專利名稱：一種軟骨源性膠原海綿支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支架，尤其涉及一種軟骨源性膠原海綿支架的制備方法及由該方 法制備得到的產(chǎn)品，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
軟骨損傷后，缺乏有效自身修復(fù)的能力。目前，臨床上對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷治療的手段 不多，效果也不太理想。組織工程技術(shù)可能成為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)新手段。天然生物支 架材料具有細(xì)胞信號(hào)識(shí)別，促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物 降解性等優(yōu)點(diǎn)。其中，天然脫細(xì)胞生物支架材料主要利用同種或異種器官/組織，經(jīng)理化處 理得到的脫細(xì)胞基質(zhì)材料。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)是由細(xì)胞自身分泌 組成的，并圍繞在細(xì)胞周圍，主要含有膠原蛋白、纖維蛋白粘連素、層粘連蛋白，層連素等。 ECM不僅為細(xì)胞提供了一個(gè)支持結(jié)構(gòu)和附著位點(diǎn)，而且對(duì)細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化以及 基因表達(dá)的調(diào)控有重要作用和顯著影響。軟骨的主要成分為II型膠原。楊自權(quán)，何君仁，李剛等.可塑形脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料的制備及性狀研究.中國(guó)修 復(fù)重建外科雜志· 2008 ；22 (10) 1232-1237公開了一種采集新鮮牛膝關(guān)節(jié)，切取關(guān)節(jié)表面透明軟骨，凍干后低溫粉碎為軟骨 微粒，系列篩網(wǎng)篩選直徑106 150 μ m的軟骨微粒。胰酶、Triton X-100及低張Tris-HCl 溶液聯(lián)合作用進(jìn)行脫細(xì)胞處理，冷凍干燥塑形，紫外線交聯(lián)后制備脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料。楊強(qiáng)，彭江，盧世璧等.新型脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架的制備.中國(guó)修復(fù)重建 外科雜志· 2008 ；22 (3) 359-363公開了一種支架載體，取天然人軟骨粉碎后，采用梯度離心法取lOOnm-5 μ m軟骨 微絲，脫細(xì)胞處理后制備為質(zhì)量體積比為3%的懸液，采用冷凍凍干法制備脫細(xì)胞軟骨基質(zhì) 三維多孔支架。254nm紫外線和碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺對(duì)支架進(jìn)行交聯(lián)?？导t軍，盧世璧，張莉等.人脂肪干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)支架在生物反應(yīng)器 中構(gòu)建組織工程軟骨·中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)· 2007 ；11(10) 1801-1804，1811公開了一種軟骨基質(zhì)支架的制備方法，關(guān)節(jié)軟骨凍干后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過篩，選取 25-38 μ m大小的軟骨微粒。在樣品中先加入2. 5g/L胰蛋白酶，37°C消化24h，再加入 Triton X-100震蕩72h。將軟骨微粒和蒸餾水按1 3的比例混合后滴加在模板中，置入 冷凍干燥機(jī)凍干后行紫外線交聯(lián)。紫外線照射8h完成。最后經(jīng)25kGy 60Co輻照滅菌完成 支架制備?？浊迦仍谥袊?guó)專利CN200710090962. 0，一種關(guān)節(jié)軟骨生物支架材料及制備方法 中公開了一種軟骨支架，取新鮮豬軟骨打碎，通過脫鈣、脫脂、脫細(xì)胞等步驟后得到基質(zhì)材 料，再與II型膠原共混得到所述的軟骨支架。美國(guó)專利US2005159822報(bào)道了微粒脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法。US2007014867該 專利報(bào)道了脫細(xì)胞基質(zhì)植入物的制備方法及其治療關(guān)節(jié)軟骨、骨或骨軟骨缺損和損傷的方法。
