專利名稱：：一種抗剛地弓形蟲表面抗原1人源抗體Fab片段及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及抗剛地弓形蟲抗原抗體，具體涉及一種抗剛地弓形蟲表面抗原l(SAG1)人源抗體Fab片段及其編碼基因和用途。
背景技術(shù)：
：剛地弓形蟲(7bxo/7/做wago"&7)簡稱弓形蟲，屬于頂復(fù)門、真球蟲目、弓形蟲科，是一種世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病原蟲，可引起人獸共患的弓形蟲病(toxoplasmosis)。免疫缺損者(如惡性腫瘤、器官移植和應(yīng)用免疫抑制劑患者，以及免疫缺陷者)感染弓形蟲后，導(dǎo)致腦膜炎、肝炎、肺炎等嚴(yán)重的全身性弓形蟲病，甚至死亡。由于弓形蟲病是艾滋病患者的最重要并發(fā)癥之一，近些年來隨著艾滋病感染率的升高，弓形蟲病發(fā)病率也不斷增高。據(jù)調(diào)查，30%-40%的艾滋病患者伴有弓形蟲病，弓形蟲腦炎已成為艾滋病患者死亡的重要原因之一。研究顯示，初孕婦女感染弓形蟲后，可以經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)，畸胎或死胎。受感染的新生兒往往患有先天性弓形蟲病而出現(xiàn)各種畸形及智力發(fā)育不全等癥狀，嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育。目前臨床上治療弓形蟲病仍以傳統(tǒng)的磺胺嘧啶、乙胺嘧啶和葉酸的聯(lián)合用藥為主，雖然具有一定的療效，但療程過長，往往由于其抑制骨髓、損害肝臟、易出皮疹等嚴(yán)重副作用而被迫停止用藥。尤其是弓形蟲腦炎、先天性弓形蟲病以及免疫缺陷病人不能耐受長期化療，而停藥后復(fù)發(fā)率高，根治效果差。由于弓形蟲為專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，因而阻斷其對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵，從而可以控制其感染的發(fā)生和發(fā)展，這是被動(dòng)免疫作用防治弓形蟲的有效機(jī)制之—。SAG1作為弓形蟲速殖子表膜表面的主要抗原之一，是迄今研究最多的弓形蟲表膜蛋白。研究顯示，SAG1主要分布于弓形蟲速殖子表膜、速殖子內(nèi)以及納蟲空泡的管狀結(jié)構(gòu)中，僅占弓形蟲體總蛋白的3%5%，卻可抑制患者血清中50%的抗體活性，說明SAG1含量雖然少，卻是速殖子的主要抗原成分，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原，其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgE、IgA及SIgA多種抗體?？筍AGl抗體在體外具有抑制弓形蟲速殖子感染宿主細(xì)胞及殺蟲作用，在體內(nèi)也具有保護(hù)作用，并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，如Y-干擾素、白細(xì)胞介素等。Mineo等用滅活的抗SAG1的鼠血清和抗SAG1單克隆抗體的Fab片段進(jìn)行抗體中和抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示抗SAG1血清和單克隆抗體都可抑制87%的弓形蟲強(qiáng)毒株RH株入侵人體成纖維細(xì)胞，對(duì)弓形蟲弱毒株P(guān)Tg也有60%作用，而對(duì)于SAG1缺陷株僅有10-20%的抑制效果。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)兩株抗SAG1抗體6A8和JS能夠抑制弓形蟲的生長，其抑制生長作用隨著抗體濃度的增加而增強(qiáng)。在體外，抗SAG1IgG還可以與人體血清中的C3補(bǔ)體相結(jié)合，從而激活人體血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)，溶解弓形蟲速殖子，導(dǎo)致蟲體死亡。因此，抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段，即可成為弓形蟲病治療的抗體耙向藥物，也可以預(yù)防弓形蟲感染的抗體藥物。目前，研究實(shí)踐所得到的抗SAG1多克隆抗體和單克隆抗體多為鼠源抗體或兔源抗體。鼠源抗體和兔源抗體由于具有免疫源性，在應(yīng)用于人體可引起機(jī)體針對(duì)異種蛋白的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生人抗鼠抗體或人抗兔抗體，既影響療效，又可誘發(fā)過敏反應(yīng)，因而難以應(yīng)用于臨床。雖然可以通過抗體工程技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行人源化改造，但技術(shù)過程繁雜，耗時(shí)耗力，短期難以取得成效；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物亦有價(jià)格昂貴、產(chǎn)量受限等問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段及其編碼基因。本發(fā)明所述的人源Fab抗體選自抗剛地弓形蟲人源免疫球蛋白基因文庫。本發(fā)明提供了下述能編碼識(shí)別剛地弓形蟲SAG1人源Fab片段及其編碼基因，然而產(chǎn)生本發(fā)明的基因序列的方法不受特別的限制。(1)抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段的輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))和恒定區(qū)(C區(qū));(2)抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段的重鏈(H鏈)可變區(qū)(V區(qū))和恒定區(qū)1(C區(qū)1)。