平后， 這些方法不適用，而且因為其他作用，包括與其他噬菌體或核糖體組分以及抗原的其他作 用，不能在合理的時間范圍內(nèi)建立達到平衡所需的條件。一般技術(shù)人員可以從上述參考文獻內(nèi)容收集關(guān)于抗體多樣性原因的有趣科學(xué)信 息。然而，本發(fā)明提供增強特定抗原抗體對的抗體親和力的方法，同時保留抗體的其他相關(guān) 特性或需要特性。這在考慮需要賦予特定抗體各種不同特性包括抗原結(jié)合時特別重要。如果起始抗體具有需要保留的需要特性時，選擇性誘變方法是保留這些需要特性 而同時增強抗體活性的最佳策略。例如誘變Y61時，目的是增強抗體對hIL-Ι的親和力而 且提高抗體的中和效價，同時保留所需要的特性。需要的Y61特性包括(1)保留與其他蛋 白或人組織的非交叉反應(yīng)性，(2)保留精確的表位特異性，即優(yōu)選識別p70(p40/p35)異源 二聚體中的P40表位，因此防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾；以及(3)產(chǎn)生具有盡可能接近 其相應(yīng)種系免疫球蛋白序列的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明方法提供選擇性誘變方法作為保留抗體需要特性同時 增強親和力和/或中和效價的策略。術(shù)語“選擇性誘變方法”定義同上，包括分別使選定氨 基酸殘基突變的方法?？墒紫葟膬?yōu)選選擇性誘變位點選擇需要突變的氨基酸殘基，然后從 接觸位點、再后從超突變位點選擇需要突變的氨基酸殘基?？墒垢鱾€選定的位置突變?yōu)橹?少2個其他氨基酸殘基，確定所述突變對抗體需要特性以及抗體活性改善的影響。選擇性誘變方法包括以下步驟按照順序1)優(yōu)選選擇性誘變位點；2)接觸位點；3)超突變位點，選擇候選位置， 然后根據(jù)在抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的位置對位置排序(優(yōu)選順序為⑶R3>OTR2 > CDR1)；按照排列的順序分別使候選的優(yōu)選選擇性誘變位點、超突變位點和/或接觸位點 突變?yōu)樗锌赡艿钠渌被釟埢治龈鱾€突變對抗體活性的影響，以確定增強活性的
氨基酸殘基；必要時，逐步組合各個增強活性的氨基酸殘基，分析各種組合對抗體活性的影響；選擇具有增強活性的氨基酸殘基的突變抗體，就其免疫原性潛能根據(jù)氨基酸取代的部 位和同一性對所述突變抗體進行排序。最高位次為包含幾乎與種系數(shù)據(jù)庫描述的可變區(qū)序 列相同的氨基酸序列的突變抗體，或者具有與其他人抗體相似的氨基酸序列的突變抗體。 第二位次為包含種系序列或其他人抗體序列罕見的氨基酸取代的突變抗體。最低位次為種 系序列或另一種人抗體序列未曾有的氨基酸取代的突變抗體。如上所述，突變抗體包含的 至少一個增強活性的氨基酸殘基位于⑶R3優(yōu)于位于⑶R2，位于⑶R2優(yōu)于位于⑶R1。重鏈 可變區(qū)CDR優(yōu)于輕鏈可變區(qū)CDR。還可以研究突變抗體例如與其相應(yīng)的親代抗體相比的活性增強情況.例如應(yīng)用 中和測定或利用表面胞質(zhì)團共振分析的結(jié)合特異性/親和性(參見實施例3)可測定突變 抗體的活性改善。優(yōu)選活性改善較親代抗體增高至少2-20倍?；钚愿纳戚^親代抗體增高 可至少為“xl”至“x2”倍，其中“xl”和“x2”為2-20之間而且包括2和20的整數(shù)，包括所 述范圍中的范圍，例如2-15 (例如5-10)。還可以研究具有增強活性的氨基酸殘基的突變抗體，以確定突變后是否保留至少 一種其他需要特性。例如以抗hIL-12抗體測試(1)保留與其他蛋白或人組織的非交叉反 應(yīng)性，⑵保留表位識別，即優(yōu)選識別p70(p40/p35)異源二聚體中的p40表位，因此防止游 離可溶性P40的結(jié)合干擾，以及(3)產(chǎn)生具有盡可能接近其相應(yīng)種系免疫球蛋白序列的重 鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列的抗體；以及根據(jù)不同于種系序列的數(shù)目確定哪些抗體至 少可能引發(fā)人免疫反應(yīng).對具有1個以上(例如至少2個或至少3個)增強活性的氨基酸 殘基的抗體進行相同的觀測，以確定是否保留了需要特性。在誘變Y61中應(yīng)用“選擇性誘變方法”的一個實例如下所述。各突變H31S — E、 L50 — Y或L94G —Y分別增強抗體的中和活性。然而當(dāng)測試組合克隆時，組合克隆 H31S — E+L50 — Y+L94G — Y 的活性不比 L50 — Y+L94G — Y(J695)更好。所以，CDRl 的位 置31由種系氨基酸殘基Ser變?yōu)镚lu對于J695的活性比Y61有提高是非必須的。因此， 選擇性誘變方法鑒定與最終活性有關(guān)的最小數(shù)目的變化，由此降低最終抗體的免疫原性潛 力而且保留抗體的其他需要特性。選擇性誘變方法制備的編碼VH和VL的分離DNA可轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片 段基因或scFV基因，如IV部分所述。為了表達選擇性誘變方法制備的VH和VL區(qū)，可將編 碼重鏈和輕鏈的表達載體轉(zhuǎn)染入各種宿主細胞，見IV部分的詳細介紹。優(yōu)選宿主細胞包括 原核生物宿主細胞，例如大腸桿菌，或者真核生物宿主細胞，例如酵母細胞，如釀酒酵母。最 優(yōu)選的真核生物宿主細胞是哺乳動物宿主細胞，見IV部分的詳細介紹。選擇性誘變方法提供了制備活性增強的抗體的方法而不需要用其他方法預(yù)先進 行抗體親和力成熟。選擇性誘變方法提供制備經(jīng)過回復(fù)突變、親和力增強的抗體的方法。選 擇性誘變方法還提供增強親和力成熟抗體的活性的方法。技術(shù)人員知道，選擇性誘變方法可用于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)抗體操作技術(shù).實例包 括但不限于CDR移植抗體、嵌合抗體、scFV片段、全長抗體的Fab片段和其他來源例如轉(zhuǎn)基 因小鼠的人抗體。對抗體進行快速大規(guī)模的突變分析包括利用核糖體展示技術(shù)的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 (參見例如 Hanes 等，(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :4937_4942 ；Dall Acqua 等，(1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8 :443_450 ；He 等，(1997) Nucleic Acid Res. 25 :5132_5134)和授予Kawasaki的美國專利第5，643，768和5，658，754號。選擇性誘變方法還提供制備可用 核糖體展示技術(shù)選擇的活性增強抗體的方法。在本發(fā)明方法中，通過改變HCVR和/或LCVR的各個⑶R位點而進一步修飾抗體或 其抗原結(jié)合部分。盡管可以用噬菌體展示抗體制備這些修飾，但是優(yōu)選所述方法，因為可用 在其他類型宿主系統(tǒng)如細菌、酵母或哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中表達的抗體實施該方法。選 擇用于修飾的CDR中的各個位點基于為接觸位點和/或超突變位點的位點。本文定義的優(yōu)選接觸位點和超突變位點示于表3 (參見附件A)，其按照本發(fā)明方 法的修飾詳細介紹于實施例2。優(yōu)選接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、 H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、 L91、L92、L93、L94 和 L96。優(yōu)選超突變位點選自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、 L31、L32、L53和L93。更優(yōu)選的氨基酸殘基(稱為“優(yōu)選選擇性誘變位點”)既是接觸位點 又是超突變位點，它們選自 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、 L92、L93、L94。特別優(yōu)選的接觸位點選自L50和L94。優(yōu)選增強活性的氨基酸殘基取代位于 選自以下位點的氨基酸殘基H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。更優(yōu)選增強活性的氨基酸殘基取代位于以下位點的氨基酸殘基H30、H31、H31B、H32、 H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94。特別優(yōu)選增強活性的氨基酸殘 基取代位于選自L50和L94的位點的氨基酸殘基。一般來說，本發(fā)明方法包括選擇目的親代抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈或輕鏈 CDR中特別優(yōu)選的選擇性誘變位點、接觸位點和/或超突變位點，隨機突變所述各位點(例 如利用突變寡核苷酸的遺傳方法制備修飾抗體的“微小文庫(mini-library)”)或者使一 個位點突變?yōu)樘囟ㄐ枰被?，以鑒定顯示增強活性的氨基酸殘基，純化修飾抗體(例如 用非噬菌體展示宿主系統(tǒng))，檢測修飾抗體對抗原的活性(例如利用BIAcore分析測定k。ff 速率)，必要時，對其他CDR位點重復(fù)所述步驟，組合證實活性增強的各個突變，以及測試各 種組合是否產(chǎn)生較親代抗體更高活性(例如親和性或中和效價)的抗體或其抗原結(jié)合部 分。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法， 包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)依次選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的1)優(yōu)選選擇性誘變位點，2)接觸 位點或3)超突變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；e)任選對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟 a)-d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形成組 合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及
g)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié) 合部分。最好所述選定抗體的活性提高而如上所述不喪失或保留親代抗體的至少一種需要 特性。一般技術(shù)人員應(yīng)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可檢測或觀測所述需要特性。優(yōu)選的接觸位點選自H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。優(yōu)選超突變位點選自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更優(yōu)選的優(yōu)選選擇性誘變位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特別優(yōu)選的接觸位點選自L50和L94。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)任選對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟 a)-d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、2個單獨顯示具有改進活性的增強活性 的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有兩個增強活性氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于 所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選的接觸位點選自H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96.優(yōu)選超突變位點選自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更優(yōu)選的優(yōu)選選擇性誘變位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特別優(yōu)選的接觸位點選自L50和L94。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；
e)任選對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟 a)-d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、3個單獨顯示具有改進活性的增強活性 的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有兩個增強活性氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于 所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選增強活性的氨基酸殘基取代位于選自以下位點的氨基酸殘基H30、H31、 H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、 L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。在誘變各個選定位點后，可對突變克隆測序，以鑒定在各克隆的選定位點中導(dǎo)入 了什么氨基酸殘基。可選擇少數(shù)克隆(例如約24個)進行測序，在統(tǒng)計學(xué)上來說應(yīng)獲得 10-15種獨特抗體，但可對大多數(shù)克隆(例如60個以上)進行測序，保證鑒定在選定位點具 有每種可能取代的抗體。在一個實施方案中，首先選擇用于誘變的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)的接觸位點和/ 或超突變位點。然而，對于已經(jīng)通過噬菌體展示選擇隨機誘變⑶R3區(qū)而體外使親和力成熟 的抗體，最好首先選擇重鏈和/或輕鏈CDRl或CDR2中的接觸位點和/或超突變位點。在一個更優(yōu)選的實施方案中，首先選擇用于誘變的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)的優(yōu)選 選擇性誘變位點。然而，對于已經(jīng)通過噬菌體展示選擇隨機誘變⑶R3區(qū)而體外使親和力成 熟的抗體，最好首先選擇重鏈和/或輕鏈CDRl或CDR2中的優(yōu)選選擇性誘變位點。在另一個優(yōu)選實施方案中，如下依次通過選擇性誘變方法優(yōu)化選定抗體首先使 選自 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94 的優(yōu)選 選擇性誘變位點各自突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基(優(yōu)選為5-14個其他氨基酸)，所獲 得抗體的特征為親和力、中和效價提高(而另外可能的特征為保留至少一種其他地方論述 的其他特性)。如果一個優(yōu)選選擇性誘變位點的突變根本不能或不能足夠增強親和力或中 和效價，甚至如果組合多個增強活性的氨基酸取代優(yōu)選選擇性誘變位點的氨基酸殘基也不 能獲得具有目標(biāo)活性(包括親和力和/或中和效價)的組合抗體，則從H35、H50、H53、H54、 H95、H96、H97、H98、L30A和L96選擇其他氨基酸殘基用于選擇性誘變，并使其各自突變?yōu)橹?少2個其他氨基酸殘基(優(yōu)選為5-14個其他氨基酸殘基)，獲得抗體的特征為親和力、中和 效價提高(而另外可能的特征為保留至少一種其他地方論述的其他特性)。如果選自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A 和 L96 的氨基酸殘基的單 一突變根本不能或不能足夠增強活性(包括親和力和/或中和效價)，甚至如果組合多個增 強活性的氨基酸取代這些位點的氨基酸也不能獲得具有目標(biāo)活性(包括親和力和/或目標(biāo) 中和效價)的組合抗體，則從H33B、H52B、L31A選擇其他氨基酸殘基用于選擇性誘變，并 使其各自突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基(優(yōu)選為5-14個其他氨基酸殘基)，獲得抗體的 特征為親和力、中和效價提高(而另外可能的特征為保留至少一種其他地方論述的其他特 性)。當(dāng)然，連續(xù)選擇性誘變方法可在以上概述的任何步驟終止，只要鑒定出具有需要 活性(包括親和力和中和效價)的抗體。如果預(yù)先選定位點的誘變鑒定出了增強活性的氨基酸殘基，但是組合抗體仍然未達到活性的目標(biāo)組合(包括親和力和中和效價)，和/或如 果所鑒定的增強活性的氨基酸還影響其他需要特性而因此不可接受時，則可對其他CDR殘 基進行誘變(參見IV部分)。本發(fā)明方法可用來改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以獲得預(yù)定的目標(biāo)活性 (例如預(yù)定的親和力和/或中和效價，和/或需要特性)。因此，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分活性以獲得預(yù)定目標(biāo)活性的方法， 包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)從 H30、H31、H3IB、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、
L94選擇優(yōu)選選擇性誘變位點。c)分別使選定的優(yōu)選選擇性誘變位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得 第一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；d)評價第一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定單一選擇性誘變位點的 突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分；e)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形 成組合抗體或其抗原結(jié)合部分。f)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性。g)如果步驟d)或f)沒有獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分，或者 獲得只具有部分活性的抗體，則使選自H35、H50、H53、H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96
的其他氨基酸殘基突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得第二組突變抗體或其抗原結(jié) 合部分；h)評價第二組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定選自H35、H50、H53、 H54、H95、H96、H97、H98、L30A和L96的單個氨基酸殘基的突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性 或部分活性的抗體或其抗原結(jié)合部分；i)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的步驟g)的各 個突變，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；j)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分目標(biāo)活性；k)如果步驟h)或j)沒有獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分，或者 獲得只具有部分活性的抗體，則使選自H33B、H52B和L31A的其他氨基酸殘基突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得第三組突變抗體或其抗原結(jié)合部分；1)評價第三組突變抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定選自H33B、H52B和L31A 的單一氨基酸殘基的突變是否產(chǎn)生具有預(yù)定目標(biāo)活性或部分活性的抗體或其抗原結(jié)合部 分；m)逐步組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的步驟k)的各 個突變，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；η)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，以確定組合抗體或其抗原結(jié)合部 分是否具有預(yù)定目標(biāo)活性，由此獲得具有預(yù)定目標(biāo)活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。
可應(yīng)用許多誘變方法，包括PCR裝配、Kunkel (dut-ung-)和硫代磷酸(Amersham Sculptor試劑盒)寡核苷酸定向誘變。各種各樣的宿主表達系統(tǒng)可用來表速突變抗體，包括細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳 動物表達系統(tǒng)(以及噬菌體展示表達系統(tǒng))。合適細菌表達載體的實例為pUCl 19 (Sfi)。其 他抗體表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的和/或在以下IV部分中介紹?？设b定用本發(fā)明方法生產(chǎn)的修飾抗體或其抗原結(jié)合部分，而不依賴于噬菌體展示 方法進行選擇。因此，對于改善通過噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得但是其活性不能進一步通過 噬菌體展示系統(tǒng)誘變增強的重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，特別優(yōu)選本發(fā)明方 法。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方 法，包括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；e)任選對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟 b)至 d)；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、顯示具有改進活性的各個突變，形成組 合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié) 合部分。優(yōu)選接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、 H58、H95、H96、H97、H98、HlO 1、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96。優(yōu)選超突變位點選自 H30、H31、H31B、H32、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L53 和 L93。 更優(yōu)選的優(yōu)選選擇性誘變位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、 L50、L91、L92、L93和L94。特別優(yōu)選的接觸位點選自L50和L94。利用現(xiàn)有的方法制備結(jié)合親和力和中和效價提高同時保留如上所述的其他抗體 特性是不可能的或者極其費時。但是，本發(fā)明方法可非常容易地鑒定這類抗體。本發(fā)明方 法處理的抗體可以是任何來源的抗體。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方 法，包括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，而且以合適表達系統(tǒng)表達 所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為所述抗體需要保留的特性；直到獲得相對于所述親 代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們 選自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選 識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或 3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自 1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/ p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種 系免疫球蛋白序列的抗體。如果抗體針對特定抗原的親和力會因此增強，而此時噬菌體展示方法(或相關(guān)系 統(tǒng)，包括核糖體展示)不再適用，且要保留其他需要特性，則可應(yīng)用本發(fā)明方法。因此，在另 一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；