現(xiàn)有技術(shù)公開的軟骨支架材料均為軟骨粉碎后的微粒通過脫脂、脫鈣、脫細(xì)胞等 方法得到的天然基質(zhì)材料，以及在這種材料上再附加膠原等得到的復(fù)合材料，加上軟骨供 體差異，其制備的軟骨支架材料是不均一的，可重復(fù)性差，質(zhì)量難以控制，支架材料的不均 一性導(dǎo)致在不同研究者的動(dòng)物試驗(yàn)中，其修復(fù)缺損效果不一致，不具有可比性，難以在臨床 上大規(guī)模應(yīng)用，更難以大規(guī)模的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明人致力于研究得到一種膠原 海綿支架，其原料可以來源于同種或異種動(dòng)物多個(gè)個(gè)體，其孔徑及孔隙率均可控制的均一 的海綿支架，更利于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和臨床使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將軟骨進(jìn)行脫細(xì)胞去抗原性處理，制備軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)，進(jìn)一步采用酶解 去除膠原端肽清除膠原的抗原性，酸溶后采用不同模具成型凍干，制備三維多孔海綿支架。本發(fā)明提供的制備軟骨源性膠原海綿支架的方法，包括以下步驟a、將新鮮軟骨片冷凍干燥后粉碎，得到軟骨微粒；b、將軟骨微粒脫細(xì)胞；C、按體積比V/V 1 5 1 10將步驟b的脫細(xì)胞軟骨微粒與0. 5mol/L HAc (乙 酸)混合，以胃蛋白酶與軟骨微粒濕重重量比1 3 100，加入胃蛋白酶，低溫下連續(xù)攪拌 12 24小時(shí)，離心取上清液，調(diào)節(jié)pH值至5. 6，離心取沉淀，蒸餾水清洗，離心棄上清，得到 軟骨源性膠原；d、按重量比1 3 100，將步驟c的軟骨源性膠原與0. 05mol/L HAc混合，低溫 下連續(xù)攪拌2 6小時(shí)，置于模具中，冷凍干燥36 60小時(shí)后取出，紫外線照射6 10小 時(shí)，得到軟骨源性膠原海綿支架。上述方法還包括步驟e、蒸餾水清洗步驟d得到的軟骨源性膠原海綿支架，去除 殘留HAc，凍干，封裝，輻照滅菌。進(jìn)一步的，步驟a所述的軟骨為豬、?；蜓虻亩浌腔蚶哕浌牵浌俏⒘Ｐ∮?90 μ m ；所述冷凍干燥為，先-70°C預(yù)凍后，冷凍干燥機(jī)干燥24hr，然后冷凍粉碎30min。步驟b中脫細(xì)胞的方法為按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨微粒與0.25%胰 酶與0. 1 % EDTA組成的胰酶EDTA混合液TNE混合，低溫振蕩12 30小時(shí)，離心，棄上清， PBS清洗，離心棄上清，得到軟骨微粒備用。優(yōu)選的，步驟c中軟骨微粒與乙酸的體積比為1 10，胃蛋白酶與軟骨微粒濕重重 量比為2 100，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值。步驟d中軟骨源性膠原與0.05mol/L HAc的重量比為2 100，模具形狀根據(jù)軟骨 缺損修復(fù)所需形狀進(jìn)行適應(yīng)性變化。步驟e所述輻射滅菌采用25kGy 60Co照射。另一方面，本發(fā)明還提供一種軟骨源性膠原海綿支架，它是由權(quán)利要求1 6任意 一項(xiàng)所述方法制備得到的，其形狀與軟骨缺損修復(fù)需要相適配。更進(jìn)一步的，它是通過選擇模具制備得到的任意規(guī)格、形狀的適于各種軟骨缺損 修復(fù)的軟骨源性膠原海綿支架。上述制備方法中，所用的軟骨可為豬、?；蜓虻亩浌?、關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨；步驟a 中可取新鮮豬耳軟骨在-70°C冰箱預(yù)凍后，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24hr，液氮冷凍粉碎
4機(jī)粉碎30min，8號(hào)篩網(wǎng)取粒徑90 μ m以下軟骨微粒備用；步驟b中將上述軟骨微粒脫細(xì)胞，方法是按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨 微粒與胰酶EDTA混合液(0. 25% Trypsin+0. 1 % EDTA, TNE)混合，4°C振蕩12 30hr，以 IOOOg離心IOmin棄上清，反復(fù)PBS清洗3次，離心棄上清；步驟b能有效去除軟骨細(xì)胞，排除其導(dǎo)致的抗原反應(yīng)，能充分保留軟骨的II型膠 原以及少量的GAG(糖胺聚糖)、透明質(zhì)酸等促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的成分，II型膠原是軟骨基 質(zhì)的主要成分，對(duì)軟骨細(xì)胞的粘附、分化和遷移具有重要的促進(jìn)作用，有利于軟骨的形成， 糖胺聚糖(GAG)、透明質(zhì)酸可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的粘附和擴(kuò)增。