專利名稱：從枳椇中提取生物堿的方法及枳椇生物堿的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從枳椇中提取生物堿的方法及枳椇生物堿的純化方法。

背景技術(shù)：
生物堿是一類存在于植物藥中結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有顯著生物活性的堿性化合物，枳椇除果梗外葉、根、種子等均含生物堿，均可藥用，特別是種子含生物堿量也很高。枳椇子主要含有環(huán)肽類生物堿和β-咔啉類生物堿，目前已從北枳椇的根皮中分離得到環(huán)肽類生物堿異歐鼠李堿(frangulanine)、去-N-甲基異歐鼠李堿(枳椇堿A、horenineA)和枳椇堿B(horenine B)，從北枳椇的種子中得到異歐鼠李堿和β-咔啉類生物堿黑麥草堿(perlolyrine)。研究表明，枳椇子總生物堿能明顯拮抗乙醇所致肝損傷，其中所含的異歐鼠李堿對誘導(dǎo)線粒體浮脹腫瘤有離子選擇性；黑麥草堿能明顯地增加冠脈血流量和心肌營養(yǎng)性血流量，且有抗血栓、抗血小板凝聚作用[，而且對H2O2引起的人胎兒劑靜脈內(nèi)皮細胞損傷有保護作用。但是，國內(nèi)外目前對于枳椇生物堿從枳椇中分離提純的方法尚無報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種從枳椇中提取生物堿的方法及提取的粗生物堿的純化方法。
本發(fā)明首先提供了一種從枳椇中提取生物堿的方法，該方法包括以下步驟 (1)枳椇用酸乙醇溶液浸漬，過濾，得酸乙醇提取液； (2)回收乙醇溶劑，然后用稀酸溶解，靜置，過濾； (3)調(diào)節(jié)濾液的pH值＝10～12； (4)用不溶于水的萃取劑萃取； (5)分相，濃縮水相。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(1)中，所述酸乙醇溶液為鹽酸乙醇溶液、硫酸乙醇溶液、乙酸乙醇溶液、酒石酸乙醇溶液或草酸乙醇溶液；所述酸乙醇溶液為的濃度為1％～11％(V/V)。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(1)中，所述浸漬的溫度20℃～80℃，時間2h～20h。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(1)中，枳椇與酸乙醇溶液的質(zhì)量比為1∶5～35. 作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(2)中，所述稀酸為稀越酸、稀硫酸、稀乙酸、稀酒石酸或稀草酸；所述靜置于4-30℃下靜置，所述回收乙醇的方法為普通蒸餾或減壓蒸餾。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(4)中，所述不溶于水的萃取劑為氯仿、乙醚或乙酸乙酯；萃取的次數(shù)為2～5次。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取生物堿的方法，步驟(5)中，所述濃縮水相的方法為減壓蒸餾或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再于40℃～60℃下烘干。
本發(fā)明還進一步提供了一種從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，粗生物堿用大孔吸附樹脂柱進行洗脫、純化。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，所述大孔吸附樹脂的型號為D101、XDA-10、LSA-300B、LX-38、LSA-21、H-30、LS-11或LSD-001，所述大孔吸附樹脂柱的柱體積為7～7.5mL，柱留體積為2～2.5mL，所用的大孔吸附樹脂的量為4～6g，柱留體積即柱體積最大保留溶劑。
