專利名稱：用于誘導移植耐受的干細胞組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明基本上涉及一種從脂肪組織中獲得間充質干細胞(MSC)的新方法及其與 來源于骨髓和外周血的造血干細胞和間充質干細胞相組合而用于產生“移植耐受”(即不使 用/盡可能少地使用免疫抑制藥物進行移植)的用途。
背景技術：
移植已成為因器官衰竭而垂危的患者的可行治療方式。遺憾的是，所有這些患者 都必須終身接受免疫抑制藥物治療。尋找器官供體、支付其費用和術后護理的這整個過程 不僅讓人在情感上疲憊不堪，而且費用對于普通印度家庭來說也無法承受。即使他們能夠 渡過所有這些難關，感染和/或惡性腫瘤形式的并發(fā)癥也經常使患者失去移植器官和生 命。這些問題的唯一合理答案是不使用/盡可能少地使用免疫抑制藥物進行移植(耐受)。因此我們在1998年8月認真開始著手我們對耐受的研究。我們研究的主要課題 是在器官移植前對受者進行供體干細胞移植。成功的干細胞移植將保護移植器官免受排斥 而無需任何免疫抑制藥物。我們繼續(xù)調整我們的耐受研究方案，直到產生了一個安全有效 的方案。50年來，包括Peter Medawar爵士(諾貝爾獎獲得者)在內的眾多醫(yī)學家在不同 的動物模型中研究“耐受”課題。這些課題中沒有一個能夠成功轉移到人模型上，因為人的 免疫生物學情況要比動物復雜得多，因此很難在人中完成相同的工作。我們高興地在此聲 明，我們(IKDRC-ITS的Ahmedabad課題組)已經有超過1000名患者在最低免疫抑制條件 下跨越MHC屏障進行了移植(即不需要考慮與供體的遺傳相容性和免疫匹配)(稱為近似 耐受(prope tolerance))。他們中的大部分已沒有任何問題地獲得了穩(wěn)定充分的移植物功 能，并且他們中的一些已經過上了正常生活而無需任何免疫抑制藥物。這項研究的主要優(yōu) 點是使因器官衰竭而垂危的患者獲得新生，而且只需極少的花費。但是我們無法獲得可再 現(xiàn)的結果。問題在于無法得到足夠數(shù)量的MSC以改善造血干細胞(HSC)移植并因此產生更 好的耐受。我們發(fā)現(xiàn)脂肪組織是獲得充足數(shù)量MSC的便利來源。因此我們調整了我們的研 究，并開發(fā)了從器官供體脂肪組織中分離MSC的自有技術。發(fā)明目的和
發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的是為可常規(guī)用于產生移植“耐受”的只能得自供體的間充質干 細胞(MSC)找到充分的替代性來源。本發(fā)明的另外一個目的是開發(fā)一種從選定來源中分離 和分化MSC的實用方便的方法。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種不同干細胞的組合物以 及實現(xiàn)最期望和一致結果的患者給藥方法。本發(fā)明首次描述了脂肪組織源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干細胞 (PBSC)的新組合物，其能幫助產生移植耐受(以極低劑量的免疫抑制藥物達到穩(wěn)定充分的 同種異體移植物功能且排斥反應極低/沒有排斥反應)。這些細胞使用我們自有的網膜靜脈套管插入(omental veincanulation)技術通 過小切口開腹術移植到門脈循環(huán)中。這些細胞在非清髓最小條件下移植到受者中，其中使用供體特異性白細胞輸注、針對受者的抗T細胞和抗B細胞抗體，并在移植干細胞前對受者 的膈下淋巴結、部分骨盆和臀部骨骼及胸腰椎進行1000CGY的靶標特異性照射。這是首次不使用任何異種材料就在體外從人脂肪組織中產生間充質干細胞MSC。 之前有通過使用異種材料從胚胎干細胞或者臍帶血或骨髓(BM)產生MSC的報道。然而從 未有過不使用異種遺傳材料而產生MSC。發(fā)明詳述 在我們連續(xù)的研究中，我們觀察到MSC改善了 HSC移植，并且脂肪組織是MSC的良 好的、容易獲得的可利用來源。除了脂肪組織，MSC不能從其他任何來源中大量獲得。我們開發(fā)了從器官供體的脂肪組織分離和培養(yǎng)MSC的新技術。