專利名稱：：總合草苔蟲中一種甾體類化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從海洋動物總合草苔蟲中提取的一種新的甾體類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：總合草苔蟲&wnYz>^是一種真體腔動物，在世界水域分布廣泛，我國沿海從渤海到南海的西沙群島的多鹽水域都有。該群體呈紅褐色或紫褐色，呈草叢狀，高40150mm，每支有個蟲兩列，交互排列。其群體常附著在海帶、石花菜、貝類以及船底、碼頭、航標(biāo)等水下設(shè)施上，影響海洋養(yǎng)殖和國防、海洋交通，是海洋主要污損生物之一。本申請人曾經(jīng)從此種草苔蟲中分離到一種具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物并已申請專利(專利申請?zhí)?7106686.8)。但至今未見從中提取具有抗腫瘤活性的甾體類化合物的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從海洋動物總合草苔蟲^^w/fl^nY/"a中提取的具有抗腫瘤活性的新的甾體類化合物，為兩個新的甾體化合物，采用質(zhì)譜和核磁共振等光譜技術(shù)，確定了化合物的結(jié)構(gòu)，分別為(1)3^24(5>二羥基-5，25-二稀-7-甾酮，(2)3/5，25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下.當(dāng)R為26日寸，化合物為3^24(5>二羥基-5，25-一稀-7-甾酮，OH當(dāng)R為I時，化合物為3p,25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮。本發(fā)明化合物的制備方法如下l.提取，制備總提物將干燥總合草苔蟲粉碎后，按常規(guī)用95%乙醇冷浸提取，得提取液，將提取液濃縮得浸膏，加入50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物；2.分離純化1)制備粗提物將乙酸乙酯總提物用90%甲醇混懸，按常規(guī)經(jīng)石油醚脫脂后，調(diào)節(jié)甲醇濃度至60%，用二氯甲烷萃取，得粗提物；2)分離甾體化合物將上述粗提物過SephadexLH-20凝膠柱，用體積比為1:1的CH;zCl2-MeOH洗脫，根據(jù)薄層層析檢識的結(jié)果，收集含有甾體類化合物的洗脫液部分，過200300目的正相硅膠柱，以體積比為5:10:1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢識的結(jié)果，收集含有甾體類化合物的洗脫液部分，再按常規(guī)經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以體積比為1:11:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，然后經(jīng)反相高效液相色譜(83%甲醇/水，流速1.5mL/min，檢測波長為239nm)分離，分別得到化合物(1)3",24(5)-二羥基-5，25-二稀-7-甾酮和化合物(2)3^25-二羥基-5，23-二稀-7-甾酮。經(jīng)體外活性試驗證明，上述甾體類化合物對HepG2、HT-29和NCI-H460三種不同的腫瘤細(xì)胞均有一定的抗腫瘤活性，ICs。值為22.58)ig/ml至53.41pg/ml，接近甚至優(yōu)于陽性對照藥長春新堿，因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明化合物制備方法簡單，抗腫瘤活性顯著。本發(fā)明為研究和開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利用我國海洋藥用資源提供了科學(xué)依據(jù)。具體實施方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實施例1.制備本發(fā)明甾體化合物取干燥粉碎后的總合草苔蟲50kg，分別用95%乙醇50L冷浸提取5次，每次一周，合并浸提液，浸提液經(jīng)減壓濃縮后得浸膏，浸膏按常規(guī)用50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物，乙酸乙酯總提物用卯°/。甲醇混懸，按常規(guī)用石油醚脫脂；調(diào)節(jié)甲醇濃度至60%，用二氯甲烷萃取，得粗提物40g;將上述粗提物40g過SephadexLH-20凝膠柱，用CH2Cl2-MeOH=1:1洗脫，根據(jù)薄層層析檢識的結(jié)果，收集含有甾體類化合物的洗脫液部分，過200300目正相硅膠柱，以體積比為5:10:1石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢識的結(jié)果，收集含有甾體類化合物的洗脫液部分，再經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以體積比為l:11:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，然后經(jīng)反相高效液相色譜(83%甲醇/水，流速1.5mL/min,檢測波長為239nm)分離，分別得到化合物(1)3^24(5>二羥基-5，25-二稀-7-甾酮和化合物(2)3尿25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮，其理化性質(zhì)和核磁共振譜數(shù)據(jù)如下(/)3々,24(5>二羥基-5,25-二稀-7-甾酮黃色固體;m.p.144畫145。C;UV(MeOH)Xmax(s)239(0.03)nm;[a]-63.38。(c0.5,MeOH);ESI-MS—):437.18[M+Na]+,851.37[2M+Na]+;459.19[M+COOH]—,873.51[2M+COOHr;和13C核磁共振譜數(shù)據(jù)見表(2)3^25-二羥基-5，23-二稀-7-甾酮黃色固體；m.p.145-147°C;UV(MeOH)Xmax(s)239(0.04)nm;[a]))9-71.01o(c0.5，MeOH);IR(KBr)cm.1:3421,2937，2869，1670,1458，1383，1182，1061，970,629;ESI-MS(w/z):437.26[M+Na]+,851.55[2M+Na]+;459.19[M+COOH]-,873.49[2M+COOH]—;'H和l3C核磁共振譜數(shù)據(jù)見表1。表1.本發(fā)明化合物1和2的核磁共振譜數(shù)據(jù)(CDC13,500MHz/125MHz)position化合物l化合物2'HS(irt.