專利名稱：：具有CpG基序的核酸在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及具有CpG基序的核酸在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：組織纖維化累及人體幾乎所有器官和系統(tǒng)，是許多疾病致殘、致死的主要原因，嚴(yán)重烕脅人類健康。據(jù)美國有關(guān)統(tǒng)計(jì)資料證明，該國因各種疾病而致死的病人中，接近45%可以歸于各種組織纖維增生疾病。目前，組織纖維增生性疾病仍然沒有針對(duì)性有效的治療方案。纖維增生性疾病屬于典型的多基因、多表型復(fù)雜疾病。由于年齡、性別、遺傳因素及環(huán)境因素等影響，各種內(nèi)外致病原引起的反復(fù)組織損傷可導(dǎo)致組織微環(huán)境改變。組織微環(huán)境改變引起組織修復(fù)失調(diào)，導(dǎo)致組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞丟失、間質(zhì)細(xì)胞反復(fù)破壞、重建并過度沉積、正常肺組織結(jié)構(gòu)改變并喪失功能。正是這種修復(fù)失調(diào)引起了纖維化疾病的發(fā)生。對(duì)多種纖維化疾病模型的研究發(fā)現(xiàn)，纖維化疾病是一類Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢的疾病。Th2細(xì)胞因子如IL-5(白介素-5)、IL-13能促進(jìn)和加重器官纖維化；相反，Thl細(xì)胞因子如IFN-Y則具有抗纖維化的作用。TLRs在抗原呈遞細(xì)胞如DCs調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮中心作用，激活不同TLRs可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Thl、Th2或調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Treg)等不同方向極化。如果產(chǎn)生促炎癥Thl反應(yīng)，則有利于組織損傷的修復(fù)和再生；反之，如果局部組織免疫微環(huán)境朝向Th2/Treg方向發(fā)展，則促進(jìn)組織纖維化和組織重構(gòu)的發(fā)生。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TLRs介導(dǎo)的ToU/Th平衡失調(diào)，在各種組織纖維增生疾病如哮喘、急性呼吸窘迫綜合癥、特發(fā)性肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬、結(jié)腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、結(jié)核、AIDS、和系統(tǒng)性硬化等許多感染性和非感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中均發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，通過改變組織局部免疫微環(huán)境，特別是改變Thl/Th2/Trcg免疫極化方向是治療纖維化的新途徑。Toll樣受體(Tolilikereceptors,TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫受體。它是模式識(shí)別受體中一個(gè)大家族，是溝通先天免疫與獲得性免疫反應(yīng)的重要橋梁，作為各種致病微生物的模式識(shí)別受體啟動(dòng)宿主防衛(wèi)反應(yīng)。TLRs分布廣泛，在多種來源的細(xì)胞如肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)。TLR9是TLRs家族中的重要成員。它在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并依賴MyD88進(jìn)行信號(hào)傳遞，最終調(diào)節(jié)NF-kb等核因子活性的受體。在組成宿主與外環(huán)境之間第一道屏障的肺泡上皮細(xì)胞也表達(dá)TLR9及TLRl-6。具有CpG基序的核酸，可以被Toll樣受體9(TLR9)所識(shí)別，并且最終激活宿主細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng)，是TLR9的激動(dòng)劑。CpG基序(CpGmotife)是以非甲基化CpG二核苷酸(胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)為核心的寡聚脫氧核苷酸。CpG基序在細(xì)菌和病毒基因中很常見，其中CpG二核苷酸以正常的速率表達(dá)并且不被甲基化。然而，脊椎動(dòng)物能夠抑制其基因組DNA序列中CpG二核苷酸的表達(dá)，或使表達(dá)的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化。人工合成具有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpGODN)，可以模擬細(xì)菌DNA，激活免疫細(xì)胞和其它細(xì)胞內(nèi)的TLR9，引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因而是TLR9.的激動(dòng)劑。CpGODN可以刺激單核細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞分泌IFN-tx、IFN-y，也能誘導(dǎo)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。CpGODN與TLR9作用，激活抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，促使NF-kB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，上調(diào)TNF-tx等炎性因子的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)共刺激分子CD40、MHCII類分子表達(dá)。CpGODN也可以促進(jìn)髓樣DCs成熟，促進(jìn)IL-12、IFN，等Thl細(xì)胞因子的生成，激活Thl免疫反應(yīng)，推動(dòng)Th2占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)向趨于TM/Th2平衡方向發(fā)展。許多研究表明，CpGODN是否具有免疫活性關(guān)鍵取決于其是否含有非甲基化或低甲基化的CpG基序。非甲基化的CpGODN可激活B淋巴細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生多種免疫效應(yīng)；并可通過間接途徑激活T淋巴細(xì)胞，誘生的IL-2和TNF-2可活化CD+細(xì)胞，促其分泌IFN-y等；同時(shí)可增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，研究表明細(xì)菌DNA或活性O(shè)DN可直接活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y。合成的CpGODN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要為Thl類，提示CpGODN可通過誘導(dǎo)Thl型應(yīng)答或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Thl型轉(zhuǎn)換，顯示出CpGODN作為未來人類疫苗佐劑的可行性。到目前為止，已有三種人工合成、含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸片段(CpGODN)，分別為A型、B型和C型，它們可以引起不同類型的免疫反應(yīng)。目前應(yīng)用于科研的商業(yè)化CpGODN序列見表1。在體外，三種不同類型的CpGODN序列對(duì)人類和小鼠免疫細(xì)胞的激活作用也不同。A型CpGODN，其特征為一到兩個(gè)磷酸二酯鍵相連接的CpG基序以磷酸二酯鍵相連并形成回文序列，在序列的3'端有硫代磷酸?；膒oly-G尾(硫代磷酸酰化磷酸二酯鍵中與磷原子結(jié)合的一個(gè)氧原子被硫原子代替)。此修飾使CpGODN能夠抵抗DNA酶的作用，在體內(nèi)半衰期延長。因A型CpGODN若全部硫代修飾則影響其免疫刺激活性，故僅將其3'和5'末端的堿基進(jìn)行硫代修飾。強(qiáng)烈誘導(dǎo)pDC分泌IFN-a并激活NK細(xì)胞，中等程度誘導(dǎo)DC成熟，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化能力及活化TLR9依賴的NF-kB信號(hào)能力較弱。如ODN2261。B型CpGODN，其特征為全硫代磷酸?；羌軜?gòu)成的線性分子，一個(gè)或多個(gè)CpG基序。強(qiáng)烈誘導(dǎo)DC成熟和B細(xì)胞分化，誘導(dǎo)pDC分泌IFN-a能力較弱。如ODN1826。C型CpGODN，其特征為全硫代磷酸?；羌軜?gòu)成，含有多個(gè)CpG基序，3'末端回文序列，在體內(nèi)形成二聚體。即擁有A型促TW型免疫反應(yīng)能力，又具有B型誘導(dǎo)B細(xì)胞分化功能。如ODN2395。表1.目前應(yīng)用于科研的商業(yè)化CpGODN序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>大寫字母表示磷酸二酯鍵，小寫字母表示其中的磷酸二酯鍵由硫代磷酸酯鍵代替，下劃線代表其屬回文序列。下劃線的序列中，""前為5'—3'的序列，""后為其相對(duì)應(yīng)的3'—5'的回文序列。用不同的CpGODN分別刺激轉(zhuǎn)染小鼠TLR9和人TLR9的HEK293細(xì)胞系，通過檢測NF-kB報(bào)告基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，A型CpGODN2336中等強(qiáng)度激活人TLR9，而僅低度激活小鼠TLR9;B型CpGODN2006高度激活人TLR9，對(duì)小鼠TLR9產(chǎn)生中等強(qiáng)度激活反應(yīng)；B型CpGODN16680DN1826高度激活小鼠TLR9，而僅低度激活人TLR9;C型CpGODN2395高度激活小鼠TLR9，同時(shí)較高程度激活人TLR9。