專利名稱：山橿乙酸乙酯部位提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種山橿乙酸乙酯部位提取物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
山橿Lindera reflexa Hemsl.系樟科山胡椒屬植物，為灌木或小喬木。主要分布于河南的大別山區(qū)、桐柏山區(qū)、江蘇、安徽等地，而河南信陽地區(qū)分布最廣泛，且產(chǎn)量豐富，是山橿的主要產(chǎn)地。山橿根或根皮入藥，性溫，味辛，具有行氣止痛，健脾消積，活血消腫等作用。山橿在長期的臨床應(yīng)用中收到良好的效果，且有很長的應(yīng)用歷史。由于其良好的臨床療效和我省豐富的藥材資源，被收入《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》。
由于山橿資源廣泛，價格低廉，臨床效果明顯，如果其對抗炎、抑制潰瘍和鎮(zhèn)痛的有效部位、活性成分進行深入研究，并開發(fā)成治療胃病的新藥，將會創(chuàng)造顯著的經(jīng)濟效益及良好的社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明之目的就是提供一種山橿乙酸乙酯部位提取物及其應(yīng)用，即一種用乙酸乙酯從山橿根中提取的有效部位物質(zhì)，在制備治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍藥物中的應(yīng)用，可有效解決制備治療及預(yù)防慢性胃炎，胃潰瘍藥物的問題。
本發(fā)明是采用極性不同的系統(tǒng)溶劑對山橿依次進行提取，得石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位。選取山橿乙酸乙酯部位回收乙酸乙酯，得浸膏，即得用于制備治療及預(yù)防慢性胃炎，胃潰瘍藥物的山橿有效部位提取物山橿乙酸乙酯部位提取物，該提取物是取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2-4小時，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2-4小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2-4小時，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2-4小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，40-60℃濃縮干燥，得干粉，得率為2.48％，即為山橿根藥理有效部位提取物(或稱山橿乙酸乙酯部位提取物)。所說的重量體積(W/V)是指固體物以g計，液體物以ml計。
篩選確定山橿活性部位。采用河南省羚銳制藥股份有限公司生產(chǎn)的中成藥制劑“胃疼寧片”為陽性對照組(胃疼寧片為山橿的水煎煮浸膏、山橿揮發(fā)油、雞蛋殼與蜂蜜制成的中成藥)，山橿乙酸乙酯部位提取物為乙酸乙酯部位組，0.9％生理鹽水為模型組，分別通過急性胃潰瘍模型實驗，慢性胃潰瘍模型實驗，疼痛模型實驗，炎癥模型實驗等來確定具有確切療效的山橿有效部位。
Wister大白鼠用幽門結(jié)扎法造急性胃潰瘍模型，用醋酸法造慢性胃潰瘍模型，分別用以上各組灌胃給藥；通過統(tǒng)計胃潰瘍面積和潰瘍抑制率來考察山橿有效部位對Wister大白鼠胃潰瘍模型的影響。采用扭體法和熱板法，分別以扭體次數(shù)和痛域值為觀察指標(biāo)來統(tǒng)計山橿有效部位對小鼠疼痛模型的影響。用二甲苯致耳殼水腫炎癥模型，以實驗小鼠兩耳片重量之差為腫脹度，考察山橿有效部位對實驗小鼠耳殼水腫炎癥模型的腫脹抑制率。
綜合考慮對急性胃潰瘍模型和慢性胃潰瘍模型、疼痛模型、炎癥模型的實驗結(jié)果，可以確定山橿的有效部位為山橿的乙酸乙酯部位。
本發(fā)明的山橿乙酸乙酯部位提取物制備方法簡便，所得有效部位提取物，質(zhì)量穩(wěn)定，可有效用于制備治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍藥物，開辟了山橿制備藥物的新領(lǐng)域，是中醫(yī)藥學(xué)上的一大創(chuàng)新。
具體實施例方式 以下結(jié)合實際情況對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細(xì)說明。
實施例1 取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2小時，第三次加入4倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2小時，第三次加入4倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，45℃濃縮干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。
實施例2 取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，第三次加入6倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流3小時，第三次加入6倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流3小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，50℃濃縮干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。
