專利名稱：：一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因表達的siRNA及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA，siRNA的核苷酸序列及含有siRNA的重組載體，以及它們的用途。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)錄因子Spl(Specificityprotein1)是一種DNA結(jié)合蛋白，是第一種被克隆和純化的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Sp/Kiippel樣轉(zhuǎn)錄因子家族，其主要特征是含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)。它由3個保守的Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)相互特異結(jié)合而形成，鋅指之間可能參與蛋白之間的相互作用。通常認(rèn)為Spl以細胞和啟動子的特異性方式調(diào)控GC伏擊區(qū)啟動子的基因表達，雖然Spl自發(fā)現(xiàn)以來就被認(rèn)為是一種基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄因子，但越來越多的證據(jù)表明它是控制細胞功能的上游基因，受Spl調(diào)節(jié)的下游基因眾多，它廣泛的參與和調(diào)節(jié)一系列的生物功能，包括細胞生長、分化和腫瘤的發(fā)展與演進等。由于通過抑制上游因子的表達可以抑制下游多種基因的表達。因此，針對上游轉(zhuǎn)錄因子的靶向治療已成為研究的熱點。腫瘤分子靶向治療的特點是高效、特異、安全。但是腫瘤基因靶向治療面臨的最大問題是缺乏腫瘤高特異性的相關(guān)基因和無毒、高效的基因治療載體。小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)具有嚴(yán)格的序列特異性、高效性和生物遺傳性，可以特異、高效地阻斷體內(nèi)同源基因表達，促使同源mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi)。自RNAi現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)后，因其操作簡單、特異性高、能迅速而方便地使某個基因失去功能等特點，獲得了生物學(xué)家的青睞而首先被應(yīng)用于功能基因組和反向遺傳學(xué)的研究。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對缺乏轉(zhuǎn)錄因子Spl基因的特異性抑制劑的不足，提供一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA及抑制所用的重組載體和方法，所述的siRNA特異性地在mRNA水平靶向Spl基因，有效抑制Spl表達，使腫瘤細胞增殖減慢，瘤體生長受到明顯抑制。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA，所述的siRNA對應(yīng)的耙序列是人轉(zhuǎn)錄因子Spl基因編碼區(qū)的mRNA，所述的siRNA的長度為1630bp。所述的siRNA的長度較佳的為1825bp。更佳的，所述的siRNA是由下述核苷酸序列序列的任意一種或幾種A:5'-GGTGCAAACCAACAGATTA-3，3'—CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5，B:5'-CCAACAGATTATCACAAAT-3，3'-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5，C:5'-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3'3'-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5'A由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2組成，B由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4組成，C由SEQIDNO.5由SEQIDNO.6組成。siRNA的核苷酸序列由正義鏈和反義鏈組成，SEQIDNO.l是正義鏈，SEQIDNO.2是反義鏈，SEQIDNO.3是正義鏈，SEQIDNO.4是反義鏈，SEQIDNO.5是正義鏈，SEQIDNO.6是反義鏈。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種重組載體，其含有如上所述的編碼抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA。根據(jù)本發(fā)明，所述的重組載體所用的載體可以是本領(lǐng)域常規(guī)的載體，包括各種質(zhì)粒，本發(fā)明優(yōu)選pGCsi3.OGFP質(zhì)粒。將所述siRNA片段連接到載體如pGCsi3.OGFP質(zhì)粒中，即得本發(fā)明的重組載體。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是一種轉(zhuǎn)錄因子Spl基因沉默的細胞，含有如上所述的重組載體。