目前CpGODN已被開發(fā)成治療Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢的過敏性哮喘的疫苗，在動(dòng)物模型上被證實(shí)作用持久、效力高、安全可靠，已進(jìn)入三期臨床。在一些免疫抑制性疾病如腫瘤，CpGODN作為腫瘤疫苗佐劑也已逬入二期臨床。研究表明TLR9的配基不僅能夠激活Thl免疫反應(yīng)，以疫苗形式給予時(shí)，還具有對(duì)抗慢性炎癥的作用。此外，已有報(bào)道CpGODN可用于治療皮膚病、抗流感病毒、丙型肝炎病毒和狂犬病病毒感染。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的抗纖維化藥物療效針對(duì)性不強(qiáng)的缺陷，提供具有CpG基序的核酸的一種新應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是具有CpG基序的核酸在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述的具有CpG基序的核酸可以是現(xiàn)有的任何具有CpG基序的核酸，較佳的包括細(xì)菌DNA和人工合成的具有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpGODN)。CpGODN較佳的是經(jīng)過化學(xué)修飾的寡聚脫氧核苷酸。化學(xué)修飾較佳的是硫代磷酸?；揎?，即在人工合成DNA時(shí)，將DNA分子骨架的磷酸二酯鍵部分或全部改變?yōu)榱虼姿狨ユI，磷酸基團(tuán)中不參與成鍵的氧原子被硫原子所取代。將DNA分子骨架的磷酸二酯鍵改變?yōu)榱虼姿狨ユI，其免疫活性極大增加。所述的CpGODN較佳的選自A型、B型、C型三種不同類型的CpGODN。本發(fā)明中，所述的具有CpG基序的核酸用于制備抗纖維化藥物。其中，所述的纖維化較佳的包括腎纖維化，肺纖維化，心血管組織纖維化、肝纖維化和胰腺纖維化。這些臟器的纖維化既可以是原發(fā)性(特異性)的，即原因不明的纖維化；也可以是繼發(fā)性的，即繼發(fā)于原先疾病的纖維化。因此，該藥物可預(yù)防或治療具有纖維增生性特征的疾病。該疾病包括腎纖維化疾病包括終末期腎病，各種原因引起的急、慢性腎衰，特別是各種慢性腎臟疾病導(dǎo)致的慢性腎衰，包括原發(fā)性腎臟病如腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、小管間質(zhì)性腎病、遺傳學(xué)腎炎、多囊腎等，繼發(fā)性腎病如糖尿病腎病、腹膜后纖維化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高血壓性腎病、高尿酸血癥腎病等，以及尿路梗阻性腎?。环卫w維化疾病包括慢性阻塞性肺病(COPD)、特發(fā)性肺纖維化、間質(zhì)性肺炎等；心血管組織纖維化疾病包括高血壓、高血壓心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、擴(kuò)張性心肌病、肥厚性心肌病、心律失常(特別是心房纖顫、室性心動(dòng)過速)、慢性心衰等；肝纖維化疾病包括病毒性肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝等)，酒精性肝炎，脂肪肝，以及上述肝病及其它原因?qū)е碌母斡不取１景l(fā)明中的具有CpG基序的核酸可以單獨(dú)或作為主要成分形成各種藥物組合物或劑型后應(yīng)用于個(gè)體。個(gè)體可以是人或動(dòng)物。可經(jīng)腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、粘膜用藥等途徑應(yīng)用。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明為現(xiàn)有的具有CpG基序的核酸提供了一種新用途，用于制備抗纖維化藥物。該藥物可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)組織纖維化，特別是腎纖維化，肺纖維化，心血管組織纖維化和肝纖維化。纖維化疾病一直沒有有效的藥物和治療方法，長期困擾著諸如慢性腎臟病、高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺病、肝硬化等病人及其家屬和醫(yī)生。具有CpG基序的核酸作用疫苗或治療性小分子物質(zhì)用于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)組織纖維化，將切實(shí)有效的解除這些病人痛苦，為人類健康帶來福音，具有廣闊的治療前景以及重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和有益效果。圖l，CpGODN抑制體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌M2細(xì)胞因子及IL-17。其中，圖A和C為不同濃度CpGODN無顯著性增加Ml型巨噬細(xì)胞分泌的IL-12;圖B和D為不同濃度CpGODN顯著減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-10;圖E，不同濃度CpGODN明顯增加Ml/M2巨噬細(xì)胞(IL-12/IL-10)的比值；圖F，CpGODN顯著降低巨噬細(xì)胞分泌的IL-17。圖2，CpGODN預(yù)防UUO誘導(dǎo)的腎纖維化。其中，圖A，CpGODN降低UUO誘導(dǎo)的腎纖維化(HE染色-100倍、Masson染色-200倍、免疫組織化學(xué)染色-200倍)；圖B，CpGODN明顯降低動(dòng)物腎組織膠原面積比例；圖C，CpGODN明顯減少腎組織羥脯氨酸的含量；圖D，CpGODN明顯降低ct-SMA(a-平滑肌肌動(dòng)蛋白)的表達(dá)。其中a-SMA為a-平滑肌肌動(dòng)蛋白；IOD為積分光密度值。圖3，CpGODN降低纖維化前膠原的mRNA表達(dá)并調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs(金屬基質(zhì)蛋白酶/金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑)平衡。其中，圖A，CpGODN調(diào)節(jié)相關(guān)基因mRNA表達(dá)的典型圖；圖B，CpGODN顯著降低前膠原I的表達(dá)；圖C，CpGODN明顯抑制a-SMA的表達(dá)；圖D,CpGODN明顯抑制MMP2的表達(dá)；圖E，CpGODN顯著抑制TIMPl的表達(dá)；圖F，CpGODN上調(diào)MMP2/TMPl的比值，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖4，CpGODN對(duì)MCP-l(單核細(xì)胞趨化蛋白-l)、趨化因子RANTE的mRNA表達(dá)和免疫效應(yīng)細(xì)胞分布的調(diào)節(jié)作用。其中，圖A，CpGODN明顯減少腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤；圖B，CpGODN顯著降低MCP-1的表達(dá)；圖C，CpGODN顯著降低RANTE的表達(dá)。其中，IOD為積分光密度值；AU為相對(duì)單位。圖5,CpGODN對(duì)TLRs(Toll樣受體)及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響。其中，圖A，CpGODN無顯著性降低脾臟中TGF-p(轉(zhuǎn)化生長因子-P)表達(dá)；圖B，CpGODN明顯增加脾臟中IL-12表達(dá)；圖C，CpGODN顯著增加脾臟中IL-12/TGF-f3的比值；圖D，CpGODN顯著降低腎臟中TGF-p表達(dá)；圖E，CpGODN明顯增加腎臟中IFN-Y(干擾素-Y)表達(dá)；圖F,CpGODN明顯增加腎臟中IFN-Y/TGF-p的比值；圖G，CpGODN對(duì)腎臟中TLR2表達(dá)無明顯作用；圖H,CpGODN對(duì)腎臟中TLR4表達(dá)無明顯作用；圖I,CpGODN顯著增加腎臟中TLR9表達(dá)；圖6，CpGODN對(duì)Thl、Th2細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。其中，圖A，CpGODN對(duì)Thl、Th2、Treg(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)及Thl7細(xì)胞因子表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用；圖B，CpGODN對(duì)Thl細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)無明顯作用；圖C，CpGODN對(duì)Thl細(xì)胞因子IFN-Y的表達(dá)無明顯作用；圖D，CpGODN顯著降低Th2細(xì)胞因子PAI-l(纖溶酶原激活物抑制因子l)的表達(dá)；圖E，CpGODN明顯降低Th2細(xì)胞因子IL-13的表達(dá)；圖F，CpGODN顯著降低Treg細(xì)胞因子TGF-(31的表達(dá)；圖G，CpGODN明顯降低Thl7細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)。其中，IOD為積分光密度值。圖7,CpGODN減輕因UUO誘導(dǎo)14天形成的腎纖維化。其中，圖A,CpGODN具有抗腎纖維化的作用(Masson染色，IO倍)；圖B，CpGODN具有抗腎纖維化的作用(Masson染色，40倍)；圖C，CpGODN具有抗腎纖維化的作用(免疫熒光染色，ot-SMA表達(dá))；圖D，CpGODN具有抗腎纖維化的作用(免疫熒光染色，E-鈣粘素表達(dá))；圖E，CpGODN顯著降低腎間質(zhì)絕對(duì)膠原面積及膠原面積比例；圖F，CpGODN明顯降低ct-SMA的表達(dá)、增加E-鈣粘素的表達(dá)。