實施例3 取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取4小時，第三次加入8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流4小時，第三次加入8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流4小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，60℃濃縮干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。
實施例4 取山橿根粉碎，過24目篩，取山橿根粉500g用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml石油醚回流3小時，第三次加入3000ml石油醚回流3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml乙酸乙酯回流3小時，第三次加入3000ml乙酸乙酯回流3小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，50℃濃縮干燥，得干粉12.4g，即山橿乙酸乙酯部位提取物。
本發(fā)明的一種山橿有效部位提取物即山橿乙酸乙酯部位提取物有效用于制備治療及預(yù)防慢性胃炎，胃潰瘍的藥物，并為試驗所證明，有關(guān)試驗資料如下 經(jīng)以下對比試驗，結(jié)果表明，本發(fā)明的山橿有效部位提取物對急性胃潰瘍模型和慢性胃潰瘍模型、疼痛模型、炎癥模型的治療作用比較穩(wěn)定 有效部位的藥理模型篩選 1.用胃消化性胃潰瘍模型進行藥效學(xué)篩選，其中包括急性胃潰瘍模型(幽門結(jié)扎法)和慢性胃潰瘍模型(醋酸法)兩種 1.1急性胃潰瘍模型(胃潰瘍幽門結(jié)扎法)取體重200±20g的Wistar大白鼠30只，雌雄各半，隨機分成3組，每組10只，分別為模型組、陽性對照組、乙酸乙酯部位組。模型組以0.9％生理鹽水按20ml/Kg體重劑量灌胃給藥。陽性對照組胃疼寧片以0.225g/Kg劑量每日次灌胃給藥(配制11.25mg/ml胃疼寧片溶液按20ml/Kg體重劑量給藥)。山橿乙酸乙酯部位喂藥組按山橿藥材7g/Kg劑量每日次灌胃給藥。
連續(xù)灌胃7天。用急性胃潰瘍模型(幽門結(jié)扎法)造模，于造模前48小時禁食不禁水，18小時后脫頸椎處死，剖腹，結(jié)扎賁門取胃，向胃內(nèi)注射1％甲醛溶液10ml，并將胃浸泡于1％甲醛溶液中固定15min后，沿胃大彎剖開，用生理鹽水清洗后，觀察潰瘍的發(fā)生情況。用肉眼和放大鏡觀察胃黏膜面，記錄每組產(chǎn)生潰瘍的鼠數(shù)、潰瘍數(shù)、每個潰瘍面的最大直徑、潰瘍面積及病變情況等。潰瘍指數(shù)按Guth標(biāo)準(zhǔn)由每個潰瘍面的最大直徑計算其潰瘍指數(shù)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下病變面直徑＜1mm計1分，病變面直徑在1--1.9mm之間計2分，病變面直徑在2--2.9mm之間計3分，病變面直徑在3--4mm之間計4分，病變面直徑＞4mm者將其分成若干段，每段按上法計分；糜爛寬度＞2mm時則分值×2計。全胃得分為粘膜損傷指數(shù)，即潰瘍指數(shù)。
潰瘍抑制百分率＝(模型組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/模型組潰瘍指數(shù) 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量采用x±s進行統(tǒng)計描述，用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析。由統(tǒng)計結(jié)果可知乙酸乙酯部位組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；乙酸乙酯部位組與陽性對照組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1-2。
表1-2山橿有效部位對幽門結(jié)扎法所致大鼠胃潰瘍的影響(x±s)
與模型組比較**P＜0.01。
1.2慢性胃潰瘍模型(醋酸法)取體重200±20g的Wistar大鼠30只，雌雄各半，半空腹?fàn)顟B(tài)下隨機分為3組，每組10只，分別為模型組、陽性對照組、乙酸乙酯部位組。采用醋酸法造慢性胃潰瘍模型，從手術(shù)次日起，分別灌胃給藥生理鹽水、胃疼寧片溶液(0.225g/Kg劑量)、山橿乙酸乙酯部位提取物(按山橿藥材7g/Kg劑量)，每日1次，連續(xù)治療12天，第14天處死，開腹、結(jié)扎幽門和賁門，取胃浸于0.01ml/ml甲醛溶液中，固定10分鐘。沿胃大彎剪開，將胃外翻，倒掉內(nèi)容物，用吸管沖掉食物殘渣。觀察并記錄潰瘍情況，計算潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制百分率。
潰瘍指數(shù)統(tǒng)計方法、潰瘍抑制率計算方法同幽門結(jié)扎法。