所述的L鏈含有如SEQ1列出的氨基酸序列。編碼所述的L鏈的氨基酸序列的DNA如下SEQ1:L鏈基因DIVMTQSPSTLSASVGDRVT1GACATCGTCATCACCCAGTCTCCTTCCACCCTCTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCITCRASQAIEDDLDWYQQKP61ATCACTTGCC7雄706^C077K^^CTGGTATCAGCAGAAACCAGKAPKRLVYGASNLORGVPS121GGTAAAGCCCCTMGCGCCTGGTTTATWS7ra釘7g6M4fiCGGGTCCCGTCARFSGSGSGTEFTLTISSLQP181AGATTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACCGAGTTCACTCTCACAATCAGTAGCCTGCAGCCTEDFATYYCLQHHSYPWTFGQ241GAAGATTTTGCAACATATTACTGTC7^6^"ra77rrr爿OT6TC6T孤GCCAAGTRVDIKRTVAAPSVFIFPP301GGGACCAGGGTGGACATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCASDEQLKSGTASVVCLLNNFY361TCTGATGAGCAGTTGAMTCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATPREAKVQWKVDNALQSGNSQ421CCCAGAGAGGCCMAGTACAGTGGMGGTGGATMCGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGESVTEQDSKDSTYSLSSTLT481GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCMGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGLSKADYEKHKLYACEVTHQG541CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCLSSPVTKSFNRGEC601CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT所述的H鏈含有如SEQ3列出的氨基酸序列。編碼所述的H鏈的氨基酸序列的DNA如下SEQ3:H鏈基因MAEVKLLESGGGLVQPGGSL1ATGGCCGAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGRLSCAASGFTFSSYAMSWVR61AGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGC4gC71/J7ffOH7UACTGGGTCCGCQAPGKGLEWVSVIYSGGSST121CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA《77J77r席7^0YYADSVKGRFTISRDNSKNT181膨附(506"釘6T(腦6Km:GGTTCACCATCTCCAGAGATMTTCCAAGMCACGLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK241CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATKDNWNFYFDYWGQGTLVTV301層扁fi4Z4^C鵬盧7T(T釘7T6^萌GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCSSASTKGPSVFPLAPSSKST361TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCSGGTAALGCLVKDYFPEPVT421TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ481GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT541TCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCQTYICNVNHKPSNTKVDKKI5601CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACMGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGMAATTVPRD661GTGCCCAGGGAT所列的SEQ1和SEQ3的序列中，用下劃線標(biāo)記的序列是框架區(qū)FR(frameworkregion,FR)序歹U，斜體序列是互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)序歹廿。含有編碼本發(fā)明的抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段基因的質(zhì)粒載體構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)部分。本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒載體，含有編碼所述的重鏈V區(qū)的DNA和所述的輕鏈V區(qū)的DNA，它能插入編碼本發(fā)明的抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段的基因。本發(fā)明的質(zhì)粒不受特別限制，優(yōu)選pFab-His2。表達(dá)本發(fā)明的抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段的宿主細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)部分。