圖8，CpGODN逆轉(zhuǎn)UUO誘導(dǎo)21天所形成的腎纖維化。其中，圖A，CpGODN具有抗腎纖維化的作用(Masson染色，IO倍)；圖B，CpGODN具有抗腎纖維化的作用(Masson染色，20倍)；圖C,CpGODN顯著降低腎間質(zhì)絕對(duì)膠原面積及膠原面積比例；圖D，CpGODN明顯降低(x-SMA的表達(dá)、增加E-鈣粘素的表達(dá)。圖9，CpGODN給藥后對(duì)纖維化腎功能的改善。其中，圖A、B，CpGODN明顯降低UUO術(shù)后14天的血清肌肝和尿素氮水平；圖C、D，CpGODN明顯降低UUO術(shù)后21天的血清肌肝和尿素氮水平。圖10，CpGODN給藥后能逆轉(zhuǎn)因腎纖維化引起的免疫耐受性。其中，圖A，CpGODN顯著降低UUO術(shù)后4天脾臟中M2巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+細(xì)胞比例；圖B，CpGODN對(duì)UUO術(shù)后14天腎臟中M2巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+細(xì)胞比例無明顯作用；圖C，CpGODN明顯降低UUO術(shù)后21天脾臟中M2巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+細(xì)胞比例；圖D，CpGODN無顯著性降低UUO術(shù)后21天腎臟中M2巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+細(xì)胞比例；圖e，CpGODN對(duì)腎組織細(xì)胞因子TGF-pi、IFN-y、IL-13表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；圖F，CpGODN顯著降低TGF-(31的表達(dá)；圖G，CpGODN無顯著性增加IFN-Y的表達(dá)；圖H，CpGODN顯著降低IL-13的表達(dá)。其中IOD為積分光密度值。圖ll，CpGODN對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)Smad3，Stat3(轉(zhuǎn)錄激活因子3)，MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)作用。其中，圖A，CpGODN顯著抑制Smad3的活性；圖B，CpGODN明顯抑制Stat3的表達(dá)；圖C，CpGODN顯著降低ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控蛋白激酶)的活性；圖D,CpGODN具有活化p38的作用；圖E，CpGODN明顯上調(diào)p-p38/p-ERK(磷酸化p38/磷酸化ERK)的比值。圖12，CpGODN對(duì)壓力過負(fù)荷引起的高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響。其中，圖a，CpGODN對(duì)大鼠心率無明顯影響；圖b，CpGODN未明顯降低大鼠血壓；圖c，CpGODN明顯降低LVEDP(左室舒張末壓)；圖d，CpGODN明顯降低dp/dtmax(左室收縮壓最大上升速率)；圖e，CpGODN未明顯改變dp/dtmin(左室舒張壓最大下降速率)絕對(duì)值。圖13，CpGODN減輕壓力過負(fù)荷引起的心血管肥厚。其中，圖a，CpGODN抑制心臟肥大；圖b，CpGODN明顯降低ANP(心鈉素)的表達(dá)；圖c，CpGODN顯著降低心肌細(xì)胞直徑(Masson染色，200倍)；圖d，CpGODN降低主動(dòng)脈血管直徑(Masson染色，400倍)；圖e，CpGODN顯著降低心肌細(xì)胞的直徑；圖f，CpGODN顯著降低主動(dòng)脈血管直徑。圖14,造模手術(shù)后28天，CpGODN減輕壓力過負(fù)荷引起的心臟纖維化。其中，圖a，CpGODN對(duì)心臟纖維化的抑制作用(Masson染色，200倍)；圖b，CpGODN顯著降低心臟纖維化；圖c，CpG0DN顯著增加MMP9/TIMP1(金屬基質(zhì)蛋白酶9/金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑l)表達(dá)的比值；圖d，CpGODN顯著降低膠原I的表達(dá)。圖15，CpGODN促進(jìn)Thl細(xì)胞反應(yīng)，降低Smad2和Smad3表達(dá)，增強(qiáng)浸潤到心臟免疫細(xì)胞上的TLR4表達(dá)。其中，圖a,CpGODN對(duì)TGF-(31(轉(zhuǎn)化生長因子-Pl)表達(dá)的影響(Masson染色，標(biāo)尺為100微米)；圖b，CpGODN對(duì)IFN-Y(干擾素-y)表達(dá)的影響(Masson染色，標(biāo)尺為100微米)；圖c，CpGODN顯著降低TGF-(31的表達(dá)；圖d,CpGODN明顯增力口IFN-Y的表達(dá)；圖e，CpGODN顯著增力口IFN-Y/TGF-卩l(xiāng)比值；圖f，CpGODN顯著抑制Smad2的活性；圖g，CpGODN明顯降低Smad3的表達(dá)；圖h，CpGODN增強(qiáng)浸潤到心臟免疫細(xì)胞上的TLR4表達(dá)(激光共聚焦掃描顯微鏡分析)。圖16，CpGODN對(duì)壓力過負(fù)荷所致心臟肥大信號(hào)通道的表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)作用。其中，圖a，CpGODN無顯著性降低蛋白激酶Akt的表達(dá)；圖b，CpGODN顯著降低p-AKT〔磷酸化AKT)的表達(dá)；圖c，CpGODN顯著增強(qiáng)GSK-3p(糖原合成酶激酶-3p)的活性。圖17，CPGODN調(diào)節(jié)心臟組織TLR活性。其中，圖a，CpGODN顯著降低TAK1(激活性激酶l)的表達(dá)；圖b，CpGODN顯著降低IRF3(干擾素調(diào)節(jié)因子3)的表達(dá)；圖c，CpGODN無顯著性增加p-p38(磷酸化p38)的表達(dá)；圖d，CpGODN明顯降低ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控蛋白激酶)的表達(dá)；圖e，CpGODN顯著降低p-ERK(磷酸化ERK)的表達(dá)；圖f，CpGODN顯著降低NF-KB(核轉(zhuǎn)錄因子-KB)的表達(dá)；圖g，CpGODN明顯降低i-KB(抑制蛋白kB)的表達(dá)；圖h,CpGODN明顯降低pi-KB(磷酸化i-KB)的表達(dá)。圖18，CpGODN降低博萊霉素引起肺纖維化,的病理學(xué)檢查(HE染色，IOO倍)。其中，圖A:假手術(shù)組；圖B:模型組；圖C:干擾素組；圖D:陰性對(duì)照組(GpC組)；圖E:CpG組。圖19，CpGODN降低博萊霉素引起肺纖維化的病理學(xué)檢査(Masson染色，200倍)。其中，圖A:假手術(shù)組；圖B:模型組；圖C:千擾素組；圖D:GpC組；圖E:CpG組。圖20，CpGODN降低博萊霉素引起肺纖維化的病理影像學(xué)分析。其中，圖A，CpGODN顯著降低膠原絕對(duì)面積百分比；圖B，CpGODN顯著降低膠原相對(duì)面積百分比。圖21，CpGODN對(duì)小鼠肺組織羥脯氨酸及膠原含量的影響。其中，圖A，CpGODN顯著降低小鼠肺組織羥脯氨酸的含量；圖B，CpGODN顯著降低小鼠肺組織膠原的含量。圖22，CpGODN對(duì)小鼠肺組織MMPs(金屬基質(zhì)蛋白酶)、TIMPs(金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制劑)及ProColI(前膠原I)表達(dá)水平的影響。其中，圖A，CpGODN明顯增加MMP2的表達(dá)；圖B，CpGODN明顯增加MMP9的表達(dá)；圖C，CpGODN明顯降低TIMP1的表達(dá)；圖D，CpGODN明顯降低TIMP2的表達(dá)；圖E，CpGODN顯著降低前膠原I的表達(dá)。圖23，CpGODN對(duì)小鼠肺臟MMPs/TIMPs表達(dá)平衡的影響。其中，圖A，CpGODN對(duì)MMP2/TIMP1的表達(dá)無明顯差異性影響；圖B,CpGODN明顯增加MMP2/TIMP2的表達(dá)；圖C，CpGODN顯著增加MMP9/TIMP1的表達(dá)；圖D，CpGODN明顯增加MMP9/TIMP2的表達(dá)。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下面實(shí)施例中所述的"室溫"是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為20-25"C。實(shí)施例1CpGODN在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導(dǎo)的腎纖維化方面的新用途材料和方法主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-實(shí)驗(yàn)所用的CpGODN(ODN1826:5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'全程硫代)(本發(fā)明中，全程硫代是指DNA分子骨架中的全部的磷酸二酯鍵都改變?yōu)榱虼姿狨ユI)及陰性對(duì)照GpCODN(ODN1826c:5'-tccatgagcttcctgagctt-3'全程硫代)，均由北京賽百盛生物工程公司合成并純化。使用時(shí)溶解于PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)。實(shí)驗(yàn)所用的SPF級(jí)SD大鼠(雄性，180200g)及C57BL/6小鼠(雄性，6~8周齡，16~18g)，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateralureteralobstruction,UUO)誘導(dǎo)腎纖維化動(dòng)物模型制備動(dòng)物禁食過夜，戊巴比妥鈉(45mg/kg，i.p.)(i.p.表示腹腔注射)麻醉。仰臥位固定，腹部局部剃毛，消毒手術(shù)部位，腹正中線切口，依次切開皮膚、肌肉暴露腹腔。在左后腹壁辨認(rèn)左側(cè)腎臟及輸尿管，將左側(cè)輸尿管在上l/3部位用4-0絲線兩點(diǎn)結(jié)扎，兩點(diǎn)間距離約5mm，剪斷輸尿管，關(guān)閉腹腔，依次縫合肌肉皮膚，青霉素皮下注射抗感染。