作為優(yōu)化，上述從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，所述洗脫用的洗脫劑為10％～90％的乙醇水溶液；流速為1.5～2.5mL/min；大孔吸附樹脂的上樣量為4～5mg粗生物堿/克。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法將枳椇生物堿從枳椇中分離的難題，提供了一種從枳椇中提取生物堿的方法，該方法具有簡單、易掌握、成本低、收率高的優(yōu)點。



圖1是提取生物堿的工藝流程示意圖； 圖2是乙醇濃度對生物堿洗脫率的影響； 圖3是pH值對生物堿吸附量的影響 圖4是上樣濃度對大孔樹脂對生物堿吸附量的影響。

具體實施例方式 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1 確定枳椇各部位的生物堿含量 1.1試驗材料、試劑與儀器 1.1.1材料 北枳椇各部位(枝、葉、果柄、種子)均采自陜西太白山。將新鮮的葉子，枝干，果柄洗凈、去雜處理，清水漂洗并瀝干水分。取一部分果柄打漿，除去果汁，保留果渣。分離種子與種殼。將上述各部位(葉子、枝干、果柄、果渣、種子、種殼)分別在50℃干燥至恒重。粉碎，過40目篩，其中果渣過80目篩，備用。
1.1.2試劑 氯仿、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、甲基紅-溴甲酚綠指示劑均為分析純。
氫氧化鈉溶液的標定用分析天平精密稱取0.2g固體氫氧化鈉置于100mL的燒杯中，加少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)置250ml的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，用0.049mol/L的硫酸溶液標定，該氫氧化鈉溶液濃度為0.019089mol/L。
硫酸溶液的標定用1mL的移液管吸取9N的硫酸溶液0.55mL置250mL的容量瓶中，加蒸餾水置刻度，用0.02mol/L的氫氧化鈉溶液標定，該硫酸的濃度為0.01061mol/L。1.1.3儀器 FW-177中草藥萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；FA2004電子分析天平，上海精科天平；CS101-3型干燥箱，重慶銀河試驗儀器有限公司；R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；冷凝管；水浴鍋；圓底燒瓶。
1.2試驗方法 1.2.1生物堿分布試驗 1.2.1.1生物堿預(yù)試液的制備 分別取干燥樣品粉末3g，加0.5％鹽酸的乙醇溶液10mL，水浴回流30分鐘，過濾，濾液蒸發(fā)乙醇至無醇味，加適量的蒸餾水溶解。
1.2.1.2生物堿沉淀和顯色反應(yīng) 分別取原料的酸性水提液各1mL置三支試管中，分別加入碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑和鞣酸試劑各1-2滴如碘-碘化鉀試劑產(chǎn)生棕色或者褐色沉淀為陽性反應(yīng)，碘化汞鉀試劑產(chǎn)生白色沉淀為陽性反應(yīng)，鞣酸試劑產(chǎn)生黃棕色沉淀為陽性反應(yīng)。
根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象按快慢和劇烈程度分為5個級別劇烈陽性(用“+++”表示)、極陽性(用“++”表示)、陽性反應(yīng)(用“+”表示)、不明顯(用“±”表示)、陰性反應(yīng)(用“-”表示) 1.2.2生物堿含量測定 1.2.2.1實驗原理 生物堿在一般情況下顯堿性，酸堿滴定法滴定時，加入的硫酸先和生物堿反應(yīng)，生成生物堿鹽類，剩余的硫酸用氫氧化鈉滴定，根據(jù)公式生物堿含量(mg/g)＝(V1-V2)·C·2.502/0.01/M1，計算出1g原料中所含生物堿的量。公式中 V1——加入的硫酸總體積，單位mL； V2——中和氫氧化鈉溶液消耗的硫酸體積，單位mL； C——滴定用硫酸的濃度，單位mol/L； 2.502/0.01——每mL0.01mol/L的硫酸溶液相當于2.502mg的異歐鼠李堿； M1——測定中所用原料的重量單位g。