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之四是一種如上所述的轉(zhuǎn)錄因子Spl基因沉默的細胞的制備方法，包括將如上所述的的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的方法，優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。本發(fā)明中，所述的重組載體含有編碼抑制Spl基因表達的siRNA，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞后，轉(zhuǎn)錄出siRNA，降解Spl的mRNA，使宿主細胞內(nèi)源的Spl基因沉默。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之五是一種如上所述的siRNA的用途，用于制備轉(zhuǎn)錄因子Spl抑制劑，或者用于制備治療或預(yù)防轉(zhuǎn)錄因子Spl相關(guān)疾病的藥物組合物，如治療或抑制腫瘤的藥物、肝癌靶向藥物等。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之六是一種藥物組合物，至少包括一種如上所述的抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA為活性成分和一種藥用載體。所述的載體是常規(guī)的藥用載體，如填充劑、稀釋劑和賦形劑等。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明的siRNA序列能夠有效降解轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因的mRNA，從而特異性抑制Sp1基因的表達。一方面，本發(fā)明提供的siRNA序列，可用于制備與Spl基因相關(guān)疾病的治療藥物，如腫瘤、細胞凋亡相關(guān)疾病。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和有益效果。圖l是測序結(jié)果圖。圖2是載體構(gòu)建示意圖。圖3是轉(zhuǎn)染后在熒光倒置顯微鏡下觀察的轉(zhuǎn)染率。A，轉(zhuǎn)染24h后；B，轉(zhuǎn)染48h后。圖4是對照組的瞬時轉(zhuǎn)染率。圖5是siRNA24h組的瞬時轉(zhuǎn)染率。圖6是siRNA48h組的瞬時轉(zhuǎn)染率。圖7是CCK8法檢測細胞增殖率。圖8是各組間WesternBlot分析結(jié)果。1.Huh-7,2.Huh-7/Neg-siRNA，3.Huh-7/Spl-siRNA。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明所述的"室溫"是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。實施例1針對轉(zhuǎn)錄因子Spl的siRNA序列的設(shè)計1、寡居核苷酸的設(shè)計與合成根據(jù)Gennbank中報道的Spl核苷酸序列(NM-138473)，針對Spl基因編碼區(qū)選取19個核苷酸作為siRNA作用靶點，共選擇3條靶序列，各設(shè)計1條19nt的隨機寡居核苷酸序列。該個siRNA對Spl基因的作用靶序列見表1。表1.SiRNA耙序列序列位置15'-CAGGTGCAAACCAACAGATTATTCAAGACGTAATCTGTTGGTTTGCACCTG-3'721-73925'-AACCAACAGATTATCACAAATTTCAAGACGATTTGTGATAATCTGTTGGTT-3'729-74735'-GAGGAAGTGGAGGCAACATCATTCAAGACGTGATGTTGCCTCCACTTCCTC-3'751-769由上海吉凱基因技術(shù)公司化學(xué)分別合成序列如下3條寡聚核苷酸A:5，-GGTGCAAACCAACAGATTA-3，(SEQIDNO.1)，3'-CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5'(SEQIDNO.2)，作用于轉(zhuǎn)錄因子SplmRNA的第721-739位；B:5，-CCAACAGATTATCACAAAT-3，(SEQIDNO.3)，3'-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5'(SEQIDNO.4)，作用于轉(zhuǎn)錄因子SplmRNA的第729-747位；C:5，-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3，(SEQIDNO.5)，3'-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5，(SEQIDNO.6)，作用于轉(zhuǎn)錄因子SplmRNA的第751-769位。2、寡聚核苷酸的退火將上述3條寡聚核苷酸分別用無菌雙蒸水溶解，溶液濃度為1.5mg/ml。各取1相互配對的寡聚核苷酸加入20iU退火緩沖液(1Ommol/LTris，pH7.5，50mmol/LNaCl，lmmolEDTA)。在PCR擴增儀上進行退火，退火程序為90。C4min—85°C4min—80°C4min—75°C4min—70°C10min—65°ClOmin—60°C5min，然后緩慢降至室溫，-20。C保存。3、退火后的產(chǎn)物進行核苷酸測序，結(jié)果見圖1。實施例2含有針對轉(zhuǎn)錄因子Spl的siRNA的質(zhì)粒構(gòu)建1、實驗材料T4連接酶，pGCsi3.0GFP質(zhì)粒，大腸桿菌DH1013，含卡那霉素的LB培4/9頁養(yǎng)液，質(zhì)粒抽取試劑盒；購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司。