，mult"/inHz)13CSCmult.)11.94:1H,m)36.36CCH2)1.94(1H,m)36.37(CH2)1.20<:1H，m)1.20(1H,m)21.94<:1H，m)31.22(CH2)1.94(IH，m)31.21(CH2)1.63<:1H，m)1.61(lH,m)33.67(1H，m)70.55(CH)3.68(1H,m)70.53(CH)42.50(1H,m)41,83(CH2)2.51(lH，m)41.83(CH2)2.41(1H,m)2.40(H，m)5165.32(C)165.09(C)65.69(1H，s)126.14(CH)5.69(1H,s)126.13(CH)7202.15(C)202.18(C)82.23(1H,m)45.41(CH)2.24(1H,m)45.41(CH)91.50(IH，m)49.93(CH)1.50(1H,m)49.94(CH)1038.29(C)38.29(C)111.56(舊，m)21.23(CH2)1.57(IH，m)21.22(CH2)1.54(IH，m)1.52(IH，m)122.02〔IH,dt,14.03.6)38.71(CH2)2.02(1H，m)38.64(CH2)uo(1H,m)U3(lH,m)1343.13(C)43.15(C)141.34(IH，m)49.98(CH)1,34(1H，m)49.94(CH)152.42〔1H，trO26,30(CH2)2.42(1H，m)26.34(CH2)2.37〔IH,m)2.37(1H,m)161.89〔IH,m)28.49(CH2)1.92(IH，28.55(CH2)1.26〔IH,m)1.29(lH，m)171.08〔1H'm)54.56(CH)1.09(1H,m)54.47(CH)180.68〔3H,s)11.98(CH3)0.69(3H,s)12.04CCH3)191.20〔3H，s)18.90(CH3)1.20(3H,s)17.33(CH3)201.45〔IH,m)35.53CCH)1.47(IH，m)36.02(CH)210.97〔3H，d，7.2)18.32(CH3)0.92(3H，d，5.0)18.82CCH3)221.47(1H，m)31.72CCH2)2.16(1H,m)38.83(CH2)1.09(1H,m)1.77(1H,m)231.48(IH,m)31.22(CH2)5.59(1H,m)125.35(CH)1.41(1H，m)244.01(1H,t,6.4)76.74(CH)5.59(1H，m)139.54(CH)25147.54(C)70.75(C)264.93(1H，brs)111.40(CH2)1.31(3H,s)29.96(CH3)4.83(1H,brs)271.72(3H,s)17.23(CH3)1.31(3H,s)29.92(CH3)體外抗腫瘤活性實驗實驗使用的腫瘤細(xì)胞株為上海天甲生物有限公司提供的HepG2(人肝癌細(xì)胞株)、H460(人肺癌細(xì)胞株)和HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)。實驗方法采用常規(guī)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺盼蘭染色法。實驗分4組空白對照組、陽性對照組和本發(fā)明化合物1組和化合物2組。陽性對照藥為長春新堿。將本發(fā)明化合物l、2和陽性對照藥分別用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細(xì)胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時貼壁細(xì)胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細(xì)胞處于對數(shù)生長期，實驗時細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，細(xì)胞懸液濃度為5xl04個/毫升。置37"C的C02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過夜后，每孔加20微升藥物溶液，空白對照組加20微升DMSO，每種濃度重復(fù)5孔。藥物作用于細(xì)胞3天后進(jìn)行MTT法測定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37'C孵育4小時，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長下用酶標(biāo)儀測定OD值。臺盼蘭排染法，加入臺盼蘭工作液，計數(shù)活細(xì)胞。按下列公式計算被測物對癌細(xì)胞生長的抑制率空白對照組細(xì)胞數(shù)一用藥組細(xì)胞數(shù)~~空白對照組細(xì)胞數(shù)~"00%半數(shù)有效抑制濃度IC5o值采用Logit法計算，結(jié)果見表2表2.本發(fā)明化合物1和2對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可見，本發(fā)明化合物1禾n2對HepG2和HT-29腫瘤細(xì)胞株的IC5o值均明顯小于陽性對照藥長春新堿，對NCI-H460腫瘤細(xì)胞株的IC50值相對接近于陽性對照藥長春新堿。說明本發(fā)明化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制活性接近甚至優(yōu)于對照藥長春新堿，因此可以用于制備抗腫瘤藥物。權(quán)利要求1.一種甾體類化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下其中，R基團(tuán)表示id="icf0002"file="A2009100489890002C2.tif"wi="109"he="29"top="103"left="60"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從海洋動物總合草苔蟲Bugulaneritina中提取的一種新的甾體類化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下體外活性試驗證明，其對HepG2、HT-29和NCI-H460三種不同的腫瘤細(xì)胞均有顯著的抗腫瘤活性，IC₅₀值接近甚至優(yōu)于陽性對照藥長春新堿，因此可用于制備抗腫瘤藥物。文檔編號A61K31/575GK101514222SQ200910048989公開日2009年8月26日申請日期2009年4月9日優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日發(fā)明者劉香芳,張紅軍,帆楊,林厚文,陳萬生,陳建濤申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)