上述手術(shù)是除假手術(shù)組以外的其它組的動(dòng)物進(jìn)行的手術(shù)，假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，但僅分離輸尿管不做結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)如下-實(shí)驗(yàn)l:SD大鼠按體重隨機(jī)分為五組，每組10只。各組給藥成分如下表2所示，表中溶劑PBS指磷酸鹽緩沖生理鹽水。于造模前3天經(jīng)腹腔注射給藥，造模后第4天、第8天給藥，共3次。但是干擾素組為造模當(dāng)天開始給藥，每日一次。各組分別于術(shù)后14天處死動(dòng)物，取材。表2.CpGODN對(duì)腎纖維化作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)驗(yàn)2:C57BL/6小鼠按體重隨機(jī)分為三組，各組給藥成分如下表3所示，表中溶劑PBS指磷酸鹽緩沖生理鹽水。于造模手術(shù)后第4天開始經(jīng)腹腔注射給藥，每隔3天給藥1次。各組分別于造模手術(shù)后第14及21天處死動(dòng)物(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組15只動(dòng)物)，取材。表3.CpGODN對(duì)腎纖維化作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>腎纖維化病理評(píng)價(jià)及免疫組化l.UUO所致腎纖維化實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)分析取動(dòng)物左側(cè)腎皮質(zhì)組織，4%(w/v)多聚甲醛固定后石蠟包埋。HE染色觀察基本病理改變，Masson染色觀察纖維化狀況，并根據(jù)Masson特殊染色的結(jié)果，應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)SpotAdvanced3.0獲得高清晰的免疫組化染色的病理圖片(200倍)。使用Image-ProPlus軟件測量出每個(gè)視野染色后的著色面積。每組分析4-6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取20個(gè)視野，取均值代表一個(gè)動(dòng)物腎組織膠原染色面積，并用非參數(shù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)染色檢測腎皮質(zhì)a-SMA、CD68、IL-17、TGF-(31、PAI-1、IL-12、IFN-7和IL-13的表達(dá)，SP試劑盒(SP9001，SP9003)和顯色劑3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，ZLI-9032)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。采用SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)方法，主要步驟包括石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；胰酶抗原修復(fù)；3%(w/v)過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶；0.5%(w/v)Triton透膜；正常血清封閉；加一抗4。C過夜；加入生物素化二抗，ABC復(fù)合物，DAB顯色；透明、封片。陽性染色為胞菜或胞核棕色顆粒，陰性對(duì)照以PBS或正常山羊血清代替一抗。應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)SpotAdvanced3.0獲得高清晰的免疫組化染色的病理圖片(200倍)。使用Image-ProPlus5.1測量出每個(gè)視野染色后的著色強(qiáng)度。每組分析4-6個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取20個(gè)視野，取均值代表一個(gè)動(dòng)物腎組織特定蛋白的染色強(qiáng)度，并用非參數(shù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3.免疫熒光免疫熒光檢測腎皮質(zhì)a-SMA、E-cadherin表達(dá)。主要步驟包括腎臟組織取出用OCT(Sakurafmetech,USA)包裹，迅速用液氮冷凍。切10pM冰凍切片，丙酮固定；0.5%(w/v)Triton透膜；正常血清封閉；加一抗(1:100)4。C過夜；a-SMA加AlexaFlora594標(biāo)記抗小鼠二抗(購自Invitrogen，1:100)，E-cadherin(E-鈣粘素)加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗大鼠二抗(1:100)37"C孵育1小時(shí)，DAPI封片。以紅(或綠)和藍(lán)雙色熒光通道掃描觀察。激光共聚焦掃描顯微鏡(E2000U)檢須!la-SMA、E-cadherin的熒光表達(dá)強(qiáng)度。細(xì)胞因子表達(dá)的PCR檢測弓I物的設(shè)計(jì)使用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件"Primerprimer5.0"進(jìn)行，通過Blast進(jìn)行同源比較確保其特異性；取存放于RNA保存液中的組織，Trizol法提取總RNA，定量后以5pg量完成mRNA的逆轉(zhuǎn)錄。WesternBlot:取適量組織，加入裂解緩沖液(O.lmMEDTA，O.lmMEGTA，10mMKCI，10mMHEPEs，50mMNaF，0.1MNa3VO4，0.1MNa3PO4，1limol/L的抑肽酶(Aprotinin)，1)imol/L胰蛋白酶抑制劑(Trypsininhibitor),lpmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，1lamol/L亮抑肽酶(Leupeptins)和lpmol/LDTT(二硫蘇糖醇))勻漿后，冰上放置15min，間或振蕩；迅速加入10%(w/v)NP-40混勻，4°C、12000rpm，離心5min。取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同用于WestemBlot分析。WesternBlot實(shí)驗(yàn)中使用Amersham顯色液(華美公司NBT/BCIP染色試劑盒IK5030)顯色，經(jīng)Westem-blot分析軟件(gelPro32)測出各條帶的光密度值分析。流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠脾臟、腎臟M2細(xì)胞小鼠放血處死，迅速取脾臟，冰PBS洗，濾紙吸干，研磨并過150目篩網(wǎng)，收集過篩組織碎片，離心(4。C，800g，6分鐘)。彈散沉淀，力n500pl紅細(xì)胞裂解液(購自eBioscience公司)37'C破紅7分鐘；過150目篩網(wǎng)，收集過篩細(xì)胞，PBS洗兩次后，加入3%(w/v)BSA封閉30min;加入F4/80-FITC和CD206-TRITC抗體孵育，流式細(xì)胞儀檢測，獲得？4/80+CD206+M2細(xì)胞。腎臟組織剪碎后于含膠原酶的溶液中消化l小時(shí)，終止消化后，離心(4'C，800g，6分鐘)。彈散沉淀，力B50(^1紅細(xì)胞裂解液37'C破紅7分鐘；后同脾臟處理步驟。腎組織羥脯氨酸含量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶SOD檢測腎纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過檢測腎組織羥脯氨酸含量評(píng)價(jià)組織膠原沉積量；通過檢測MDA和SOD的活性，評(píng)價(jià)腎組織清除氧自由基的能力。新鮮腎組織勻槳，離心取上清，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。采用MDA和SOD試劑盒(購自江蘇南京建成生物有限公司)，按其測定方法分別測定腎組織羥脯氨酸含量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶SOD的含血清肌肝、尿素氮測定小鼠去眼球取血，靜置，3500rpm離心10分鐘，取血清，用于血清肌肝、尿素氮測定。分別采用血清肌肝、尿素氮試劑盒(購自中生北控生物技術(shù)股份有限公司)，按其測定方法分別測定。流式細(xì)胞術(shù)測定體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)RAW264.7細(xì)胞(購自ATCC)接種于六孔板，每孔接種5X105個(gè)細(xì)胞，分別加CpGODN0.75,1.5,3嗎/ml和GpCODN3路/ml室溫孵育24小吋進(jìn)行刺激，收細(xì)胞。冷PBS洗細(xì)胞三次，用3%(w/v)BSA室溫封閉半小時(shí)，分別用IL-17、IL-10、IL-12抗體(Ce11signalingTech公司)窒溫孵育半小時(shí)，冷PBS洗，后加熒光標(biāo)記二抗孵育。對(duì)照實(shí)驗(yàn)選用同型對(duì)照(抗體類型均為IgG型)的單克隆抗體。標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，使用CellQuest軟件(BectonDickinson)分析。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值i標(biāo)準(zhǔn)誤(X士SE)表示，使用SPSS專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗(yàn)，pO.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果CpGODN抑制體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌M2細(xì)胞因子及IL-17-現(xiàn)有技術(shù)顯示，腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)TLR9，腎臟的TLR9是由免疫細(xì)胞表達(dá)的。