1.2.2.2生物堿的提取 參考圖1所示，精密稱取各干燥后的原料粉末5g，置于圓底燒杯中，加入5％鹽酸乙醇溶液，置60℃水浴上回流8小時，過濾，得酸乙醇提取液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇溶劑，用稀酸水溶解(5％鹽酸水溶液)，冷置過夜，過濾，除去不溶解的非堿性脂溶性雜質(zhì)(對于未除凈的脂溶性雜質(zhì)，可用乙醚或者氯仿萃取幾次)，堿化濾液至pH＝11，移入1000mL的分液漏斗中用氯仿萃取四次，每次80mL，合并萃取液，回收氯仿中約40mL左右轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加氯仿至刻度制成樣品液。備用。
1.2.2.3酸堿滴定法測定總生物堿的含量 精密吸取樣品液5mL于燒杯中，精確加入0.01mol/L的硫酸溶液20mL，置于水浴鍋上除去氯仿，加甲基紅-溴甲酚綠指示劑(0.10％甲基紅醇溶液與0.20％溴甲酚綠醇溶液以2∶3比例混合)2滴，用0.02mol/L氫氧化鈉溶液滴定至黃色，保持30秒鐘不退色為止。記錄氫氧化鈉消耗的毫升數(shù)。
1.2.2.4總生物堿的計算方法 總生物堿含量以異歐鼠李堿的含量計算，每mL 0.01mol/L的硫酸相當于2.502mg異歐鼠李堿，以異歐鼠李堿計算總生物堿的含量。
實施例2枳椇生物堿的提取工藝 果梗生物堿提取工藝 由上述試驗得知枳椇果梗中總生物堿含量最高，采用酸性乙醇為溶劑、加熱回流提取法提取枳椇果梗中的總生物堿。
2.1果梗生物堿提取單因素試驗 分別對酸性乙醇濃度、酸體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比和提取次數(shù)進行了單因素試驗，以確定各因子的影響效果和適宜的范圍。以果?？偵飰A含量作為評價指標，3次重復(fù)。
①提取試劑的確定取果梗原料5g，浸漬溫度60℃，固液比1∶15，浸漬時間8h，分別用5％鹽酸乙醇溶液、5％硫酸乙醇溶液、5％乙酸乙醇溶液、5％酒石酸乙醇溶液、5％草酸乙醇溶液提取生物堿，計算總生物堿含量。
②酸體積分數(shù)的確定選定最佳的生物堿提取試劑，固定原料5g，浸漬溫度60℃，固液比1∶15，浸漬時間8小時，分別用含有1％、3％、7％、9％和11％(記錄其相對應(yīng)的pH值)體積分數(shù)的酸水乙醇溶液提取，計算總生物堿的含量。
③提取溫度的確定酸體積分數(shù)為5％，其余條件同上，分別在以下溫度進行提取，室溫(測量記錄溫度)20℃、30℃、40℃、50℃、70℃、80℃，計算總生物堿含量。
④固液比的確定其余條件同上，分別用以下固液比進行回流提取，1∶5、1∶10、1∶15、1∶25、1∶30和1∶35，計算總生物堿含量。
⑤時間的確定其余條件同上，分別浸漬以下的時間2h、4h、6h、10h、12h、16h和20h，計算總生物堿含量。
2.2果梗生物堿提取正交試驗 以單因素試驗結(jié)果為參考，選用L9(3)4正交試驗設(shè)計表，以溶劑(乙醇/水/鹽酸)濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)為影響因素，以總生物堿含量為指標，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，從中篩選最優(yōu)的工藝條件和技術(shù)參數(shù)。提取方法是稱取5g果梗粉末，按試驗設(shè)計條件，熱回流提取后趁熱過濾，提取液在45℃下真空干燥，備用。