e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為需要保留的特性；直到獲得相對于所述親代抗體或 其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分；f)任選對至少一個其他優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點重復(fù)步驟 a)至 e)；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性和至少 一種保留特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性；直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特 性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游 離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體.在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們 選自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選 識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或 3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自 1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/ p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種 系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；
e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為所述抗體需要保留的特性；直到獲得相對于所述親 代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們 選自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選 識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或 3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選 自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/ p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種 系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包 括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突 變位點，由此鑒定選定的接觸位點或超突變位點；c)分別使所述選定的優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點突變?yōu)橹辽? 個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表 達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性，其中所述特性為所述抗體需要保留的特性；直到獲得相對于所述親 代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選實施方案中，所述接觸位點選自H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、 H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、 L55、L91、L92、L93、L94和L96，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述超突變位點選自H30、H31、H31B、H32、H52、H56、 H58、L30、L31、L32、L53和L93，而所述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交 叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止 游離可溶性P40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，選擇性誘變的殘基選自優(yōu)選選擇性誘變位點，它們 選自 H30、H31、H31B、H32、H33、H52、H56、H58、L30、L31、L32、L50、L91、L92、L93、L94,而所 述其他特性選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選 識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或 3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述接觸位點選自L50和L94，而所述其他特性選自 1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/ p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種 系免疫球蛋白序列的抗體。IV.修飾其他⑶R殘基最后，可用增強活性的氨基酸殘基需要、和/或結(jié)合抗原和/或保留所述抗體其他 需要特性直接或間接需要的任何方法鑒定特定抗體抗原對中的所有CDR殘基。這類CDR殘 基稱為“優(yōu)選選擇性誘變位點”。應(yīng)該注意的是，在特定的條件下也可以用其他方法鑒定所 述優(yōu)選選擇性誘變殘基，包括抗體和抗原的共結(jié)晶以及分子建模。如果完成了優(yōu)選鑒定集中于上述優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點的 增強活性的氨基酸的所有努力，或者如果需要其他改進，可如下所述修飾其余CDR殘基。應(yīng) 該知道，按照上述實施方案已經(jīng)可以在任何一個或多個接觸位點或超突變位點修飾所述 抗體，但是可能需要進一步改進。所以，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗 原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價所述突變抗體或所述突變抗體系列或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗 體或其抗原結(jié)合部分的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價所述突變抗體或所述突變抗體系列或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗 體或其抗原結(jié)合部分的至少一種其他特性的變化，直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原 結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。如果一個殘基的誘變不能滿足要求，則可誘變其他殘基；因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；B)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的
位點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至d)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性的增強 活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性，直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部 分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。如果完成了優(yōu)選鑒定集中于上述接觸位點或超突變位點的增強活性的氨基酸的 所有努力，或者如果需要其他改進，而且所述抗體不能通過誘變和噬菌體展示(或相關(guān)的 核糖體展示)方法進一步優(yōu)化，則可如下所述修飾其余CDR殘基。應(yīng)該知道，按照上述實施 方案已經(jīng)可以在任何一個或多個優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點修飾所述抗 體，但是可能需要進一步改進。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方 法，包括a)提供重組親代抗體或其抗原結(jié)合部分；所述重組抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇 獲得，但是其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、 H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、 L91、L92、L93、L94以外的氨基酸殘基和；c)分別使所述選定接觸或超突變位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得 一組突變抗體或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化，直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。
如果單一誘變不足以提高所述抗體的親和力，則可誘變其他殘基。因此，在另一個 實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分，并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達所述抗體系列；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他位點重復(fù)步驟b)至d)，所述位點既不是b)項選定的位點，也 不是 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、H97、H98、 H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個單獨顯示具有改進活性的增強 活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和其他特性；直到獲得相對于所述親代抗體或其 抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體?？赡芡瓿闪藘?yōu)選鑒定集中于所述優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點或超突變位點的 增強活性的氨基酸的所有努力，或者可能需要其他改進，而且重要的是保留所述抗體的其 他特性。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性而不 影響其他特性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化，直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性 并保留其他特性的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。如果單一殘基的誘變不能滿足要求，則可誘變其他殘基；所以，在另一個實施方案 中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性變化；f)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至e)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；g)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個分別顯示改進活性而不影響至 少一種其他特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及h)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和至少一種其他特性的保留情況；直到獲得相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種保留的其他特性的抗體或其 抗原結(jié)合部分。對優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸和超突變殘基的誘變可能并沒有足夠增強所述抗體 的親和力，而誘變和噬菌體展示方法(或相關(guān)核糖體展示方法)可能不再有用，而且應(yīng)該保 留至少一種其他特性。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的親和力的 方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、HlOU L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的
位點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組突變抗體 或其抗原結(jié)合部分并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的至少一種其他特性的變化，直到獲得相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性的抗體或其抗原結(jié)合部分。所述其他特性優(yōu)選選自1)保留與其他蛋白或人體組織的非交叉反應(yīng)性，2)保留 表位識別，即優(yōu)選識別p70 p40/p35異源二聚體情況下的p40表位，防止游離可溶性p40的 結(jié)合干擾，和/或3)產(chǎn)生接近種系免疫球蛋白序列的抗體。如果單一殘基的誘變不能滿足要求，則可誘變其他殘基；所以，在另一個實施方案 中，本發(fā)明提供改善抗體或其抗原結(jié)合部分的活性的方法，包括a)提供親代抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體以噬菌體展示系統(tǒng)選擇獲得，但是 其活性不能通過所述噬菌體展示系統(tǒng)誘變進一步提高；b)在 H30、H31、H3IB、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 以外的位
點選擇用于突變的互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基；c)分別使所述選定位點突變?yōu)橹辽?個其他氨基酸殘基，由此獲得一組交變抗體 或其抗原結(jié)合部分并以非噬菌體展示系統(tǒng)表達；d)評價該組突變抗體或其抗原結(jié)合部分相對于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分 的活性和至少一種其他特性的保留情況，由此鑒定增強活性的氨基酸殘基；e)對至少一個其他⑶R位點重復(fù)步驟b)至d)，所述CDR位點既不是b)項選定的 位點，也不是 H30、H31、H31B、H32、H33、H35、H50、H52、H52A、H53、H54、H56、H58、H95、H96、 H97、H98、H101、L30、L31、L32、L34、L50、L52、L53、L55、L91、L92、L93、L94 和 L96 位點；f)組合所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分、至少2個分別顯示改進活性而不影響至 少一種其他特性的增強活性的氨基酸殘基，形成組合抗體或其抗原結(jié)合部分；以及g)評價具有2個增強活性的氨基酸殘基的所述組合抗體或其抗原結(jié)合部分相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分的活性和至少一種其他特性的保留情況，直到獲得相對 于所述親代抗體或其抗原結(jié)合部分具有改進活性和至少一種其他保留特性的抗體或其抗 原結(jié)合部分。V.表達抗體可通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白輕鏈基因和重鏈基因，制備本發(fā)明的抗 體或抗體部分。為了重組表達抗體，用一個或多個攜帶編碼所述抗體的免疫球蛋白輕鏈和 重鏈的DNA片段的重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，使得所述輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達， 而且優(yōu)選分泌入培養(yǎng)所述宿主細胞的培養(yǎng)基中，從該培養(yǎng)基中可回收所述抗體。標(biāo)準(zhǔn)重 組DNA方法學(xué)用來獲得抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因，使這些基因?qū)胫亟M表達載體中， 然后使所述載體導(dǎo)入宿主細胞中，所述標(biāo)準(zhǔn)方法例如為以下文獻介紹的方法=Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis (編輯)，Molecular Cloning ；A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Ausubel, F. Μ.等(編輯)CurrentProtocols in Molecuar Biology,Greene Publishing Associates, (1989)和 Boss 等的美國專利第 4，816，397 號。為了獲得編碼Joe 9wt或Joe 9wt-相關(guān)抗體的重鏈可變區(qū)的DNA片段，如II部 分所述，從人文庫篩選人IL-12特異性抗體并使其突變。獲得編碼Joe 9wt或Joe 9wt_相 關(guān)VH和VL節(jié)段的DNA片段后，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法例如PCR定點誘變(PCR介導(dǎo)的誘變，其中突 變核苷酸摻入PCR引物中，使得PCR產(chǎn)物存在所述突變)或其他定點誘變方法，對這些序列 進行誘變。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進一步操作具有需要水平的活性和結(jié)合特異性/親和性的人IL-12抗體如J695，例如使可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv 基因。在這些操作中，VL或VH編碼DNA片段與編碼另一種蛋白的另一 DNA片段如抗體恒 定區(qū)或柔性接頭有效連接。本文使用的術(shù)語“有效連接”是指兩種DNA片段連接在一起，使 得兩種DNA片段編碼的氨基酸序列保持在讀框中。編碼VH區(qū)的分離DNA可通過使VH編碼DNA與另一種編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和 CH3)的DNA分子有效連接而轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知 的(參見例如 Kabat，E· A·等(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest， 第五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增可獲得包含這些 區(qū)段的DNA片段。所述重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒 定區(qū)及Kabat介紹的其任何同種異型變異體(Kabat，E. Α.等(1991) Sequence of Proteins oflmmunological Interest，第五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)，但是 最優(yōu)選為IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，VH編碼DNA可以與另一種只編碼 重鏈CHl恒定區(qū)的DNA分子有效連接。編碼VL區(qū)的分離DNA可通過使VL編碼DNA與另一種編碼輕鏈恒定區(qū)CL的DNA 分子有效連接而轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是 本領(lǐng)域己知的(參見例如 Kabat，E. A.等(1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國人類健康服務(wù)部，NIH公告第91-3242號)，通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增可獲 得包含這些區(qū)段的DNA片段。所述輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選λ恒定 區(qū)。為了獲得scFv基因，使VH和VL編碼DNA片段與另一種編碼柔性接頭的片段 如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3W片段有效連接，使得VH和VL序列可表達為鄰接的單 鏈蛋白，VL和VH區(qū)通過柔性接頭連接在一起(參見例如Bird等(1988) Science M2 423-426 ；Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；McCafferty 等， Nature(1990)348 :552_554)。為了表達本發(fā)明抗體或抗體部分，使如上所述獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈 的DNA插入表達載體中，使得所述基因與轉(zhuǎn)錄控制序列和翻譯控制序列有效連接。在這種 情況下，術(shù)語“有效連接”是指抗體基因連接入載體，使得所述載體中的轉(zhuǎn)錄控制序列和翻 譯控制序列發(fā)揮其預(yù)定的調(diào)節(jié)所述抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的作用。