統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量采用x±s進行統(tǒng)計描述，用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析。由統(tǒng)計結(jié)果可知乙酸乙酯部位組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；乙酸乙酯部位組與陽性對照組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。實驗結(jié)果見表1-3。
表1-3山橿有效部位對醋酸法所致大鼠胃潰瘍的影響(x±s)
與模型組比較**P＜0.01。
2.用疼痛模型進行藥效學(xué)篩選，包括扭體法和熱板法。
2.1扭體法取體重18-25g的清潔級Wistar小鼠，雌性，實驗室適應(yīng)3天后，取同批次小鼠50只，隨機分為3組模型組(生理鹽水組)10只、陽性對照組(胃疼寧組)20只、乙酸乙酯部位組20只。所有動物在進行扭體實驗前禁食24h，飲水不限。
模型組小鼠以生理鹽水(按20ml/kg劑量)灌胃給藥；陽性對照組小鼠以“胃疼寧片”(按0.289g/kg劑量)灌胃給藥；乙酸乙酯部位組以山橿乙酸乙酯提取物(按相當(dāng)于山橿原藥材9g/Kg劑量)灌胃給藥。連續(xù)灌胃5天。于造模前24小時禁食不禁水，各組小鼠灌胃給藥120分鐘后，腹腔注射0.6％冰醋酸0.15ml/10g，觀察給藥小鼠扭體反應(yīng)潛伏期(以腹部收縮、伸展后肢或臀部抬高為扭體反應(yīng)陽性)記錄15分鐘內(nèi)每只小鼠扭體的次數(shù)，按下試計算各給藥組鎮(zhèn)痛抑制率，給藥組與模型組進行比較。
鎮(zhèn)痛百分率＝(給藥組無扭體數(shù)-模型組無扭體數(shù))/模型組實際扭體數(shù) 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量采用x±s進行統(tǒng)計描述，用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析。由統(tǒng)計結(jié)果可知乙酸乙酯部位組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；乙酸乙酯部位組與陽性對照組比較有差異(P＜0.05)，但沒有顯著性差異(P＜0.01)。實驗結(jié)果見表1-4。
表1-4山橿各部位對冰醋酸法所致小鼠扭體反應(yīng)的影響(x±s)
與模型組比較**P＜0.01。
2.2熱板法 取體重18-25g的清潔級Wistar小鼠，雌性。實驗室適應(yīng)3天后，進行預(yù)試用YLS-6A智能熱板儀(55±5)℃篩選熱板痛反應(yīng)時間合格的實驗小鼠。隨機分為3組模型組(生理鹽水組)10只、陽性對照組(胃疼寧組)20只、乙酸乙酯部位組20只。模型組小鼠以生理鹽水(按20ml/kg劑量)灌胃給藥；陽性對照組小鼠以“胃疼寧片”(按0.289g/kg劑量)灌胃給藥；乙酸乙酯部位組以山橿乙酸乙酯提取物(按相當(dāng)于山橿原藥材9g/Kg劑量)灌胃給藥。每天1次，連續(xù)5天。小鼠末次灌胃給藥后分別在60、120、180分鐘時，將小鼠放入熱板，測定每鼠痛閾值。
按如下公式計算給藥后痛閾提高值痛閾提高值＝用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量采用x±s進行統(tǒng)計描述，用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析。由統(tǒng)計結(jié)果可知乙酸乙酯部位組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)；乙酸乙酯部位組與陽性對照組比較有差異(P＜0.05)，但沒有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果見表1-5。
表1-5山橿各部位對熱板法小鼠痛域值的影響(x±s)
與模型組比較**P＜0.01；*P＜0.05。
3抗炎實驗(小鼠耳廓腫脹法) 取體重18-24g的清潔級Wistar小鼠，雌性，50只，隨機分為3組模型組(生理鹽水組)10只、陽性對照組(胃疼寧組)20只、乙酸乙酯部位組20只。模型組小鼠以生理鹽水(按20ml/kg劑量)灌胃給藥；陽性對照組小鼠以“胃疼寧片”(按0.289g/kg劑量)灌胃給藥；乙酸乙酯部位組以山橿乙酸乙酯提取物(按相當(dāng)于山橿原藥材9g/Kg劑量)灌胃給藥。每天1次，連續(xù)5天。末次給藥1.5h后，將二甲苯均勻涂于小鼠右耳前后兩面，40μL/只，左耳作自身空白對照。1h后將小鼠脫椎處死，用內(nèi)徑9mm打孔器分別在左、右雙耳同一部位打下圓耳片，天平上稱重，右耳圓片重量減去左耳圓片重量之差為腫脹度，計算腫脹抑制率。
腫脹抑制率＝(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)值變量采用x±s進行統(tǒng)計描述，用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析。由統(tǒng)計結(jié)果顯示山橿乙酸乙酯部位組與模型組比較有差異(P＜0.05)；與陽性對照組比較沒有差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1-6。
表1-6山橿各部位對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(x±s)
與模型組比較**P＜0.01；*P＜0.05。