步驟c進(jìn)一步采用胃蛋白酶去除膠原的端肽，按體積比1 5 1 10將軟骨微 粒與0. 5mol/L HAc混合，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶與軟骨微粒濕重重量比1 3 100)， 4°C下連續(xù)攪拌12 24hr，IlOg離心5min，取上清液，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 6，棄 上清，蒸餾水反復(fù)清洗3次，離心棄上清，得到軟骨源性膠原。去端肽可進(jìn)一步降低材料的 抗原性，冷凍干燥以及滅菌處理都可降低材料的抗原性，從而制備主要成分為軟骨源性膠 原的海綿支架。不同類型的膠原蛋白在結(jié)構(gòu)上有很大差別，但所有的膠原蛋白均具有由三條α 鏈組成的右手三螺旋結(jié)構(gòu)。形成螺旋結(jié)構(gòu)的三條α鏈可以是相同的，也可以是不同的，每 條α鏈自身形成左手螺旋。三條鏈依次交錯(cuò)排列，以右手螺旋圍繞中心軸線形成三螺旋結(jié) 構(gòu)。三螺旋區(qū)域的氨基酸分別約有200或460個(gè)，非螺旋末端短肽起著與基質(zhì)中其他 蛋白交聯(lián)以及在膠原蛋白分子內(nèi)部共價(jià)交聯(lián)的作用，非螺旋區(qū)域在不同類型結(jié)構(gòu)和功能上 的差異較大。三螺旋區(qū)具有抵抗如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的能力，只能被特異 的膠原蛋白酶水解。胃蛋白酶只對(duì)膠原蛋白的非螺旋區(qū)域(即端肽)起作用，對(duì)螺旋區(qū)不進(jìn)行水解 [Hickman D, Sima T J, Miles C A. Koopmans, Isinglass/colagen :denaturation and functionality. Journal of Biotechnology, 2000 (79) :245_257]，可通過文獻(xiàn)公開的方法 對(duì)其粘度及熱力學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，離心可棄去酶解后的非螺旋區(qū)。步驟d是進(jìn)一步酸溶解后成形，將步驟c的軟骨源性膠原按W/W :1 3/100，與 0. 05mol/L HAc混合，低溫下連續(xù)攪拌2 6hr，獲得凝膠狀的軟骨源性膠原，故可根據(jù)需要 選擇任意形狀的模具，置于模具中，冷凍干燥后獲得不同規(guī)格、形狀的支架，適于各種軟骨 缺損的修復(fù)；-70°C冰箱預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)36 60小時(shí)后取出，紫外線照射6 10 小時(shí)，得到軟骨源性膠原海綿支架初產(chǎn)品。采用紫外線輻照交聯(lián)處理支架，可提高支架的力學(xué)性狀。膠原在體內(nèi)降解速度太 快，為減慢降解速度以與細(xì)胞功能相匹配，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步交聯(lián)。交聯(lián)方法可分為化 學(xué)交聯(lián)、光交聯(lián)和輻照交聯(lián)。本發(fā)明采用紫外線輻照方法，可使膠原蛋白之間相互作用發(fā)生 交聯(lián)，從而提高材料的力學(xué)性狀，與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛相比，紫外線交聯(lián)后基質(zhì)材料 中無(wú)化學(xué)成分殘留，對(duì)細(xì)胞的毒副作用較小。軟骨源性膠原海綿支架初產(chǎn)品經(jīng)蒸餾水反復(fù)清洗3次，去除可能殘存的HAc ；凍 干，封裝，輻照滅菌，即可得到使用方便的軟骨源性膠原海綿支架終產(chǎn)品。步驟d中，成形時(shí)還可用公知方法，加入致孔劑Nacl以調(diào)節(jié)膠原海綿支架的孔徑，進(jìn)一步滿足工業(yè)生產(chǎn)和臨床使用的需要。本發(fā)明克服了現(xiàn)有軟骨脫細(xì)胞支架不均一，難以產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)缺陷，提供了一種 均一的軟骨源性膠原海綿支架，原料來源廣，適于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，質(zhì)量可控，臨床推廣、使用方 便。