實施例3枳椇生物堿的純化工藝 3.1總生物堿粗提取液及上柱液的制備 枳椇總生物堿粗提物置于燒杯中，加蒸餾水置于水浴中蒸發(fā)掉提取時殘留的氯仿，再適量蒸餾水充分拌勻，使其充分溶解，過濾，即得樣品溶液，備用。
3.2大孔吸附樹脂的預(yù)處理和再生 ①大孔吸附樹脂的預(yù)處理及裝柱新購大孔樹脂用95％乙醇浸泡12h充分溶脹后，加熱回流2h，除去乙醇后添加2倍量的50％乙醇回流三次，濕法裝柱，用乙醇清洗至流出液加水不混濁為止，再用蒸餾水洗至澄清備用。
②大孔吸附樹脂再生一般用75％左右乙醇溶液洗脫。經(jīng)反復(fù)使用后，吸附樹脂顏色變深，吸附效果下降時，也可用1mol/L的氫氧化鈉(或者HCl)洗滌或者浸泡適當時間，至樹脂接近原顏色為宜，繼而用水洗至中性即可再生。
3.3靜態(tài)吸附試驗 ①大孔樹脂吸附能力的測定處理過的幾種大孔樹脂去除表面水后，各取0.5g分別置于具塞磨口三角瓶內(nèi)，加入生物堿樣品液20mL(含生物堿11.04mg)，常溫下，搖床或者振搖器上振搖12h-24h，使樹脂充分吸附后過濾，吸取濾液5mL用滴定法測定生物堿含量，計算浸泡液中生物堿總濃度，并按下式計算樹脂的吸附能力。
樹脂吸附能力＝[樹脂吸附前起始生物堿濃度(mg/mL)-樹脂吸附終止后剩余生物堿濃度(mg/mL)]×提取溶液體積(mL)/樹脂質(zhì)量(g) ②洗脫率的測定 將上述靜態(tài)吸附后的大孔樹脂濾出并吸干表面水分，分別置于具塞磨口三角瓶內(nèi)，精密加入20ml體積分數(shù)為70％乙醇，振蕩器振蕩12h-24h。使枳椇生物堿充分解吸附，過濾，分別量取5mL濾液，滴定法測生物堿含量，計算濾液中總生物堿濃度，并按下式計算解吸率。
解吸率＝[解吸溶液體積(mL)×樹脂解吸后濾液生物堿的濃度(mg/mL)]/[樹脂質(zhì)量(g)×樹脂的吸附量(mg/g)]×100％ ③洗脫劑濃度對洗脫率的影響 確定大孔樹脂D101，精密稱取上述靜態(tài)吸附后的再經(jīng)過濾出并吸干表面水分的大孔樹脂10份，每份0.5g，分別置于具塞磨口三角瓶內(nèi)，加入濃度為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇水溶液20mL后，振蕩器振蕩12h-24h，使枳椇生物堿充分解吸附，過濾，濾液量取5.0mL浸飽液滴定法測生物堿含量，計算解吸率。
④pH對大孔樹脂吸附量的影響 精密稱取已經(jīng)處理好的干的大孔吸附樹脂若干份，每份0.5g，分別置于具塞磨口三角瓶內(nèi)，精密加入pH＝4、5、6、7、8、9、10和11的樣品液各20mL后，常溫下，搖床上振搖12h-24h，過濾，將濾液pH值調(diào)至11，萃取，然后分別測定總生物堿濃度，計算飽和吸附量。
3.4動態(tài)吸附-洗脫試驗 ①上柱液濃度對大孔樹脂動態(tài)吸附枳椇總生物堿的影響分別稱取已經(jīng)處理好的大孔樹脂5g，濕法裝柱，柱體積為7.2mL，柱留體積為2.3mL(柱留體積即柱體積最大保留溶劑)，加入不同濃度的生物堿樣品液(總生物堿為22.08mg)，流速2mL/min，過柱完成后，分別收集各自的過柱液，測其中總生物堿的殘留量。
②沖洗雜質(zhì)用水量對大孔樹脂動態(tài)吸附枳椇總生物堿的影響 分別稱取已經(jīng)處理好的大孔樹脂5g，兩份，濕法裝柱，加入生物堿樣品液，分別以流速2mL/min過柱，在以最適溶劑洗脫之前，第一份不用水洗，第二份用1BV、2BV和3BV(BV，BedVolume，單位為m3)的水沖洗，共沖洗三次，分別測定過柱水中總生物堿殘留量，計算損失量及水沖洗對總生物堿純度的影響。
③洗脫劑洗脫次數(shù)對大孔樹脂動態(tài)吸附枳椇總生物堿收率的影響 分別稱取已經(jīng)處理好的大孔樹脂5g，濕法裝柱，加入生物堿樣品液，以流速2/min過柱，測得柱中生物堿含量為15.3mg，過柱完后用90％酒精溶液洗脫，按照1BV洗脫，共洗脫5次，收集每次的洗脫劑，測定其中生物堿含量。
