專利名稱：同時制備3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5,17-二烯和3-乙酰氧基-2^＇-氯-5 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為抗胃液分泌和抗?jié)儎┑?-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲 酰-雄留-5，17-二烯和3-乙酰氧基-2'-氯-5-留烯并[17，16-b]吡啶的制備和生物學(xué) 評價。
背景技術(shù)：
消化性潰瘍病(PUD)是影響胃腸(GI)道的最常見疾病之一。其導(dǎo)致胃或十二 指腸粘膜或中的炎性損傷，損傷延伸超過粘膜下層至粘膜肌層中。治療潰瘍的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué) 方法是使用抗酸劑、H2受體阻滯劑和質(zhì)子泵抑制劑。西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁 (famotidine)、尼扎替丁(nizatidine)和雷尼替丁(ranitidine)是H2受體阻滯劑的實(shí) 例。質(zhì)子泵抑制劑(PPI)是初級保健部門中開出的最普遍的藥物處方類型之一，并且經(jīng)常 用于酸-消化性疾病(acid-p印tic disease)的治療中。PPI通過抑制產(chǎn)生酸的胃壁細(xì)胞 的酶氫-鉀三磷酸腺苷酶(H+，K+-ATP酶)來減少酸的產(chǎn)生。質(zhì)子泵是胃酸分泌中的終末 期并且負(fù)責(zé)將H+離子分泌至胃腔中。胃中酸的缺乏有助于愈合十二指腸潰瘍。奧美拉唑 (Omeprazole) (Prilosec)是一種質(zhì)子泵抑制劑，其阻斷胃產(chǎn)生酸。幾種其他的PPI諸如蘭 索拉唑(lansoprazole)、雷貝拉唑(rab印razole)、泮托拉唑(pantoprazole)和埃索美拉 唑(esom印razole)已經(jīng)被引進(jìn)入臨床實(shí)踐中。然而，抗?jié)兯幬锟赡茉黾幽承κ澄锏倪^ 敏。在臨床實(shí)踐中所有PPI均包括非留體藥物。另一方面，甾體氮雜雜環(huán)類眾所周知作為酶諸如5 α -還原酶和17 α -裂合酶的 抑制劑。此外，留體雜環(huán)類諸如達(dá)那唑(danazol)、地夫可特(deflazacort)、可的伐唑 (cortivazol)、nevazol、2-氮雜留體化合物 Q-azasteroid)和非那雄胺(finasteride)吸 引了較多的注意力，這歸因于它們針對多種疾病諸如良性前列腺增生、哮喘、5 α-還原酶抑 制劑、前列腺癌和L-1210白血病的生物學(xué)活性。然而，如PPI的留體化合物的生物學(xué)活性 還未知。參考文獻(xiàn)可以參考A E Brandstorm美國專利1995. 5386032,其中報道了一種通 過使5-甲氧基-2-Κ4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基)_甲硫基]-IH-苯并咪唑與間氯 過氧化苯甲酸在二氯甲烷溶液中在PH 8. 0-8. 6下反應(yīng)，然后加入甲酸烷基酯來合成5-甲 氧基-2-[ 甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基)-甲基]亞磺?；?IH-苯并咪唑(奧美拉 唑)的改良方法。另一參考文獻(xiàn)可以參考C Slemon & BMarcel美國專利1994, 5374730,其中，奧美 拉唑和蘭索拉唑由相應(yīng)的乙酸-硫化物化合物通過氧化過程以形成酰胺亞磺?；衔?， 緊接著通過堿水解為亞磺酰基羧酸酯或鹽以及脫羧作用而產(chǎn)生。還有另一篇參考文獻(xiàn)可以參考K Kyogoku，K Hatayama，S Yokomori，JSawada 和I Tanaka美國專利1978 4085135,其中已經(jīng)描沭了具有抗胃和抗十二指腸潰瘍活件的 2' _(羧基甲氧基)_查耳酮的制備。
還有另一篇參考文獻(xiàn)可以參考K Amin,M Dahlstrom,P Nordberg & IStarke美國 專利2001,6313136其中，取代的咪唑并吡啶衍牛物被報告抑制胃酸分泌并目.因此可以用 于預(yù)防和治療胃腸炎性疾病。還有另一篇參考文獻(xiàn)可以參考N M Gray美國專利2005,6953808其中，光學(xué)純的 (“)泮托拉唑已經(jīng)用于治療人的胃十二指腸潰瘍，同時基本上降低了與泮托拉唑的外消旋 混合物相關(guān)的不良反應(yīng)的伴發(fā)易感性。還有另一篇參考文獻(xiàn)可以參考V C 0 Njar, G T Klus & A M H Brodie, Bioorg. Med. Chem. Lett.(牛物有機(jī)醫(yī)學(xué)化學(xué)書信)1996. 6. 