該軟骨源性膠原海綿支架具有良好的生物相容性，其孔徑及孔隙率可控，抗原性極低， 可為軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)增殖環(huán)境。本發(fā)明的軟骨支架具有良好的軟骨細(xì)胞相容性，有利于軟骨細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和 增殖，有利于軟骨形成，植入軟骨缺損部位可獲得良好的修復(fù)效果。綜上，本發(fā)明的軟骨支架具有下述優(yōu)點(diǎn)(1)軟骨源性膠原海綿支架主要成分為II型膠原，含少量GAG及透明質(zhì)酸，為軟骨 細(xì)胞生長(zhǎng)提供了良好的支架；(2)本發(fā)明的制備方法包括凍干、脫細(xì)胞、端肽去除以及滅菌等步驟，極大降低了 支架的抗原成分，從而不會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)；(3)本發(fā)明克服了現(xiàn)有軟骨脫細(xì)胞支架不均一的技術(shù)缺陷，提供了一種均一的軟 骨源性膠原海綿支架；(4)在置于模具冷凍干燥時(shí)可根據(jù)需要選擇不同的模具從而獲得不同規(guī)格的支 架，適于各種軟骨缺損的修復(fù)；(5)本發(fā)明的方法成本低廉，適于推廣。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1本發(fā)明軟骨源性膠原海綿支架的外觀。圖2本發(fā)明軟骨源性膠原海綿支架掃描電鏡圖(SEMX400)，支架孔隙率高 (90. 16% )，空隙互相交通，本發(fā)明制備的材料結(jié)構(gòu)均一，現(xiàn)有技術(shù)方法制備的支架中有明
顯顆粒。圖3公開文獻(xiàn)(楊自權(quán)，何君仁，李剛等.可塑形脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料的制備及性 狀研究.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志.2008 ；22 (10) : 1232-1237)得到的軟骨基質(zhì)材料的HE染 色圖和掃描電鏡圖，圖A =HE染色示脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料由不規(guī)則的紅染軟骨微顆粒組成， 表面粗糙；圖B 掃描電鏡示脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料呈多孔狀海綿結(jié)構(gòu)，孔徑30 150 μ m，孔 徑大小不一，有明顯顆粒。圖4本發(fā)明軟骨源性膠原海綿材料組織學(xué)觀察4A =HE染色(X200)見材料結(jié)構(gòu) 均一，無(wú)細(xì)胞殘留；4B =MASSON染色(X200)示材料主要由膠原構(gòu)成。圖5本發(fā)明軟骨源性膠原海綿大鼠體內(nèi)植入8周(HEX 100)，表明本發(fā)明所制備的 支架不引起免疫排斥(可以看到周圍組織長(zhǎng)入材料，有散在的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，巨噬細(xì) 胞及分葉狀粒細(xì)胞極少，材料周圍沒有發(fā)現(xiàn)明顯的纖維包裹層)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 制備本發(fā)明的軟骨源性膠原海綿支架
1、取新鮮豬耳軟骨在-70°C冰箱預(yù)凍后，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24hr，液氮冷 凍粉碎機(jī)粉碎30min，8號(hào)篩網(wǎng)取粒徑90 μ m以下軟骨微粒；2、按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨微粒與胰酶EDTA混合液(0. 25 % Trypsin+0. 1 % EDTA, TNE)混合，4°C振蕩 12 30hr,以 IOOOg 離心 IOmin 棄上清，反復(fù) PBS 清洗3次，離心棄上清；3、按體積比1 10將軟骨微粒與0. 5mol/L HAc混合，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶 與軟骨微粒濕重重量比2 100)，4°C下連續(xù)攪拌12 24hr。4、IlOg離心5min，取上清液，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 6，棄上清，蒸餾水反 復(fù)清洗3次，離心棄上清，得到軟骨源性膠原。5、將步驟4的軟骨源性膠原按W/W :2/100，與0. 05mol/L HAc混合，低溫下連續(xù)攪 拌2 6hr，置于所需形狀的模具中，-70°C冰箱預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)48h后取出。