選擇與所用的表達宿主 細胞匹配的表達載體和表達控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可插入獨立的載體， 而更常見的是，將這兩種基因插入同一表達載體。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如連接在抗體基因片 段和載體中的互補限制性位點，或者如果沒有限制性位點則平端連接)使抗體基因插入表 達載體中。在插入J695或J695相關(guān)的輕鏈序列或重鏈序列之前，所述表達載體已經(jīng)帶有 抗體恒定區(qū)序列。例如一種使J695或J695相關(guān)的VH和VL序列轉(zhuǎn)化為全長抗體基因的方 法是將其分別插入編碼重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體中，使得VH節(jié)段與所述載體 中的CH節(jié)段有效連接，而VL節(jié)段與所述載體中的CL節(jié)段有效連接。另外或者二者擇一， 重組表達載體可編碼有助于抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽。抗體鏈基因可克隆入載體， 以便信號肽按讀框與抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源 信號肽(即非免疫球蛋白信號肽)。除了抗體鏈基因之外，本發(fā)明重組表達載體攜帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)序列.術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”是指包括控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增 強子和其他表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。例如以下文獻介紹了這類調(diào)節(jié)序列 Goeddel ；GeneExpression Technology :Methods in Enzymology 185，Academic Press， SanDiego,CA(1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，表達載體的設(shè)計，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可能取 決于諸如用于轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、需要蛋白的表達水平等的因素。用于哺乳動物宿主 細胞表達的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括控制蛋白在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如得 自以下病毒的啟動子和/或增強子巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病 毒40 (SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)) 和多瘤病毒。關(guān)于病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進一步介紹，參見例如Stinski的美國專利第 5，168，062號、Bell等的美國專利第4，510，245號和Schaffner等的美國專利第4，968，615 號，Bujard等的美國專利第5，464，758號和Bujard等的美國專利第5，654，168號。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列之外，本發(fā)明重組表達載體可攜帶其他序列，例如調(diào) 節(jié)所述載體在宿主細胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點)和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基 因有助于選擇所述載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細胞(參見例如均為Axel等的美國專利第 4，399，216,4, 634，665和5，179，017號)。例如，選擇標(biāo)記基因通常賦予載體導(dǎo)入其中的 宿主細胞對藥物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還 原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤選擇/擴增dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于G418選 擇)。為了表達輕鏈和重鏈，編碼重鏈和輕鏈的表達載體通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)染入宿主細胞 中。各種形式的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”包括通常用于將外源DNA導(dǎo)入原核生物宿主細胞或真核生物 宿主細胞的各種各樣的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上可 在原核生物宿主細胞或真核生物宿主細胞中表達本發(fā)明抗體，但是優(yōu)選在真核生物宿主細 胞中表達抗體，而最優(yōu)選哺乳動物宿主細胞，因為真核生物細胞、尤其是哺乳動物細胞較 原核生物細胞更可能裝配和分泌適當(dāng)折疊的免疫活性抗體。用于表達本發(fā)明重組抗體的優(yōu) 選哺乳動物宿主細胞包括中國蒼鼠卵巢細胞(CH0細胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220 介紹的 dhfrTHO 細胞，和 DHFR 選擇標(biāo)記一起使 用，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601_621 中所介紹)、NSO 骨髓瘤細 胞、COS細胞和SP2細胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞時，如下 制備抗體培養(yǎng)宿主細胞足夠長時間，使抗體在宿主細胞中表達，更優(yōu)選所述抗體分泌入宿 主細胞在其中生長的培養(yǎng)基中。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法可從培養(yǎng)基中回收抗體。宿主細胞也可以用來產(chǎn)生完整抗體的一部分，例如Fab片段或scFv分子。應(yīng)該知 道，關(guān)于上述方法的各種改變也屬于本發(fā)明范疇。例如最好用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或重 鏈(而不是同時的二者)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細胞。重組DNA技術(shù)也可用來去除結(jié)合hIL-12 非必需的編碼輕鏈或重鏈或二者的DNA的一部分或全部。本發(fā)明的抗體也包括這樣的截短 DNA分子表達的分子。另外，可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)交聯(lián)方法交聯(lián)本發(fā)明抗體與第二種抗體制備 雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，而另一條重鏈和輕鏈?zhǔn)欠莌IL-12 抗原特異性的。在一個用于重組表達本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的優(yōu)選系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈 和抗體輕鏈的重組表達載體通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入dhfr-CHO細胞。在重組表達載體中，抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因獨立與增強子/啟動子調(diào)節(jié)元件(例如得自SV40、CMV、腺 病毒等，如CMV增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件)有 效連接，以驅(qū)動高水平的基因轉(zhuǎn)錄。重組表達載體還攜帶有DHFR基因，它使得可應(yīng)用甲氨 蝶呤選擇/擴增選擇以載體轉(zhuǎn)染的CHO細胞。培養(yǎng)選定的轉(zhuǎn)化體宿主細胞，以便表達抗體 重鏈和抗體輕鏈，從培養(yǎng)基中回收完整抗體。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)用來制備重組表達載體、 轉(zhuǎn)染宿主細胞、選擇轉(zhuǎn)化體、培養(yǎng)宿主細胞以及從培養(yǎng)基中回收抗體?？捎萌嗣庖咔虻鞍?基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)表達本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分(參見例如Taylor， L.D.等(1992) Nucl. Acids Res.迎6287_6295)。也可以修飾植物細胞，以產(chǎn)生表達本發(fā)明 抗體或其抗原結(jié)合部分的轉(zhuǎn)基因植物。鑒于以上所述，本發(fā)明的另一個方面涉及可用于重組表達本發(fā)明抗體和各種抗體 部分的核酸、載體和宿主細胞組分。本發(fā)明的特征優(yōu)選在于編碼J695的CDR或J695的完 整重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的分離核酸。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的特征在于 一種編碼抗體重鏈可變區(qū)的分離核酸，所述分離核酸編碼包含SEQ ID N0:25氨基酸序列的 J695重鏈⑶R3。優(yōu)選編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸還編碼包含SEQ ID N0:27氨基酸序列的 J695重鏈⑶R2。更優(yōu)選編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸還編碼包含SEQ ID N0:29氨基酸序列 的J695重鏈⑶R1。甚至更優(yōu)選所述分離核酸編碼包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的抗體 重鏈可變區(qū)(J695的全長VH區(qū))。在其他實施方案中，本發(fā)明的特征在于一種編碼抗體輕鏈可變區(qū)的分離核酸，所 述分離核酸編碼包含SEQ ID N0:26氨基酸序列的J695輕鏈⑶R3。優(yōu)選編碼抗體輕鏈可 變區(qū)的核酸還編碼包含SEQ ID N0:28氨基酸序列的J695輕鏈⑶R2。更優(yōu)選編碼抗體輕 鏈可變區(qū)的核酸還編碼包含SEQ ID N0:30氨基酸序列的J695輕鏈⑶R1。甚至更優(yōu)選所 述分離核酸編碼包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的抗體輕鏈可變區(qū)(J695的全長VL區(qū))。本發(fā)明還提供編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體。例如在一個實施方案 中，本發(fā)明提供編碼以下抗體鏈的重組表達載體a)具有包含SEQ ID NO 31氨基酸序列的可變區(qū)的抗體重鏈；以及b)具有包含SEQ ID NO 32氨基酸序列的可變區(qū)的抗體輕鏈。本發(fā)明還提供一種或多種本發(fā)明重組表達載體導(dǎo)入其中的宿主細胞。優(yōu)選所述宿 主細胞為哺乳動物宿主細胞，更優(yōu)選宿主細胞為CHO細胞、NSO細胞或COS細胞。本發(fā)明甚 至還提供如下合成本發(fā)明重組人抗體的方法在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，直 到合成本發(fā)明的重組人抗體。所述方法還可包括從培養(yǎng)基中分離所述重組人抗體。VI.藥用組合物和藥物的給藥本發(fā)明抗體和各種抗體部分可摻入適合給予患者的藥用組合物中。通常所述藥用 組合物包括本發(fā)明抗體或抗體部分以及藥學(xué)上可接受的載體。本文使用的“藥學(xué)上可接受 的載體”包括生理學(xué)上匹配的任何溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲 吸收劑等。藥學(xué)上可接受的載體的實例包括一種或多種水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘 油、乙醇等，以及它們的組合物。在大多數(shù)情況下，最好所述組合物包含等滲劑，例如糖類、 多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載體還可包括微量的輔助物質(zhì)，例 如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，它們延長抗體或抗體部分的保藏期或有效性。本發(fā)明的抗體和各種抗體部分可摻入適用于胃腸外給藥的藥用組合物中。優(yōu)選抗體或抗體部分制備為含0. l-250mg/ml抗體的注射溶液。注射溶液可由裝于燧石小瓶或琥 珀小瓶、安瓿或預(yù)填充的注射器的液體劑型或凍干劑型構(gòu)成。緩沖劑可為PH 5.0_7.0(最 好PH 6.0)的L-組氨酸(l-50mM)，最好5-10mM。其他合適的緩沖劑包括但不限于琥珀酸 鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。氯化鈉可用來以0-300mM濃度(液體劑型最好為150mM) 改善溶液的等滲性(toxicity)。凍干劑型可包含低溫防護劑，主要為0-10%蔗糖(最好 0.5-1.0%)。其他合適低溫防護劑包括海藻糖和乳糖。凍干劑型可包含增量劑，主要為 1-10%甘露醇(最好2-4% )。液體和凍干劑型可應(yīng)用穩(wěn)定劑，主要為l_50mM L-蛋氨酸 (最好5-10mM)。其他合適的增量劑包括甘氨酸、精氨酸，也可包含0-0. 05%吐溫80 (最好 0. 005-0. 01% )0其他表面活性劑包括但不限于吐溫20和BRIJ表面活性劑。在一個優(yōu)選實施方案中，藥用組合物包含約0.01mg/kg-10mg/kg劑量的所述抗 體。更優(yōu)選所述抗體劑量包括每隔1周給予lmg/kg，或每周給予0. 3mg/kg。本發(fā)明的組合物可以為各種形式。這些形式包括例如液體、半固體和固體劑型，例 如液體溶液(例如注射溶液和輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓 劑。優(yōu)選形式取決于預(yù)定的給藥模式和治療用途。常見的優(yōu)選組合物為注射溶液或輸注溶 液形式，例如類似于用于其他抗體被動免疫接種人類的組合物。優(yōu)選的給藥模式為胃腸外 給藥(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉給藥)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體通過靜脈 輸注或注射給藥。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗體通過肌肉或皮下注射給藥。通常治療組合物在生產(chǎn)及儲藏條件下必須是無菌穩(wěn)定的。所述組合物可配制為溶 液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或其他適合高濃度藥物的有序結(jié)構(gòu)。可如下制備無菌注射溶液 將需要量的所述活性化合物(即抗體或抗體部分)以合適溶劑根據(jù)需要與以上列舉的一種 成分或組合物混合，然后過濾除菌。一般如下制備分散劑將所述活性化合物摻入含有基本 分散介質(zhì)和以上列舉的需要的其他成分的無菌溶媒中。在用于制備無菌注射溶液的無菌凍 干粉的情況下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和噴霧干燥，由所述活性成分和任何其他需要 成分的預(yù)先過濾除菌溶液制得凍干粉。例如利用如卵磷脂包衣、在分散劑的情況下維持需 要的顆粒大小，以及利用表面活性劑可維持溶液的合適流體性。通過使組合物中含有延遲 吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鹽和明膠可延長注射組合物的吸收。盡管對于許多治療應(yīng)用來說，優(yōu)選的給藥途徑/給藥模式為皮下注射、靜脈內(nèi)注 射或輸注，但是可用本領(lǐng)域已知的各種方法給予本發(fā)明的抗體和各種抗體部分。技術(shù)人員 知道，給藥途徑和/或給藥模式取決于需要的效果.在某些實施方案中，可應(yīng)用避免所述化 合物快速釋放的載體制備所述活性化合物，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼片和微包 囊傳遞系統(tǒng)?？蓱?yīng)用可生物降解、生物匹配的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙 醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這類制劑的大多數(shù)方法是專利方法或本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的方法。參見例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編著，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可利用例如惰性稀釋劑或可食同化 載體口服給藥。所述化合物(和其他成分，如果需要的話)可裝入硬殼或軟殼明膠膠囊、壓 制成片或直接摻入患者的食物中。對于口服治療性給藥，所述化合物可摻混于賦形劑，而且 以攝食片劑、口頰片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。為了通 過非胃腸外給藥給予本發(fā)明化合物，可能必須用防止其失活的物質(zhì)對本發(fā)明化合物進行包衣或者本發(fā)明化合物與所述物質(zhì)同時給予。其他活性化合物也可以摻入所述組合物中。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體或抗 體部分可與一種或多種其他治療藥物配制在一起和/或共同給予，所述藥物可用于治療 IL-12活性起有害作用的疾病。例如本發(fā)明的抗hIL-12抗體或抗體部分可與一種或多種結(jié) 合其他靶的其他抗體(例如結(jié)合其他細胞因子或結(jié)合細胞表面分子的抗體)配制在一起和 /或共同給予。而且，本發(fā)明的一種或多種抗體可與兩種或兩種以上的前述藥物聯(lián)合使用。 這樣的聯(lián)合治療可有利地使用較低劑量的所給予的治療藥物，因此避免與各種單一治療相 關(guān)的可能毒性或并發(fā)癥。熟練醫(yī)師知道，當(dāng)本發(fā)明抗體用作聯(lián)合治療的一部分時，最好比只 給予患者所述抗體的劑量更低的劑量的抗體(例如通過應(yīng)用聯(lián)合治療可達到協(xié)同治療效 果，它又使得可應(yīng)用較低劑量的所述抗體而達到需要的治療效果)。白細胞介素12在與涉及免疫和炎癥因素的各種疾病有關(guān)的病理學(xué)中起重要作 用。這些疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、少年慢性關(guān)節(jié)炎、Lyme關(guān)節(jié)炎、 牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸 炎、炎癥性腸病、胰島素依賴型糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、變應(yīng)性疾病、牛皮癬、皮炎性硬皮 病、特應(yīng)性皮炎、移植物抗宿主病、器官移植排斥反應(yīng)、與器官移植有關(guān)的急性或慢性免疫 病、肉樣瘤病、動脈硬化、彌散性血管內(nèi)凝血、Kawasaki病、Grave病、腎病綜合征、慢性疲勞 綜合征、Wegener肉芽腫病、Henoch-Schoenlein紫癜、腎臟顯微鏡下血管炎、慢性活動性肝 炎、眼色素層炎、膿毒性休克、毒素性休克綜合征、膿毒病綜合征、惡病質(zhì)、感染性疾病、寄生 蟲病、獲得性免疫缺陷綜合征、急性橫貫性脊髓炎、慢性舞蹈病、帕金森氏病、阿爾茨海默氏 病、中風(fēng)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性腫瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison病、I 型散發(fā)性多腺體缺陷和II型多腺體缺陷、Schmidt綜合征、成人(急性)呼吸窘迫綜合征、 脫發(fā)、斑形脫發(fā)、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)病、Reiter病、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎 關(guān)節(jié)病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶爾森氏菌和沙門氏菌相關(guān)性關(guān)節(jié)病、脊柱關(guān)節(jié)病、動脈硬 化性疾病/動脈硬化、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性大皰病、尋常天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類 天皰瘡、線性IgA病、自身免疫性溶血性貧血、Coombs陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、少 年惡性貧血、肌痛性腦炎/Royal Free Disease、慢性粘膜皮膚念珠菌病、巨細胞性關(guān)節(jié)炎、 原發(fā)性硬化性肝炎、隱原性自身免疫性肝炎、獲得性免疫缺陷病綜合征、獲得性免疫缺陷相 關(guān)性疾病、丙型肝炎、普通可變性免疫缺陷(普通可變性低丙種球蛋白血癥)、擴張性心肌 病、女性不育、卵巢功能衰竭、成熟前卵巢功能衰竭、纖維性肺病、隱原性纖維性肺泡炎、炎 癥后間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性肺炎、結(jié)締組織病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、混合型結(jié)締組織病相關(guān)性肺 病、全身性硬化相關(guān)性間質(zhì)性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性間質(zhì)性肺病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡相 關(guān)性肺病、皮肌炎/多肌炎相關(guān)性肺病、Sjogren病相關(guān)性肺病、關(guān)節(jié)僵硬性脊椎炎相關(guān)性 肺病、脈管炎性彌散性肺病、含鐵血黃素沉著病相關(guān)性肺病、藥物引起的間質(zhì)性肺病、輻射 性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜酸性粒細胞性肺炎、淋巴細胞侵潤性肺病、感染后間 質(zhì)性肺病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性肝炎或 狼瘡樣肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗-LKM抗體肝炎)、自身免疫介導(dǎo)的低血糖、具有黑色 棘皮癥的B型胰島素抵抗、甲狀旁腺功能低下、與器官移植有關(guān)的急性免疫病、與器官移植 有關(guān)的慢性免疫病、骨關(guān)節(jié)病、原發(fā)性硬化性膽管炎、特發(fā)性白細胞減少、自身免疫性嗜中 性白細胞減少、腎病N0S、腎小球腎炎、顯微鏡下的腎臟脈管炎、萊姆病、盤狀狼瘡紅斑、特發(fā)性男性不育或N0S、精子的自身免疫、多發(fā)性硬化(全部亞型)、胰島素依賴型糖尿病、交感 性眼炎、繼發(fā)于結(jié)締組織病的肺動脈高壓、Goodpasture綜合征、結(jié)節(jié)性多動脈炎在肺部的 表現(xiàn)、急性風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性脊椎炎、Still病、全身性硬化、Takayasu病/動脈炎、自身免疫 性血小板減少、特發(fā)性血小板減少、自身免疫性甲狀腺病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺腫自身 免疫性甲狀腺機能低下(Hashimoto病)、萎縮性自身免疫性甲狀腺機能低下、原發(fā)性粘液 性水腫、晶狀體性眼色素層炎、原發(fā)性脈管炎和白癜風(fēng)。