本發(fā)明提供了一種大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞為宿主細(xì)胞，它能表達(dá)本發(fā)明的抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段。本發(fā)明的宿主細(xì)胞不受特別的限制。本發(fā)明通過構(gòu)建抗剛地弓形蟲人源免疫球蛋白基因文庫并經(jīng)過克隆印跡法、ELISA、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)、測(cè)序分析等從所述抗剛地弓形蟲人源免疫球蛋白基因文庫中篩選得到具有抗凝活性的抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段，命名為Toxl403L-llH，而后進(jìn)行了大量的表達(dá)純化及進(jìn)一步的鑒定。在本發(fā)明的實(shí)施中，篩選能表達(dá)抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段的質(zhì)粒載體的方法不受特別的限制，可通過例如免疫印跡、ELISA等進(jìn)行選擇。本發(fā)明的實(shí)施中，純化抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段的方法不受特別的限制，但首選是通過表達(dá)蛋白上攜帶的6XHisTag經(jīng)Ni-NTA柱純化。本發(fā)明所制備的單克隆抗體鑒定的方法不受特別限制，如聚丙烯酰胺凝膠電泳、Westernblotting等。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有上述的Fab片段為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述人源Fab抗體的用途。所述的抗體Fab片段可用于制備防治弓形蟲病的抗體藥物和抗體靶向藥物。與鼠源抗弓形蟲SAG1抗體相比較，本發(fā)明的抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段能夠特異性識(shí)別弓形蟲速殖子重組表面抗原1(SAG1)并有與之具有較高的親和力，同時(shí)可以與弓形蟲速殖子特異性識(shí)別。如能進(jìn)一步證實(shí)弓形蟲速殖子表面抗原l(SAG1)的高親和力可以抑制弓形蟲速殖子對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵，從而阻斷弓形蟲感染，則對(duì)弓形蟲病的治療和預(yù)防具有重要的應(yīng)用價(jià)值。動(dòng)物源性單克隆抗體制備技術(shù)雖已普及，但應(yīng)用于人體時(shí)可引起人抗異源性抗體發(fā)應(yīng)，雖可通過抗體人源化技術(shù)得以改進(jìn)，但過程繁雜，耗時(shí)耗力，短期難以取得成效。本發(fā)明利用抗體庫技術(shù)，在體外制備具有高親和力的完全人源性工程抗體，獲得抗剛地弓形蟲SAGl人源抗體Fab片段，由于無Fc段，在發(fā)揮抑制弓形蟲入侵宿主細(xì)胞作用的同時(shí)，不會(huì)激活補(bǔ)體和引起人體免疫反應(yīng)等病理損害，應(yīng)用于人體安全可靠。圖1質(zhì)粒載體pFabl-His2。圖2熒光顯微鏡下觀察陽性克隆Toxl403L-llH與弓形蟲速殖子的IFA結(jié)果。圖3陽性克隆Toxl403L-llH輕鏈可變區(qū)CDR、FR劃分。圖4陽性克隆Toxl403L-llH重鏈可變區(qū)CDR、FR劃分。圖5陽性克隆Toxl403L-llH表達(dá)產(chǎn)物提純后10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中，M.PrecisionPlusProteinStandard;1.鎳離子親和層析純化Fab片段。圖6Fab片段重、輕鏈片段的WesternBlot檢測(cè)，其中，M.PrecisionPlusProteinStandard;1.考馬思亮藍(lán)染色；2,HRP標(biāo)記His-probe反應(yīng)；3:HRP標(biāo)記抗人IgGFab抗體反應(yīng)；4:HRP標(biāo)記抗人kchain抗體反應(yīng)。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例更具體的說明本發(fā)明。實(shí)施例l.構(gòu)建抗體庫采用弓形蟲腦炎患者的外周抗凝血5ml，以Ficoll-Paque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)分離淋巴細(xì)胞，以試劑盒(QIAGENGmbH,Hilden，Germany)提取總RNA。將總RNA用Gene-AmpRNAPCR試劑盒(Perkin-ElmerCetus,Norwalk,Conn)錄成cDNA，并以人IgG輕重鏈可變區(qū)保守序列的上、下游引物(Invitrogen)(表l)進(jìn)行免疫球蛋白y、k、X鏈基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(QIAGENGmbH,Hilden，Germany)提純后，分別以AcI和MzeI(NEWENGLANDBioLabs)雙酶切k鏈和X鏈產(chǎn)物。酶切后的k鏈和人鏈產(chǎn)物與人免疫球蛋白Fab表達(dá)載體pFab-His2(圖l)連接，隨后電轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109(Takara,中國大連)中，構(gòu)成輕鏈庫。