6、紫外線照射8hr.7、蒸餾水反復(fù)清洗3次，去除可能殘存的HAc ；凍干，封裝，輻照滅菌。本實(shí)施例制備的軟骨源性膠原海綿，呈白色多孔海綿狀，質(zhì)地均一；模具塑形后形 態(tài)規(guī)則，不易變形(圖1)。掃描電鏡觀察材料呈多層蜂巢樣結(jié)構(gòu)，支架孔徑及大小分布較均勻(圖2)，并且 孔隙相互貫通，吸水性2029% 士 253%，經(jīng)Image-Pro Plus(v6. 0)圖像分析軟件分析，孔 徑(90. 66 士 21. 26) μ m，支架孔隙率90. 10% 士 2.42% ；現(xiàn)有技術(shù)制備的產(chǎn)品掃描電鏡示脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料呈多孔狀海綿結(jié)構(gòu)，孔徑 30 150 μ m，孔徑大小不一，有明顯顆粒(圖3B)，其平均孔隙率89. 37%。組織學(xué)觀察HE染色(X 200)見材料結(jié)構(gòu)均一，無(wú)細(xì)胞殘留(圖4A) ；MASSON染色 (X200)示材料主要由膠原構(gòu)成(圖4B)；現(xiàn)有技術(shù)制備的產(chǎn)品HE染色示脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料由不規(guī)則的紅染軟骨微顆粒 組成，表面粗糙(圖3A)；實(shí)施例2 制備本發(fā)明的軟骨源性膠原海綿支架1、取新鮮豬肋軟骨在-70°C冰箱預(yù)凍后，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24hr，液氮冷 凍粉碎機(jī)粉碎30min，8號(hào)篩網(wǎng)取粒徑90 μ m以下軟骨微粒；2、按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨微粒與胰酶EDTA混合液(0. 25 % Trypsin+0. 1 % EDTA, TNE)混合，4°C振蕩 12 30hr,以 IOOOg 離心 IOmin 棄上清，反復(fù) PBS 清洗3次，離心棄上清；3、按體積比1 5將軟骨微粒與0.5mol/L HAc混合，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶與 軟骨微粒濕重重量比3 100)。4°C下連續(xù)攪拌24hr。4、IlOg離心5min，取上清液，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 6，棄上清，蒸餾水反 復(fù)清洗3次，離心棄上清，得到軟骨源性膠原。5、將步驟4的軟骨源性膠原按W/W :2/100，與0. 05mol/L HAc混合，低溫下連續(xù)攪 拌2 6hr，置于所需形狀的模具中，-70°C冰箱預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)48h后取出。6、紫外線照射8hr.7、蒸餾水反復(fù)清洗3次，去除可能殘存的HAc;凍干，封裝，輻照滅菌。實(shí)施例3 制備本發(fā)明的軟骨源性膠原海綿支架
1、取新鮮牛耳軟骨在-70°C冰箱預(yù)凍后，置于真空凍干機(jī)冷凍干燥24hr，液氮冷 凍粉碎機(jī)粉碎30min，8號(hào)篩網(wǎng)取粒徑90 μ m以下軟骨微粒；2、按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨微粒與胰酶EDTA混合液(0. 25 % Trypsin+0. 1 % EDTA, TNE)混合，4°C振蕩 12 30hr,以 IOOOg 離心 IOmin 棄上清，反復(fù) PBS 清洗3次，離心棄上清；3、按體積比1 10將軟骨微粒與0. 5mol/L HAc混合，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶 與軟骨微粒濕重重量比1 100)。4°C下連續(xù)攪拌24hr。4、IlOg離心5min，取上清液，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5. 6，棄上清，蒸餾水反 復(fù)清洗3次，離心棄上清，得到軟骨源性膠原。5、將步驟4的軟骨源性膠原按W/W :3/100，與0. 05mol/L HAc混合，低溫下連續(xù)攪 拌2 6hr，置于所需形狀的模具中，-70°C冰箱預(yù)凍后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)48h后取出。6、紫外線照射8hr.7、蒸餾水反復(fù)清洗3次，去除可能殘存的HAc ；凍干，封裝，輻照滅菌。實(shí)施例4軟骨源性膠原海綿支架的體內(nèi)植入及組織學(xué)評(píng)價(jià)取健康成年SD大鼠24只，雌雄各半，體重180_200g。