2777其中,已經(jīng)制備甾體17_咪唑 基-和三唑基衍生物作為17-裂合酶抑制劑的候選物。還有另一篇參考文獻(xiàn)可以參考G A Potte, S E Barie,M Jarman & M GRowlands, T. Med. Chem.(醫(yī)學(xué)和化學(xué)雜志)1995. 38. 2403其中，已經(jīng)報告甾體17_吡啶基衍生物(阿 比特龍(abiraterone))作為17-裂合酶抑制劑的活性候選物。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是制備和研究作為潛在的抗胃液分泌和抗?jié)儎┑?-乙酰氧 基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基_2'氯-5甾烯并[17， 16-b]吡啶(5)。本發(fā)明的另一目的是從3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5，17- 二烯(3)的 Vilsmeier甲?；饔弥苽?-乙酰氧基-17乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和 3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)。本發(fā)明的另一目的是由16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-肟的Beckmarm重排合成3_乙 酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2'氯_5_甾烯并[17，16_b] 吡啶(5)。本發(fā)明還有另一個目的是評價與市售的抗胃潰瘍藥物奧美拉唑比較，4和5的H+， K+-ATP酶抑制活性。本發(fā)明還有另一個目的是評價化合物4對H+，K+-ATP酶的抑制的性質(zhì)。本發(fā)明還有另一個目的是研究作為組胺刺激的胃酸分泌的抑制劑的3-乙酰氧 基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)。本發(fā)明還有另一個目的是評價與市售的抗胃潰瘍藥物西咪替丁和奧美拉唑相比， 4對組胺刺激的酸分泌活性的抑制。本發(fā)明還有另一個目的是評價與市售的抗胃潰瘍藥物西咪替丁相比，化合物4在 體內(nèi)抑制大鼠中冷束縛應(yīng)激誘發(fā)的潰瘍的潛力。本發(fā)明還有另一個目的是評價與市售的抗胃潰瘍藥物西咪替丁相比，化合物4在 體內(nèi)抑制幽門結(jié)扎大鼠中胃酸分泌的潛力。本發(fā)明還有另一個目的是評價與市售的抗胃潰瘍藥物奧美拉唑相比，化合物4在 體內(nèi)抑制大鼠中吲哚美辛(indomethacin)誘發(fā)的潰瘍的潛力。發(fā)明概述本發(fā)明涉及作為抗胃液分泌和抗?jié)儎┑?-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲 酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2'-氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的生物 學(xué)評價。
制備包括16-DPA⑴至16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-肟(2)的肟化，2至3_乙酰氧 基-17-乙酰氨基-雄甾-5，17-二烯(3)的Becfcmarm重排，緊接著3至3-乙酰氧基-17-乙 酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16_b]吡 啶(5)的 Vilsmeier 反應(yīng)(圖 1)。附圖簡要說明

圖1 圖1說明了制備化合物4和5的方法。該制備包括如步驟1顯示的16-DPA(1) 至16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯酯-肟( 的肟化作用，如步驟II顯示的式( 化合物至3-乙 酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾_5，17-二烯(3)的Beckmarm重排，緊接著如步驟III顯示的 式⑶化合物至3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰 氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的Vilsmeier反應(yīng)。圖2 化合物4對胃壁細(xì)胞中基礎(chǔ)酸分泌的作用。在指定的濃度下用化合物4處 理壁細(xì)胞混懸液(5xl06細(xì)胞)1小時后測量氨基比林(AP)攝取率的劑量依賴性抑制。CMD 西咪替丁 ；OPZL 奧美拉唑。數(shù)據(jù)代表2-3次測定的平均值，每次測定一式三份地進(jìn)行。