實施例4實驗分析與結(jié)果 4.1實驗分析 4.1.1枳椇中生物堿的分布 枳椇不同部位生物堿提取液定性分析結(jié)果見表1。
表1枳椇生物堿成分的試驗
注劇烈陽性(用“+++”表示)、極陽性(用“++”表示)、陽性反應(yīng)(用“+”表示)、不明顯(用“±”表示)、陰性反應(yīng)(用“-”表示)。
由表1可以看出，枳椇各部位都含有生物堿類化學(xué)成分，但是各成分在枳椇不同部位中的含量不同初步可以確定果柄和果渣中的生物堿含量最高。
4.1.2枳椇中不同部位總生物堿含量 枳椇不同部位總生物堿其含量測定結(jié)果，如表2所示，枳椇果梗中總生物堿含量最高，依次是種子、果渣、種殼、葉及枝木，定量分析結(jié)果與定性分析結(jié)果基本一致。但是，提取過程中發(fā)現(xiàn)果梗含脂溶性雜質(zhì)較多，需要多次萃取。
表2枳椇各部位生物堿含量
4.1.3枳椇總生物堿酸提取試劑的確定 根據(jù)果梗生物堿酸提取試驗得到的結(jié)果，如表3所示。
表3不同酸對生物堿提取率的影響
由表3可見，鹽酸提取枳椇果柄中的總生物堿的提取率最高。
4.1.4枳椇中總生物堿浸漬提取過程中單因素的確定 根據(jù)果梗生物堿酸提取試驗得到的研究結(jié)果，分別如表4、表5、表6和表7所示。
表4不同鹽酸的百分數(shù)對生物堿提取率的影響
由表4可以看出，7％左右的酸乙醇提取液的提取率最高；提取液顏色隨著酸度的增加而加深，至7％之后幾乎不加深，而脂溶性雜質(zhì)依次增多。
表5不同溫度對生物堿提取率的影響
由表5可以發(fā)現(xiàn)，提取率隨著溫度升高而升高，70℃左右生物堿得率高，之后提取率反而下降。研究中發(fā)現(xiàn)，提取液的顏色隨著提取溫度的增加而加深，至80℃以上則沸騰。
表6不同固液比對生物堿提取率的影響
由表6發(fā)現(xiàn)，提取率隨固液比增大而增大，當固液比達到1∶15后，再增加時生物堿提取量基本不變。
表7不同浸提時間對生物堿提取率的影響
由表7發(fā)現(xiàn)，提取率隨浸提時間延長而增大，浸提時間10h左右生物堿的提取率較高，之后，隨著浸提時間的加長，提取率反而下降。
4.1.5枳椇果?？偵飰A浸漬法提取工藝 提取總生物堿過程中受多個因素影響，如鹽酸的體積分數(shù)、固液比、浸提溫度和浸提時間等均對提取率有較大影響。在單因素對生物堿提取率試驗的基礎(chǔ)上，按L9(3)4正交設(shè)計方案，設(shè)計了正交試驗，如表8所示，各試驗處理結(jié)果及枳椇果柄中總生物堿類物質(zhì)總量，如表9所示。
表8L9(3)4正交試驗因素水平表
表9L9(3)4正交實驗結(jié)果
從表9中極差分析可知，鹽酸的體積分數(shù)、浸漬溫度、固液比、浸漬時間因素對總生物堿提取量影響的主次順序為固液比＞浸漬溫度＞鹽酸的體積分數(shù)＞浸漬時間，最佳因素組合為A2B2C3D1，即最佳提取工藝條件為浸漬溫度75℃，鹽酸體積分數(shù)6％，時間9小時，固液比1∶18。但由于固液比1∶15與1∶18時生物堿得率相差不大，為節(jié)省酒精，固液比可改為1∶15。
在最佳工藝條件下，進行平行實驗，測得枳椇果柄總生物堿平均收率為13.8mg/g。
4.1.6大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附試驗結(jié)果 8種大孔吸附樹脂的吸附能力、解析量和洗脫率結(jié)果見表10；不同乙醇濃度洗脫液的洗脫率見表11及圖2；提取液pH值對總生物堿吸附的飽和吸附量見表11及圖3。
表10不同大孔樹脂吸附量、解析量和洗脫率
表11不同濃度洗脫液、不同pH提取液對生物堿純化的影響