本發(fā)明的人抗體和各種抗體部分可 用來治療自身免疫性疾病、尤其是與炎癥有關(guān)的疾病，包括類風(fēng)濕性脊椎炎、變態(tài)反應(yīng)、自 身免疫性糖尿病、自身免疫性眼色素層炎。優(yōu)選本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、多 發(fā)性硬化、胰島素依賴型糖尿病和牛皮癬，見VII部分更詳細的介紹。本發(fā)明的人抗體或抗體部分也可以與用于治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病的 一種或多種其他治療藥物一起使用。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可單獨或聯(lián)合使用以治療所述疾病。應(yīng)該知道，本 發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可單獨使用或與其他物質(zhì)例如治療藥物聯(lián)合使用，所述其他藥 物由技術(shù)人員選定以達到預(yù)定目的。例如所述其他物質(zhì)可以是本領(lǐng)域已知的用于治療本發(fā) 明抗體所治療疾病或病癥的治療藥物。所述其他物質(zhì)也可以是賦予所述治療組合物有益 特性的物質(zhì)，例如影響所述組合物粘度的物質(zhì)。還應(yīng)該知道，本發(fā)明范圍內(nèi)的組合是用于其預(yù)定目的的組合。以下列舉的物質(zhì)是 為了說明本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明。為本發(fā)明組成部分的組合可以是本發(fā)明抗體和至 少一種選自以下所列的其他物質(zhì)。所述組合也可以包括一種以上其他物質(zhì)，例如兩種或三 種其他物質(zhì)，只要這樣的組合形成的組合物能夠?qū)崿F(xiàn)其預(yù)定作用。優(yōu)選的組合為非類固醇抗炎藥物(也稱為NSAIDS)，非類固醇抗炎藥物包括諸如 布洛芬的藥物。其他優(yōu)選組合有包括強的松龍的皮質(zhì)類固醇；當(dāng)聯(lián)合本發(fā)明抗IL-12抗 體治療患者時，通過逐漸減少所需要的類固醇劑量可減少甚至消除應(yīng)用類固醇的周知副作 用?？膳c本發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)合用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥物的非限制性實 例包括以下藥物抑制細胞因子的抗炎藥物(CSAID)；其他的人細胞因子或生長因子(例如 TNF.LT,IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18,EMAP-II,GM-CSF,FGF 和 PDGF) 的抗體或拮抗劑。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可與針對細胞表面分子(例如CD2、CD3、 CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7. 1)、CD86 (B7. 2)、CD90)或其配體 (包括⑶154 (gp39或⑶40L))的抗體聯(lián)合使用。優(yōu)選的治療藥物組合可在不同位點干擾自身免疫和隨后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)；優(yōu)選的 實例包括TNF拮抗劑，例如嵌合人源化或人TNF抗體、D2E7(1996年2月9日申請的美國申請 序號 08/599，226)、cA2 (Remicade )、CDP 571、抗 TNF抗體片段(例如 CDP870)和可溶性 p55 或p75 TNF受體以及它們的衍生物、(p75TNFRIgG(Enbrel )或p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、可 溶性IL-13受體(sIL-13)，此外還有TNF α轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑；同樣IL-1抑制劑(例如 白細胞介素1轉(zhuǎn)化酶抑制劑，例如Vx740或IL-IRA等)因為同樣的原因可能也是有效的。 其他優(yōu)選的組合包括白細胞介素11、抗P7s和ρ-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)。再一優(yōu)選組 合為自身免疫反應(yīng)中的其他重要作用物，它們可與IL-12作用平行發(fā)揮作用、依賴于IL-12 作用或與IL-12作用協(xié)同作用；特別優(yōu)選IL-18拮抗劑，包括IL-18抗體或可溶性IL-18受體或IL-18結(jié)合蛋白。已經(jīng)證實，IL-12和IL-18相互重疊但是具有不同的作用，二者的拮 抗劑組合可能是最有效的。又一優(yōu)選組合是非消耗性抗-CD4抑制劑。另外的其他優(yōu)選組 合包括協(xié)同刺激途徑CD80(B7. 1)或CD86(B7. 2)的拮抗劑，包括抗體、可溶性受體或拮抗性 配體。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分也可以與藥物聯(lián)合使用，所述藥物例如甲氨蝶呤、 6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、奧沙拉嗪氯喹啉/羥氯喹啉、青霉胺、金硫蘋果酸 鹽(肌肉注射和口服)、硫唑嘌呤、秋水仙堿、皮質(zhì)類固醇類(口服、吸入和局部注射)、β _2 腎上腺素受體激動劑(沙丁胺醇、特布他林、沙美特羅)、黃嘌呤類(茶堿、氨茶堿)、色甘酸 鹽、萘多羅米、酮替芬、異丙托銨和氧托銨、環(huán)孢菌素、冊506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、來 氟米特、NSAID如布洛芬、皮質(zhì)類固醇類如強的松龍、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血 栓形成劑、補體抑制劑、腎上腺素能藥物、干擾促炎細胞因子如TNF α或IL-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥 物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL_1 β轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)、抗 P7s、p-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)、TNFa轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑、T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑 如激酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 抑制劑、可溶性細胞因子受體以及它們的衍生物(例如可溶性P55或p75 TNF受體和衍生 物 p75TNFRIgG(Enbrel )和 p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、可溶性 IL-13 受體(sIL-13))和抗炎細胞因子 H^i^niL-4、IL-lO、IL-ll、IL-13*TGF0)。優(yōu)選 組合包括甲氨蝶呤或來氟米特，在中度或重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下優(yōu)選環(huán)孢菌素。與本發(fā)明抗體或其抗體部分聯(lián)合用于炎癥性腸病的治療藥物的非限制性實例包 括以下藥物布地奈德；表皮生長因子；皮質(zhì)類固醇類；環(huán)孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水楊 酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制劑；美沙拉秦；奧沙拉秦；巴柳氮；抗 氧化劑；血栓烷抑制劑；IL-I受體拮抗劑；抗IL-I β單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生 長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基咪唑化合物；其他人細胞因子或生長因子(例如TNF、 LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、ΕΜΑΡ-ΙΙ、GM-CSF、FGF 和 PDFG)的 抗體或拮抗劑。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可與針對細胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、 ⑶8、⑶25、⑶28、⑶30、⑶40、⑶45、⑶69、⑶90)或其配體的抗體聯(lián)合使用。本發(fā)明抗體或 其抗原結(jié)合部分也可以與各種藥物聯(lián)合使用，所述藥物例如為甲氨蝶呤、環(huán)孢菌素、Π(506、 雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、來氟米特、NSAID如布洛芬、皮質(zhì)類固醇類如強的松龍、磷酸二 酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓形成劑、補體抑制劑、腎上腺素能藥物、干擾促炎細胞因子 如TNF α或IL-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)、IL-1 β 轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)、抗P7s、p-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)、TNFa轉(zhuǎn)化酶抑制劑、 T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑如激酶抑制齊U、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡唳、硫唑嘌呤、6-巰基 嘌呤、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、可溶性細胞因子受體以及它們的衍生物(例如可溶性p55 或 P75TNF 受體、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、可溶性 IL-13 受體(sIL-13))和抗炎細胞因 子(例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 和 TGF β ) 可聯(lián)合抗體或抗原結(jié)合部分治療節(jié)段性回腸炎的治療藥物的優(yōu)選實例包括 以下藥物TNF拮抗劑，例如抗TNF抗體、D2E7(1996年2月9日申請的美國申請序號 08/599，226)、cA2 (Remicade )、CDP571、抗 TNF 抗體片段(例如 CDP870)、TNFR-Ig 構(gòu)建 物(p75TNFRIgG(Enbrel )和 p55TNFRIgG(Lenerc^pt)、抗 P7s、ρ-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)、可溶性IL-13受體(sIL-13)和PDE4抑制劑。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與 諸如布地奈德和地塞米松的皮質(zhì)類固醇類聯(lián)合使用。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分也可 以與以下藥物聯(lián)合使用例如柳氮磺吡啶、5-氨基水楊酸和奧沙拉秦，而且也可以與干擾 促炎因子(例如IL-1)的合成或作用的藥物聯(lián)用，例如IL-I β轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740) 和IL-lra。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分還可以與T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑聯(lián)用，例如酪氨 酸激酶抑制劑6-巰基嘌呤。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可與IL-Il組合使用?？膳c本發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)合治療多發(fā)性硬化的治療藥物的非限制性 實例包括以下藥物皮質(zhì)類固醇類；強的松龍；甲基強的松龍；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰 胺；環(huán)孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干擾素-β la(Av0nex ；Biogen)； 干擾素 lb(Betaseron ；Chiron/Berlex) ；Copolymer 1(Cop-1 ；Copaxone ；Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)；高壓氧；靜脈免疫球蛋白；克拉立平(clabribine)； 其他人細胞因子或生長因子(例如 TNF、LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDR；)的抗體或拮抗劑。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可 與針對細胞表面分子(例如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、 CD86、CD90)或其配體的抗體聯(lián)合使用。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分也可以與各種藥物 聯(lián)合使用，所述藥物例如為甲氨蝶呤、環(huán)孢菌素、Π(506、雷帕霉素、霉酚酸莫非替克、來氟米 特、NSAID如布洛芬、皮質(zhì)類固醇類如強的松龍、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗血栓形 成劑、補體抑制劑、腎上腺素能藥物、干擾促炎細胞因子如TNFa或IL-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物 (例如1肌1(力11(、11(1(、？38或嫩？激酶抑制劑)、11^1 β轉(zhuǎn)化酶抑制劑(例如Vx740)、抗P7s、 P-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGL)、TACE抑制劑、T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑如激酶抑制劑、金屬蛋 白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、可溶性細胞因 子受體以及它們的衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受體、sIL-lRI、sIL-lRII、sIL_6R、 可溶性IL-13受體(sIL-13))和抗炎細胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF3 )。可與本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分聯(lián)合治療多發(fā)性硬化的治療藥物的優(yōu)選實例 包括干擾素- β如干擾素β Ia和干擾素β Ib ；Copaxone，皮質(zhì)類固醇類、IL-I抑制劑、TNF 抑制劑和抗⑶40配體和⑶80的抗體。本發(fā)明的藥用組合物可包含“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明抗體或抗體 部分?！爸委熡行Я俊笔侵敢员匾慕o藥劑量和時間周期達到需要的治療效果的有效量?？?體或抗體部分的治療有效量可隨各種因素(例如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重)以及 抗體或抗體部分在個體激發(fā)需要反應(yīng)的能力而變化。抗體或抗體部分的治療有效量也可以 為抗體或抗體部分的治療有益作用超過其任何毒性或有害作用的劑量?！邦A(yù)防有效量”是指 以必要的給藥劑量和時間周期達到需要的預(yù)防效果的有效量。一般來說，因為預(yù)防有效量 是在患者患病前或疾病早期階段使用，所以預(yù)防有效量低于治療有效量?？烧{(diào)整給藥方案以獲得最佳需要反應(yīng)(例如治療反應(yīng)或預(yù)防反應(yīng))。例如單次大 劑量給藥，可隨時間給予數(shù)個分劑量，或者可根據(jù)治療情況的要求相應(yīng)減少或增加劑量。特 別優(yōu)選配制為劑量單位形式的胃腸外組合物，以便于給藥而且劑量均勻。本文使用的劑量 單位形式是指根據(jù)待治療的哺乳動物對象的單位劑量調(diào)制的物理獨立單位；每個單位含有 預(yù)計產(chǎn)生需要治療效果的預(yù)定量活性化合物和需要的藥用載體。本發(fā)明的劑量單位形式的 規(guī)格取決于或直接取決于(a)活性化合物的獨特特性和需要達到的具體治療效果或預(yù)防效果，以及(b)配制技術(shù)固有的限制，例如活性化合物在各個個體的治療敏感性。本發(fā)明抗體或抗體部分治療或預(yù)防有效量的典型非限制性范圍為0. 01-20mg/kg, 更優(yōu)選l-10mg/kg，甚至更優(yōu)選0. 3-lmg/kg。需要注意的是，劑量值可隨需要緩解的病癥類 型和程度而變化。進一步需要指出的是，對于任何具體對象，具體給藥方案應(yīng)該在不同時間 根據(jù)個體需要和管理或監(jiān)控所述組合物使用的人員的專業(yè)判斷而進行調(diào)整，本文給出的 劑量范圍僅僅是舉例說明，而不是限制要求保護的組合物的范圍或?qū)嵤?。VII.本發(fā)明抗體的使用因為本發(fā)明抗hIL-12抗體或其部分能夠結(jié)合hIL-12，所以可應(yīng)用常規(guī)免疫測定， 例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織的免疫組織化學(xué)，將其用來檢 測hIL-12(例如生物樣品，例如血清或血漿)。本發(fā)明提供檢測生物樣品中的hIL-12的方 法，包括使生物樣品與本發(fā)明抗體或抗體部分接觸，以及檢測與hIL-12結(jié)合的抗體(或抗 體部分)或非結(jié)合的抗體(或抗體部分)，由此檢測生物樣品中的hIL-12。應(yīng)用有助于檢測 結(jié)合抗體或非結(jié)合抗體的可檢測物質(zhì)直接標(biāo)記或間接標(biāo)記抗體。合適的可檢測物質(zhì)包括各 種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶實例包括辣根過氧物酶、堿性磷酸 酶、β _半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復(fù)合物的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物 素和抗生物素蛋白/生物素；合適熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、 羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；合適放射 性物質(zhì)的實例包括125I、131I、35S或3H。作為標(biāo)記抗體的替代方法，可應(yīng)用以可檢測物質(zhì)標(biāo)記的rhIL-12標(biāo)準(zhǔn)品和非標(biāo)記 抗hIL-12抗體通過競爭性免疫測定檢測生物體液中的hIL-12。在該測定中，混合生物樣 品、標(biāo)記的rhIL-12標(biāo)準(zhǔn)品和抗hIL-12抗體，測定標(biāo)記的rhIL_12標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合非標(biāo)記抗體 的量。生物樣品中的hIL-12量與結(jié)合抗hIL-12抗體的標(biāo)記rhIL-12標(biāo)準(zhǔn)品量成反比。本發(fā)明的Y61和J695抗體也可以用來檢測非人類物種來源的IL-12、尤其是靈長 類來源的IL-12。例如Y61可用來檢測彌猴和恒河猴的IL-12。J695可用來檢測彌猴、恒河 猴和狒狒的IL-12。然而，抗體既不與小鼠IL-12交叉反應(yīng)也不與大鼠IL-12交叉反應(yīng)(參 見實施例3，F(xiàn)小節(jié)).本發(fā)明的抗體和抗體部分能夠在體外(參見實施例3)和體內(nèi)(參見實施例4) 中和hIL-12活性。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分可用來抑制IL-12活性，例如抑制含有 hIL-12的細胞培養(yǎng)物、人類對象或其他具有本發(fā)明抗體與之交叉反應(yīng)的IL-12的哺乳動物 對象(例如靈長類，諸如狒狒、彌猴和恒河猴)的IL-12活性。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā) 明提供中和人IL-12活性和至少一種其他靈長類IL-12、但是不中和小鼠IL-12活性的分離 的人抗體或其抗原結(jié)合部分，所述靈長類IL-12選自狒狒IL-12、狨IL-12、黑猩猩IL-12、彌 猴IL-12和恒河猴IL-12。所述IL-12優(yōu)選為人IL-12。例如對于含有或懷疑含有hIL_12 的細胞培養(yǎng)物，可在所述培養(yǎng)基中加入本發(fā)明抗體或抗體部分，抑制培養(yǎng)物中的hIL-12活 性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在患有其中IL-12活性有害的疾病的患者 抑制IL-12活性的方法。IL-12參與了各種各樣的疾病的病理生理學(xué)(Windhagen等， (1995)J. Exp. Med. 182 1985-1996 ；Morita φ (1998)Arthritis and Rheumatism. 41 306-314 ；Bucht 等，(1996) Cl in. Exp. Immunol. 103 :347_367 ；Fais 等(1994) J. InterferonRes. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Am. J. Path. 150 :823_832 ；Monteleone 等，(1997) Gastroenterology. 112 1169-1178 和 Berrebi 等，(1998)Am. J. Path. 152 667-672 ； Parronchi等(1997)Am. J. Path. 150 :823_832)。本發(fā)明提供在患有這種疾病的患者抑制 IL-12活性的方法，該方法包括給予所述患者本發(fā)明抗體或抗體部分，使得所述患者體內(nèi)的 IL-12活性受到抑制。最好是所述IL-12為人IL-12，所述患者為人類患者?；蛘?，所述患 者可以是表達本發(fā)明抗體與之交叉反應(yīng)的IL-12的哺乳動物。甚至所述患者可以是導(dǎo)入了 hIL-12的哺乳動物(例如通過給予hIL-12或表達hIL-12轉(zhuǎn)基因)。