分別以S力I和iVort(NEWENGLANDBioLabs)對(duì)輕鏈庫及Y鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切修飾，連接反應(yīng)后，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌JMI09中，構(gòu)成3xl06的非依賴性克隆滴度的抗體庫。表1是人IgG輕重鏈可變區(qū)保守序列的上下游引物序列。表lk<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中引物方向?yàn)?'至3'，下劃線部分表示酶切位點(diǎn)，符號(hào)M代表核苷酸A或C;Y代表C或T;W代表A或T;R代表A或G;H代表A或C或T;S代表C或G;K代表T或G。實(shí)施列2弓形蟲速殖子表面抗原l(SAG1)的重組表達(dá)SAG1是誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)的主要靶抗原，其具有高度免疫原活性及免疫保護(hù)性。全長的SAG1蛋白由319個(gè)氨基酸組成，分子量約為30kDa。研究證實(shí)SAG1蛋白的N端信號(hào)肽和C端疏水性序列不具有抗原性。本發(fā)明首先合成編碼SAG1蛋白所需的cDNA，通過PCR擴(kuò)增183870位堿基間的基因片段(氨基酸位點(diǎn)為61289)。該基因片段經(jīng)過7WfeI和WoI酶切純化后，與pET19b(Novagen)載體相連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中，將獲得的陽性克隆進(jìn)行序列分析，將正確序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21star(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞(Novagen)，經(jīng)異丙基-卩-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工)誘導(dǎo)表達(dá)，提取包涵體蛋白，并進(jìn)行蛋白復(fù)性(根據(jù)Novagen的包涵體蛋白提純方法)，其分子量為28.9kDa。以提純的重組蛋白0.5ng/100pl包被酶標(biāo)板，檢測(cè)重組蛋白的特異性和敏感性。當(dāng)稀釋度為l:400時(shí)，病人血清反應(yīng)的OD49o值為1.035士0.002,而正常對(duì)照為0.240士0.003。提示該重組抗原可以用于抗剛地弓形蟲免疫球蛋白抗體庫的篩選。實(shí)施例3.抗剛地弓形蟲人免疫球蛋白G的篩選取3xl()S的非依賴性克隆滴度的抗體庫DNA10ng，轉(zhuǎn)化10C^1JM109大腸桿菌，將菌液涂布在Luriabroth(10gsodiichloridum,10gtryptone,5gyeastextract/L,PH7)平板(含氨芐青霉素50ng/ml)上，37。C培養(yǎng)7小時(shí)，待克隆(約5"03個(gè)克隆/90mm直徑平板)直徑為0.3mm左右時(shí)，以直徑為82mm硝酸纖維素膜(Armacia/Pharmacia)覆于平板上，待克隆完全轉(zhuǎn)移至膜上，將膜置于含1.0mMIPTG的LB平板上，30。C誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白(100mMTris-HCl[pH7],150mMNaCl，5mMMgCl2，1.5%BSA,1mgofDNase,40mglysozyme/ml)對(duì)膜進(jìn)行溶菌。經(jīng)洗滌除去膜上殘留的細(xì)菌碎片等，以牛血清白蛋白(BSA)封閉，與400ng純化的重組蛋白反應(yīng)，隨后分別與陽性血清、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgGFc抗體(ICNPharmaceuticals,Aurora,Ohio)反應(yīng)，顯色(HRP-1000，KonicaCo,Tokyo,Japan)。每次以48張膜進(jìn)行篩選，在膜上發(fā)現(xiàn)深染的克隆都作為陽性克隆，此為克隆印跡法?；驈目贵w庫中取10ngDNA，轉(zhuǎn)化100plJM109大腸桿菌，挑取轉(zhuǎn)化所得的每3個(gè)單個(gè)克隆至2ml含氨芐青霉素的superbroth培養(yǎng)基(30gtryptone，20gyeastextract,10g3-(N-moipholino)propanesulfonicacid[MOPS]/L，pH7)中，待00600為0.60.8時(shí)加入IPTG，使其最終濃度為0.1mM，30。C誘導(dǎo)表達(dá)1012小時(shí)，14000rpm2分鐘離心收集細(xì)菌，細(xì)菌沉淀中加入10(H;l含lmMPMSF(苯甲基磺酰氟)的PBS，懸浮細(xì)菌，4。C進(jìn)行超聲粉碎，而后14000rpm離心10分鐘，取上清液，加入包被有0.5嗎重組SAGl蛋白/孔的酶標(biāo)板上，進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的抗人IgGFab(ICNPharmaceuticals,Aurora,Ohio)為二抗,以鄰苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)顯色。每塊酶標(biāo)板上均加入陽性血清為陽性對(duì)照，一旦OD49o讀數(shù)高于一定數(shù)值即為陽性。將克隆印跡法或ELISA篩選所得的陽性克隆挑入25ml含氨芐青霉素的的SB培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng)至OD6(K)為0.60.8時(shí)，加入IPTG，使其最終濃度為0.1mM，30。C誘導(dǎo)表達(dá)1012小時(shí)，14000rpm2分鐘離心收集細(xì)菌，細(xì)菌沉淀中加入500^1含lmMPMSF的PBS，懸浮細(xì)菌，4。