圖3 化合物4對胃壁細(xì)胞中組胺(0. ImM)刺激的酸分泌的作用。在指定的濃度 下用化合物4處理壁細(xì)胞混懸液(5xl06細(xì)胞)1小時后測量氨基比林(AP)攝取率的劑量 依賴性抑制。組胺刺激的AP攝取率被認(rèn)為是100%。CMD 西咪替??；OPZL 奧美拉唑。數(shù) 據(jù)代表2-3次測定的平均值，每次測定一式三份地進(jìn)行。圖4 化合物4對大鼠中冷束縛應(yīng)激性潰瘍的作用。動物分成4組。數(shù)據(jù)表示為 均數(shù)士SEM(n = 6)。進(jìn)行Mudent' s非配對t_檢驗(yàn)以評價治療組與未治療對照的均數(shù) 的統(tǒng)計學(xué)顯著差異。*P < 0. 05vs.對照，< 0. 01 vs.對照。圖5:化合物4在幽門結(jié)扎大鼠中的抗分泌作用。動物分成6組。數(shù)據(jù)表示均數(shù) 士 SEM (η = 6)。進(jìn)行Mudent' s非配對t_檢驗(yàn)以評價治療組與未治療對照的均數(shù)的統(tǒng)計 學(xué)顯著差異。*P < 0. 05vs.對照，< 0. 01 vs.對照，< 0. 001 vs.對照。圖6 化合物4對大鼠中吲哚美辛誘發(fā)的潰瘍的作用。動物分成5組。數(shù)據(jù)表示 均數(shù)士SEM(n = 6)。進(jìn)行Mudent' s非配對t_檢驗(yàn)以評價治療組與未治療對照的均數(shù) 的統(tǒng)計學(xué)顯著差異。*P<0. 05vs.對照，**P<0. Olvs.對照。發(fā)明的詳述因此，本發(fā)明提供了一種從16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯⑴同時制備3-乙酰氧 基-17乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2'-氯_5_甾烯并 [17,16-b]吡啶(5)的混合物的方法，且所述方法包括以下步驟(a)使式1的16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯與鹽酸羥胺和磷酸二氫鉀在質(zhì)子溶劑中 在回流下反應(yīng)1-2小時，然后去除溶劑并用碳酸氫鈉中和得到的物質(zhì)從而獲得產(chǎn)物式2的 16-脫氫孕烯醇酮-3-乙酸酯-20-肟，(b)在0-10°C的溫度下用Vilsmeier試劑在氯仿中直接處理16-脫氫孕烯醇酮 乙酸酯-肟O) 2-4小時，然后用氯仿中和并萃取，并用水洗滌，然后干燥并去除溶劑，從 而獲得所需產(chǎn)物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙 酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)；或使上面所述式2化合物與三氯氧磷 (phosphorous oxychloride)在攪拌的條件下在1_15 °C的溫度下反應(yīng)，從而獲得作為 beckmann重排產(chǎn)物的式3的3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄留_5，17- 二烯，并且將上面所述式3化合物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄留-5，17- 二烯與三氯氧磷和二甲基甲酰胺 的混合物在5-25°C的溫度下反應(yīng)2-4小時，并在水中淬滅所述反應(yīng)混合物，從而獲得3-乙 酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基_2'氯-5-甾烯并 [17,16-b]吡啶(5)的混合物，然后用氯仿中和并萃取，用水洗滌，然后干燥和去除溶劑，從 而獲得3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基_2' 氯-5-甾烯并[17,16-b]吡啶(5)的所需混合物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述化合物4和5從步驟 b中獲得的混合物中分離。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述化合物從所述混合物中的分離通過本領(lǐng)域中 任何已知方法完成。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，優(yōu)選的分離方法是在硅膠上的柱色譜法。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，其中使用的式1的16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯是商品 級。