本發(fā)明抗體可以因為 治療目的而給予人類患者(下文進一步討論)。此外，本發(fā)明抗體可給予表達所述抗體與之 交叉反應(yīng)的IL-12的非人類哺乳動物，其目的是獸醫(yī)學(xué)目的或作為人類疾病動物模型。關(guān) 于后者，這樣的動物模型可用于評價本發(fā)明抗體的治療效能(例如試驗給藥劑量和給藥 療程)。本文使用的術(shù)語“其中IL-12活性有害的疾病”包括其中已經(jīng)證實所述病癥患者 體內(nèi)存在的IL-12是或懷疑是與所述病癥的病理生理學(xué)有關(guān)或者為引起所述病癥惡化的 因素的疾病和其他病癥。因此，其中IL-12活性有害的病癥是預(yù)期抑制IL-12活性可緩解 所述病癥的癥狀和/或發(fā)展的病癥。這類病癥的證據(jù)是例如所述病癥患者的生物體液中的 IL-12濃度升高(例如所述患者的血清、血漿、滑液等中的IL-12濃度升高)，所述IL-12濃 度可用例如如上所述的抗IL-12抗體檢測。關(guān)于其中IL-12活性有害的病癥有許多實例。 在一個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分可用于治療本文所述疾病或病癥的療法。 在另一個實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分可用于生產(chǎn)治療本文所述疾病或病癥的 藥物。下面進一步討論本發(fā)明抗體和抗體部分在治療幾個非限制性的具體病癥中的應(yīng)用；A.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎白細胞介素12在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥性疾病中具有作用。在類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎患者的滑液中已經(jīng)檢測到誘導(dǎo)型IL-12p40信使，而且證實IL-12存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎患者的滑液中(參見例如 Morita 等，(1998) Arthritis and Rheumatism 41 306-314) 發(fā)現(xiàn)IL-12陽性細胞存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜的內(nèi)層下。本發(fā)明人抗體和抗體部分可用 來治療例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Lyme關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié) 炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。一般來說，所述抗體或抗體部分系統(tǒng)性給藥，盡管對于某些病癥來說， 局部給予所述抗體或抗體部分可能是有益的。本發(fā)明抗體或抗體部分也可以與一種或多種 其他用于治療自身免疫性疾病的治療藥物一起給予.在用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型中，在關(guān)節(jié)炎之前用 抗IL-12 mAb(大鼠抗小鼠IL-12單克隆抗體，C17. 15)處理小鼠非常明顯地抑制疾病的發(fā) 生以及降低疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。發(fā)生關(guān)節(jié)炎后早期給予抗IL-12 mAb治療降低關(guān)節(jié) 炎嚴(yán)重程度，但是發(fā)生疾病后晚期用抗IL-12 mAb治療小鼠對疾病嚴(yán)重程度的影響最小。B.節(jié)段性回腸炎白細胞介素-12也在炎癥性腸病節(jié)段性回腸炎具有作用。節(jié)段性回腸炎患者的 腸粘膜的IFN-Y和IL-12表達增高(參見例如Fais等，(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ；Parronchi 等，(1997) Amer. J. Pathol. 150 823~832 ;Monteleone 等，(1997) Gastroenterology 112 1169~1178 ；Berrebi等，(1998)Amer. J. Pathol. 152 :667_672)。已 經(jīng)證實抗IL-12抗體抑制小鼠結(jié)腸炎模型疾病，所述模型例如為TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎IL-12失效小鼠，以及抑制最近的IL-10失效小鼠疾病。因此，本發(fā)明抗體和抗體部分可用于治療 炎癥性腸病。C.多發(fā)性硬化白細胞介素-12在多發(fā)性硬化的病理生理學(xué)中為關(guān)鍵介導(dǎo)物。在多發(fā)性硬化患 者的病變部位證實了誘導(dǎo)型IL-12p40信使或IL-12本身的表達(Windhagen等，(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996, Drulovic 等，(1997) J. Neurol. Sci. 147 145-150)。慢性進行 性多發(fā)性硬化患者的IL-12循環(huán)水平升高。研究多發(fā)性硬化患者的T細胞和抗原提呈細胞 (APC)揭示，自我保持的各個系列的免疫性相互作用為進行性多發(fā)性硬化發(fā)生Thl型免疫 反應(yīng)的基礎(chǔ)。T細胞分泌的IFN-Y增加導(dǎo)致APC產(chǎn)生的IL-12增加，這可長時間維持產(chǎn)生 慢性狀態(tài)的Thl型免疫活化和疾病的循環(huán)(Balashov等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. M 599-603)。采用多發(fā)性硬化的小鼠和大鼠實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)模型研究了 IL-12 在多發(fā)性硬化患者中的作用。在多發(fā)性硬化的小鼠復(fù)發(fā)緩解型EAE模型中，用抗IL-12 mAb 預(yù)先處理延遲麻痹以及降低臨床評分。在麻痹高峰或隨后的復(fù)發(fā)期用抗IL-12 mAb治療降 低臨床評分。因此，本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分可用來緩解人類患者多發(fā)性硬化的相關(guān) 癥狀。D.胰島素依賴型糖尿病白細胞介素-12為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的重要介導(dǎo)物。通過給予IL-12在 NOD小鼠誘導(dǎo)IDDM，而抗IL-12抗體對IDDM過繼轉(zhuǎn)移模型具有保護作用。發(fā)病早的IDDM 患者常常出現(xiàn)所謂的“蜜月期”，在“蜜月期”中保有部分殘留胰島細胞功能。這些殘留胰島 細胞產(chǎn)生胰島素，而且調(diào)節(jié)血糖水平比給予胰島素更好。用抗IL-12抗體治療這些早期發(fā) 病的患者可進一步防止破壞胰島細胞，由此維持內(nèi)源性來源的胰島素。E.牛皮癬白細胞介素-12為牛皮癬的關(guān)鍵介導(dǎo)物。牛皮癬包括與THl型細胞因子表達類 型有關(guān)的急性和慢性皮膚病變。(Hamid 等(1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1 225-231 ； Turka等(1995)Mol. Med. 1 :690_699)。在患病的人體皮膚樣品中檢測到IL-12 p35和p40 mRNA。由此，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可用來緩解諸如牛皮癬的慢性皮膚病。通過以下實施例進一步闡明本發(fā)明，而不能將其解釋為以任何方式限制本發(fā)明。 在整個本說明書中引用的所有引用文獻，包括參考文獻、授予的專利和公開的專利申請，其 內(nèi)容均通過引用特別結(jié)合到本文中。進而應(yīng)該知道，在此所附的所有表格(參見附件A)內(nèi) 容均引用性納入本發(fā)明。
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實施例實施例1 分離抗IL-12抗體A.篩選IL-12結(jié)合抗體通過篩選3個不同的scFv噬菌體展示文庫分離抗hIL-12的抗體，所述噬菌體展 示文庫利用從人扁桃體(稱為scFv 1)、扁桃體和外周血淋巴細胞(PBL)(稱為svFv 2)、 以及骨髓來源的淋巴細胞(稱為BMDL)獲得的mRNA的人VL和Wi cDNA制得.Vaughan等 (1996)NatureBiotech. 14 309-314中介紹了文庫的構(gòu)建以及篩選方法。應(yīng)用所述各種抗原即人IL-12 p70亞單位、人IL-12 p40亞單位、嵌合IL-12 (小 鼠P40/人p35)、小鼠IL-12、生物素化人IL-12和生物素化嵌合IL-12篩選所述文庫。應(yīng) 用標(biāo)準(zhǔn)方法使所述抗原包被在免疫試管中，從而選擇IL-12特異性抗體(Marks等，(1991) J. Mol. Biol. 222 581-597)。用 IL-12 或生物素化 IL-12 篩選 scFv 文庫 2，產(chǎn)生大量 IL-12 特異性結(jié)合物。根據(jù)BstNl酶性消化類型確定而且經(jīng)DNA測序證實，選擇5個不同的克隆 類型。主要克隆類型有 VHDP58/VLDPL11、VHDP77/VLDPK31、VHDP47/VL 和 VHDP77/VLDPK31， 它們均能夠識別IL-12的p40亞單位。以IL_12p70篩選BMDL文庫獲得3個不同克隆類型.發(fā)現(xiàn)其中2個克隆為交叉反 應(yīng)克隆。對主要克隆測序，而且該克隆由VHDP35/VLDP組成。該克隆識別IL-12的p40亞 單位。用IL-12 p70篩選svFv文庫1沒有獲得特異性IL-12抗體。為了鑒定優(yōu)選結(jié)合p70異源二聚體或IL-12的p53亞單位而不是p40亞單位的 IL-12抗體，使用聯(lián)合的scFv 1+2文庫以及BMDL文庫。為了選擇識別p70異源二聚體或
78P35亞單位的IL-12抗體，使噬菌體文庫預(yù)溫育，并在游離p40存在下進行選擇。對分離克 隆的測序顯示9個不同抗體譜系。通過“micro-Friguet”滴定法進一步分析亞單位優(yōu)選 性。以ELISA中捕獲生物素的IL-12滴定含有scFv的上清液并測定ED5Q。產(chǎn)生50% ED的 scFv濃度與濃度逐漸增加的游離p70或p40 (抑制劑)預(yù)溫育。檢測生物素IL-12包被板 的ELISA信號的減少，并對游離p70或p40濃度作圖。這為p70和p40的各克隆提供IC5(1。 如果兩種亞單位的滴定過程一致，則svFv既結(jié)合p40又結(jié)合p70。滴定過程的任何變化說 明P70優(yōu)選于p40的程度。B.對IL-12的杭體i普系特異件的親和力成孰(Toe 9)測試各克隆抑制IL-12在IL-12受體結(jié)合測定(稱為RBA)中結(jié)合其受體的能力， 以及測試其抑制IL-12誘導(dǎo)的PHA刺激的人體母細胞增殖(PHA測定)的能力，如實施例3 所述。克隆Joe 9在RBA和PHA測定中的IC50值均最低，兩種測定的IC50值均為1 X 10_6M. 另外，Joe9重鏈可變區(qū)(VH)的變化數(shù)與從VBASE數(shù)據(jù)庫鑒定的最接近的種系序列C0S-3相 比最小。表1(見附件A)顯示VH3家族種系序列，其中C0S-3為成員之一，以及VaI家族種 系序列各成員。所以，選擇親和力成熟的Joe 9。Joe9野生型(Joe9wt)抗體的VH和VL的 氨基酸序列示于圖1A-1D。為了提高Joe 9的親和力，制備各種突變的重鏈和輕鏈二者的互補決定區(qū) 3(^1 3)。應(yīng)用重鏈^1 3(稱為“!13”)或輕鏈⑶R3(稱為“L3”)特異性簡并寡核苷酸通過定 點PCR誘變產(chǎn)生⑶R3變異體，在各⑶R3中平均存在3種堿基取代(稱為“摻入(spike)”)。 應(yīng)用含有全部4種核苷酸的隨機混合物的簡并重鏈寡核苷酸5’ TGTCCCTTGGCCCCA(G) (T) (A) (G) (T) (C) (A) (T) (A) (G) (C) (T) (C) (C) (C) (A) (C) (T) GGTCGTACAGTAATA3，(SEQ ID NO 580)和寡核苷酸 pUC 反向 Tag :GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCACACA GG (SEQ ID NO 581)對重鏈⑶R3進行PCR誘變，產(chǎn)生所有組成成分的重鏈⑶R3突變體。應(yīng)用Joe 9 反向寡核苷酸(5，TGG GGCCAA GGG ACA3，(SEQ ID NO 582)和 fdteteseq 24+21 寡核苷酸 (5' -ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GACGTT AGT-3' (SEQ ID NO
583)擴增親代輕鏈。兩種PCR產(chǎn)物之間的互補性用來驅(qū)使兩種片段在PCR裝配反應(yīng)退火，用pUC 反向 Tag(SEQ ID NO 581)禾口 fdTag 5，-ATT CGT CCTATA CCG TTC—3，(SEQ ID NO:
584)擴增全長重組svFv文庫。用含有全部4種核苷酸的混合物的輕鏈寡核苷酸 5，GGTCCCAGTTCCGAAGACCCTCGAACC (C) (C) (T) (C) (A) (G) (G) (C) (T) (G) (T) (T) (G) (T) (C) ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3，(SEQ IDNO :585)禾口 Joe 9 反向寡核苷酸5，TGG GGC CAA GGG ACA3，(SEQID NO 586)對輕鏈進行PCR誘變，產(chǎn)生所有組成成分的輕鏈⑶R3突變體。 應(yīng)用 pUC 反向 Tag (SEQ ID NO 581)和 HuJH3F0R寡核苷酸 5，TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3， (SEQ ID NO 587)擴增親代重鏈。兩種PCR產(chǎn)物之間的互補性用來驅(qū)使兩種片段在PCR裝 配反應(yīng)退火，用反向 Tag GAC ACC TCG ATC AGC G(SEQ ID NO 588)禾口 HuJ λ 2-3F0R NOT寡 核苷酸 5，GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGCCGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC3’ (SEQ ID NO 589)擴增全長重組svFv文庫。用InM生物素化IL-12選擇重鏈⑶R3突變體，用含7nM濃度的游離IL-12或p40 的PBS于室溫下洗滌1小時。利用噬菌體ELISA分析克隆，并應(yīng)用低密度IL-12芯片以 BIAcore動力學(xué)結(jié)合研究測試結(jié)合IL-12的克隆(參見實施例5中的BIAcore分析方法)。一般來說，BIAcore 分析禾[I用 BIAcore 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)通過 表面胞質(zhì)團共振(SPR)測量配體(固定在生物傳感器基體上的重組人IL-12)和分析物(抗 體溶液)之間的實時結(jié)合作用。該系統(tǒng)利用SI^R的光學(xué)特性檢測葡聚糖生物傳感器基體中 蛋白濃度變化。蛋白質(zhì)與已知濃度的葡聚糖基體共價結(jié)合。通過葡聚糖基體注射抗體，注 射抗體和固定配體之間的特異性結(jié)合使基體蛋白濃度增加，結(jié)果是sra信號改變。sra信號 變化記錄為共振單位(RU)，而且沿傳感圖的y軸隨著時間而顯示。為了測定解離速率(off rate, koff)、結(jié)合速率(on rate, kon)、結(jié)合速率常數(shù)(Ka) (association rate constant)禾口 解離速率常數(shù)(Kd) (dissociation rate contstant)，應(yīng)用BIAcore動力學(xué)評價軟件(2. 1 版本)。以中和測定分析證實k。ff速率改善的克隆，中和測定包括抗體對IL-12結(jié)合其受體 的抑制作用(RBA測定)、對IL-12誘導(dǎo)的PHA刺激的人母細胞增殖的抑制作用(PHA測定) 和對IL-12誘導(dǎo)的人母細胞產(chǎn)生γ干擾素的抑制作用(IFNy測定)。關(guān)于重鏈⑶R3摻入 克隆70-1至70-13的中和測定的解離速率和/或IC5tl值的總結(jié)見表2 (參見附件A)?？?隆70-1的k。ff速率比親代Joe 9克隆更佳，而且具有2.0X 10_7M的最低IC5tl值。因此，選 擇克隆70-1轉(zhuǎn)化為完整IgGl。應(yīng)用InM生物素IL-12選擇輕鏈CDR3突變體，用含7nM濃度的游離ρ40的PBS洗 滌。利用噬菌體ELISA分析克隆，并應(yīng)用低密度IL-12芯片以BIAcore結(jié)合分析測試結(jié)合 IL-12的克隆.以中和測定測試解離速率優(yōu)于親代Joe 9克隆的克隆，所述中和測定測定 對IL-12受體結(jié)合的抑制作用或?qū)HA母細胞增殖的抑制作用。關(guān)于輕鏈CDR3突變克隆 78-34至79-1中和測定的解離速率和/或IC5tl值的總結(jié)見表2 (參見附件Α)。根據(jù)k。ff速率，與親代Joe 9相比，克隆78_34和78_35的k。ff速率提高。選擇其 中2個克隆對重鏈突變體進行組合分析。C.組合克隆具有最佳結(jié)合特性的突變輕鏈和重鏈克隆用于組裝scFv。通過PCR重疊延伸并連 接(pull-throug)如上所述的突變VH和VL區(qū)段而組合效價特性改善的突變克隆組合。組 合重鏈突變體(70-2、70-13和70-1)和輕鏈突變體(78_34、78_35和79_1)產(chǎn)生克隆101-14 至26-1，如表2所示(參見附件A)。這些克隆中和測定的k。ff速率和/或IC5tl值見表2。BIAcore結(jié)合分析鑒定了克隆101_11，它由重鏈CDR3突變克隆70_1和輕鏈CDR3 突變克隆78-34組合產(chǎn)生，其解離速率為0. 0045^。此k。ff速率分別與重鏈⑶R3突變體 克隆70-1 (0.0134s—1)或輕鏈CDR3突變克隆78-34 (0.0164s—1)相比顯著改善。此外，克隆 101-11的中和測定顯示顯著改善。因此，選擇克隆101-11進行如下所述的親和力成熟。P.克隆101-11的親和力成熟克隆101-11的進一步親和力成熟包括應(yīng)用摻入寡核苷酸引物對101-11的重鏈和 輕鏈⑶R3 二者進行重復(fù)循環(huán)的PCR誘變。以降低濃度的生物素化IL-12(bio-IL-12)選擇 克隆。應(yīng)用BIAcore結(jié)合分析和RBA、PHA中和測定評價所述突變克隆的結(jié)合特性。克隆 136-9至170-25的k。ff速率和/或IC5tl值見表2 (參見附件A)。克隆103-14證實受體結(jié) 合測定和PHA母細胞測定二者的IC5tl值均提高?？寺?03-14還證實k。ff速率低，因此選擇 它進行進一步的親和力成熟。E.制備和選擇克隆103-14輕鏈⑶R3的隨機文庫應(yīng)用如下概述的3個不同文庫于3個節(jié)段系統(tǒng)性隨機化克隆103-14的輕鏈CDR3(QSYDRGFTGSMV(SEQ ID NO :590))，其中X由序列NNS的隨機密碼子編碼，N為任何核 苷酸，而S為脫氧胞嘧啶或脫氧胍。L3. 1 = XXXXXXFTGSMV(SEQ ID NO 591)L3.2 = QSYXXXXXXSMV(SEQ ID NO 592)L3. 3 = QSYDRGXXXXXX(SEQ ID NO 593)對克隆103-14的全部3個輕鏈CDR(稱為L3. 1、L3. 2和L3. 3)進行隨機誘變。不 突變克隆103-14的重鏈⑶R3(稱為H3)。構(gòu)建基于克隆103-14的4個隨機文庫(H3和 L3. 1、L3. 2 & L3. 3)，使其接受各種各樣的選擇條件，包括應(yīng)用有限的抗原濃度和存在或缺 乏過量游離抗原(P40和p70)。主要用BIAcore從選擇物(克隆73-B1至99-G11)篩選產(chǎn) 品，間或應(yīng)用RBA進行篩選，結(jié)果示于表2 (參見附件A)。對克隆103-14的輕鏈⑶R進行隨機誘變獲得克隆Y61，與親代克隆103-14相比， 其IC5tl值明顯改善。選擇Y61轉(zhuǎn)化為完整IgGl。按照PHA測定，完整Yei-IgGl的IC5tl值 約130pM。IC50值不受游離p40過量50倍摩爾的影響，證實游離p40不與Y61抗IL-12抗 體交叉反應(yīng)，因而未減少抗體結(jié)合異源二聚體。Y61重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的全長序列如 下所示。Y61重鏈可變區(qū)肽序列CDRHlQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEffVACDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 23)Y61輕鏈可變區(qū)肽序列CDRLlQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGGRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2GNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCCDR L3QSYDRGTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO 24)按照Kabat定義指示CDR殘基。實施例2 :Y61超突變位點和接觸位點的突變通常采用噬菌體展示方法對親和力改善的重組抗體進行選擇。可如下達到此目 的通過隨機突變組合的CDR殘基，獲得包含不同序列的單鏈抗體的大文庫。一般根據(jù)其抗 體抗原反應(yīng)達到平衡的能力選擇親和力改善的抗體。但是，當(dāng)Υ61 scFV在噬菌體表面表達 并與IL-12溫育時，未能找到允許系統(tǒng)達到正常抗體抗原平衡的選擇條件。scFV-噬菌體保 持與IL-12結(jié)合，推測是由于非特異性作用所致，因為純化Y61 scFv顯示正常解離動力學(xué)。 因為Y61不能應(yīng)用噬菌體展示親和力成熟的常規(guī)方法(即制備文庫以及通過誘變多⑶R殘 基進行選擇)，所以開發(fā)了新的策略，其中使各個CDR位點突變。該策略涉及選擇用于突變的合適CDR位點，而且基于鑒定和選擇為優(yōu)選選擇性誘變位點、接觸位點和/或超突變位點的氨基酸。接觸位點定義為當(dāng)抗原與抗體反應(yīng)時與抗 原接觸的概率高的殘基，而超突變位點定義為認為在抗體體內(nèi)親和力成熟過程中發(fā)生體細 胞超突變的概率高的殘基。優(yōu)選選擇性誘變位點為既是接觸位點又是超突變位點的CDR位 點。應(yīng)用實施例1所述的方法已經(jīng)優(yōu)化Y61抗體的CDR3區(qū)，因此，難以應(yīng)用噬菌體展示選 擇方法進一步改進位于抗體結(jié)合位點中心的區(qū)城。通過去除不利的抗原抗體接觸或工程構(gòu) 建新的接觸使CDR3區(qū)外面的潛在接觸位點突變，可進一步改善活性。認為是抗原接觸點的Y61的氨基酸殘基和體內(nèi)親和力成熟過程中的體細胞超突 變部位的CDR位點示于表3 (參見附件A)。對于Y61的親和力成熟，選擇CDR3外面的15個 殘基、L3環(huán)中的3個殘基和H3環(huán)中的5個殘基進行PCR誘變。使Y61 scFv基因克隆入pUC119 (Sfi)質(zhì)粒載體中，以用于誘變。以隨機密碼子設(shè) 計合成寡核苷酸，以使各個選定位點突變。經(jīng)PCR誘變后，對少數(shù)克隆(約24個)測序，并 用宿主細胞例如細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞表達。純化表達抗體，用BIAcore系統(tǒng)測定 k。ff。然后用中和測定測試解離速率改善的克隆(與Y61相比)。對其他CDR位點重復(fù)該過 程。將證實中和活性改善的各個突變組合，以獲得中和效價更高的抗體。為了提高中和效價突變的Y61 CDR位點和各位點的相應(yīng)氨基酸取代示于圖 2A-2H。給出了 BIAcore分析測得的解離速率。這些解離速率示于每個表右側(cè)的直方圖中。位點H30、H32、H33、H50、H53、H54、H58、H95、H97、H101、L50、L92、L93 的取代結(jié)果 證實，所檢測的所有氨基酸取代均產(chǎn)生解離速率比Y61低的抗體。發(fā)現(xiàn)位點H52、L32和L50 中只有一個氨基酸取代改善了 Y61的解離速率，所有其他改變均對活性產(chǎn)生不利影響。對 于L50，Gly —Tyr這個單一的改變明顯提高(5_10倍)Y61的中和效價。結(jié)果證實，這些位 點對Y61的活性是重要的，說明大多數(shù)情況下噬菌體展示能夠選擇最佳殘基。但是，在位點 H31、H56、L30和L94發(fā)現(xiàn)數(shù)個取代改善Y61的解離速率，說明這些位點對抗原結(jié)合也是重 要的，盡管噬菌體展示方法不能選擇這幾個最佳殘基。對Y61的接觸位點和超突變位點進行選擇性突變鑒定了輕鏈CDR2中的氨基酸殘 基L50和輕鏈⑶R3中的殘基L94，它們均提高Y61的中和能力。這些突變的組合產(chǎn)生累加 效應(yīng)，獲得抗體J695，其中和能力明顯增強。J695重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列的全 長序列如下所示。J695重鏈可變區(qū)肽序列CDRHlQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEffVACDR H2FIRYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCKTCDR H3HGSHDN WGQGTMVTVSS(SEQ ID NO 31)J695輕鏈可變區(qū)肽序列CDRLlQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIYCDR L2YNDQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC
