專利名稱：：一種含櫻黃素的藥物組合物及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物組合物及其用途，具體涉及含紅車軸草素(Pratensdn)、櫻黃素(Prunetin)的藥物組合物及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：異黃酮類成分廣泛存在于植物中，具有多種生物活性，如抗癌、降低血脂、植物雌性激素樣作用、提高機體免疫力等作用，有關(guān)黃酮類成分的相關(guān)研究一直為國內(nèi)外學(xué)者所重視并不斷深入。紅車軸草(TrifoliumpretenseL.)又名三葉草、紅花苜蓿等，多用作牧草，全草中含多種黃酮和異黃酮類成分化合物，現(xiàn)代藥理研究證明，紅車軸草具有顯著的生物活性，已報道的活性有1、雌性激素樣作用該植物中含有多種異黃酮類成分具有雌性激素樣作用，如鷹嘴豆芽素(biochanin)A和B(即芒柄花素formononetin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)等，但上述異黃酮的雌激素樣作用均弱，當(dāng)然也有研究認(rèn)為鷹嘴豆芽素B作用最弱或無活性。2、抗癌作用有報告稱本品水提物給大鼠灌服或注射，能抑制肉瘤S45的生長；其中所含染料木素對人鼻咽癌KB細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。3、降血脂作用報告表明染料木素能降低血清中甘油三酯及膽固醇的作用，而鷹嘴豆芽素A也能抑制血清膽固醇升高，大豆素也顯示明顯的降脂作用。4、其它作用有文獻報道本品有抗病原微生物作用，其中所含三葉豆紫檀甙有抗真菌的作用。目前為止，報道的紅車軸草總黃酮或紅車軸草提取物多以鷹嘴豆芽素A和B為主要組成成分，或兼帶少量染料木素、大豆素，其中的紅車軸草素、櫻黃素的含量甚微，一般沒有列入含量檢測范圍，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為R4Q、OR1(1)鷹嘴豆芽素A(biochanin)鷹嘴豆芽素B(formononetin)大豆素(daidzein)染料木素(genistein)紅車軸草素(pratensein)櫻黃素(prunetin)到目前為止，還未見國內(nèi)外對紅車軸草素、櫻黃素或其苷類作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的研究報道以及相關(guān)醫(yī)藥應(yīng)用方面的報道。R2R3R4MeOHHHMeHHHHHHHHOHHHMeOHHHHOHHMe
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種含紅車軸草素和/或櫻黃素的藥物組合物，通過選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用，具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松和癌癥等作用。本發(fā)明紅車軸草素和/或櫻黃素以經(jīng)典的E-SCREEN法測定雌激素樣活4性，顯示出二者均可促進MCF-7細(xì)胞的增殖，具有雌激素樣作用，活性為藥物雌二醇的10'5-10—3。本發(fā)明紅車軸草素和/或櫻黃素在心血管系統(tǒng)和骨骼中對某些雌激素應(yīng)答性組織發(fā)揮選擇性作用。體外試驗也證實二者均可顯著地促進成骨細(xì)胞的增殖，并可顯著增加細(xì)胞基質(zhì)鈣和礦化結(jié)節(jié)鈣。顯示具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)疾病和骨質(zhì)疏松癥方面可發(fā)揮作用。本發(fā)明動物實驗還發(fā)現(xiàn)紅車軸草素或櫻黃素的毒性很低，大劑量使用時動物的行為也無任何顯著變化。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述通式(1)紅車軸草素、櫻黃素為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的紅車軸草素和/或櫻黃素和藥物組合物可用于制備治療癌癥、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松、心腦血管疾病和藥物先導(dǎo)化合物的藥物。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑等。其制劑形式包括各種固體劑型及液體劑型。另外還可以在組合物中加入其它輔劑和香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的紅車軸草素、櫻黃素可以藥物組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或胃腸外、局部用藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油性懸浮劑等或其它液體制劑如糖漿等；用于胃腸外時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。局部給藥時，可將其制成霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、皮下植入劑等。優(yōu)選的形式是片劑、緩釋片劑、包衣片劑、膠囊、鼻噴霧劑、皮下植入劑，特別優(yōu)選在腸道的特定部位緩釋的制劑。本發(fā)明的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的生產(chǎn)方法制備，例如使紅車軸草素和/或櫻黃素活性成份與一種或多種載體混合，根據(jù)不同適應(yīng)癥選擇不同給藥途徑將其制成臨床應(yīng)用所需的合適劑型。本發(fā)明的藥物組合物的活性成份是紅車軸草素，櫻黃素，優(yōu)選含有重量比為0.1%_99.5%的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5%-95%的活性成分。