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其中步驟(a)中使用的質(zhì)子溶劑是乙醇。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其中步驟(a)中獲得的式2的16-脫氫孕烯醇 酮-3-乙酸酯-20肟的收率在80-90%的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，其中步驟(b)中獲得的3-乙酰氧基-17-乙酰氨 基-16-甲酰-雄甾-5，17-二烯的收率在65-85%的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，其中步驟(b)中獲得的3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯 并[17，16-b]吡啶(5)的收率在80-90%的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，甾體中間體16-DPA(1)可以以高收率轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的 綴合的肟⑵。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，烯酰胺(enamide)3-乙酰氧基_17_乙酰氨基-雄 甾-5，17- 二烯(3)可以通過用三氯氧磷處理由相應(yīng)的甾體綴合的肟2衍生。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，甾體烯酰胺(3)的Vilsmeier反應(yīng)在環(huán)境溫度 下得到3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基_2' 氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，應(yīng)用化合物4或5或其混合物作為抗胃液分泌 和或抗?jié)儎?。還在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含化合物4或5或其 混合物以及藥物佐劑(adjutant)或載體在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，留體衍生物4和5已經(jīng)顯示類似于苯并咪唑衍生物 諸如奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑或埃索美拉唑的抗H+，K+-ATP酶活性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，4和5的抗H+，K+-ATP酶活性在體外與抗胃潰瘍藥 物奧美拉唑進(jìn)行比較。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，化合物4對H+，K+-ATP酶的抑制作用證明在本質(zhì)上 是不可逆的，類似于奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑或埃索美拉唑。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，富含頂膜(apical membrane)和微管泡膜的豬 胃膜用于評價4和5的抗H+，K+-ATP酶活性。
還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，檢驗(yàn)各種濃度的化合物4對新鮮制備的兔胃壁 細(xì)胞的基礎(chǔ)酸分泌的作用。發(fā)現(xiàn)在暴露于遞增的濃度的化合物4時基礎(chǔ)酸分泌僅微小地降 低(圖幻。在相同的試驗(yàn)條件下，H2受體拮抗劑西咪替丁 QOO μ Μ)產(chǎn)生與使用最高濃度 的化合物4(300μΜ)所觀察到的大約相同程度的抑制(僅 10%)。相反，奧美拉唑，一種 H+，K+-ATP酶抑制劑，在20 μ M劑量時產(chǎn)生對基礎(chǔ)酸分泌的強(qiáng)抑制(80-90% )。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，在新鮮制備的兔胃壁細(xì)胞中，進(jìn)一步檢驗(yàn)化合 物4對組胺(0. ImM)刺激的酸分泌的作用。其顯示對組胺刺激的酸分泌的劑量依賴性抑制 (圖3)，IC50值為約130 μ Μ。發(fā)現(xiàn)化合物4在抑制組胺刺激的分泌方面與西咪替丁相比幾 乎是同等有效的。然而奧美拉唑在相同的20 μ M低劑量下產(chǎn)生類似的對組胺刺激的酸分泌 的強(qiáng)抑制作用，如對基礎(chǔ)酸分泌那樣。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，針對大鼠中的冷束縛應(yīng)激性潰瘍模型檢測化合物 4的抗?jié)兓钚??；衔?