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CDR L3QSYDRYTHPALL FGTGTKVTVLG(SEQ ID NO 32)按照Kabat定義指示CDR殘基。關(guān)于重鏈和輕鏈可變區(qū)序列對比的總體情況示于圖1A-1D，說明從Joe9至J695的 克隆的譜系發(fā)展。CDR和殘基按照Kabat編號。實施例3 抗hIL-12抗體的功能活性為了檢測本發(fā)明的人抗人IL-12抗體的功能活性，所述抗體用于數(shù)個檢測抗體抑 制IL-12活性的能力的檢測法中。A.制備PHA活化的人淋巴母細胞按照 Current Protocols in Immunology,Unit 7. 1 所述，通過 Ficoll- Hypaque 梯度離心(1500rpm，45分鐘)從健康供者收集白細胞(leukopac)，從白細胞再分離人外周 血單核細胞(PBMC)。收集位于血液水溶液和淋巴細胞分離液交界面的PBMC，用磷酸緩沖鹽 水(PBS)以1500rpm離心15分鐘洗滌3次，以去除Ficoll-Paque顆粒。然后按照 Current Protocols in Immunology, Unit 6. 16 所述， 舌化 PBMC 形 成淋巴母細胞。將洗滌后的PBMC以0.5-1Χ IO6細胞/ml重懸浮于添加0.2% (ν/ν) PHA-P (Difco, Detroit, MI)的 RPMI 完全培養(yǎng)基(RMPI 1640 培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FBS)、 100U/ml青霉素、lOOyg/ml鏈霉素)中，在5%二氧化碳大氣中于37°C培養(yǎng)4天。4天后， 用加有0. 2% (v/v)PHA-P和50U/ml重組人IL-12的RPMI完全培養(yǎng)基以1 1體積將細胞 培養(yǎng)物一分為二。通過使攜帶人IL-12 cDNA的表達載體轉(zhuǎn)染入COS細胞(參見Kaufman 等，(1991) Nucleic Acids Res. 19,4484-4490)產(chǎn)生重組人 IL-12，按照 PCT/US96/01382 所 述純化重組人IL-12。然后使細胞培養(yǎng)物再培養(yǎng)1-3天。收獲PHA母細胞，用RPMI完全培 養(yǎng)基洗滌2次，用95% FBS,5% DMSO以10X IO6細胞/ml凍存細胞。在存在IL-2下培養(yǎng)1天后收集用于IL-12受體結(jié)合測定(參見B部分)的PHA母 細胞，而在存在IL-2下培養(yǎng)3天后收集用于PHA母細胞增殖測定(參見C部分)和γ干 擾素誘導(dǎo)測定(參見D部分)的PHA母細胞。B. IL-12受體結(jié)合測定如下分析抗IL-12抗體抑制放射性標(biāo)記的IL-12結(jié)合PHA母細胞上的IL-12受體 的能力。使各種濃度的抗IL-12抗體與50-100pM125I-hIL-12 (應(yīng)用Bolton-Hunter標(biāo)記方 法制備碘化 hIL-12，比活 20-40mCi/mg，ΝΕΝ-Dupont)在結(jié)合緩沖液(RPMI 1640,5% FBS, 25mMHepes pH 7.4)中于37°C預(yù)溫育1小時。如上所述分離PHA母細胞，洗滌一次，再用結(jié) 合緩沖液重懸浮為2 X IO7細胞/ml細胞密度。在抗體125I-hIL-12混合物中加入PHA母細 胞(IX IO6細胞)，室溫下溫育2小時。如下分離細胞結(jié)合放射性與游離125I-hIL-12 室溫 下離心檢測混合物30秒，吸出液體，用0. Iml結(jié)合緩沖液洗滌，然后于4°C以10，OOOXg離 心4分鐘。利用γ計數(shù)器檢測細胞沉淀物的細胞結(jié)合放射性。在缺乏抗體的情況下測定 總結(jié)合，而通過在所述測定中含有25nM非標(biāo)記IL-12測定非特異性結(jié)合。一式二份進行溫 育。在采用Y61和J695人抗IL-12抗體的IL-12受體結(jié)合測定中，兩種抗體對IL-12 受體結(jié)合具有相似的抑制作用。Y61抑制IL-12受體結(jié)合的IC5tl值約1. 6X 10_"M，而J695 的 IC50 值約 1. 1 ΧΙΟ、。
C.人PHA母細胞增殖測定評價抗IL-12抗體抑制PHA母細胞增殖的能力(IL-12刺激PHA母細胞增殖)。在 微量滴定板(U形底，96孔，Costar, Cambridge, ΜΑ)的IOOml RPMI完全培養(yǎng)基中使連續(xù)稀 釋的抗IL-12抗體與230pg/ml hIL-12于37°C、5%二氧化碳預(yù)溫育1小時。洗滌如上所述 分離的PHA母細胞一次，將其用RPMI完全培養(yǎng)基重懸浮為3 X IO5細胞/ml細胞密度。在 抗體/hIL-12混合物中加入PHA母細胞(100ml，3X IO4細胞)，于37°C、5%二氧化碳溫育3 天，用 0. 5mCi/ 孔(3H)-胸苷(Amersham，Arlington Heights, IL)標(biāo)記 4-6 小時。將培養(yǎng) 內(nèi)容物通過細胞收集器(Tomtec，Orange, CT)收獲在玻璃纖維濾膜上，利用液閃計數(shù)檢測 摻入細胞DNA中的(3H)-胸苷。一式二份檢測所有試樣。存在各種濃度p70 p40(即IL-12異源二聚體與游離p40亞單位的比率)的中 和結(jié)果示于表4 (參見附件A)。分析在PHA母細胞增殖測定中的Y61人抗IL-12抗體證實，在只有IL_12 p70而 沒有任何過量的p40(p70 p40比率為1 0)的情況下，所述抗體抑制PHA母細胞增殖的 IC5tl值約1.8X10-1QM。在存在50倍過量游離p40(p70 p40比率為1 50)的情況下，Y61 抗體抑制PHA母細胞增殖的IC5tl值約1.8 X ΙΟ,Μ。該結(jié)果證實，Υ61抑制母細胞增殖的能 力不受存在的過量Ρ40的影響。在ρ70 ρ40比率1 0的情況下，人抗IL-12抗體J695抑制PHA母細胞增殖的 IC5tl值約LOXlO-11Mt5在ρ70 ρ40比率1 50的情況下，該抗體抑制PHA母細胞增殖的 IC5。值約5. 8士2. 8 X ICT12M(η = 2)，說明過量ρ40對J695抗體只有輕微的抑制作用?？傮w 結(jié)果證實，因為在L50和94的突變，J695比Υ61的中和活性有改善。P. γ干擾素誘導(dǎo)測定如下分析抗IL-12抗體抑制PHA母細胞產(chǎn)生IFN y (IL-12刺激產(chǎn)生IFN γ )的能 力。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的100ml RPMI完全培養(yǎng)基中使各種濃度的抗 IL-12抗體與200-400pg/ml hIL-12于37°C、5%二氧化碳預(yù)溫育1小時。洗滌如上所述分 離的PHA母細胞一次，將其用RPMI完全培養(yǎng)基重懸浮為1 X IO7細胞/ml細胞密度。在抗體 /hIL-12混合物中加入PHA母細胞(100μ 1，1X106細胞)，于37°C和5%二氧化碳溫育18 小時。溫育后從各孔取出150 μ 1無細胞上清液，應(yīng)用ELISA(Endogen Interferon gamma ELISA, Endogen, Cambridge, ΜΑ)檢測所產(chǎn)生的人IFNy水平。一式二份檢測各上清液。人抗IL-12抗體Υ61在該測定中的分析證實，Υ61抑制人IFNy產(chǎn)生的IC5tl值約 1.6父10,] ，而人抗1卜12抗體邛95抑制人IFNy產(chǎn)生的IC5。值約5. 0士2. 3 X ICT12M(η = 3)。結(jié)果證實，因為L50和L94的修飾而顯著改善J695的親和力。Ε.用分離的PBMC誘導(dǎo)產(chǎn)生非人IL-12為了檢測人抗hIL-12抗體與其他物種IL-12的交叉反應(yīng)性，如下制備非人 IL-12。對彌猴、狒狒和犬 PBMC 使用 Iymphopr印(Nycomed，Oslo, Norway)，對犬 PBMC 使 M Accu-paque (Accurate Chemical & Sci. Corp. ， Westbury， NY)，寸力鼠 PBMC Lympholyte-rat (AccurateChemical & Sci. Corp. , Westbury, NY),如上所述通過密度梯度 離心從新鮮的肝素化血液分離PBMC。然后按照文獻所述(D，Andrea等，(1992) J. Exp. Med. 176,1387-1398, Villinger 等，(1995) J. Immunol. 155,3946-3954，Buettner 等，(1998) Cytokine 10，241-248)，誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-12.洗滌后的PBMC以IXlO6細胞/ml重懸浮于加有0.0075% (重 量 / 體 禾只)SAC (Pansorbin ；Calbiochem-Behring Co. , La Jolla, CA)或 l_5mg/ml ConA(SigmaChemical Co.，St. Louis,MO)和 0. 0075% SAC 的 RPMI 完全培養(yǎng)基中，在 5%二 氧化碳大氣下于37°C培養(yǎng)18小時。離心收集無細胞和無SAC培養(yǎng)基并通過0. 2mm濾膜過
濾ο從Emory University School of Medicine，Atlanta，GA 獲得的恒河猴 IL-12 為 重組恒河猴IL-12。F.小鼠2D6細胞增殖測定小鼠T細胞克隆2D6在小鼠IL-2、IL-4、IL-7和IL-12作用下增殖(Maruo等， (1997) J. Leukocyte Biol. 61，346-352)。還檢測到其在含有大鼠IL-12的大鼠PBMC上清液 作用下的明顯增殖。犬、彌猴、狒狒或人IL-12對2D6細胞沒有作用。以加有50mM β-巰基 乙醇(β ME)和30ng/ml小鼠IL-12的RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠2D6細胞。檢測前1天， 洗除小鼠IL-12，用加有β ME的RPMI完全培養(yǎng)基溫育所述細胞過夜。在微量滴定板(U形底，96孔，Costar)的IOOml RPMI完全培養(yǎng)基中使連續(xù)稀釋的 抗IL-12抗體與40pg/ml小鼠IL-12于37°C、5%二氧化碳下預(yù)溫育1小時。洗滌2D6細 胞一次，將其用含β ME的RPMI完全培養(yǎng)基重懸浮為IX IO5細胞/ml細胞密度。在抗體/ hIL-12混合物中加入2D6細胞(100 μ 1，1 X IO4細胞)，于37°C、5%二氧化碳溫育3天，以 0. 5mCi/孔(3H)-胸苷標(biāo)記4-6小時。收獲培養(yǎng)內(nèi)容物，利用液閃計數(shù)進行計數(shù)。一式二份 檢測所有樣品。G. .1695與非人IL-12的種間交叉反應(yīng)性應(yīng)用從數(shù)個非人類物種分離的PBMC分析J695與非人IL-12的種間交叉反應(yīng)性。 應(yīng)用如上所述的幾個生物測定證實大鼠、犬、彌猴和狒狒PBMC上清液中存在非人IL-12活 性，所述測定例如小鼠2D6細胞增殖測定、人PHA母細胞增殖測定和通過用針對小鼠IL-12 和/或人IL-12的兔和/或羊多克隆抗體阻斷非人PBMC誘導(dǎo)的反應(yīng)的、干擾素誘導(dǎo)測定。 然后通過測定觀測到50%抑制反應(yīng)的J695抗體濃度，以相同生物測定評價人抗hIL-12抗 體Y61和J695與PBMC上清液中的非人IL-12或純化的小鼠IL-12和恒河猴IL-12的交叉 反應(yīng)性。種間交叉反應(yīng)性結(jié)果總結(jié)于表5。結(jié)果證實，Y61和J695分別能夠識別各種猴的 IL-12(例如Y61能夠識別彌猴IL-12和恒河猴IL-12，J695能夠識別彌猴IL-12、恒河猴 IL-12和狒狒IL-12)，而且J695對犬IL-12的活性約低35倍；Y61和J695均與小鼠或大 鼠IL-12沒有交叉反應(yīng)性。H. .1695的人細胞因子特異性以競爭性ELISA測試J695的特異性，其中測試一組人細胞因子干擾可溶性J695 結(jié)合固定的人IL-12的能力。該組人細胞因子包括IL-Ia和IL-1 β (Genzyme, Boston, MA)、IL-2 (Endogen)、IL-4, IL-10、IL-17、IFNy 和 TGF-β 1 (R & D，Minneapolis, MN)、 IL-8 (Calbiochem)、PDGF> IGF-I 禾口 IGF-II(Boehringer Mannheim Corp. , Indianapolis, IN) ,TNFa 和淋巴毒素、IL-6、可溶性 IL-6 受體、IL-ll、IL-12p70、IL-12p40、M_CSF 禾口 LIF。 EBI-3為非洲淋巴瘤病毒感染B淋巴細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-12p40相關(guān)蛋白(Devergne等， (1996) J.Virol. 70 1143-1153)，它表達為人 IgG-Fc 嵌合體(EBI-3/Fc)。還測試了 單鏈鮭 精 DNA(Sigma)。
表5種間交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù) 用0. Iml人IL-12 (2 μ g/ml的0. IM碳酸鹽包被緩沖液(4體積0. IM碳酸氫鈉和 8.5體積0. IM碳酸氫鈉))于4°C包被平底ELISA免疫測定微量滴定板(96孔，高度結(jié)合， Costar)過夜。用含0. 05%吐溫20的PBS (PBS-T)洗滌板2次，用200 μ 1的lmg/ml牛血清白 蛋白(BSA, Sigma)的PBS-T于室溫下封閉1小時，再用PBS-T洗滌2次。加入含IL-12抗體 J695(100ng/ml)的樣品(100 μ 1)和各細胞因子(2ηΜ)的含 50 μ g/mlBSA 的 PBS-T (PBS-T/ BSA)并于室溫下溫育2小時。洗滌板4次，然后與100μ 1小鼠抗人λ-HRP(1 500的 PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc.，Birmingham, AL)于室溫下溫育 1 小時。洗滌板 4 次，然后用 ABTS (Kirkegaard & Perry Lab.，Gaithersburg, MD)在黑暗中顯色 20-30 分 鐘。用微量板讀數(shù)器(Molecular Devices, Menlo Park, CA)讀取0D45(1nm。確定相對于缺 乏任何可溶性細胞因子時J695結(jié)合IL-12包被板的百分結(jié)合率。結(jié)果證實，J695結(jié)合固定的人IL-12只被人IL_12 p70阻斷，在較低程度上被人 IL-12 p40阻斷，不被所測試的任何其他細胞因子阻斷。I.對新型IL-12分子的結(jié)合已經(jīng)介紹了一種替代IL-12異源二聚體，其中p35亞單位被新型pl9分子代替。應(yīng) 用3D同源性檢索IL-6/IL-12家族成員鑒定了 pl9，而且以活化樹突細胞合成pl9。pl9結(jié) 合p40形成pl9/p40 二聚體，它具有IL-12樣活性，但是其IFN γ誘導(dǎo)作用不如ρ35/ρ40異 源二聚體有效。預(yù)測識別單獨的Ρ40、但是優(yōu)選識別ρ70分子中的ρ40(例如J695和Υ61， 參見實施例3Η)的抗體也會既中和ρ35/ρ40分子又中和ρ19/ρ40分子。實施例4 抗hIL-12抗體的體內(nèi)活性用改進的Bree等使用的模型檢測IL-12抗體對IL-12誘導(dǎo)反應(yīng)的體內(nèi)作用，以研 究人 IL-12 對彌猴外周血液學(xué)的影響(Bree 等，(1994)Biochem Biophys Res. Comm. 204 1150-1157)。在以前的研究中，以1 μ g/kg/天連續(xù)5天給予人IL-12，在24小時后使白細 胞(WBC)數(shù)降低、尤其是淋巴細胞和單核細胞亞組降低。在72小時時觀察到血小板數(shù)降低。 在IFN- γ作用下單核細胞活化標(biāo)志血漿新蝶呤水平在24小時時開始升高，在72小時時達到最高。在人抗hIL-12抗體的第一個研究中，使平均體重5kg的15只健康彌猴鎮(zhèn)靜，并分 為5組(η = 3)。第1組接受靜脈內(nèi)(IV)給予10mg/kg人靜脈免疫球蛋白(IVIG，Miles, Eckhart，IN，用A蛋白瓊脂糖凝膠純化)。第2組接受靜脈內(nèi)給予lmg/kg C8.6.2(中和小 鼠抗人IL-12單克隆抗體)。第3組接受靜脈內(nèi)給予10mg/kg C8. 6. 2。第4組接受靜脈內(nèi) 給予lmg/kg Y61 (人抗人IL-12抗體，從CHO細胞條件培養(yǎng)基純化)。第5組接受靜脈內(nèi)給 予 10mg/kg Y61。給予所述抗體后1小時，所有彌猴接受單次皮下(SC)注射人IL-12(lyg/kg)。在 以下時間點取血試樣基線、8、24、48、96和216小時，分析全血細胞分類計數(shù)和血清化學(xué)。 還檢測血清人IL-12、C8. 6. 2抗體、Y61抗體、猴IFN- γ、猴IL-10、猴IL-6和血漿新蝶呤水平。用IL-12和IVIG對照抗體(第1組)處理的彌猴呈現(xiàn)大多數(shù)預(yù)期的血液學(xué)變 化，包括WBC、血小板、淋巴細胞計數(shù)和單核細胞計數(shù)降低。這樣的降低在用1或10mg/kg C8. 6. 2或Y61抗體處理的彌猴(第2-5組)沒有觀測到或不明顯。通過猴IFN-Y 禾Π 猴 IL-IO (Biosource International, Camarillo, CA)、猴 IL-6 (Endogen)和血漿新蝶呤(ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, NY)特異性的 ELISA 分 析血清或血漿樣品。在任何IL-12治療的動物，包括用IL-12和IVIG治療的對照動物，均 沒有檢測到IFN- y、IL-IO或IL-6。這可能是因為IL-12劑量低(僅1劑的1 μ g/kg)。盡 管如此，IL-12和IVIG處理動物的血漿新蝶呤水平增加約3倍，但是所有C8. 6. 2或Y61處 理動物均沒有變化，包括較低劑量(lmg/kg) Y61處理的動物，說明Y61在體內(nèi)有效阻斷這種 對IL-12的敏感反應(yīng)。 在第二個研究中，通過給予外源性rhIL-12和檢測J695是否能夠阻斷或降低通常 與給予rhIL-12有關(guān)的反應(yīng)，從而研究J695在彌猴體內(nèi)的活性和藥效學(xué)(PD)。對雄性彌猴 (每組η = 3)如下給藥經(jīng)隱靜脈以單劑快速靜脈濃注(IV)注射或背部皮膚皮下(SC)注 射0. 05,0. 2或1. Omg/kg J695或lmg/kg靜脈免疫球蛋白(IVIG)。給予J695或IVIG后1 小時，所有動物接受單劑背側(cè)皮膚皮下注射1 μ g/kg rhIL-12。給予J695后直到28天通 過股靜脈收集血樣。從每個血樣獲得血清，并用ELISA檢測IL-12、J695、IFN- γ和抗J695 抗體。應(yīng)用反相高效液相層析檢測新蝶呤。相對于給予J695或rhIL-12之前檢測的新蝶呤水平歸一化的新蝶呤水平示于圖 3。為了比較各組間的新蝶呤抑制作用，計算各動物新蝶呤水平歸一化的曲線下面積(AUC) (表6)。新蝶呤暴露(AUC)受到劑量依賴性的抑制，相對于IVIG對照組各IV組抑制約 71-93%, SC組抑制約71-100%。這些結(jié)果說明，當(dāng)通過IV或SC途徑給藥時，抑制新蝶呤 作用50%需要的J695劑量(ED50)低于0. 05mg/kg。表6 J695在彌猴體內(nèi)對IL-12誘導(dǎo)的新蝶呤的劑量依賴性抑制 用J695處理還防止或減少通常與給予rhIL-12有關(guān)的血液學(xué)變化(白細胞減少 和血小板減少)。給予rhIL-12后24小時，淋巴細胞計數(shù)相對于對照IV和SC IVIG處理組 的基線值下降約50%。所有3個劑量水平的SC或IV給予J695均防止這種降低，使得24 小時時的淋巴細胞計數(shù)與基線值大致相同。給予IL-12后48小時，用IV和SC IVIG處理 組的血小板計數(shù)相對于基線值下降約25%。目標(biāo)為維持高于90%效應(yīng)水平的血清水平的典型劑量方案為大致每隔一周IV和 SC給予lmg/kg或大致每周給予0. 3mg/kg,假設(shè)重復(fù)給藥有輕微累積作用。該研究證實，能 夠?qū)Ω鞣N猴安全給予這樣劑量的抗體。在獨立的毒性研究中，還發(fā)現(xiàn)能夠安全給予各種猴 高至100mg/kg的所述抗體。J695還有效防止用嵌合IL-12處理的小鼠產(chǎn)生IFN- γ，所述嵌合IL-12是組合小 鼠Ρ35亞單位和人IL-12 ρ40亞單位的分子。與在小鼠無生物活性的人IL-12相反，這種 嵌合IL-12在小鼠保持生物功能，包括誘導(dǎo)IFN-γ。此外，人ρ40亞單位允許所述嵌合分 子被J695結(jié)合并中和。腹膜內(nèi)注射給予雌性C3H/HeJ小鼠(10只/實驗組)嵌合IL-12， 每次劑量為0. 05mg/kg，在第0、1、2、3和4天每天給藥5次。在注射IL-12之前30秒，在 第 0、2 和 4 天腹膜內(nèi)注射給予劑量為 0. 05,0. 01,0. 002,0. 0004,0. 00008 和 0. 000016mg/kg 的J695。在第0、2和4天腹膜內(nèi)注射給予劑量為0. 05mg/kg的對照hulgGl γ。在第5天 從小鼠取血，并用ELISA測定血清IFN- γ水平。結(jié)果證實，J695對IFN- γ產(chǎn)生量產(chǎn)生劑 量依賴性抑制，ED5tl約0. 001mg/kg。總而言之，這些結(jié)果證實，J695是體內(nèi)IL-12活性的有 效抑制劑。實施例5 人抗體與重組人IL-12 (rhIL-12)結(jié)合的動力學(xué)分析應(yīng)用BIAcore 系統(tǒng)(Biacore AB, Uppsala, Sweden)通過表面胞質(zhì)團共振(SPR)檢 測捕獲配體(人抗rhIL-12抗體J695，捕獲在生物傳感器基體上)和分析物(rhIL-12溶 液)之間的實時結(jié)合作用。所述系統(tǒng)利用SH 的光學(xué)特性檢測葡聚糖生物傳感器基體中的 蛋白濃度變化。蛋白質(zhì)共價結(jié)合到已知濃度的葡聚糖基體上.通過葡聚糖基體注射抗體， 注射抗體和固定配體之間的特異性結(jié)合使基體蛋白濃度增加，結(jié)果SH 信號發(fā)生改變。SPR 信號變化記錄為共振單位(RU)，而且隨時間沿傳感器圖的y軸顯示。為了有助于山羊抗人 IgG(Southern Biotechnology Associates, Cat.