因此可以推斷CpGODN作為TLR9的激動(dòng)劑，其對(duì)于腎臟的免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。而巨噬細(xì)胞是腎纖維化發(fā)生發(fā)展中作用最為重要的一種免疫細(xì)胞，且巨噬細(xì)胞也有相應(yīng)于Thl和Th2極化特點(diǎn)的二種表型，即Ml和M2型。Ml型巨噬細(xì)胞以分泌IL-12等細(xì)胞因子為特征；M2型巨噬細(xì)胞主要分泌IL-10等細(xì)胞因子。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，不同濃度CpGODN(0.75,1.5,3jig/ml)刺激細(xì)胞24小時(shí)后，分泌IL-12的Ml型巨噬細(xì)胞比例有所增加，但與對(duì)照組相比無顯著差異(圖1A，C)，而分泌IL-10的M2型巨噬細(xì)胞顯著減少(圖1B，D)，即M2型巨噬細(xì)胞活化較少，Ml/M2巨噬細(xì)胞比值增力n(圖1E)。GpC對(duì)上述細(xì)胞因子無明顯作用。此外我們還檢測了巨噬細(xì)胞所分泌的IL-17。我們發(fā)現(xiàn)CpGODN降低巨噬細(xì)胞分泌IL-17(圖1F)。CpGODN預(yù)防UUO誘導(dǎo)的腎纖維化動(dòng)物行UUO后14天，腎皮質(zhì)明顯變薄，多數(shù)腎小管擴(kuò)張、萎縮，間質(zhì)浸潤的細(xì)胞數(shù)增多(圖2A:HE);腎組織有大面積膠原沉積，沉積的膠原集中于腎小囊、腎小管周圍的間質(zhì)區(qū)域(圖2A:Masson)。與未治療的UUO動(dòng)物比較，CpGODN治療顯著降低腎組織間質(zhì)膠原沉積，IFN-Y治療的動(dòng)物其腎間質(zhì)膠原沉積量也明顯少于未治療的動(dòng)物。結(jié)果表明，CpGODN和IFNY治療的動(dòng)物腎組織膠原面積比例明顯小于未治療的模型組動(dòng)物(圖2B)。組織中羥脯氨酸含量是衡量組織膠原沉積量，即腎纖維化的另一指標(biāo)。動(dòng)物行UUO后14天腎組織勻漿中羥脯氨酸含量較假手術(shù)組升高l倍；與病理結(jié)果一致，CpGODN及IFN-y均明顯減少腎組織羥脯氨酸含量(圖2C)。肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的一個(gè)亞群，特異性的表達(dá)a-SMA;此外纖維化時(shí)上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞表型即EMT，也會(huì)特異性的表達(dá)a-SMA。二者是細(xì)胞外膠原的主要來源，在很大程度上可反映組織纖維化的程度。本發(fā)明免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，uuo顯著誘導(dǎo)了a-SMA的表達(dá)，a-SMA陽性染色集中于腎小管上皮細(xì)胞周邊及腎間質(zhì)細(xì)胞，腎小球幾乎沒有(x-SMA的表達(dá)。CpGODN及IFN-Y組大鼠腎組織oc-SMA表達(dá)呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平，陽性染色面積明顯少于模型組(圖2A，D)。對(duì)纖維化標(biāo)志蛋白-前膠原I(proColI)及cx-SMA的mRNA表達(dá)情況檢測結(jié)果顯示在正常腎臟，前膠原I的水平較低，纖維化時(shí)則大幅升高，行UUO14天時(shí)前膠原I在腎組織的表達(dá)較假手術(shù)組上升了2.5倍(p0.001)。CpGODN和IFN-Y則顯著降低前膠原I的表達(dá)(圖3A，B)。UUO也誘導(dǎo)了a-SMA的mRNA表達(dá)(p0.05)，同樣CpGODN和IFN-y對(duì)其表達(dá)有明顯的抑制作用(圖3A，C)。同時(shí)檢測了組織中降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，和它的抑制物(TIMPs)的表達(dá)。在假手術(shù)組大鼠腎組織，MMP2(明膠酶A)及TIMP1均表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平。UUO大幅度地誘導(dǎo)了MMP2及TIMPl的mRNA表達(dá)，與假手術(shù)組比較，兩者在UUO后14天分別增加了4.5倍(圖3A，D)和5.5倍(圖3A，E)，CpGODN對(duì)二者的表達(dá)均有顯著的抑制作用，而IFN-7僅對(duì)TIMP-1有明顯的抑制作用。從比值上看，CpGODN增加了MMP2/TIMP1的比值(p0.05)，但作用不及IFN-7顯著(圖3F)。CpGODN降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腎纖維時(shí)抑制性免疫微環(huán)境基于炎癥在腎纖維化中的重要作用，我們撿測了腎組織局部化學(xué)趨化因子的表達(dá)及浸潤到腎組織的巨噬細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示單核細(xì)胞趨化因子(MCP-l)mRNA表達(dá)在UUO后顯著增加，CpGODN和IFN-Y治療組腎組織MCP-l的表達(dá)明顯低于模型組(圖4B)。另一種化學(xué)趨因子-調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)分泌因子(RANTE)基礎(chǔ)表達(dá)及UUO誘導(dǎo)后無明顯差異，但給予CpGODN和IFN-Y干預(yù)后仍明顯減少了RANTE的表達(dá)。相應(yīng)于化學(xué)趨化因子表達(dá)的降低，腎組織局部浸潤的免疫細(xì)胞量也有所改變。我們發(fā)現(xiàn)行UUO后14天，腎組織局部CD68+巨噬細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組，CpGODN和IFNi的干預(yù)在不同程度上減少了間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤(圖4A)。在檢測脾臟及腎組織細(xì)胞因子的表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)無論是在脾臟還是腎臟，UUO明顯誘導(dǎo)了TGF-卩mRNA(圖5A，D)的表達(dá)，對(duì)IFN-y(圖5B，E)和IL-12(圖5C)的表達(dá)沒有顯著的影響；CpGODN禾口IFN-Y均具有下調(diào)抑制性細(xì)胞因子TGF-卩和上調(diào)TW細(xì)胞因子IL-12或IFN-ymRNA表達(dá)的作用。對(duì)TLRsmRNA表達(dá)情況的結(jié)果表明，UUO不同程度地誘導(dǎo)了TLR2、TLR4和TLR9的表達(dá)；與模型組比較，CpGODN主要上調(diào)了腎組織局部TLR9的表達(dá)而對(duì)TLR2及TLR4作用不明顯(圖5G-I)。為進(jìn)一步研究腎組織局部免疫微環(huán)境的變化，我們對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的分析。主要檢測了TM、Th2、Treg及Thl7細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果表明，UUO對(duì)Thl、Th2、Treg及Thl7免疫反應(yīng)均有誘導(dǎo)作用，在腎組織局部形成一種比較復(fù)雜的炎癥狀態(tài)。CpGODN和IFN-Y對(duì)Thl細(xì)胞因子IL-12(圖6A，B)、IFN-y(圖6A,C)的表達(dá)沒有明顯作用，與模型組比較無差異；但比較明顯地抑制了Th2型抑制性細(xì)胞因子PAI-l(圖6A，D)、IL-13(圖6A，F(xiàn))和Treg細(xì)胞因子TGF-(3的表達(dá)(圖6A，F(xiàn))。這些結(jié)果進(jìn)一步確證，CpGODN和IFN-Y都具有抑制Th2，Treg免疫反應(yīng)，使Thl/Th2/Treg平衡向Thl方向極化的作用。IL-17是一種在慢性炎癥疾病中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，而腎纖維化正是一種慢性炎癥性疾病。IL-17的分泌受到TGF-(3的正性調(diào)節(jié)。在整體模型上，我們發(fā)現(xiàn)UUO誘導(dǎo)了腎組織局部IL-17的表達(dá)，而CpGODN禾niFN-Y則有效地抑制了IL-17的表達(dá)(圖6A，G)。這可能與CpGODN及IFN-Y能夠很好地抑制TGF-p的表達(dá)有關(guān)。在體內(nèi)，IL-17主要由Thl7細(xì)胞分泌，這提示我們，腎纖維化可能也有Thl7的參與，而CpGODN對(duì)于T細(xì)胞向TM7細(xì)胞的分化具有調(diào)節(jié)作用。CpGODN逆轉(zhuǎn)已形成的腎纖維化已有的研究顯示，減少抑制性Th2型細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)Thl免疫反應(yīng)具有抗纖維化作用。CpGODN能夠通過活化TLR9，調(diào)整免疫反應(yīng)向Thl方向極化，因此我們有理由相信，CpGODN可能具有逆轉(zhuǎn)腎纖維化的作用。我們?cè)谇懊娴膶?shí)驗(yàn)中己確定，行UU03天即可以誘導(dǎo)明確的腎纖維化改變。因此我們選擇UUO第4天開始藥物治療，觀察CpGODN是否具有抗纖維化作用。結(jié)果顯示，CpGODN具有明顯的抗腎纖維化作用，經(jīng)CpGODN治療后動(dòng)物腎組織沉積的膠原面積僅為模型組的一半(pO.01)(圖7A，B，E)。從免疫熒光切片可以看到，與模型組ct-SMA的強(qiáng)熒光著色相比，CpGODN治療組的熒光染色明顯較弱(圖7C)。E-鈣粘素是上皮細(xì)胞的特征性蛋白，當(dāng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，這種蛋白的表達(dá)會(huì)降低，因此它也是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志性蛋白。