顯示在50mg/kg體重下有效的體內(nèi)抗?jié)兓钚?。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，針對大鼠中的幽門結(jié)扎誘發(fā)的潰瘍模型研究化合 物4的抗分泌活性?；衔?顯示在體內(nèi)在50mg/kg體重下酸排出量的輕微減小( 33% 抑制)。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，針對大鼠中的吲哚美辛誘發(fā)的潰瘍模型研究了 化合物4的抗?jié)兓钚?。該化合物顯示在10-50mg/kg體重下有效的抗?jié)兓钚裕遗c5mg/ kg奧美拉唑的活性相當(dāng)。還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，甾體烯酰胺(1)的Vilsmeier反應(yīng)在環(huán)境溫度 下得到3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基_2' 氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案建議使用化合物4或5或它們的混合物用作抗胃液分泌 和或抗?jié)儎＿€在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含化合物4或5或它們 的混合物以及藥物佐劑或載體。因此，本發(fā)明提供了作為抗胃液分泌和抗?jié)儎┑?-乙酰氧基-17-乙酰氨 基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基-2'-氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶 (5)的生物學(xué)評價。合成的第一個步驟包括16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯(1)與鹽酸羥胺的肟化反應(yīng)以得 到16-脫氫孕烯醇酮-3-乙酸酯-20-肟O)。在第二個步驟中，2的溶液用三氯氧磷處理， 從而獲得作為Beckmarm重排產(chǎn)物的3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄留-5，17- 二烯(3)。 在第三個步驟中，三氯氧磷和二甲基甲酰胺的混合物用3在環(huán)境溫度下處理以得到3-乙酰 氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧基氯-5-甾烯并 [17，16-b]吡啶(5)的混合物。下面的實(shí)施例通過舉例說明而給出，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為本發(fā)明的范圍。實(shí)施例-I16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟的制備向式1化合物(2. Ommol)在乙醇OOml)中的溶液中加入鹽酸羥胺(5. Ommol)和 磷酸二氫鉀(5.0mmol)，并且反應(yīng)混合物回流1小時。去除溶劑并用碳酸氫鈉中和，得到固體物質(zhì)，該固體物質(zhì)通過由甲醇重結(jié)晶得到肟2，產(chǎn)量為0. 94g(90% )，m. p. 200°C。3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5,17- 二烯(3)16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟(2) (3. Ommol)溶解在三氯氧磷(6ml)中并在5°C 下攪拌。反應(yīng)混合物倒入至水中，用醚中和并萃取。用水洗滌有機(jī)部分，在無水硫酸鈉上干 燥，并且去除溶劑得到作為固體產(chǎn)物的3，其用于下面的步驟中而無需純化。通過式3化合物的Vilsmeier反應(yīng)制備3_乙酰氧基_17_乙酰氨基_16_甲酰-雄 迸_5，17- 二烯(4)和3-乙酰氧,某-2'氯,-5-靴希并「17，16-bl雌(5)氯仿中的0. 55g 3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾_5，17- 二烯(3)用三氯氧磷 和二甲基甲酰胺的混合物在10°C下處理4h。反應(yīng)混合物在水中淬滅，用飽和碳酸氫鈉溶 液中和，并用氯仿萃取，用水洗滌、干燥和去除溶劑從而得到產(chǎn)物的混合物，該產(chǎn)物通過柱 色譜法在硅膠上純化以獲得化合物4和5，收率分別為65%和27%。化合物4 收率65%， mp 236 "C, IR(KBr)v 3338,2940,1732,1625,1600,15000^:^^1^(0)(:13)3 10.80 038, 1H)，9. 50 (s，1H) ,9. 18 (s，1H)，5. 19 (bs，1H)，4· 40 (m, 1H)，2. 02(s，3H)，1. 90(s，3H)，