在脊柱兩旁各選三點(diǎn)，同側(cè) 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)相距3cm，在10%水合氯醛腹腔麻醉后切開皮膚、在皮下筋膜淺面用鈍器解剖法制 備皮下囊，無(wú)菌條件下將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料(I型膠原)分別植入到大鼠脊柱兩側(cè)皮下， 每個(gè)囊內(nèi)植入一個(gè)植入物，植入物之間不能相互接觸。分別于術(shù)后1、2、4、8周取出植入物 各6個(gè)。軟組織標(biāo)本在4%多聚甲醛固定液中固定24小時(shí)，石蠟包埋，進(jìn)行HE及Masson染 色，顯微鏡下觀察。組織學(xué)觀察結(jié)果材料經(jīng)HE染色見軟骨細(xì)胞消失，整體呈纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未見細(xì) 胞碎屑及藍(lán)染的核物質(zhì)(圖4A)，Masson染色見大量的膠原纖維存在(圖4B)。皮下植入試驗(yàn)1周實(shí)驗(yàn)組見以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較大的脫細(xì)胞軟骨顆 粒材料周圍血管化明顯，纖維增生不明顯；對(duì)照組以單核巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞為主的炎性浸 潤(rùn)，周圍血管增生可見。2周實(shí)驗(yàn)組炎性細(xì)胞主要聚集在較大的軟骨粒周圍，可觀察到材料的降解現(xiàn)象， 材料周圍及內(nèi)部可見大量血管生成，成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入。對(duì)照組可見組織界面明顯，交界處巨 噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞大量聚集。4周實(shí)驗(yàn)組材料降解明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕且分散；對(duì)照組交界面組織側(cè)纖維 增生活躍，材料側(cè)炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)。8周實(shí)驗(yàn)組仍可以看到少量殘余材料結(jié)構(gòu)，周圍組織長(zhǎng)入材料，有散在的淋巴細(xì) 胞和漿細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及分葉狀粒細(xì)胞極少，材料周圍沒有發(fā)現(xiàn)明顯的纖維包裹層，材料內(nèi) 均勻分布成纖維細(xì)胞(圖5)；對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯，材料周圍有纖維包裹層，材料降 解慢，血管化不明顯。結(jié)果表明本發(fā)明支架無(wú)免疫排斥反應(yīng)。實(shí)施例5支架細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)采用MTT法檢測(cè)支架浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性。將無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液與材料采用國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液，并用DMEM和FBS配成含10% FBS的50%及100%濃度的浸提液。胎兔股骨取骨髓，采用密度梯度離心法體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將200 μ 1密度為1. 0X 104/ml的BMSCs種植 到96孔板上，待細(xì)胞貼壁后分別與50% (B組)及100% (C組)濃度的浸提液，以及DMEM 培養(yǎng)液作對(duì)照(A組)。每天觀察兩種濃度浸提液及對(duì)照DMEM各6孔，于培養(yǎng)后2，4，6d每 孔加入20 μ 1 MTT溶液37°C下培養(yǎng)4h后，加入150 μ 1 DMS0，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm測(cè) 定吸光度㈧值。 表1.不同濃度浸提液細(xì)胞增殖活力(η = 6，X士 S)