2、實驗方法將實施例1退火后的寡聚核苷酸與pGCsi3.0GFP質(zhì)粒酶切片段用T4連接酶連接過夜后，再轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌DH1013，在含有卡那霉素的瓊脂糖平板上過夜生長，隨機挑取單個菌落，放入含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中擴增，并提取質(zhì)粒，命名為siSpl/pGCsi3.0GFP。制成含熒光蛋白GFP的siSpl/pGCsi3.0GFP。3、實驗結(jié)果載體構(gòu)建示意圖見圖2。實施例3培養(yǎng)陽性克隆的Huh-7/Spl-siRNA細胞1、實驗材料Huh-7人肝癌細胞株(上海腫瘤研究所)，標(biāo)記有綠色熒光蛋白(GFP)的Huh-7人肝癌細胞株，DEDM(高糖)培養(yǎng)液，胰蛋白酶，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒HilyMax，10%胎牛血清；購自日本Dojindo公司。2、實驗方法1)細胞培養(yǎng)Huh-7系肝癌細胞系，貼壁生長，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，用10%胎牛血清、100iig/ml青霉素及100iig/ml鏈霉素的DEDM(高糖)培養(yǎng)液，在37°C、5%C02飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，選用活力良好，臺盼藍測定活細胞數(shù)>90%，處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。2)轉(zhuǎn)染前一天將處于對數(shù)生長期的細胞以100000個/孔(細胞密度為50%)接種于24孔板，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。3)在2個1.5ml滅菌E卯endorf管中配置對照液，配方如下DEDM(高糖)培養(yǎng)液30ii1，SplsiRNA空載體質(zhì)粒(即pGCsi3.OGFP)0.5iig，和HilyMax2ii1。在22個1.5ml滅菌E卯endorf管中配置轉(zhuǎn)染液，配方如下DEDM(高糖)培養(yǎng)液30ii1，SplsiRNA質(zhì)粒(即siSpl/pGCsi3.OGFP)0.5iig，和HilyMax2ii1。4)混合上述溶液直至澄清透明，并于室溫下靜置15min。5)將前一天所接種的24孔板中的培養(yǎng)液棄掉，每孔加入含10%胎牛血清、無任何抗生素的DE匿(高糖)培養(yǎng)液200iil，輕輕混勻。6)A1，A4孔加入步驟3)所配置的對照液，其余22孔加入轉(zhuǎn)染液，并輕輕混勻。7)將24孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后取出。8)棄去各孔中的培養(yǎng)液，每孔加入含10%胎牛血清，無任何抗生素的DE匿(高糖)培養(yǎng)液200iil，輕輕混勻。9)將24孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h之內(nèi)在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。10)24h后將此24孔板中的A1_A3，B1_B3，Cl-C3和Dl-D3孔細胞逐孔用胰酶消化，并置于15ml離心管中1000rpm，7min離心，棄去上清液，用PBS液洗滌一次，再次1000rpm，7min離心，PBS液洗滌，取出lml以備流式檢測轉(zhuǎn)染率。11)48h后將此24孔板中的A4-A6，B4-B6，C4-C6和D4-D6孔細胞逐孔用胰酶消化，并置于15ml離心管中1000rpm，7min離心，棄去上清液，用PBS液洗滌一次，再次1000rpm，7min離心，PBS液洗滌，取出lml以備流式檢測轉(zhuǎn)染率。3、實驗結(jié)果3.l對于Huh-7細胞，24h后轉(zhuǎn)染率見圖3A，48h后轉(zhuǎn)染率見圖3B。3.2經(jīng)過流式細胞儀檢測，對照組見圖4、表2，siRNA24h組見圖5、表3，siRNA48h組見圖6、表4，48h轉(zhuǎn)染效率明顯增加。表2表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.3轉(zhuǎn)染了SplsiRNA的Huh-7細胞命名為Huh-7/Spl-siRNA細胞，由上?？党巧锕こ逃邢薰竞Y選，選擇陽性細胞克隆繼續(xù)以上條件培養(yǎng)。同時設(shè)計以下隨機序列，作為陰性對照(Neg2siRNA):正義鏈5，-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3，，反義鏈3'-AAGAGGCTTGCACAGTGCA-5'。按照實施例1、2、3相同的步驟條件將該對照序列導(dǎo)入Huh-7細胞。轉(zhuǎn)染了對照序列的Huh-7細胞命名為Huh-7/Neg-siRNA細胞。下面通過效果實施例來進一步說明本發(fā)明的有益效果。效果實施例1針對轉(zhuǎn)錄因子Spl的siRNA對Huh_7肝癌細胞增殖的影響1、實驗材料Huh-7細胞，Huh-7/Spl-siRNA細胞，Huh-7/Neg-siRNA細胞，10%胎牛血清，DEDM(高糖)培養(yǎng)液，胰蛋白酶，CCK8細胞增殖試劑盒(購自日本Dojindo公司)。