C進(jìn)行超聲粉碎，而后14000rpm離心10分鐘，取上清液，加入每孔包被有0.5pg重組SAGl蛋白或其他無關(guān)蛋白如重組溶組織內(nèi)阿米巴150kDa表面蛋白等的酶標(biāo)板上，進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的抗人IgGFab為二抗，顯色。當(dāng)重組SAGl蛋白與其他無關(guān)蛋白的OD49o讀數(shù)有顯著性差別時(shí)，即將該克隆的細(xì)菌混懸液與剛地弓形蟲速殖子抗原片進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光反應(yīng)，即為陽性克隆。累計(jì)篩選約6xl()s個(gè)克隆,獲得l個(gè)陽性克隆Toxl403L-llH與剛地弓形蟲速殖子呈明顯的特異性結(jié)合反應(yīng)(圖2)。實(shí)施例4.抗剛地弓形蟲速殖子SAGl抗體Fab片段Toxl403L-llH的特性分析取陽性克隆Toxl403L-llH的質(zhì)粒，分別以AcI-AWeI和胡I-Mj/1限制性內(nèi)切酶酶切，獲得輕鏈和重鏈基因，再與經(jīng)酶切修飾的測(cè)序載體CV-2和CV-1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，分別提取含輕鏈或重鏈基因的質(zhì)粒DNA，以M13Reverse引物(5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3'),進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作由Invitrogen公司完成。并以VectorNTI10軟件推算氨基酸序列(序列2，4)，以IgBlast進(jìn)行同源性分析(表2),并根據(jù)Kabat系統(tǒng)對(duì)陽性克隆Toxl403L-llH的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的CDR、FR進(jìn)行劃分(圖3，4)。表2是陽性克隆Toxl403L-llH基因序列的同源性比較。表2_V片段D片段J片段克隆-家系同源性％家系同源性％家系同源性％Toxl403L-llHVk1-1789.61//Jk194.74VH3-2398.26D1-778.54JH497.92由于Fab抗體含有6個(gè)His-Tag，且重鏈與His相連，故選用His結(jié)合樹脂(Novagen，Madison，Wis.)進(jìn)行提純。陽性克隆Toxl403L-llH進(jìn)行大量培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，收集細(xì)菌，進(jìn)行溶菌和超聲粉碎，離心取上清液進(jìn)行純化。以1M咪唑11溶出純化的Fab片段，以DCProteinAssay(BioRad)測(cè)定蛋白含量，并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)其純度(圖5)。同時(shí)以Westemblot檢測(cè)Fab抗體重輕鏈的完整性(圖6)。純化的抗體以Biocore3000(BiocoreAB，UppsalaSweden)檢測(cè)其親和力，以純化的重組抗原SAG1蛋白包被后，分別以濃度為2.5ng/ml，1.25pg/ml，0.625ng/ml，0.3125ng/ml的Fab抗體片段與其進(jìn)行反應(yīng)，以BIAevalution3.1軟件求出結(jié)合率(KA)和解離率(KD)分別為9.0xl()7(l/M)和2.01x10—8(M)。結(jié)果顯示，該Fab抗體與剛地弓形蟲速殖子重組SAGl蛋白具有較高的親和力。提示Fab抗體可抑制弓形蟲速殖子對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵，從而阻斷弓形蟲感染。所述的Fab抗體可制備治療和預(yù)防弓形蟲病的藥物。SEQUENCELISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>—種人源抗剛地弓形蟲表面抗原1(SAG1)抗體Fab片段與用途<130><160>4<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211〉642<212〉DNA<213〉人(Homosapiens)<220><221>CDS<222〉(1)..(642)<400>1gacategtgatgacccagtctccttecaccctgtctgcatctgtagga48AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015gacagsgtcsecstcacttgcegggcaagtcaggcc3ttgsagatgat96AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAlalieGluAspAsp202530ttagactggtatcagcagaaaccaggtaaagcccctaagcgcctggtt144LeuAspTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysArgLeuVal354045tatggtgcatecaacttgcaaagaggggtcccgteaagattcagtggt192TyrGlyAlaSerAsnLeuGinArgGlyValProSerArgPheSerGly505560agtggateagggaccgagttcactetcacaateagtagectgcagcct240SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580gaagattttgcaacatattactgtetacaacatcattcttacccgtgg288GluAspPheAlaThrTyrTyrCysLeuGinHisHisSerTyrProTrp859095acgttcggccaagggaccagggtggacateaaacgaactgtggetgca336ThrPheGlyGinGlyThrArgValAsplieLysArgThrValAlaAla100105110ccatctgtcttcatettcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga384ProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSerGly115120125actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc432第1頁ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140aaagtacagtggaaggtggataacgccetccaategggtaacteccsgLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGin145150155160gsgsgtgtcscsgsgcsggsc3gc33ggscsgcsectscsgcetcsgc528GluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175sgcsecctgscgctgsgc333gc3g3ctscg3g33aesc333etctsc576SerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysLeuTyr180185190gcctgcgsaigtcsecestcsgggcctgsgctegcccgtc3c3sagsgc624AlaCysGiuValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSer195200205ttcaacaggggagagtgt642PheAsnArgGlyGluCys210<210〉2<211〉214<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400〉2AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAlalieGluAspAsp202530LeuAspTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysArgLeuVal354045TyrGlyAlaSerAsnLeuGinArgGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysLeuGinHisHisSerTyrProTrp859095第2頁480ThrPheGlyGinGlyThrArgValAsplieLysArgThrValAlaAla100105110ProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSerGly115120125ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140LysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGin145150155160GluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175SerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysLeuTyr180185190AlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSer195200205PheAsnArgGlyGluCys210<210〉3<211>672<212〉DNA<213〉人(Homosapiens)<220><221〉CDS<222〉(7)..(672)<400〉3atggccgaggtgaagcttetcgagtctgggggaggcttggtacagcctGluValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinPro1510ggggggtecctgagaetctectgtgcagcctecggattcacctttageGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSer15202530sgctstgcc3tgsgctgggtccgccsggetcc3ggg卿gggctggsg144SerTyrAlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGlu第3頁4896354045tgggtcteagttatttatageggtggtagtageacatactatgcagac192TrpValSerVallieTyrSerGlyGlySerSerThrTyrTyrAlaAsp505560tecgtg卿ggceggttcaccatetecagagataattecaagaacacg240SerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThr657075ctgtatctgcaaatgaacagectgsgagccgaggacacggccgtatat288LeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr808590tactgtgcgaaaacgaaagataactggaacttctactttgactactgg336TyrCysAlaLysThrLysAspAsnTrpAsnPheTyrPFieAspTyrTrp95100105110ggccsggg3secctggtcsecgtctectc3gcctecsecssgggccca384GlyGinGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyPro115120125tcggtcttccccctggcaccctectecaag3gcacctctgggggcsea432SerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThr130135140gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacg480AlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThr145150155gtgtcgtggaacteaggcgccctgaccageggcgtgcacaccttcccg528ValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPhePro160165170getgtcetacagtecteaggaetctsctecetcageagegtggtgsec576AlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThr175180185190gtgccctecageagettgggcacccagacctacatetgcaacgtgaat624ValProSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsn195200205cac犯gcccageaacacc犯ggtggacaagaaaattgtgcccagggat672HisLysProSerAsnThrLysValAspLysLyslieValProArgAsp210215220<210>4<211〉222<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400〉4第4頁GluValLysLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerVallieTyrSerGlyGlySerSerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysThrLysAspAsnTrpAsnPheTyrPheAspTyrTrpGlyGin100105110GlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerVal115120125PheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAla130135140LeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSer145150155160TrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaVal165170175LeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro180185〗90SerSerSerLeuGlyThrGinThrTyr卩eCysAsnValAsnHisLys195200205ProSerAsnThrLysValAspLysLyslieValProArgAsp210215220第5頁權(quán)利要求1、一種抗剛地弓形蟲表面抗原1人源抗體Fab片段，包括重鏈V區(qū)和輕鏈V區(qū)，其特征是所述的輕鏈V區(qū)含有序列1，重鏈V區(qū)3的核苷酸序列。2、按權(quán)利要求l所述的抗剛地弓形蟲表面抗原l人源抗體Fab片段，其特征是所述的抗剛地弓形蟲表面抗原1人源抗體Fab片段選自抗剛地弓形蟲人源免疫球蛋白基因文庫。3、按權(quán)利要求l所述的抗剛地弓形蟲表面抗原l人源抗體Fab片段，其特征是所述的輕鏈含有序列2的氨基酸序列。4、按權(quán)利要求l所述的抗剛地弓形蟲表面抗原l人源抗體Fab片段，其特征是所述的重鏈含有序列4的氨基酸序列。5、一種表達(dá)載體，其特征是含有編碼權(quán)利要求3所述的輕鏈的DNA和/或含有編碼權(quán)利要求4所述的重鏈的DNA。6、按權(quán)利要求5，其中所述的表達(dá)載體是一種質(zhì)粒，選自pFab-His2。7、一種含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。8、基于權(quán)利要求7，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或真核細(xì)胞。9、基于權(quán)利要求8，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌JM109。10、一種藥物組合物，其特征是含有上述的Fab片段活性成分。11、權(quán)利要求1的抗剛地弓形蟲表面抗原1人源抗體Fab片段在制備防治弓形蟲病的抗體藥物或抗體靶向藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種抗剛地弓形蟲表面抗原1(SAG1)人源抗體Fab片段及其編碼基因和用途。本發(fā)明通過構(gòu)建抗剛地弓形蟲人源免疫球蛋白基因文庫并經(jīng)ELISA、稀釋凝血酶原時(shí)間、測(cè)序分析等從庫中篩選到抗剛地弓形蟲SAG1人源抗體Fab片段，經(jīng)表達(dá)純化及鑒定，證實(shí)所述的人源抗體Fab片段能夠特異性識(shí)別弓形蟲速殖子重組SAG1并與之具有較高的親和力，與弓形蟲速殖子特異性識(shí)別。本發(fā)明的人源抗體Fab片段，無Fc段，在發(fā)揮抑制弓形蟲入侵宿主細(xì)胞作用的同時(shí)，不會(huì)激活補(bǔ)體和引起人體免疫反應(yīng)等病理損害，應(yīng)用于人體安全可靠?？芍苽浞乐喂蜗x病的抗體藥物或抗體靶向藥物。文檔編號(hào)A61K39/395GK101565465SQ200910141029公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日發(fā)明者付永鋒,橘裕司,程訓(xùn)佳申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)