注1 =RGR =(實(shí)驗(yàn)組吸光值-空白對(duì)照)/ (正常對(duì)照組吸光值_空白對(duì)照)2 單純 DMEM培養(yǎng)液組3 50%浸提液組4 100%浸提液組Δ與不含浸提液對(duì)照 組比較P值> 0.05，*與不含浸提液對(duì)照組組比較P值 < 0. 05結(jié)果表明本發(fā)明的支架無(wú)細(xì)胞毒性，適于細(xì)胞粘附生長(zhǎng)和增殖。上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明得到的軟骨源性膠原海綿支架結(jié)構(gòu)均一，制備方法簡(jiǎn)單，成 本低廉，生產(chǎn)原料來源限制小，適于工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，臨床使用方便，為臨床提供了一種可 靠的、修復(fù)效果良好的軟骨缺損修復(fù)材料。
權(quán)利要求
一種制備軟骨源性膠原海綿支架的方法，包括以下步驟a、將新鮮軟骨片冷凍干燥后粉碎，得到軟骨微粒；b、將軟骨微粒脫細(xì)胞；c、按體積比V/V 1∶5～1∶10將步驟b的脫細(xì)胞軟骨微粒與0.5mol/L HAc混合，以胃蛋白酶與軟骨微粒濕重重量比1～3∶100，加入胃蛋白酶，低溫下連續(xù)攪拌12～24小時(shí)，離心取上清液，調(diào)節(jié)pH值至5.6，離心取沉淀，蒸餾水清洗，離心棄上清，得到軟骨源性膠原；d、按重量比1～3∶100，將步驟c的軟骨源性膠原與0.05mol/L HAc混合，低溫下連續(xù)攪拌2～6小時(shí)，置于模具中，冷凍干燥36～60小時(shí)后取出，紫外線照射6～10小時(shí)，得到軟骨源性膠原海綿支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是還包括步驟e、蒸餾水清洗步驟d得到的軟骨源性膠原海綿支架，去除殘留HAc，凍干，封裝，輻照滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟a所述的軟骨為豬、?；蜓虻亩浌腔?肋軟骨，軟骨微粒小于90 y m ；所述冷凍干燥為，先-70°C預(yù)凍后，冷凍干燥機(jī)干燥24hr，然 后冷凍粉碎30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟b中脫細(xì)胞的方法為按體積比V/V 1 8 1 12將軟骨微粒與0. 25 %胰酶與0. 1 % EDTA組成的胰酶EDTA混合液TNE混 合，低溫振蕩12 30小時(shí)，離心，棄上清，PBS清洗，離心棄上清，得到軟骨微粒備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟c中軟骨微粒與HAc的體積比為 1 10，胃蛋白酶與軟骨微粒濕重重量比為2 100，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的方法，其特征步驟d中軟骨源性膠原與0.05mol/LHAc的 重量比為2 100，模具形狀根據(jù)軟骨缺損修復(fù)所需形狀進(jìn)行適應(yīng)性變化。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是步驟e所述輻射滅菌采用25kGy60Co照射。
8.一種軟骨源性膠原海綿支架，其特征是其由權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng)所述方法制 備得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠原海綿支架，其特征是其形狀與軟骨缺損修復(fù)需要相適配。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的膠原海綿支架，其特征是其為通過選擇模具制備得到 的任意規(guī)格、形狀的適于各種軟骨缺損修復(fù)的軟骨源性膠原海綿支架。全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備軟骨源性膠原海綿支架的方法以及由該方法得到的膠原海綿支架。本發(fā)明方法包括粉碎、脫細(xì)胞、去端肽、溶解、交聯(lián)，得到的膠原海綿支架具有良好的生物相容性，抗原性極低，可由來源于同種動(dòng)物多個(gè)個(gè)體的軟骨制備出均一的海綿支架，其孔徑及孔隙率均可控制，可為軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)增殖環(huán)境，特別對(duì)軟骨缺損部位具有良好的修復(fù)效果，更利于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和臨床使用。
文檔編號(hào)A61L27/56GK101890184SQ20091005936
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者楊志明, 羅靜聰, 解慧琪 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院