0.98(s，3H)，2. 35-1. 20(17H，m)；質(zhì)譜m/z 399 (M+)?；衔?5 :收率 27 %，mp 200 °C, 1HNMR(CDCl3)ST-IUda^J = 8Hz) ,6. 76 (d, 1H, J = 8Hz)，5· 20 (bs，1H)，4· 35 (m，1H)，
1.90(s，3H)，1. 05(s，3H)，2· 67-1. 15(17Η, m) ； IR (KBr) ν 2960，1725，1562，1412cm-1 ；質(zhì)譜 m/z 399 (M+)。實(shí)施例-II制備16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟(2)向1 (4. Ommol)在乙醇GOml)中的溶液中加入鹽酸羥胺(10. Ommol)和磷酸二氫 鉀(lO.Ommol)，并且反應(yīng)混合物回流1小時。去除溶劑并用碳酸氫鈉中和，得到固體物質(zhì)， 該固體物質(zhì)通過由甲醇重結(jié)晶得到肟2，產(chǎn)量為0. 93g(90% )，m. p. 200°C。3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5，17- 二烯(3)16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟(2) (6. Ommol)溶解在三氯氧磷(iaiil)中并在 5°C下攪拌。反應(yīng)混合物倒入至水中，用醚中和并萃取。用水洗滌有機(jī)部分，在無水硫酸鈉 上干燥，并且去除溶劑得到作為固體產(chǎn)物的式3化合物，其用于下面的步驟中而無需純化。通過3的Vilsmeier反應(yīng)制備3_乙酰氧基_17_乙酰氨基_16_甲酰-雄甾_5， 17- 二烯⑷和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并「17，16-bl吡啶(5)氯仿中的1. Ilg 3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾_5，17-二烯(3)用三氯氧磷 和二甲基甲酰胺的混合物在10°C下處理證。反應(yīng)混合物在水中淬滅，用飽和碳酸氫鈉溶液 中和，并用氯仿萃取，用水洗滌、干燥和去除溶劑從而得到產(chǎn)物的混合物，該產(chǎn)物通過柱色 譜法在硅膠上純化?；衔?:收率66%，mp236°C和化合物5:收率18%，mp 201°C。實(shí)施例-III制備16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟(2)向式1化合物(4. Ommol)在乙醇GOml)中的溶液中加入鹽酸羥胺(10. Ommol)和 磷酸二氫鉀(10. Ommol)，并且反應(yīng)混合物回流1小時。去除溶劑并用碳酸氫鈉中和，得到固 體物質(zhì)，該固體物質(zhì)通過由甲醇重結(jié)晶得到肟2，產(chǎn)量為0. 93g(90% )，m. p. 200°C。3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5，17- 二烯(3)16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯-20-肟(2) (12. Ommol)溶解在三氯氧磷中并在5°C下攪拌。反應(yīng)混合物倒入至水中，用醚中和并萃取。用水洗滌有機(jī)部分，在無水硫酸鈉 上干燥，并且去除溶劑得到作為固體產(chǎn)物的3，其用于下面的步驟中而無需純化。通過3的Vilsmeier反應(yīng)制備3_乙酰氧基-17-乙酰氨基_16_甲酰-雄甾-5, 17- 二烯⑷和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并「17,16-bl吡啶(5)60ml氯仿中的4. 22g 3_乙酰氧基_17_乙酰氨基-雄甾-5，17- 二烯(3)用三氯 氧磷(55ml)和二甲基甲酰胺(55ml)的混合物在10°C下處理2_4h。反應(yīng)混合物在水中淬 滅，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，并用氯仿萃取(3x20ml)，用水洗滌、干燥和去除溶劑從而得 到產(chǎn)物的混合物，該產(chǎn)物通過柱色譜法在硅膠上純化。化合物4 收率65%，mp 235°C和化 合物 5 收率 20%,mp200°Co體外牛物學(xué)評價3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5. 17- 二烯⑷和 3-乙酰氧某-2'氯,5-階I希并「17，16-bl吡啶(5)的質(zhì)子泵抑制活件富含頂膜和微管泡膜的豬胃膜如文獻(xiàn)中所述制備(S Bandopadhyay, PK Das, M V Wright, J Nandi, D Bhattacharya & T K Ray, J. Biol. Chem.