UU014天后，與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物腎組織E-鈣粘素?zé)晒鈴?qiáng)度極弱，腎組織結(jié)構(gòu)不完整。CpGODN治療組有較亮的熒光染色，腎組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，一些腎小管尚保存有完整的基底膜結(jié)構(gòu)(圖7D)。為進(jìn)一步確證此結(jié)果，我們用Westernblot法檢測了二種蛋白的表達(dá)。得到的結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果一致，經(jīng)UUO誘導(dǎo)后二種蛋白在腎組織的表達(dá)呈現(xiàn)明顯相反的變化趨勢，UUO后(x-SMA顯著增加，而E-鈣粘素表達(dá)有明顯的減少；藥物治療則逆轉(zhuǎn)了上述改變，在降低a-SMA表達(dá)的同時(shí)，維持了E-鈣粘素的基礎(chǔ)表達(dá)(圖7F)。在UUO21天，CpGODN也顯示出較好療效(圖8)，對(duì)于上述指標(biāo)均有較明顯的改善作用。為了觀察藥物在改善纖維化的同時(shí)是否對(duì)腎功能有改善作用，我們檢測了小鼠血清肌肝及尿素氮含量。UUO后小鼠血清肌肝及尿素氮水平均上升，14天時(shí)尿素氮水平與假手術(shù)組相比已有顯著差異；UU021天，模型組小鼠血清肌肝和尿素氮水平均顯著高于假手術(shù)組，提示腎臟的清除功能發(fā)生障礙。CpGODN在UUO14天及21天都能明顯減少血清肌肝和尿素氮水平，使之趨于正常(圖9)。這說明CpGODN在改善纖維化的同時(shí)，也改善了腎功能。這也驗(yàn)證了前人的結(jié)論，腎功能與纖維化程度成反比，逆轉(zhuǎn)纖維化則有助于改善腎功能。CpGODN逆轉(zhuǎn)腎纖維化是由于逆轉(zhuǎn)組織免疫抑制微環(huán)境為了觀察CpGODN對(duì)組織免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，我們檢測了在腎纖維化中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)UUO14天及21天時(shí)，M2巨噬細(xì)胞即F4/80+CD206+細(xì)胞比例在脾臟中明顯增多(圖10A，C);CpGODN治療后，M2細(xì)胞比例有大幅度減少(p0.05)。在腎臟，UU014天時(shí)，模型組M2型巨噬細(xì)胞比例尚無明顯變化，UU021天時(shí)，則有顯著增多(圖10B，D)，CpGODN在21天時(shí)有減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞的趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。在檢測腎組織細(xì)胞因子表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，UUO誘導(dǎo)了抑制型細(xì)胞因子TGF-(3和IL-13的表達(dá)；CpGODN顯著地減少了這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)，CpGODN對(duì)IFN-Y有上調(diào)作用，但效果不明顯，因此也提高了IFN-y/TGF-P，ifn-y/IL-13比信，提示Thl/Th2/Treg平衡向Thl方向發(fā)展(圖10E-H)。目前普遍認(rèn)為，TGF-(3/Smads信號(hào)在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。其中Smad3在促進(jìn)膠原生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄方面的作用受到肯定和關(guān)注，因此我們觀察CpGODN對(duì)TGF/Smads信號(hào)的影響。結(jié)果，UUO誘導(dǎo)了Smad3的表達(dá)，CpGODN在降低TGF-p表達(dá)的同時(shí)，也抑制Smad3的活性(圖llA)。Stat3是免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的抑制性轉(zhuǎn)錄分子，而且對(duì)于調(diào)節(jié)Thl/Th2免疫反應(yīng)具有重要作用。蛋白測定結(jié)果顯示，UUOM天時(shí)Stat3的表達(dá)顯著上升(p0.001)，CpGODN對(duì)Stat3的表達(dá)具有抑制作用(圖11B)。此外我們還發(fā)現(xiàn)CpGODN對(duì)于MAPK信號(hào)具有不同的調(diào)節(jié)作用，它顯著降低ERK的活性(圖11C)，但同時(shí)具有活化p^的作用(圖llD)，上調(diào)p-p，p-ERK比銜圖llE)。總結(jié)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TLR9配基-CpGODN可以作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)組織局部免疫微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)UUO所誘導(dǎo)的腎纖維化。我們發(fā)現(xiàn)以疫苗形式給予TLR9激動(dòng)劑，可通過抑制炎癥，調(diào)節(jié)腎組織免疫微環(huán)境，預(yù)防UUO所致的腎纖維化；而對(duì)于已經(jīng)形成的纖維化改變，CpGODN通過促進(jìn)Thl免疫反應(yīng)、抑制Th2、Treg免疫反應(yīng)，調(diào)整二者的平衡狀態(tài)，發(fā)揮抗纖維化作用。CpGODN激活的TLR9信號(hào)途徑與經(jīng)典的調(diào)節(jié)腎臟組織修復(fù)的信號(hào)途徑間存在復(fù)雜聯(lián)系。CpGODN能抑制ERK、pERK和轉(zhuǎn)錄因子Stat3的表達(dá)，卻能上調(diào)pp38的表達(dá)。這些信號(hào)一方面與纖維化相關(guān)，另一方面參與TLR9調(diào)節(jié)Thl/Th2/Treg/Thl7免疫平衡。慢性腎臟病是繼心腦血管病、腫瘤、糖尿病之后又一威脅人類健康的疾病。對(duì)病人而言，無疑是一場災(zāi)難，它意味著將終生接受透析或是進(jìn)行腎移植。多數(shù)慢性腎臟病患者在發(fā)展為終末性腎功能衰竭前是可以得到正確診斷的，但遺憾的是目前還沒有確實(shí)有效的治療手段完全阻止慢性腎病的進(jìn)程，所以我們的研究發(fā)現(xiàn)CpGODN作用疫苗或治療性小分子物質(zhì)用于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腎纖維具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。實(shí)施例2CpGODN在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心血管組織纖維化方面的新用途材料和方法主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用的CpGODN(ODN1585:5'ggGGTCAACGTTGAgggggg3')及陰性對(duì)照GpCODN(ODN1585con:5'ggGGTCAAGCTTGAgggggg3'),均由北京賽百盛生物工程公司合成并純化。其中，大寫字母表示其中的磷酸二酯鍵沒有經(jīng)過修飾，小寫字母表示其中的磷酸二酯鍵由硫代磷酸酯鍵代替。使用時(shí)溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水。實(shí)驗(yàn)所用的SPF級(jí)Wister大鼠(雄性，240280g)，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。心血管纖維化動(dòng)物模型制備動(dòng)物經(jīng)腹腔戊巴比妥鈉麻醉(4050mg/kg,i.p.)后，進(jìn)行腎上腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)或假手術(shù)。大鼠仰位于鼠板固定，剪去手術(shù)處皮毛，消毒后腹正中切口，切開皮膚及肌層，切口約1.52cm;暴露內(nèi)臟后，用手指伸入腹腔，腹腔主動(dòng)脈的搏動(dòng)，以判斷其位置，然后用浸有生理鹽水的消毒紗布將大鼠胃及腸系膜等推向右側(cè)暴露腎臟及脊柱前腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分支上方分離腹主動(dòng)脈lcm長，用7號(hào)注射針頭緊貼腹主動(dòng)脈平行放置，并將二者一起結(jié)扎，然后抽出注射器針頭，即可縮窄腹主動(dòng)脈。術(shù)后每天用青霉素5萬U/只腹腔注射一周，以免感染。上述手術(shù)是除假手術(shù)組以外的其它組的動(dòng)物進(jìn)行的手術(shù)，假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，但僅分離腹主動(dòng)脈不做結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)如下Wister大鼠按體重隨機(jī)分為五組，每組15只。各組給藥成分如下表4所示，表中溶劑PBS指磷酸鹽緩沖生理鹽水。于造模前3天經(jīng)腹腔注射給藥，造模后第4天、第8天給藥，共3次。但是干擾素組為造模當(dāng)天開始給藥，每日一次。于造模手術(shù)后28天處死動(dòng)物，取材。表4.CpGODN對(duì)心血管纖維化作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組別給藥劑量及給藥方案溶劑假手術(shù)組(n=15)等量溶劑i.p.造模前3天及造模手術(shù)后第4、8天給予PBS模型組(n=15)等量溶劑i.p.PBSCpG組(n=15)CpGODN40昭/kgi.p.PBS陰性對(duì)照組(n=15)GpCODN40}ig/kgi.p.PBS干擾素組(n=15)IFN-YIO萬IU/kgi.p.