88No. 2040-01 ,Birmingham，AL)固定在生物傳感器基體上，首先用IOOmM N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)和400mM鹽酸N-乙基-N，_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)活化基體上的羧 基，使山羊抗人IgG通過游離胺基共價連接到葡聚糖基體上。接著，經(jīng)活化的基體注射山羊 抗人IgG通過活化的生物傳感器注射用醋酸鈉，pH 4.5稀釋的35μl山羊抗人IgG(25μg/ ml)，蛋白上的游離胺直接結(jié)合到活化的羧基上。注射IM乙醇胺失活未反應(yīng)的基體EDC-酯。 標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)試劑盒可市售獲得(Biacore AB, Cat. No. BR-1000-50, Uppsala, Sweden)。用 HBS、流動緩沖液(running buffer) (Biacore AB, Cat. No. BR-1001-88,Uppsala, Sweden)稀釋J695，以便J695通過山羊抗人IgG捕獲在基體上。為了測定rhIL_12特異性 抗體結(jié)合固定的山羊抗人IgG的能力，如下進行生物測定。以流速5μ1/π η通過山羊抗 人IgG多克隆抗體偶聯(lián)的葡聚糖基體注射等份J695 (25 μ g/ml ；25 μ 1等份)。在注射所述 蛋白之前和在注射后立即使HBS緩沖液單獨流經(jīng)各流動池(flowcell)。基線和相當(dāng)于J695 注射結(jié)束后約30秒時間點之間的信號凈差用來代表IgGl J695結(jié)合量(約1200RU)。檢 測直接結(jié)合可溶性rhIL-12的rhIL-12特異性抗體。用HBS流動緩沖液稀釋細胞因子，以 5 μ Ι/min流速通過固定蛋白基體注射50 μ 1等份。所用rhIL_12的濃度為10、20、25、40、 50、80、100、150和200nM。注射rhIL_12之前和注射后立即使單獨的HBS緩沖液流經(jīng)各流 動池?；€信號和細胞因子注射結(jié)束后的信號的凈差用來表示具體樣品的結(jié)合值。在注射 下一個樣品之前用IOOmM鹽酸再生生物傳感器基體。為了測定解離常數(shù)(off-rate)、結(jié)合 常數(shù)(on-rate)，應(yīng)用BIAcore動力學(xué)評價軟件(2. 1版)。與COS產(chǎn)生的J695相比，CHO產(chǎn)生的J695結(jié)合rhIL_12的典型結(jié)果示于表7。表7 =CHO或COS產(chǎn)生的J695與rhIL-12的結(jié)合 應(yīng)用BIAcore技術(shù)定量分析捕獲J695和可溶性rhIL_12之間的分子動力學(xué)作用。進行數(shù)個獨立的實驗，并用商業(yè)性BIAcore數(shù)學(xué)分析軟件分析結(jié)果，獲得動力學(xué)速率常數(shù)， 如表8所示。表8 J695對rhIL_12的表觀動力學(xué)速率常數(shù)和親和力常數(shù) CHO產(chǎn)生的 J695(Kd= 1. 34X IOD 抗體和 COS產(chǎn)生的 J695 (Kd = 9. 74X IOD 抗體作用的計算表觀常數(shù)(Kd)存在微小不同。用以下公式由觀測到的速率常數(shù)計算J695 和rhIL-12之間的表觀解離常數(shù)(Kd) Kd =解離速率/結(jié)合速率。為了測定J695和rhIL-12作用的表現(xiàn)解離速率常數(shù)和表觀結(jié)合速率常數(shù)，應(yīng)用 固定量J695(2yg/ml)和不同濃度的rhIL-12進行數(shù)個結(jié)合反應(yīng)。捕獲J695和可溶性 rhIL-12之間的實時結(jié)合作用傳感器圖表明，兩種形式的抗體的結(jié)合相和解離相非常相似。為了進一步評價捕獲IgGl J695mAb結(jié)合可溶性重組細胞因子的能力，應(yīng)用直接 BIAcore方法。在該方法中，用IgGl J695 (2 μ g/ml)包被山羊抗人IgG(25 μ g/ml)偶聯(lián)的 羧甲基葡聚糖傳感器表面，然后加入重組細胞因子。當(dāng)可溶性rhIL-12注射通過捕獲CHO或 COS產(chǎn)生的IgGl J695的生物傳感器表面時，信號量隨細胞因子溶液濃度增加而增加。所測 試的任何濃度(高至 IOOOnM)的 rmIL-12(R & D Systems, Cat. No. 419-ML, Minneapolis, MN)或rhIL-12均沒有觀測到結(jié)合。這些結(jié)果支持以下結(jié)論IgGl J695抗體識別rhIL-12 上的不同決定簇。表9顯示了應(yīng)用BIAcore的實驗結(jié)果，證實人IgGl J695mAb只結(jié)合可溶性 rhIL-12，而不結(jié)合任何一種其他重組細胞因子。表9 利用BIAcore技術(shù)的J695表位作圖 實施例6 J695與IL-12的親和力的進一步研究利用BIAcore胞質(zhì)團共振技術(shù)定量分析J695抗體和人IL-12之間的分子動力學(xué) 作用，獲得表觀動力學(xué)速率常數(shù)。BIAcore技術(shù)用來檢測可溶性rhIL_12對固相捕獲J695的結(jié)合。使山羊抗人IgG 抗體固定在生物傳感器芯片上，然后注射固定量的J695并捕獲在所述表面上。加樣不同濃 度的rhIL-12，隨時間檢測不同濃度IL-12對J695的結(jié)合。假定為零級解離動力學(xué)和一級 結(jié)合動力學(xué)以及J695和IL-12為簡單的一對一分子作用，計算表觀解離速率常數(shù)和表觀結(jié) 合速率常數(shù)。進行了 3個獨立實驗，所示值為3個實驗的平均值。根據(jù)這些測量結(jié)果獲得表 觀解離速率常數(shù)(kd)和表觀結(jié)合速率常數(shù)GO，并用其計算所述作用的Kd值(見表10)。 結(jié)果表明J695對rhIL-12具有高度親和力。表10 J695和人IL-12作用的動力學(xué)參數(shù) 實施例7 大鼠抗小鼠白細胞介素-12的單克隆抗體C17. 15的特性和中和活性為了評價應(yīng)用小鼠IL-12特異性的單克隆抗體在炎癥和自身免疫小鼠模型的 IL-12治療研究與類似的人類疾病方法的相關(guān)性，研究了大鼠抗小鼠IL-12單克隆抗體 C17. 15與小鼠IL-12的作用。評價C17. 15中和PHA母細胞增殖測定中的小鼠IL-12活性 以及阻斷小鼠IL-12結(jié)合細胞表面受體的能力，也評價C17. 15-小鼠IL-12結(jié)合作用的動 力學(xué)。在人PHA母細胞增殖測定(參見實施例3)中，連續(xù)稀釋的C17. 15或大鼠 IgG2a (對照抗體)與230pg/mL小鼠IL-12于37°C預(yù)溫育1小時。使PHA刺激的母細胞加 入到所述抗體IL-12混合物中，于37°C溫育3天。然后用1 μ Ci/孔[3H]-胸苷標(biāo)記細胞6 小時。收獲培養(yǎng)物，檢測摻入的[3H]-胸苷。在沒有加入小鼠IL-12情況下檢測背景非特異 性增殖。一式二份檢測所有樣品。發(fā)現(xiàn)在該測定中C17. 15對重組小鼠IL-12的IC5tl(M)為 1. 4X 10-11，相比之下，觀測到在相同條件下J695對重組人IL-12的IC50值為5. 8 X 10_12 (見 表 11)。表11 比較抗人IL-12單克隆抗體J695和大鼠抗小鼠IL-12單克隆抗體C17. 15
的特性 還測定了 C17. 15抑制小鼠IL-12結(jié)合細胞受體的能力。連續(xù)稀釋的C17. 15與 100ρΜ[125Ι]_小鼠IL-12在結(jié)合緩沖液中于37°C預(yù)溫育1小時。2D6細胞(2X IO6)加入 到抗體/[125I]-小鼠IL-12混合物中，于室溫下溫育2小時。分離細胞結(jié)合放射性與游離 [125I]-IL-12，測定保留的細胞結(jié)合放射性。缺乏抗體時測定標(biāo)記小鼠IL-12與2D6細胞上 的受體的總結(jié)合，通過在測定中包含25nM未標(biāo)記的小鼠IL-12而測定非特異性結(jié)合?？偨Y(jié) 合減去非特異性結(jié)合計算得特異性結(jié)合。一式二份進行溫育。結(jié)果表明，C17. 15抑制小鼠 IL-12結(jié)合細胞受體的IC5tl(M)為1. 5X10,。通過生物分子作用分析評價C17. 15對重組小鼠IL-12的親和力.使山羊抗大鼠 IgG抗體固定在生物傳感器芯片上，然后注射固定量的C17. 15抗體，使C17. 15捕獲在芯片 表面上。將不同濃度的重組小鼠IL-12加樣在C17. 15表面上，隨時間檢測小鼠IL-12對 固定C17. 15的結(jié)合。假定為零級解離動力學(xué)和一級結(jié)合動力學(xué)以及固定C17. 15和小鼠 IL-12為簡單的一對一分子作用，計算表觀解離速率常數(shù)和表觀結(jié)合速率常數(shù)。根據(jù)這些測 量結(jié)果計算表觀解離速率常數(shù)(kd，解離速率常數(shù))和表觀結(jié)合速率常數(shù)(ka，結(jié)合速率常 數(shù))。這些結(jié)果用來計算所述作用的Kd值。觀測到重組小鼠IL-12-C17. 15作用的結(jié)合速
91率為3. 8Χ105Μ 解離速率為1.84 X 10 而Kd為4. 8X10·。在中和小鼠IL-12活性和結(jié)合細胞表面受體中觀測到的C17. 15活性以及C17. 15 結(jié)合小鼠IL-12的動力學(xué)與相似的J695-rhIL-12作用測量結(jié)果有關(guān)。說明根據(jù)結(jié)合速率、 解離速率、Kd、IC50和PHA母細胞測定，大鼠抗小鼠IL-12抗體C17. 15和抗人IL-12抗體 J695的作用模式幾乎相同。因此，C17. 15在炎癥和自身免疫疾病的小鼠模型中用作J695 的同源抗體，研究IL-12阻斷對這些模型動物疾病的發(fā)生或發(fā)展的影響(參見實施例8)。實施例8 給予α -小鼠IL_12抗體對小鼠自身免疫性疾病或基于炎癥的疾病的 治療Α. α-11-12^^017. 15對膠原$秀導(dǎo)型小鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用已經(jīng)證實了 IL-12水平和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)有關(guān)。例如，與健康對照相 比，在RA患者的滑液中檢測到IL-12 ρ70水平升高(Morita等(1998)Arthritis and Rheumatism. 41 =306-314)。因此，評價大鼠抗小鼠IL-12抗體C17. 15抑制膠原誘導(dǎo)型小鼠 關(guān)節(jié)炎的能力。第O天用II型膠原免疫雄性DAB/1小鼠(10/組)，從第_1天(膠原免疫前1天) 至第12天隔天用C17. 15或?qū)φ沾笫驣gG以10mg/kg腹膜內(nèi)注射處理所述小鼠。臨床監(jiān)測 所述小鼠足爪發(fā)生關(guān)節(jié)炎的情況直到第90天為止。關(guān)節(jié)炎分級為0_正常；1-炎癥局限 于一個關(guān)節(jié)；2-涉及一個以上的關(guān)節(jié)、但是不是整個足爪；3-涉及整個足爪；4-足爪變形； 5_所涉及關(guān)節(jié)僵硬.一個小鼠的關(guān)節(jié)炎評分為該小鼠各單獨足爪的關(guān)節(jié)炎級別的總和(最 大=20)。結(jié)果表示為每組的均數(shù)士SEM。如圖4所示，結(jié)果表明C17. 15處理小鼠僅在處理后第50天以后才有可檢測到的 關(guān)節(jié)炎評分，C17. 15處理小鼠獲得的最大關(guān)節(jié)炎平均評分低于IgG處理小鼠檢測到的最大 評分至少5倍。證實大鼠抗小鼠IL-12抗體C17. 15可防止小鼠發(fā)生膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎。B.大鼠α -小鼠IL_12抗體C17. 15對小鼠結(jié)腸炎的抑制作用還證實IL-12在結(jié)腸炎的發(fā)生/病理學(xué)中具有作用。例如已經(jīng)證實抗IL-12抗 體抑制小鼠結(jié)腸炎模型(例如TNBS誘導(dǎo)型結(jié)腸炎IL-12失效小鼠(Simpson等(1998) J. Exp. Med. 187(8) 1225-34)的疾病。同樣證實了抗IL-12抗體抑制IL-IO失效小鼠的結(jié) 腸炎發(fā)生。以2個研究評價了大鼠抗小鼠IL-12抗體C17. 15抑制小鼠TNBS結(jié)腸炎的能力 (Davidson 等(1998)J. Immunol. 161(6) :3143_9)。在第一個研究中，通過插入直腸的兒科臍動脈插管給予含2. OmgTNBS的150 μ L 50%乙醇溶液，在無病原體的SJL小鼠誘導(dǎo)結(jié)腸炎。對照小鼠只用150yL50%乙醇溶液處 理。在第11天通過尾靜脈靜脈內(nèi)給予單劑0. 75,0. 5,0. 25或0. Img C17. 15或0. 75mg對 照大鼠IgG2a，在第11和17天對小鼠稱重，并在第17天進行組織學(xué)評分，從而評價所述治 療的治療作用。用C17. 15治療小鼠的體重在抗體治療的48小時內(nèi)增加，而在治療后第6 天正常.組織學(xué)征實了 C17. 15的治療作用。進一步還評價了所述治療小鼠脾臟和結(jié)腸的 〔04+1~細胞的0^-^分泌以及所述治療小鼠脾臟或結(jié)腸來源的巨噬細胞的IL-12水平(見 表 12)。在第二個研究中，優(yōu)化給藥方案，在第12至14天分別用總劑量為0. Img或0. 5mg C17. 15或0. Img對照IgG2a的一半劑量治療小鼠。發(fā)現(xiàn)與未治療的對照相比，以0. Img/ 小鼠或0. 25mg/小鼠的劑量單劑給予C17. 15僅部分改善TNBS誘導(dǎo)型結(jié)腸炎，而且不會顯著降低CD4+T細胞體外產(chǎn)生IFN- γ，但是顯著降低IL-12分泌。在0. 5mg/小鼠或0. 5mg/ 小鼠以上的單劑給藥時觀測到反應(yīng)。采用所測試的最低抗體劑量并以2次分劑量注射給予 (第12和14天)改進給藥方案，表明多次低劑量比一次性大劑量更有效。所獲得數(shù)據(jù)示于 表12。表12 抗小鼠IL_12mAb C17. 15抑制在小鼠建立的結(jié)腸炎 按照結(jié)腸的排泄和肉眼外觀評價，相隔1天以2個分劑量給予總劑量為0. Img/小 鼠或0. 05mg/小鼠的C17. 15單克隆抗IL-12完全逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎。此外，該劑量方案顯著下 調(diào)固有層(lamina propria) T細胞產(chǎn)生IFN-γ和巨噬細胞產(chǎn)生IL-12，使得后一水平與沒 有TNBS結(jié)腸炎的對照乙醇處理小鼠觀測到的水平相似。因此，給予TNBS結(jié)腸炎小鼠模型 C17. 15以劑量依賴方式逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎的發(fā)展。C. a-IL-12杭體對小鼠牛自身免,瘡t牛腦脊髓炎(EAE)的抑制作用人們普遍認為IL-12在多發(fā)性硬化(MS)的發(fā)病機理中起作用。已經(jīng)證實誘導(dǎo) 的IL-12p40信使在MS患者的急性斑中表達而在炎癥性腦梗塞病變沒有表達(Windhange， Α.等(1995) J. Exp. Med. 182 1985-1996)。得自MS患者的T細胞(而非對照T細胞)通過 上調(diào)CD40L表達刺激抗原提呈細胞產(chǎn)生IL-12(Balashov，K. Ε.等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 599-603)。MS患者的IFN- y分泌增加，體外用α -IL-12抗體可阻斷IFN- γ 分泌(Balashov，K. Ε.等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :599_603)。在 MS 患者檢測 到血清IL-12水平升高，但是其他神經(jīng)疾病血清IL-12水平?jīng)]有升高(Nicoletti，F(xiàn).等 (1996) J. Neuroimmunol. 70 :87_90)。已經(jīng)證實IL-12產(chǎn)生增加與MS患者疾病活動有關(guān) (Cormabella, Μ.等(1998) J. Clin. Invest. 102 :671_678)。研究了 IL-12 在小鼠多發(fā)性硬 化模型、實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)病機理中的作用(LeonardJ.P.等(1995) J.Exp. Med. 181 :281_386 ；Banerjee, S.等(1998) Arthritis Rheum. (1998)41 :S33 ；以及 Segal, B. Μ.等(1998) J. Exp. Med. 187 =537-546)。已知該模型疾病由THl亞群T細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生。