由表10可知，樹脂型號不同，極性也不同，對生物堿吸附速率、吸附強弱和解析難易也不一樣。8種樹脂對枳椇總生物堿吸附率大小順序為D-101＞XDA-10＞LSA-300B＞LX-38＞LSA-21＞H-30＞LS-11＞LSD-001，其洗脫率大小順序為XDA-10＞D101＞H-30＞LX-38＞LSA-21＞LSA-300B＞LSD-001＞LS-11，綜合考慮樹脂的吸附-解析效果，選擇D-101樹脂進行枳椇總生物堿的分離純化。
由表11和圖2可以確定，乙醇濃度越高，洗脫率越高，綜合考慮生產(chǎn)成本，選擇90％乙醇洗脫較合適。
由表12和圖3可以確定，當提取液pH＝8.0的弱堿性條件下，D-101樹脂對總生物堿吸附率最大。
大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附試驗結(jié)果表明8種樹脂中最適合對枳椇總生物堿純化的為D-101樹脂，以pH＝8.0提取液上樣，其吸附率較快，且總生物堿的飽和吸附量達6.32mg/g，最佳洗脫溶劑為90％乙醇。
4.1.7D-101大孔吸附樹脂動態(tài)吸附-洗脫條件 上樣濃度對大孔樹脂動態(tài)吸附枳椇總生物堿的影響見圖4；水洗體積對生物堿損失結(jié)果見表12，洗脫劑洗脫次數(shù)對大孔樹脂動態(tài)吸附總生物堿收率影響見表13。表12和表13中，BV為Bed Volume，單位為m3。
表12水洗體積對動態(tài)吸附量的影響
表13洗脫次數(shù)對動態(tài)吸附總生物堿收率的影響
由圖4可見上樣液濃度越高，大孔樹脂D101對枳椇總生物堿的動態(tài)吸附量越好，所以我們選擇上樣濃度為0.6mg/ml；由表12可見，水洗后生物堿損失量不大，可用2BV水洗，損失率為2.6％，可有效的去除水溶性雜質(zhì)，提高總生物堿純度。由表13可看出，總生物堿洗脫量主要集中在4BV內(nèi)，占總生物堿洗脫量的80.38％。
4.2實驗結(jié)果 4.2.1生物堿的定性分析 通過生物堿專屬性沉淀和顯色反應(yīng)對生物堿進行定性分析，分析結(jié)果顯示枳椇的各個部位(包括葉子、枝干、果柄、果渣、種子、種殼)均含有生物堿。
4.2.2生物堿的定量分析 采用酸堿滴定法測定枳椇生物堿含量，結(jié)果表明枳椇果柄中的總生物堿含量最高，為1.020％，其他部分含量依次為種子0.924％；果渣0.759％；種殼0.374％；果葉0.339％；枝干0.269％。
4.2.3生物堿的提取工藝 在對枳椇生物堿定量的基礎(chǔ)上，采用正交法對枳椇果柄中總生物堿的提取工藝進行了優(yōu)化研究，確定了浸漬法提取枳椇總生物堿的最佳工藝為浸漬溫度75℃，鹽酸體積分數(shù)6％，時間9小時，固液比1∶18。但由于固液比1∶15與1∶18時生物堿得率相差不大，為節(jié)省酒精，固液比可改為1∶15。枳椇果柄中總生物堿收率為13.8mg/g。
4.2.4生物堿的純化工藝 比較了8種大孔吸附樹脂，對枳椇總生物堿吸附率大小順序為D-101＞XDA-10＞LSA-300B＞LX-38＞LSA-21＞H-30＞LS-11＞LSD-001，洗脫率大小順序為XDA-10＞D101＞H-30＞LX-38＞LSA-21＞LSA-300B＞LSD-001＞LS-11，綜合考慮樹脂的吸附-解析效果，選擇D-101樹脂進行枳椇果柄總生物堿的分離純化。當以pH＝8.0提取液上樣，其吸附率較快，且總生物堿的飽和吸附量達6.32mg/g。洗脫液的乙醇濃度越高洗脫率越高，乙醇濃度90％以上時，洗脫率達到94％以上。當上樣濃度為0.45mg/ml，2BV水洗去除水溶性雜質(zhì)，洗脫量4BV，得率占總生物堿洗脫量的80.38％。未純化前粗生物堿提取物中含生物堿8.2％，純化后生物堿純度為31.4％。
以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。
權(quán)利要求