造模手術(shù)后當(dāng)天開始給藥，每日一次PBS血流動(dòng)力學(xué)檢測:術(shù)后28天，腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉動(dòng)物，將其固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部正中切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，PE50導(dǎo)管插管入左心室。MPA2000測定血流動(dòng)力學(xué)改變，計(jì)算反映左室收縮功能的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左室最大收縮壓(LVSP)、左室壓力上升最大速度(+dp/dt,max)，及反映左室舒張功能的指標(biāo)左室最大舒張壓(LVDP)、左室舒張末內(nèi)壓(LVEDP)、左室壓力下降最大速度(-dp/dt,min)。組織化學(xué)分析心臟和主動(dòng)脈經(jīng)4%(w/v)多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，HE或Masson's染色分析肥厚或纖維化程度。為檢測心肌細(xì)胞肥大，選取至少200個(gè)有核且邊界清楚的心肌細(xì)胞測量最短直徑。Masson's染色確定心臟膠原沉積程度。應(yīng)用高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)SpotAdvanced3.0獲得高清晰Masson特殊染色的病理圖片(心肌200倍放大；血管400倍放大)。使用Image-ProPlus5.1軟件，測量出每個(gè)視野Masson染色后膠原著色面積、視野下心肌組織面積。以著色面積與視野心肌組織面積比表示該膠原相對(duì)含量。每組分析6-8個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10個(gè)視野，取均值代表一個(gè)動(dòng)物膠原組織在心肌組織內(nèi)相對(duì)含量和表達(dá)強(qiáng)度。通過非參數(shù)方差分析，比較各組"膠原相對(duì)面積"。通過Image-ProPlus5.1，用類似方法測量動(dòng)物主動(dòng)脈的厚度。免疫組織化學(xué)檢測心臟TGF-pi、IFN-y表達(dá)免疫組織化學(xué)染色檢測心肌TGF-p、IFN-y(購自SantaCmz)表達(dá)變化。采用SABC方法，主要步驟包括常規(guī)脫蠟、水化；3%(W/V)過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶；正常血清封閉；加一抗4'C過夜；加入生物素化二抗，ABC復(fù)合物孵育2h，DAB顯色；蘇木素復(fù)染、透明、封片。陽性染色為胞漿棕色顆粒。激光共聚焦掃描顯微鏡分析心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。0.4%(Wv)胃蛋白酶鹽酸溶液37。C抗原修復(fù)30min，PBS沖洗5minX3次。10%(w/v)正常山羊血清封閉，室溫孵育30min。分別滴加混合好的兔抗大鼠TLR4、小鼠抗大鼠OX62L和羊抗大鼠actin三種一抗(終濃度各10)ig/ml)，4"C過夜。PBS沖洗，5minX3次。滴加混合好的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗兔二抗(終濃度100昭/ml)、Cy-5標(biāo)記的抗羊二抗(終濃度20嗎/ml)和TIRITC(羅丹明)標(biāo)記的抗小鼠二抗(終濃度20pg/ml),室溫反應(yīng)2h，PBS沖洗5minX3次，90%(w/v)甘油封片。以紅、黃和綠三雙色熒光通道掃描觀察。激光共聚焦掃描顯微鏡檢測TLR4的熒光定量表達(dá)每張切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的10個(gè)視野觀察并計(jì)算單位面積下的熒光強(qiáng)度。斷層掃描TLR4與DC或心肌共表達(dá)細(xì)胞(10-20層)，利用LeicaTCSSP2軟件制作TLR4與DC/心肌細(xì)胞共表達(dá)的三維旋轉(zhuǎn)圖，以確定TLR4是表達(dá)于浸潤到心肌的DC還是心肌細(xì)胞本身。PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)通過Primerprimer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)Blast進(jìn)行同源比較確保其特異性。取適量存放于RNA保存液的心臟和血管組織各約100mg，Trizol法(使用購自Invi加gen的試劑盒)提取總RNA，溶于20-40pl去Emsol水，定量后完成mRNA逆轉(zhuǎn)錄。將獲得的cDNA通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR或普通PCR方法(EB染色)，分別檢測心臟組織肥大相關(guān)因子-ANP以及纖維化相關(guān)因子(TIMP1、MMP9以及ProColI等)的表達(dá)。WesternBIot分析取心肌組織100mg，用眼科剪在L5mlEppendorf管中將組織剪碎后勻漿，加入裂解緩沖液(含有1%(w/v)NP-40、0.5(w/v)%脫氧膽酸鈉、0.1(w/v)%SDS以及l(fā)nmol/L的抑肽酶、胰蛋白酶抑制劑、PMSF、亮抑肽酶和DTT)，振蕩混勻，冰上放置SOmin，間或振蕩；4°C、12000rpm，離心15min。取上清，Branford法測定蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，分裝，一部分用于SDS電泳,一部分放置-8(TC保存；用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(化學(xué)發(fā)光試劑盒和膠片均購自AmershamBiosciences)曝光。Western-blot印跡分析軟件(Gel-pro3.2)分析計(jì)算各條帶的光密度值，從而分析多種蛋白質(zhì)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值(Mean)±SE表示，使用方差分析ANOVA，各組比較后有差異，選擇適宜的檢驗(yàn)方法進(jìn)行多組樣本均值的兩兩比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，p<0.05認(rèn)為有差異，pO.01認(rèn)為有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果CpGODN改善心臟舒張功能造模手術(shù)后28天，檢測大鼠血流動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示在不影響心率的情況下，與假手術(shù)組相比，模型組動(dòng)脈收縮壓顯著升高；藥物治療后，IFN-Y、CpG組均未明顯降低血壓(p>0.05，圖12a-b)。LVEDP指標(biāo)反映心臟舒張功能，模型組顯著增加LVEDP;與模型組相比，IFN-Y和CPGODN治療后明顯降低LVEDP(pO.Ol，圖12c)。dp/dtmax指標(biāo)反映心臟收縮能力，模型組顯著升高心臟收縮能力；與模型組相比，CpGODN治療后明顯降低心臟收縮能力(圖12d)。另外，與假手術(shù)組相比，模型組明顯升高dp/dtmhi絕對(duì)值；藥物治療無顯著改變(圖12e)。GpC治療后對(duì)上述各指標(biāo)均未有明顯改變。CpGODN減輕壓力過負(fù)荷所致心血管肥厚和心臟纖維化造模手術(shù)后28天，模型組心臟及左心室明顯增大，心室壁增厚；心肌細(xì)胞直徑與假手術(shù)組相比顯著增大；藥物干預(yù)后，與模型組相比，CpGODN和IFN-7明顯抑制心臟肥大，并降低心肌細(xì)胞直徑(圖13a，c，d)。ANP是心肌肥厚的標(biāo)志物之一，通過實(shí)時(shí)-PCR檢測心臟組織ANPmRNA表達(dá)，結(jié)果顯示造模手術(shù)后28天，模型組ANPmRNA表達(dá)較假手術(shù)組增加了將近3倍，而給予CpGODN或IFN-y治療明顯降低其表達(dá)(p<0.05，圖13b)。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)除導(dǎo)致心臟肥大外，也導(dǎo)致大血管肥厚，如主動(dòng)脈(圖13e，f)。術(shù)后28天，模型組血管直徑較假手術(shù)組增加了46.5%;CpGODN或IFN-y治療降低了血管直徑約20%。上述結(jié)果表明，CpGODN或IFN-Y減輕心臟和血管肥厚。Masson染色結(jié)果顯示，模型組心臟出現(xiàn)顯著纖維化；CpGODN或IFN-治療后顯著降低心臟纖維化(圖14a，b)。檢測MMP9、TIMP1以及膠原ImRNA表達(dá)結(jié)果顯示，模型組MMP9/TIMP1表達(dá)比率顯著降低，膠原ImRNA表達(dá)明顯升高；CpGODN治療后顯著逆轉(zhuǎn)上述mRNA表達(dá)(圖14c，d)。上述結(jié)果均表明CpGODN能夠抑制壓力過負(fù)荷所致心臟纖維化。CpGODN改變心臟組織Thl/Th2平衡以及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)-通過免疫組化方法檢測心臟組織Thl型細(xì)胞因子-IFN-Y和Th2型細(xì)胞因子-TGF-pi表達(dá)。造模手術(shù)后28天，模型組明顯增加TGF-(3表達(dá)，IFN-y表達(dá)不明顯；CpGODN治療后顯著降低TGF-(31表達(dá)，增加IFN-Y表達(dá)(圖15a-d)，從而增加IFN-Y/TGF-p表達(dá)比率(圖15e)。模型組顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Smad2活性，上調(diào)Smad3表達(dá)；CpGODN治療后明顯抑制Smad2活性，降低Smad3表達(dá)(圖15f-g)。結(jié)果顯示，TGF-卩/Smad信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)壓力過負(fù)荷所致心臟纖維化。