綜上所述，表明本發(fā)明性能穩(wěn)定、可靠，有臨床意義。山橿根提取的有效山橿乙酸乙酯部位對急、慢性胃潰瘍模型有抑制作用并有鎮(zhèn)痛抗炎作用，山橿乙酸乙酯部位提取物能夠在制備治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍、慢性胃炎藥物中得到應(yīng)用。由于其來源于天然植物成分，藥理作用明顯，毒副作用相對較小，具有開發(fā)成為治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍、慢性胃炎藥物的潛力。
權(quán)利要求
1.一種山橿乙酸乙酯部位提取物，其特征在于，該提取物是取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2-4小時，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2-4小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2-4小時，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2-4小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，40-60℃濃縮干燥，得干粉，得率為2.48％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山橿乙酸乙酯部位提取物，其特征在于，該提取物是取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2小時，第三次加入4倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取2小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2小時，第三次加入4倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流2小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，45℃濃縮干燥，得干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山橿乙酸乙酯部位提取物，其特征在于，該提取物是取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，第三次加入6倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流3小時，第三次加入6倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流3小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，50℃濃縮干燥，得干粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山橿乙酸乙酯部位提取物，其特征在于，該提取物是取山橿根，粉碎，過24目篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取4小時，第三次加入8倍量山橿根粉重量體積的石油醚回流提取3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流4小時，第三次加入8倍量山橿根粉重量體積的乙酸乙酯回流4小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，60℃濃縮干燥，得干粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山橿乙酸乙酯部位提取物，其特征在于，該提取物是取山橿根粉碎，過24目篩，取山橿根粉500g用沸點為60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml石油醚回流3小時，第三次加入3000ml石油醚回流3小時，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml乙酸乙酯回流3小時，第三次加入3000ml乙酸乙酯回流3小時，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，50℃濃縮干燥，得干粉12.4g。
6.權(quán)利要求1或2或3或4或5的山橿乙酸乙酯部位提取物，在于制備治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍、慢性胃炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山橿乙酸乙酯部位提取物及其應(yīng)用，可有效解決制備治療及預(yù)防慢性胃炎，胃潰瘍藥物的問題，該提取物是取山橿根，粉碎，過篩，取山橿根粉用沸點為60-90℃石油醚回流提取3次，抽濾，棄去濾液，再用乙酸乙酯進行回流提取3次，抽濾，真空減壓回收乙酸乙酯，40-60℃濃縮干燥，得干粉，得率為2.48％，本發(fā)明提取物制備方法簡便，所得有效部位提取物，質(zhì)量穩(wěn)定，可有效用于制備治療及預(yù)防脾胃虛寒性胃炎、胃潰瘍藥物，開辟了山橿制備藥物的新領(lǐng)域，是中醫(yī)藥學(xué)上的一大創(chuàng)新。
文檔編號A61P1/04GK101816707SQ201010107589
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者陳隨清, 張峰, 張濤 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院