2、實驗方法2.1將Huh-7細胞，Huh-7/Spl-siRNA細胞，Huh-7/Neg-siRNA細胞分別接種于無菌培養(yǎng)瓶中，用含10X胎牛血清、100iig/ml青霉素及100iig/ml鏈霉素的DEDM(高糖)培養(yǎng)液，在37°C，5%C02飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，選用活力良好，臺盼藍測定活細胞數(shù)>90%，處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。2.2取處于對數(shù)生長期的Huh-7細胞，Huh-7/Spl-siRNA細胞和Huh-7/Neg-siRNA細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以每孔約104個細胞接種于96孔板，分為12h、24h、36h、48h、72h共5組，每組設(shè)6個復(fù)孔，到時間點后每孔加入10ylCCK8試劑，置于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后選擇450nm波長，酶標(biāo)儀測定各孔的吸收度值(A)，各測定3次，取平均值。計算細胞增殖率，并制作增殖曲線。3、實驗結(jié)果在細胞培養(yǎng)開始后，Huh-7/Spl-siRNA細胞增殖較為緩慢，在24h以前，Huh-7/Neg-siRNA細胞及Huh-7/Spl-siRNA細胞的增殖無顯著性差異(P>0.05)，而24h之后，兩者的差異才有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05=，具體見表5，圖7。表5.CCK8法檢測細胞增殖率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、結(jié)論通過siRNA抑制Spl表達，可見腫瘤細胞生長受到抑制，Spl在細胞生長中起重要作用，siRNA有抑制腫瘤細胞增殖的作用。效果實施例2針對轉(zhuǎn)錄因子Spl的siRNA對瘤組織轉(zhuǎn)錄因子Spl表達的影響1、實驗材料3只4-6周齡，體重20-25g，雌雄不限的BALB/CSPF級裸鼠，Huh-7細胞，Huh-7/Spl-siRNA細胞，Huh-7/Neg-siRNA細胞。2、實驗方法2.1肝癌實體瘤裸鼠荷瘤模型的建立隨機選取3只4-6周齡，體重20-25g，雌雄不限的BALB/CSPF級裸鼠。將Huh-7細胞，Huh-7/Spl-siRNA細胞，Huh-7/Neg-siRNA細胞三種細胞培養(yǎng)24h，經(jīng)臺盼藍染色和細胞計數(shù)，制備成活細胞比率大于90>%，細胞濃度約為1.5X106/ml的單細胞懸液。于每只裸鼠右前肢略上部位分別皮下接種Huh-7、Huh-7/Spl-siRNA、Huh-7/Neg-siRNA細胞懸液各O.2ml，并于腹部作不同染色以標(biāo)記。以皮下結(jié)節(jié)直徑超過O.5cm為瘤標(biāo)準(zhǔn)，SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。4周后頸椎脫臼法處死所有動物，75%酒精消毒，剝?nèi)∧[瘤，選取外圍生長良好、無變性壞死、半透明魚肉狀的瘤組織，于生理鹽水中切成1.5-2mm2大小的瘤塊。2.2瘤組織的種植與獲取隨機選取BALB/CSPF級裸鼠24只，4-6周齡，體重20_25g，雌雄不限。隨機分為3組，分別為Huh-7組、Spl-siRNA組、Neg-siRNA組(每組8只)。用20號套管針吸取2.1步驟中的瘤塊一塊，接種于每只裸鼠的右前肢略上部的皮下。以動物接種瘤塊為實驗起點，接種后每天觀察接種部位有無破潰紅腫出血，每3天用游標(biāo)卡尺測腫瘤長(L)寬徑(W)，觀察腫瘤體積變化，按V(mm3)=LXW2/2換算出腫瘤的近似體積。4周后頸椎脫臼法處死所有動物，置入動物體內(nèi)生物發(fā)光成像系統(tǒng)中觀察腫瘤生長情況，然后75%酒精消毒，剝?nèi)∧[瘤，并測量體積，均選取外圍生長良好、無變性壞死、半透明魚肉狀的瘤組織，于生理鹽水中切成1.5-2mm2大小的瘤塊。2.3瘤組織轉(zhuǎn)錄因子Spl表達的測定隨機選取2.2步驟各組織中的瘤塊4塊，送至上?？党巧锕こ逃邢薰緦α鼋M織中的轉(zhuǎn)錄因子Spl進行WesternBlot分析。3結(jié)果3.1瘤組織轉(zhuǎn)錄因子Spl表達的測定將動物模型中瘤體分別提取細胞總蛋白，Westernblot檢測Spl蛋白的表達變化。檢測結(jié)果表明，與空白組及陰性對照組相比，Huh-7/Spl-siRNA的Spl蛋白變化已被顯著抑制。見圖8。各細胞株中作為蛋白上樣量標(biāo)定的P-actin蛋白無明顯變化。3.2裸鼠皮下瘤生長情況，見表6。表6.三組裸鼠皮下瘤生長情況組別7天14天21天28天1132.40±15.32179.63±19.74204.35±5.68252.70±17.682128.54±13.61167.70±10.83202.10±7.37262.38±16.273110.75±11.64143.92±9.30187.53±11.58248.77±20.37注1，Huh-7組；2，Huh-7/Neg-siRNA組；3，Huh-7/Spl-siRNA組。4結(jié)論siRNA通過抑制瘤組織Spl的表達，從而抑制胰腺癌、腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤組織的生長。序列表〈110〉王理偉〈120〉一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA及其用途8/9頁:0117]:om]:oii9]<130〉P4-091596C〈160>6〈170〉Patentlnversion:0120]〈210〉1:0121]〈211〉21:0122]〈212〉DNA:0123]〈213>Artificial(人工序列):0124]〈220〉:0125]〈223〉siRNA正義鏈:0126]〈400〉1:0127]ggtgcaaaccaacagatta19:0128]〈210>2:0129]〈211〉21:0130]〈212〉DNA:0131]〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列):0132]〈220〉:0133]〈223〉siRNA反義鏈:0134]〈400〉2:0135]taatctgttggtttgcacc19:0136]〈210>3:0137]〈211>21:0138]<212〉DNA:0139]〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列):0140]〈220〉:0141]〈223>siRNA正義鏈:0142]〈400〉3:0143]ccaacagattatcacaaat19〈210〉4〈211>21〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列)〈220〉〈223〉siRNA反義鏈〈400>4atttgtgataatctgttgg19〈210〉5〈211〉21〈212>DNA〈213>Artificial(人工序列)〈223>siRNA正義鏈〈400>5gg朋gtgg3ggC朋C3tC319〈210>6〈211>21〈212>DNA〈213〉A(chǔ)rtificial(人工序列)〈220〉〈223〉siRNA反義鏈〈400>6tgatgttgcctccacttcc19權(quán)利要求一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因表達的siRNA，其特征在于，所述的siRNA對應(yīng)的靶序列是人轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因編碼區(qū)的mRNA，所述的siRNA的長度為16～30bp。2.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA是由下述核苷酸序列序列的任意一種或幾種A:5'-GGTGCAAACCAACAGATTA-3，3'-CCACGTTTGGTTGTCTAAT-5，B:5'-CCAACAGATTATCACAAAT-3，3'-GGTTGTCTAATAGTGTTTA-5，C:5'-GGAAGTGGAGGCAACATCA-3，3'-CCTTCACCTCCGTTGTAGT-5'。3.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的核苷酸序列由正義鏈和反義鏈組成，SEQIDNO.1是正義鏈，SEQIDNO.2是反義鏈，SEQIDNO.3是正義鏈，SEQIDNO.4是反義鏈，SEQIDNO.5是正義鏈，SEQIDNO.6是反義鏈。4.一種重組載體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求13任一項所述的抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA。5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體所用的載體是pGCsi3.OGFP質(zhì)粒。6.—種轉(zhuǎn)錄因子Spl基因沉默的細胞，其特征在于，含有如權(quán)利要求4或5所述的重組載體。7.—種如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)錄因子Spl基因沉默的細胞的制備方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求4或5所述的的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。8.—種如權(quán)利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制備轉(zhuǎn)錄因子Spl抑制劑，或者用于制備治療或預(yù)防轉(zhuǎn)錄因子Spl相關(guān)疾病的藥物組合物。9.一種如權(quán)利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制備胰腺癌、腸癌、胃癌、肝癌等腫瘤抑制劑中的應(yīng)用。10.—種藥物組合物，其特征在于，至少包括一種如權(quán)利要求1所述的抑制轉(zhuǎn)錄因子Spl基因表達的siRNA為活性成分和一種藥用載體。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因表達的siRNA，所述的siRNA的長度為16～30bp。本發(fā)明還公開了含有該siRNA的重組載體，該重組載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染宿主細胞，即得到Sp1基因沉默的細胞。本發(fā)明的siRNA序列能夠有效降解轉(zhuǎn)錄因子Sp1基因的mRNA，從而特異性抑制Sp1基因的表達。一方面可用于制備與Sp1基因相關(guān)疾病的治療藥物，如腫瘤、細胞凋亡相關(guān)疾病，另一方面對于研究Sp1蛋白在肝癌中的作用和肝癌的治療具有重要的意義。文檔編號A61K31/713GK101701217SQ20091019899公開日2010年5月5日申請日期2009年11月18日優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日發(fā)明者王理偉申請人:王理偉