我們成功地用一個 獨特的干細胞組合(即脂肪組織源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干細胞(PBSC)) 來產生移植耐受。耐受與移植骨髓中約10%的HSC相關。PBSC是T淋巴細胞的豐富來源， 后者也是干細胞移植所必需的。MSC的角色是HSC的老大哥。它們發(fā)揮腳手架的作用，協(xié)助 HSC在器官之間的趨化運輸。根據(jù)國際細胞治療學會間充質和組織干細胞委員會的規(guī)定，MSC在標準培養(yǎng)條件 下維持時必須具備塑料粘附性，它們必須顯示出朝向脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞的分 化潛能，它們必須陽性表達⑶90、⑶73和⑶105標志物，同時它們必須不表達造血細胞譜系 的標志物，包括⑶45、⑶；34、⑶14、⑶lib、⑶四、HLA-DR、c_kit。我們的細胞系符合上述標準。脂肪組織源性MSC (hAD-MSC)的作用是劑量依賴性的，細胞植入時需要 hAD-MSC HSC的比例為1 20，該比例越高，植入效果越好。我們的結果證實了這些實驗
室結論。之前通過不同策略使用藥物和造血干細胞誘導移植耐受的嘗試都是不成功的。這 是用獨特干細胞組合實現(xiàn)移植耐受的首次成功嘗試。這些細胞使用我們自有的網膜靜脈套管插入術技術通過小切口開腹術移植到門 脈循環(huán)中。這些細胞在非清髓最小條件下移植到受者中，其中使用供體特異性白細胞輸注、 針對受者的抗T細胞和抗B細胞抗體，并在移植干細胞前對受者的膈下淋巴結、部分骨盆和 臀部骨骼及胸腰椎進行1000CGY的靶標特異性照射。因此，該脂肪組織源性MSC、骨髓源性HSC和MSC以及外周血干細胞PBSC的獨特組 合物是在上述條件(抗T/B細胞抗體和靶標特異性照射)產生移植相關的移植耐受所必需 的。開發(fā)T IUTfe術并用于從H旨Ife組iR中IBr集禾時吝養(yǎng)MSC細朐,。技術從脂肪組織收集后分離MSC 在獲得知情同意后，在局部麻醉下，在供體臍下左側做小切口，然后從腹前壁切除 1.5克脂肪組織。確保止血后縫合。將該脂肪組織收集在下述培養(yǎng)基中1. 20ml α -MEM2. 5ml，20%人白蛋白
3. 20 μ 1，青霉素(200000 單位 /ml)4. 20 μ 1，鏈霉素(200000 單位 /ml)5. 10 μ 1，頭孢噻月虧(lgm/5ml)6· 10μ 1，氟康唑，100mg/dl。用刀將脂肪組織切成碎末。然后將其轉移到每IOml中加入IOmg I型膠原酶的上 述培養(yǎng)基中。然后放置在35RPM的搖床上37°C孵育1小時進行消化。將在培養(yǎng)皿中處理的 全部培養(yǎng)基內含物轉移到15ml離心管中，780RPM離心8分鐘。將上清液和沉淀用上述培 養(yǎng)基分別培養(yǎng)在IOOcm2和25cm2細胞+培養(yǎng)皿(Sarsted，USA)中，在37°C、5% CO2下培養(yǎng) 8天。將細胞傳代3次(每隔一天更換培養(yǎng)基)，在第3次傳代結束時，用IN磷酸鹽緩沖液 (PBS)清洗，再通過胰酶消化(0. 25%胰蛋白酶EDTA溶液，用0. 25%胰蛋白酶和0. 2% EDTA 鈉鹽粉末制成，HiMedia, India)收集細胞。檢查所收集細胞的活性、無菌性和細胞計數(shù)并進行流式細胞術分析。進行 ⑶45 (Per CP)陰性和⑶90 (PE)陽性測試。將這些細胞與培養(yǎng)的骨髓和外周血干細胞PBSC 混合，將全部內含物輸注到門脈循環(huán)中。發(fā)明結果以下為患者詳細信息用MSC+BMSC+PBSC講行腎移棺的患者總數(shù)60年齡33.5 (范圍8-59)歲性別男性女性49 11供體年齡46. 4 (范圍:20-67)歲HLA 匹配0/6 2，1/6 11，2/6 10，3/6 28，4/6 5，5/6 2，6/6 2所輸注干細胞的信息BM CD34+平均倌0. 23 (范圍0· 01-4. 01)(標準差-0. 37)CD45-/90+ 平均倌BM 0. 42 (范圍0. 02-0. 