(生物學(xué)和化學(xué)雜志)1987， 262, 5664) 0剝脫豬胃的基底粘膜區(qū)并粉碎以收集富含壁細(xì)胞的級分。勻漿組織在5000xg 下離心8min，上清液在37%蔗糖上成層并在100，OOOxg下離心41/2h。收集在界面中出現(xiàn)的 主要膜帶，用勻漿緩沖液稀釋并在110，OOOxg下再離心90min。含有富含Η+，Κ+_ΑΤΡ酶的頂 膜和微管泡膜的沉淀物懸浮在適當(dāng)?shù)木彌_液中并且在-80°C下保存用作酶來源。這些膜顯 示K+-刺激的H+-運(yùn)輸ATP酶活性，其可特異性地被奧美拉唑阻斷，奧美拉唑是一種胃H+， K+-ATP酶的不可逆抑制劑。H+，K+-ATP 酶活性在 37°C下在 Iml 含有 2mM MgCl2,2mM ATPUOmM PIPES (pH 6.8)、 20mM KCl和10-15 μ g膜蛋白的反應(yīng)混合物中測量。在與ATP開始反應(yīng)之前，測定混合物在 不同濃度的4、5或奧美拉唑的存在下預(yù)溫育15min。溫育IOmin后，通過加入Iml冰冷卻的 TCA(14% )終止反應(yīng)。K+-刺激的活性，稱為H+，K+-ATP酶，計算為在存在Mg+2加K+的條件下的活性和在 單獨(dú)存在Mg+2的條件下的基礎(chǔ)活性(Mg+-ATP酶)之間的差值。該膜顯示約40-50 □ moles Pi/mg/h的高K+-刺激活性，而基礎(chǔ)活性僅為約lOymol Pi/mg/h。釋放的無機(jī)磷酸鹽根據(jù) 報道的步驟來定量(H Sanui，Anal. Biochem.(分析生物化學(xué))1974，60，489)并且評價4和 5的作用。作用以H+，K+-ATP酶的抑制百分比進(jìn)行定量并與奧美拉唑進(jìn)行比較。處于1口] 、5口]\1、1(^]\1禾口 100 μ M濃度范圍的3_乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲 酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的胃質(zhì)子 泵(H+，K+-ATP酶)抑制活性與奧美拉唑在體外進(jìn)行比較(表1)。標(biāo)準(zhǔn)藥物奧美拉唑在相似 的試驗(yàn)條件下在3 μ M和30 μ M的濃度范圍內(nèi)顯示約20-80%抑制。而發(fā)現(xiàn)5對H+，K+-ATP 酶的抑制是極小的，4的活性促進(jìn)作為胃質(zhì)子泵抑制劑。4對H+，K+-ATP酶的抑制觀察到是 劑量依賴性的。對4計算的IC5tl值為18 μ Μ，對于奧美拉唑?yàn)榧s6 μ Μ，這可以被認(rèn)為意味 著奧美拉唑的效力是4的大約三倍。4對H+，K+-ATP酶的抑制性質(zhì)在一些方面進(jìn)行了研究。 固定濃度(10 μ Μ)的化合物4針對不同濃度的富含H+，K+-ATP酶的蛋白(5和20 μ g)的不 同抑制程度表明該抑制作為在本質(zhì)上是不可逆的(參見表幻。在另一個試驗(yàn)中，在與底物 ATP開始酶促反應(yīng)之前，膜結(jié)合酶用化合物4(10 μ M)預(yù)處理0和30min (表3)。由于酶與 化合物4的接觸時間較長引起的較高的抑制程度提供了進(jìn)一步的證據(jù)，即該分子充當(dāng)不可逆的抑制劑，類似于奧美拉唑，后者已知是胃H+，K+-ATP酶的不可逆抑制劑。表1 :4和5的抗胃質(zhì)子泵活性
權(quán)利要求
1.一種從16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯(1)同時制備3-乙酰氧基-17乙酰氨基-16-甲 酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2'-氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的混合 物的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使式1的16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯與鹽酸羥胺和磷酸二氫鉀在質(zhì)子溶劑中在回流 下反應(yīng)1-2小時，然后去除溶劑并用碳酸氫鈉中和得到的物質(zhì)從而獲得產(chǎn)物式2的16-脫 氫孕烯醇酮-3-乙酸酯-20-肟；(b)在0-10°C的溫度下用Vilsmeier試劑在氯仿中直接處理16-脫氫孕烯醇酮乙酸 酯-肟(2) 2-4小時，然后用氯仿中和并萃取，并用水洗滌，然后干燥并去除溶劑，從而獲得 所需產(chǎn)物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基-2' 氯-5-留烯并[17，16-b]吡啶(5)；或使上面所述式2化合物與三氯氧磷在攪拌的條件下在 