1.一種從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)枳椇用酸乙醇溶液浸漬，過濾，得酸乙醇提取液；
(2)回收乙醇溶劑，然后用稀酸溶解，靜置，過濾；
(3)調(diào)節(jié)濾液的pH值＝10～12；
(4)用不溶于水的萃取劑萃??；
(5)分相，濃縮水相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(1)中，所述酸乙醇溶液為鹽酸乙醇溶液、硫酸乙醇溶液、乙酸乙醇溶液、酒石酸乙醇溶液或草酸乙醇溶液；所述酸乙醇溶液為的濃度為1％～11％(V/V)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(1)中，所述浸漬的溫度20℃～80℃，時間2h～20h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(1)中，枳椇與酸乙醇溶液的質(zhì)量比為1∶5～35。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(2)中，所述稀酸為稀鹽酸、稀硫酸、稀乙酸、稀酒石酸或稀草酸；所述靜置于4-30℃下靜置，所述回收乙醇的方法為普通蒸餾或減壓蒸餾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(4)中，所述不溶于水的萃取劑為氯仿、乙醚或乙酸乙酯；萃取的次數(shù)為2～5次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從枳椇中提取生物堿的方法，其特征在于步驟(5)中，所述濃縮水相的方法為減壓蒸餾或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再于40℃～60℃下烘干。
8.一種從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，其特征在于粗生物堿用大孔吸附樹脂柱進行洗脫、純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，其特征在于所述大孔吸附樹脂的型號為D101、XDA-10、LSA-300B、LX-38、LSA-21、H-30、LS-11或LSD-001，所述大孔吸附樹脂柱的柱體積為7～7.5mL，柱留體積為2～2.5mL，所用的大孔吸附樹脂的量為4～6g。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的從枳椇中提取的粗生物堿的純化方法，其特征在于所述洗脫用的洗脫劑為10％～90％的乙醇水溶液；流速為1.5～2.5mL/min；大孔吸附樹脂的上樣量為4～5mg粗生物堿/克。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從枳椇中提取生物堿的方法，包括以下步驟(1)枳椇用酸乙醇溶液浸漬，過濾，得酸乙醇提取液；(2)回收乙醇溶劑，然后用稀酸溶解，靜置，過濾；(3)調(diào)節(jié)濾液的pH值＝10～12；(4)用不溶于水的萃取劑萃取；(5)分相，濃縮水相。本發(fā)明還涉及純化從枳椇中提取的粗生物堿的方法，用大孔吸附樹脂柱進行洗脫、純化。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法將枳椇生物堿從枳椇中分離的難題，提供了一種從枳椇中提取生物堿的方法，該方法具有簡單、易掌握、成本低、收率高的優(yōu)點。
文檔編號A61K36/752GK101773564SQ20101000096
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者張存莉, 蘭光, 王琛, 劉元偉, 吉康 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)