本發(fā)明的活性成份的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等調(diào)整，其每日給藥劑量為lmg-4mg/kg，可以一次或多次施用。下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。實施例1紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)的雌激素樣活性本實驗以MCF-7雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞為生物測試載體，采用經(jīng)典的E-SCREEN法測定其雌激素樣活性。本實驗設(shè)DMSO溶劑對照組(陰性)、lnM雌二醇對照組(陽性)、紅車軸草素組(luM、10uM)、櫻黃素組(luM、10uM)。結(jié)果顯示紅車軸草素、櫻黃素能顯著的促進MCF-7細(xì)胞的增殖，具有雌激素樣作用，但其活性僅為雌二醇的1(T5-1(T3。實施例2紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)與雌激素受體相互作用的分子模擬采用計算機輔助藥物設(shè)計方法，以雌激素受體(ERP，ERct)作為靶標(biāo)模型，以分子力學(xué)優(yōu)化的方法獲得pratensein和prunetin分子的活性構(gòu)象，用分子對接程序計算受體與配基間的相互作用。結(jié)果顯示pratensein及prunetin均可進入雌激素受體的結(jié)合腔，結(jié)果還提示二者與ERP的結(jié)合力要比與ERa的結(jié)合力強7—10倍。另外，分子上某些位置被取代，對其活性有一定影響。6由于人體ERP和ERa存在組織分布上的差異，ERP主要存在于腦、骨骼、膀胱和血管上皮組織，提示pratensein及prunetin可能在心血管系統(tǒng)和骨骼中對某些和ERa雌激素應(yīng)答性組織發(fā)揮選擇性作用。實施例3紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響取新生1-3天SD大鼠頭蓋骨用酶消化法分離成骨細(xì)胞，第三代細(xì)胞經(jīng)MTT法、甲基百里香酚藍(MTB)比色法觀察紅車軸草素、櫻黃素對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增值、細(xì)胞基質(zhì)鈣及礦化結(jié)節(jié)鈣的影響。結(jié)果顯示紅車軸草素、櫻黃素0.1-10umol/L濃度均能顯著地促進成骨細(xì)胞增殖，并能顯著增加細(xì)胞基質(zhì)鈣和礦化結(jié)節(jié)鈣。具體結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01與control比較；AP<0.05，AAP<0.01與NaF比較實施例4紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用pratensein和prunetin與雌激素受體相互作用的分子模擬結(jié)果提示，pratensein、prunetin均極有可能為一選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，結(jié)合對選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑現(xiàn)有的研究成果，因此pratensein及prunetin極有希望開發(fā)成為預(yù)防或治療與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與癌癥有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與絕經(jīng)期相關(guān)疾病有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與心腦血管系統(tǒng)疾病，保護心血管功能藥物，并以各種劑型使用或各種給藥途徑用于臨床。實施例5紅車軸草素、櫻黃對l:l)的組合物(樣品I)對卵巢切除大鼠的影響以30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔給藥麻醉，大鼠備皮，摘除兩側(cè)卵巢，術(shù)后休養(yǎng)9天后開始給藥。大鼠分為四組，正常組、模型組、樣品I100mg/kg組，雌激素50微克/kg組，每日給藥。持續(xù)30天。給藥20日起，大鼠每日陰道涂片10天，觀察生理周期。用200微升的移液槍吸取50微升0.9%的生理鹽水注射液，注入陰道，回吸灌洗液，玻片均勻涂片。晾干后瑞士染液、Giemsa染液染色，400倍電子顯微鏡下進行分類計數(shù)。給藥30日后，取血清，在動物全自動生化分析儀上測定血清甘油三酯、總膽固醇。測定大鼠血清雌激素、孕激素含量。樣品I對卵巢切除大鼠血清甘油三酯、總膽固醇的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>研究發(fā)現(xiàn)，藥物有降低甘油三酯和總膽固醇的趨勢。預(yù)實驗結(jié)果表明，樣品I對卵巢切除大鼠的子宮重量、陰道生理周期變化、血清甘油三酯、總膽固醇等，都有一定的作用。注樣品I表示的是紅車軸草素、櫻黃素(1:1)的組合物實施例6樣品I對維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用。大鼠隨機分為6組，正常對照組、模型對照組、樣品I低、中、高劑量組、陽性對照組，除正常對照組外，各組大鼠均口服維甲酸70mg/kg，服用量lml/100g大鼠，每天1次，連續(xù)14天，同時每天各組大鼠依次口服以下樣品，正常對照組、維甲酸模型組為相應(yīng)溶劑10ml/kg、樣品I低劑量組4mg/kg、中劑量組12mg/kg、高劑量組36mg/kg、陽性藥羥乙基膦酸鈉50mg/kg，服用量均為lml/100g大鼠，每天1次，連續(xù)28天，其間每周稱體重1次，以體重調(diào)整給藥用量。