1-15°C的溫度下反應(yīng)，從而獲得作為beckmarm重排產(chǎn)物的式3的3-乙酰氧基-17-乙酰氨 基-雄留-5，17- 二烯，并且將上面所述式3化合物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-雄甾-5， 17- 二烯與三氯氧磷和二甲基甲酰胺的混合物在5-25°C的溫度下反應(yīng)2-4小時，并在水中 淬滅反應(yīng)混合物，從而獲得3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄留-5，17- 二烯(4) 和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的混合物，然后用氯仿中和并萃取， 用水洗滌，然后干燥和去除溶劑，從而獲得3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5， 17- 二烯(4)和3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并[17，16_b]吡啶(5)的所需混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將所述化合物4和5從步驟b 中獲得的混合物中分離。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用的式1的16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯是商品級的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)中使用的質(zhì)子溶劑是乙醇。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)中獲得的式2的16-脫氫孕烯醇酮-3-乙 酸酯-20肟的收率在80-90 %的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中獲得的3-乙酰氧基-17-乙酰氨 基-16-甲酰-雄甾-5，17-二烯的收率在65-85%的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中獲得的3-乙酰氧基-2'氯-5-甾烯并 [17,16-b]吡啶(5)的收率在80-90%的范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中化合物4和5當(dāng)與奧美拉唑相比時，體外顯示胃質(zhì)子 泵抑制劑的潛在活性，所述奧美拉唑是一種臨床上用于治療胃腸炎性疾病的藥物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中化合物4與奧美拉唑(在30μ M濃度下80%抑制) 相比，體外顯示在100 μ M濃度下對H+，K+-ATP酶的75%抑制，并且顯示劑量依賴性地抑制 組胺刺激的酸分泌，其IC5tl值與西咪替丁相當(dāng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中化合物4在10mg/kg體重下顯示與奧美拉唑相當(dāng)?shù)?優(yōu)異的針對吲哚美辛誘發(fā)的潰瘍的體內(nèi)抗?jié)兓钚?75%保護(hù))。
11.化合物4或5或其混合物作為抗胃液分泌和或抗?jié)儎┑膽?yīng)用。
12.—種藥物組合物，包含化合物4或5或其混合物以及藥物佐劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為胃質(zhì)子泵抑制劑的3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-16-甲酰-雄甾-5，17-二烯(4)和3-乙酰氧基2′-氯-5-甾烯并[17，16-b]吡啶(5)的制備和生物學(xué)評價以及它們與一種臨床上采用的抗胃潰瘍藥物奧美拉唑的比較。化合物(4)顯示劑量依賴性地抑制胃壁細(xì)胞中組胺刺激的酸分泌，其IC50值與西咪替丁相當(dāng)。在化合物(4)的1g/Kg體重的單劑量水平下沒有觀察到瑞士白化病小鼠的死亡率或行為異常?；衔?4)還顯示優(yōu)異的針對吲哚美辛誘發(fā)的潰瘍的體內(nèi)抗?jié)兓钚浴?br> 文檔編號A61P1/04GK102066396SQ200980118933
公開日2011年5月18日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者安納拉克西米·欽尼亞, 帕魯初里·甘加達(dá)爾·勞, 普拉塔普·庫瑪·達(dá)斯, 羅梅什·錢德拉·博魯瓦, 蘇查德拉·戈斯瓦米, 蘇迪普·庫瑪·卡爾, 莫約里瑪·博特庫爾, 馬登·喬帕·巴爾塔庫爾 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會