所以，評價a-IL-12抗體預(yù)防急性EAE發(fā)生的能力。發(fā)現(xiàn)α -IL-12抗體能夠抑制急性EAE發(fā)生、抑制發(fā)生后的疾病，并減輕用自身抗 原髓鞘堿性蛋白免疫小鼠的復(fù)發(fā)的嚴(yán)重程度(Banerjee, S.等(1998) Arthritis Rheum. (1998)41 :S33)。α-IL-12抗體在小鼠的治療的有益作用在停止治療后持續(xù)2個月以上。還 證實抗IL-12抗體抑制過繼轉(zhuǎn)移致腦炎T細胞接受小鼠的疾病(LeonardJ.P.等(19950J. Exp. Med. 181 :281_386)。實施例9 J695的臨床藥理學(xué)在雙盲交叉研究中，對64名健康男性對象給予劑量逐漸遞增的J695或安慰劑。在 給藥前和給藥后0. 25h檢測補體片段C3a證實補體系統(tǒng)沒有活化。只有觀測到伴隨感染癥 狀的對象的CRP和纖維蛋白原水平升高。所有對象均存活，而且J695的總體耐受性非常好。沒有1例因為副作用事件(AE) 而停止治療。觀測到的最常見AE是頭痛和普通感冒/氣管炎，這兩種副作用均不是嚴(yán)重病癥。1名研究對象為33歲單身男性，在研究開始就患有滴狀牛皮癬。按照隨機研究設(shè) 計，該患者隨機接受經(jīng)SC給予的5mg/kg J695。給予所述抗體之前10天，所述患者僅在 手臂和腿上有散在小丘疹病變。給予所述抗體時，該患者出現(xiàn)紅斑變紅、增厚而且角化過 度。給予J695后1周，所述患者述說皮膚癥狀改善，包括病變變平和脫皮減輕。第二次給 予J695(5mg/kg IV)不久，在沒有任何局部治療的情況下患者的皮膚完全沒有牛皮癬病變。 在第二次給予抗體后隨著預(yù)期的J695清除再次出現(xiàn)覆蓋有白色鱗屑的紅斑。實施例10 比較2個CHO細胞系產(chǎn)生的J695為了重組表達J695，通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將編碼所述抗體重鏈和所述抗體輕鏈 的重組表達載體導(dǎo)入 dhfr-CHO 細胞中(Urlaub，G.和 Chasin，L. Α. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 =4216-4220) 在所述重組表達載體中的抗體重鏈基因和輕鏈基因各自與增強 子/啟動子調(diào)節(jié)元件(例如產(chǎn)生自SV40、CMV、腺病毒等的調(diào)節(jié)元件，例如CMV增強子/AdMLP 啟動子調(diào)節(jié)元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調(diào)節(jié)元件)有效連接，以驅(qū)動高水平轉(zhuǎn)錄所 述基因。所述重組表達載體還攜帶有D用FR基因，DHFR基因允許用甲氨蝶呤選擇/擴增 選擇所述載體轉(zhuǎn)染的CHO細胞。使150個編碼人抗體J695肽序列的表達載體的微生物溶解于50ml圓錐形管 的2. 7ml水中。加入300 μ L 2. 5Μ氯化鈣，將該DNA混合物滴加到50ml圓錐形管的3ml 2XHEPES緩沖鹽水中。渦旋5秒并室溫下溫育20分鐘后，使ImL溶液均勻分散在各板中 (仍然為F12培養(yǎng)基)，使該板于37°C溫育4小時。吸去液體，在每個板中加入2ml 10 % DMSO 的F12。DMSO震蕩持續(xù)1分鐘，然后在各板中加入5mlPBS稀釋DMS0。用PBS洗板2次，然 后加入IOml加有H/T和5% FBS (選擇表述DHFR的細胞)的α MEM，37°C溫育過夜。以每 孔100個細胞密度將細胞接種入96孔板，各板于37°C、5%二氧化碳溫育2周，每周更換培 養(yǎng)基1次。最后一次更換培養(yǎng)基后5天，1 50稀釋培養(yǎng)上清液，并用人IgGY鏈特異性 ELISA進行測試。使產(chǎn)生最高ELISA信號的克隆從96孔板轉(zhuǎn)移到1. 5ml/孔αΜΕΜ+5%透 析血清的12孔板中。3天后進行另一個人IgGY鏈特異性ELISA，12個具有最高活性的克 隆分入αΜΕΜ+5%透析血清和20nM MTX中。細胞系031898218在存在20nM MTX下生長，而
94沒有任何明顯細胞死亡或生長率降低，在3日測定中產(chǎn)生1. 8μ g/ml hlgG。031898218在 含MTX的培養(yǎng)基中生長的T-25培養(yǎng)物平均產(chǎn)生J695為11. 9 μ g/ml。稱為ALP903的細胞 系適應(yīng)在無血清條件下懸浮生長，產(chǎn)生7. 5pg J695/細胞/24h。ALP903細胞最初用α MEM/5 % FBS/20nM MTX培養(yǎng)基選擇后，再用20nM MTX傳代。 所述細胞在IOOnM MTX選擇下培養(yǎng)，然后在隨后的30天中用500nM MTX傳代2次。此時所 述培養(yǎng)物產(chǎn)生32 μ gJ695/mL/24h。通過有限稀釋亞克隆培養(yǎng)物。亞克隆218-22在96孔板 中2天產(chǎn)生16. 5μ g/mL J695，在12孔板中2天產(chǎn)生50. 3 μ g/mL J695。用α MEM/5%透析 FBS/500nM MTX培養(yǎng)克隆218-22 38天，然后使其如上所述進行無血清旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。稱為ALP 905的無血清懸浮培養(yǎng)的平均細胞特異性產(chǎn)量為58pg/細胞/24h。第一種用來產(chǎn)生J695的細胞系(ALP 903)由培養(yǎng)物產(chǎn)生J695抗體的產(chǎn)量低于 第二種細胞系A(chǔ)LP 905。為了保證ALP 905產(chǎn)生的J695在功能上與ALP 903產(chǎn)生的J695 相同，評價了兩批抗體的IL-12親和力、阻斷IL-12結(jié)合細胞受體的能力、抑制IL-12誘導(dǎo) IFN- γ的能力以及抑制IL-12介導(dǎo)的PHA母細胞增殖的能力。通過表面胞質(zhì)團共振研究(BIAcore分析)檢測結(jié)合IL-12的動力學(xué)速率常數(shù)，從 而確定ALP 903和ALP 905批J695對IL-12的親和力。以3個實驗(如實施例3所述) 測定ALP 903和ALP 905批J695抗體結(jié)合rhIL_12的解離速率常數(shù)(kd)和結(jié)合速率常 數(shù)(ka)。通過解離速率常數(shù)除以結(jié)合速率常數(shù)計算獲得結(jié)合IL-12的親和力Kd。計算各 個實驗的Kd，然后平均。結(jié)果表明ALP 903和ALP 905批J695測得的動力學(xué)參數(shù)和結(jié)合 rhIL-12的親和力非常類似=ALP 903批的計算Kd為1. 19士0. 22 X ICTiqM,而ALP 905批的 Kd 為 1.49 士0.47 X ICTiqM (見表 13)。評價ALP 903和ALP 905產(chǎn)生的J695阻斷rhIL_12結(jié)合PHA活化的人T淋巴母 細胞上的IL-12受體的能力(參見實施例3)。測試以10倍連續(xù)稀釋的起始濃度為IX 10_8 的各J695樣品。使所述抗體與50pM[125I]_人IL-12在結(jié)合緩沖液中于37°C預(yù)溫育1小 時。PHA母細胞加入抗體/[125I]-人IL-12混合物中，室溫下溫育2小時。通過離心和洗滌 步驟分離細胞結(jié)合放射性和游離[125I]-IL_12，計算抑制百分率。利用4參數(shù)曲線擬合由抑 制曲線確定J695的IC5tl值，并通過2個獨立實驗證實。一式二份進行溫育。兩批J695的 結(jié)果非常相似(見表13)。評價ALP 903和ALP 905細胞產(chǎn)生的J695抑制rhIL_12誘導(dǎo)體外PHA活化的人 淋巴母細胞產(chǎn)生IFN-Y的能力。連續(xù)稀釋的J695與200pg/mL rhIL_12于37°C預(yù)溫育1 小時。加入PHA淋巴母細胞，37°C溫育18小時。溫育后取出無細胞上清液，用ELISA測定 人IFN-Y水平。利用4參數(shù)曲線擬合用抑制曲線的IC5tl值對抗體濃度作圖。結(jié)果證實兩 批J695抑制IFN- γ產(chǎn)生的能力非常相似。體外PHA母細胞增殖測定用于測定ALP 903和ALP 905 J695對rhIL_12的中和 能力。連續(xù)稀釋的每種類型的J695與230pg/mL人IL-12于37°C預(yù)溫育1小時。然后加入 PHA母細胞，37°C溫育3天。然后用IYCi/孔[3H]-胸苷標(biāo)記細胞6小時。收獲培養(yǎng)物，測 量摻入的[3H]-胸苷。在缺乏rhIL-12的情況下測定非特異性增殖(背景)。發(fā)現(xiàn)ALP 903 和ALP 905 J695的IC5tl值非常相似，見表13。ALP 903批和ALP 905批J695抗體的中和rhIL-12活性、阻斷IL-12結(jié)合細胞表 面受體和結(jié)合rhIL-12中的活性沒有明顯不同，所以這兩種不同細胞類型產(chǎn)生的抗體是等同物。表13 比較ALP 903和ALP 905批的J695的特性 等同實施方案本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或者最多用常規(guī)實驗就能夠確定本文所述本發(fā)明具體實施 方案的許多等同實施方案。這樣的等同實施方案包括在以下權(quán)利要求書內(nèi)。
權(quán)利要求
一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO1氨基酸序列的重鏈CDR3。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，它編碼抗體重鏈可變區(qū)。
3.如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQID NO 5的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID NO :7氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)。
6.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
7.如權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，它編碼抗體輕鏈可變區(qū)。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQID NO 4的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQID NO 6的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID NO :8氨基酸序列的抗 體輕鏈可變區(qū)。
11.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO :9氨基酸序列的重鏈⑶R3。
12.如權(quán)利要求11所述的分離的核酸分子，它編碼抗體重鏈可變區(qū)。
13.如權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求12所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID N0:15氨基酸序列的 抗體重鏈可變區(qū)。
16.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO 10氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
17.如權(quán)利要求16所述的分離的核酸分子，它編碼抗體輕鏈可變區(qū)。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求17所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQIDNO 16氨基酸序列的抗 體輕鏈可變區(qū)。
21.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO 17氨基酸序列的重鏈⑶R3。
22.如權(quán)利要求21所述的分離的核酸分子，它編碼抗體重鏈可變區(qū)。
23.如權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO 19的氨基酸序列。
24.如權(quán)利要求22所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO 21的氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID N0:23氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)。
26.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO 18氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
27.如權(quán)利要求26所述的分離的核酸分子，它編碼抗體輕鏈可變區(qū)。
28.如權(quán)利要求27所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO 20的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求27所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQ ID NO 22的氨基酸序列。
30.如權(quán)利要求29所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID N0:24氨基酸序列的 抗體輕鏈可變區(qū)。
31.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO :25氨基酸序列的重鏈⑶R3。
32.如權(quán)利要求31所述的分離的核酸分子，它編碼抗體重鏈可變區(qū)。
33.如權(quán)利要求32所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求32所述的分離的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列。
35.如權(quán)利要求34所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID NO :31氨基酸序列的 抗體重鏈可變區(qū)。
36.一種分離的核酸分子，它編碼包含SEQ ID NO :26氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
37.如權(quán)利要求36所述的分離的核酸分子，它編碼抗體輕鏈可變區(qū)。
38.如權(quán)利要求37所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
39.如權(quán)利要求37所述的分離的核酸分子，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列。
40.如權(quán)利要求39所述的分離的核酸分子，它編碼包含SEQID N0:32氨基酸序列的 抗體輕鏈可變區(qū)。
41.一種包含權(quán)利要求1-40中任一項所述的核酸分子的重組表達載體。
42.—種已經(jīng)導(dǎo)入權(quán)利要求41所述的重組表達載體的宿主細胞。
43.一種合成結(jié)合人IL-12的人抗體的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求42所述的 宿主細胞，直到結(jié)合人IL-12的人抗體被所述細胞合成為止。
全文摘要
本發(fā)明公開了特異性結(jié)合人白細胞介素-12(hIL-12)的人抗體，優(yōu)選重組人抗體。優(yōu)選抗體對hIL-12具有高度親和力，而且在體外和體內(nèi)中和hIL-12活性。本發(fā)明的抗體可以是全長抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的抗體或抗體部分可用于檢測hIL-12以及抑制例如患有其中hIL-12活性有害的疾病的病人體內(nèi)的hIL-12活性。本發(fā)明還包括用于表達本發(fā)明重組人抗體的核酸、載體和宿主細胞以及合成所述重組人抗體的方法。
文檔編號A61P19/02GK101921772SQ20101019528
公開日2010年12月22日 申請日期2000年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月25日
發(fā)明者A·R·敦坎, A·文圖里尼, A·維多姆, A·邁勒斯, B·拉布科夫斯基, D·E·特拉西, E·J·德比施雷, G·M·韋德曼, J·G·埃爾文, J·G·薩菲爾德, M·帕斯金德, M·懷特, M·羅古斯卡, N·W·瓦尼, P·薩科拉法斯, S·L·杜富, S·卡門, S·史密斯, S·巴納吉, S·弗里德里希, T·L·霍爾特特, Z·凱馬克卡蘭 申請人:艾博特股份有限兩合公司