給藥結(jié)束，取血分離血清，按試劑盒方法測S-Ca、S-P含量，取大鼠雙側(cè)股骨，在X線骨密度儀掃描，測出骨密度(g/cm2)，稱骨重(W)，測骨長(L)，骨直徑(D)，計算骨表觀線密度(W/L)、表觀面密度(W/IrD)，然后ll(TC烘干一小時，再置于馬福爐內(nèi)200、400、600、80(TC各灰化2小時，灰化結(jié)束冷卻后，稱灰重(Wash.g)，用6NHC1提取后測骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca或P的克數(shù)表示。另一側(cè)股骨頭用3Q/。HN03脫鈣后作石蠟切片，HE染色，顯微鏡下測骨小梁寬度。以上結(jié)果均以給藥組與模型組比較，模型組與正常對照組比較。實驗當(dāng)天及第1周內(nèi)各組動物體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，給藥后2、4周維甲酸模型組體重比正常對照組體重減輕(P<0.01、P<0.05)，但用藥后各組動物體重均明顯增加，其中低劑量組(4mg/kg)有體重增加但無統(tǒng)計意義，而樣品I樣品I中、高劑量組(12mg/kg、36mg/kg)及羥乙基膦酸鈉組大鼠第2、4周的體重均比模型組增加(P<0.05)，各劑量組相互比較無明顯差異。模型組大鼠股骨骨密度比正常對照組低(PO.Ol)，血清Ca含量也較模型組低(P<0.05)，血清磷含量變化不大，但用藥組大鼠股骨密度都比模型組增加(P<0.05、PO.Ol)，血清鈣及磷的含量均較模型組升高，但樣品I中、高劑量組無明顯差異。陽性藥羥乙基膦酸鈉的大鼠股骨骨密度及血清鈣血清磷含量也比模型組有明顯的差異(P<0.05、P<0.01)。樣品I對維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松癥預(yù)防作用的骨指數(shù)影響如下與對照組比較，模型組的W、L、d、W/L、W/Ld均明顯下降，相對于模型組樣品I中、高劑量組及羥乙基膦酸鈉組的W、W/Ld均明顯提高與對照組比較，模型組的骨灰重及灰分中骨Ca及骨P含量均降低，但用藥后樣品I中、高劑量組及羥乙基膦酸鈉組骨灰重、骨Ca、骨P含量均相對增加實施例7片劑制備方法活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，活性成分含量10mg。實施例8膠囊制備方法將活性成分與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量50mg。實施例9注射制備方法將活性成分與氯化鈉9mg溶解于適量注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓶中，活性成分含量10mg。實施例10鼻噴霧劑制備方法活性成分1mg，氯化鈉8mg，EDTAlmg，磷酸鈉緩沖液(pH6-7)10mg，多乙氧基醚10mg，重蒸鎦水加至2ml，攪拌下于適當(dāng)體積的重蒸鎦水中每次加入一種成分，加水至2ml.后，將該溶液在無菌過濾器上過濾，裝入瓶中并按照適當(dāng)?shù)膭┝糠指簟?quán)利要求1、櫻黃素在制備預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥、心腦血管系統(tǒng)疾病或癌癥藥物中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥。3、櫻黃素在制備選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑或藥物先導(dǎo)化合物中的應(yīng)用。4、一種藥物組合物，其特征是該藥物組合物包括作為活性成分的櫻黃素。5、如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為固體劑型或液體劑型。6、如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為口服、鼻吸入、直腸或胃腸外，或局部用藥的藥物劑型。7、如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述的口服的藥物劑型為片劑、粉齊u、粒齊u、膠囊劑、水性懸浮劑、油性懸浮劑或糖漿；所述的鼻吸入的藥物劑型為鼻噴霧劑；所述的胃腸外的藥物劑型為注射用的溶液、水性懸浮劑或油性懸浮劑；所述的局部給藥的藥物劑型為霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑或皮下植入劑。8、如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于所述的片劑為緩釋片劑或包衣片劑。9、如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物的劑型為在腸道的特定部位緩釋的制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種含紅車軸草素和/或櫻黃素的藥物組合物，通過體內(nèi)廣泛分布的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用，具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)和骨質(zhì)疏松等作用。還用于制備治療癌癥和藥物先導(dǎo)化合物的藥物?？梢酝ㄟ^口服、鼻吸入、直腸或胃腸外、局部用藥的方式施用于需要這種治療的患者，每日給藥劑量為1mg-4mg/kg，可以一次或多次施用。制劑多樣如固體制劑、液體制劑、霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、皮下植入劑等。尤其在腸道部位作用的緩釋片劑、包衣片劑等。文檔編號A61P9/00GK101669935SQ200910206250公開日2010年3月17日申請日期2005年10月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日發(fā)明者華茉莉,方建平申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;上海先導(dǎo)藥業(yè)有限公司