84)(標準差-0. 23)BM+MSC 21. 67 (范圍3· 06-63. 73)(標準差 MSC-18. 3)(這些在 PBSC 中不存在)MSC+BM CD45-/73+平均倌(在單獨的BM中沒有發(fā)現(xiàn))6. 39 (范圍0. 1-23. 82)(標準差 6. 37)隨訪情況天數(shù)99.86(19-184)血清肌酸酐(mg%) :1.27 (0. 63-2. 3)(標準差0. 32)嵌合性用熒光原位雜交(FISH)檢測:7.2% (范圍5_14· 7% )CD3dim(天然抑制細胞):2.92% (范圍1. 47-5. 14% )(標準差1. 33)CD 19+:0. 33(范圍0· 01-1. 53% )(標準差0· 47)CD 25+ 0. 49(范圍0· 21-1. 06% )(標準差0· 26)
權利要求
1.用于在接受移植的患者中產生移植耐受的組合物，其包含從合適供體獲得的人脂肪 組織源性間充質干細胞(MSC)、骨髓源性間充質干細胞(MSC)和造血干細胞(HSC)以及外周 血干細胞(PBSC-HSC)。
2.權利要求1的組合物，其中細胞植入所需的人脂肪源性間充質干細胞(hAD-MSC)與 造血干細胞(HSC)的優(yōu)選比例為1 20或更高。
3.權利要求1或2的組合物，其用于施用給接受腎移植的患者。
4.權利要求1、2和3的組合物，其用于施用給患者，優(yōu)選通過輸注經門脈循環(huán)施用。
5.用于在接受移植的患者中產生“移植耐受”的方法，其通過施用、優(yōu)選輸注有效濃度 的組合物來實現(xiàn)，該組合物包含從合適供體獲得的人脂肪組織源性間充質干細胞(MSC)、骨 髓源性間充質干細胞(MSC)和造血干細胞(HSC)以及外周血干細胞(PBSC)。
6.權利要求5的治療方法，其中細胞植入所需的人脂肪源性間充質干細胞(hAD-MSC) 與造血干細胞(HSC)的優(yōu)選比例為1 20或更高。
7.權利要求5和6的方法，其中患者接受的移植類型為腎移植。
8.權利要求1的組合物，其中所述人脂肪組織源性間充質干細胞(MSC)是通過基本無 需異種材料的方法分離的，所述方法包括以下步驟a)從供體的腹前壁切除約1.5克脂肪組織，b)將脂肪組織收集在含有MEM、人白蛋白、抗生素和至少一種抗真菌劑的培養(yǎng)基中，c)將脂肪組織切成碎末，并且將其轉移到含有I型膠原酶的步驟b所述培養(yǎng)基中，d)在搖床上孵育和消化約1小時，e)將以上從培養(yǎng)皿中轉移到離心管中進行離心，f)將上清液和沉淀分別在37°C、5%CO2的條件下培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中的上述培養(yǎng)基中，優(yōu) 選培養(yǎng)8天，g)將細胞傳代3次，每隔一天更換培養(yǎng)基，h)用合適緩沖液清洗后通過胰酶消化收集上述細胞，i)收集細胞并檢查活性、無菌性和數(shù)目，并進行流式細胞術分析，CD45、CD90測試。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡單、經濟但高效的方法，其能在器官移植患者體內產生移植物耐受，而無需持續(xù)使用昂貴的有嚴重副作用的免疫抑制藥物。本發(fā)明基本上涉及對患者施用新組合物，所述組合物由脂肪組織源性間充質干細胞(MSC)與骨髓源性造血干細胞(HSC)和MSC以及外周血干細胞(PBSC)組合而成。這有助于產生移植物耐受，即通過極低量的免疫抑制藥物產生穩(wěn)定充分的同種異體移植物功能而使排斥反應盡可能低/不發(fā)生。本發(fā)明還涉及一種無需任何任何異種材料而從人脂肪組織中分離間充質干細胞的簡單方法。
文檔編號A61K35/14GK102065871SQ200980117407
公開日2011年5月18日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權日2008年3月15日
發(fā)明者H·L·特里維迪, 阿魯娜·瓦尼卡 申請人:H·L·特里維迪博士移植科學研究所, Smt.G.R.多斯及Smt.K M瑪塔腎病研究所及研究中心