CpGODN增強(qiáng)浸潤到心臟免疫細(xì)胞上TLR4表達(dá)因TLRs既可表達(dá)于心肌細(xì)胞又可表達(dá)于免疫細(xì)胞，所以確定哪一種細(xì)胞表達(dá)的TLR參與調(diào)節(jié)心血管肥厚和心臟纖維化具有重要意義。為明確TLR4在心臟的確切定位，我們采取激光掃描共聚焦技術(shù)分析術(shù)后28天左心室切片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4是與浸潤到心臟的免疫細(xì)胞而不是心肌細(xì)胞發(fā)生共定位(圖15h);而且，造模手術(shù)后28天，CpGODN治療明顯增強(qiáng)TLR4表達(dá)。CpGODN阻斷心臟AKT激活，增強(qiáng)GSK-3Ji活性取術(shù)后28天心臟組織胞漿蛋白，進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，模型組腹主動(dòng)脈縮窄明顯增加p-Akt表達(dá)，抑制GSK-3P活性；與模型組相比，CpGODN治療后降低p-Akt表達(dá)，增強(qiáng)GSK-鄧活性(圖16)。上述結(jié)果表明，CpGODN減輕心臟肥大與下調(diào)Akt表達(dá)、上調(diào)GSK-鄧表達(dá)有關(guān)。CPGODN調(diào)節(jié)TLR信號(hào)途徑收集手術(shù)后28天心臟組織，提取蛋白進(jìn)行Westernblot分析TLRs信號(hào)途徑幾個(gè)關(guān)鍵分子表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組顯著升高TAK1和IRF3表達(dá)；與模型組相比，CpGODN治療后明顯降低其表達(dá)(圖17a-b)。NF-KB是TLR信號(hào)途徑激活的主要核轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示，模型組顯著升高NF-kB、pi-KB和i-KB表達(dá)，而CpGODN治療后其表達(dá)顯著降低(圖17f-h)。ERK/p38比值反映Th2/Thl免疫平衡，結(jié)果顯示，CpGODN顯著降低ERK、p-ERK表達(dá)，增加p-p38表達(dá)，與模型組相比差異顯著(圖17c-e)。總結(jié)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CpGODN可以作為一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)心臟免疫微環(huán)境，抑制壓力過負(fù)荷所致心血管病理性重構(gòu)，改善心功能。CpGODN能顯著增加心臟組織IFN-Y表達(dá)，抑制TGF-卩表達(dá)。也就是說，CpGODN通過激活TLR9促進(jìn)心臟組織Thl/Th2免疫平衡向Thl免疫反應(yīng)方向漂移。CpGODN能顯著增加心臟組織p38表達(dá)并增強(qiáng)其活性，降低ERK表達(dá)并抑制其活性，結(jié)果表明p38/ERK信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)心臟組織Thl/Th2平衡向Thl免疫反應(yīng)移動(dòng)。同時(shí)TGF-P/Smad和TGF-(3/TAKl信號(hào)途徑共同參與調(diào)節(jié)CpGODN逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)的過程。CpGODN顯著抑制Akt活性，增強(qiáng)GSK-3卩活性，并降低NF-kB、i-KB表達(dá)。由此說明，CpGODN逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)不但與PI3K7Akt/GSK-鄧途徑有關(guān)，而且與NF-KB表達(dá)也密切相關(guān)?，F(xiàn)在高血壓及高心病的患病率越來越高，所以我們的研究發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義和社會(huì)意義，CpGODN作為一種免疫調(diào)節(jié)劑極有可能成為治療高血壓及高心病的有效藥物。實(shí)施例3CpGODN在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肺纖維化方面的新用途材料和方法主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用的CpGODN(ODN2395:5'tcgtcgt加cggcgc:gcgccg3'全程硫代，下劃線代表其屬回文序列)及陰性對(duì)照GpCODN(ODN2395con:5'tgctgc加ggggggcccccc3'全程硫代)，均由北京賽百盛生物工程公司合成并純化；博萊霉素，購自日本化藥株式會(huì)社。使用時(shí)溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水。實(shí)驗(yàn)中所用的SPF級(jí)C57BL/6小鼠(雄性，6~8周齡，16~18g)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。肺纖維化動(dòng)物模型制備雄性C57BL/6小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥鈉(45mg/kg，i.p.)麻醉，氣管內(nèi)注射博萊霉素(5U/kg)。具體方案如下以盡量小的創(chuàng)傷切開頸部皮膚，在彎頭眼科鑷的協(xié)助下，暴露氣管，使用微量進(jìn)樣器穿刺氣管，向氣管內(nèi)注入約50pl適量博萊霉素，迅速地旋轉(zhuǎn)并直立5分鐘，以便使博萊霉素均勻地進(jìn)入左右肺葉。整個(gè)操作在約6(TC左右的手術(shù)操作臺(tái)進(jìn)行。上述手術(shù)是除假手術(shù)組以外的其它組的動(dòng)物進(jìn)行的手術(shù)，假手術(shù)組氣管內(nèi)注射等量的注射用生理鹽水，其他手術(shù)步驟同上。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)如下雄性C57BL/6小鼠按體重隨機(jī)分為五組。各組給藥成分如下表5所示，表中溶劑PBS指磷酸鹽緩沖生理鹽水。于造模手術(shù)后32天處死動(dòng)物，取材。表5.CpGODN對(duì)博萊霉素所致肺纖維化作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>肺功能測定:1.博萊霉素所致肺纖維化實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)分析取動(dòng)物右側(cè)下葉肺組織，4%(w/v)多聚甲醛固定后石蠟包埋。在包埋肺組織的蠟塊最大橫截面切片，HE染色觀察基本病理改變，Masson染色觀察纖維化狀況，并根據(jù)Masson特殊染色的結(jié)果由第三方單位(中國疾病預(yù)防控制中心輻射安全所北京康寶科技服務(wù)部)進(jìn)行病理分級(jí)觀察，標(biāo)準(zhǔn)如下0級(jí)，無纖維化；l級(jí)，輕度(+),纖維化面積低于20%，肺胸膜以及間質(zhì)胸膜下肺組織存在一定程度肺泡結(jié)構(gòu)破壞；2級(jí)，中度(++)，纖維化面積在20%~50%之間，纖維化區(qū)域從胸膜向內(nèi)局域性延伸；3級(jí)，重度(+++),纖維化面積超過50%。2.Masson特殊染色病理影像學(xué)分析應(yīng)用高清晰素彩色病理圖文分析系統(tǒng)SpotAdvanced3.0獲得高清晰的Masson特殊染色的病理圖片(200倍)。使用Image-ProPlus5.1測量出每個(gè)視野Masson染色后的膠原的著色面積、視野下肺組織面積。以著色面積、著色面積與視野肺組織面積比表示該膠原的相對(duì)含量。博萊霉素所致肺纖維化實(shí)驗(yàn)中每組分析10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取6個(gè)視野，取均值代表一個(gè)動(dòng)物膠原組織在肺組織內(nèi)的相對(duì)含量和表達(dá)強(qiáng)度。通過非參數(shù)方差分析比較各組"視野下膠原絕對(duì)面積"以及"膠原相對(duì)面積"。3.羥脯氨酸測定羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%,在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在，因此通過羥脯氨酸檢測膠原蛋白的含量。檢測動(dòng)物左肺全葉羥脯氨酸的含量，評(píng)價(jià)肺纖維化的情況。具體方法如下取動(dòng)物左側(cè)全部肺葉，記錄濕重，生理鹽水超聲勻漿制備成10%的組織勻漿，取約150^1的勻漿上清液，加500W堿水解液，渦旋混勻后，120度0.1Kpa條件下堿水解法處理40mhi(方法參照南京建成生物工程技術(shù)有限公司試劑盒說明書，略有改動(dòng))，調(diào)pH值后定容，活性炭處理后取上清。按照說明書(氯胺T法)進(jìn)行羥脯氨酸測定。細(xì)胞因子表達(dá)的PCR檢測取適量存放于RNA保存液中的組織約100mg，Trizol法(Invitrogen)提取總RNA,溶于2040pl去DEPC水，定量后完成mRNA的逆轉(zhuǎn)錄。將獲得的cDNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，1.5(w/v)。/。瓊脂糖電泳(EB染色)檢測纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析-實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值i標(biāo)準(zhǔn)誤(^tSE)表示，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗(yàn)，經(jīng)比較p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，pO.Ol認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病理學(xué)分級(jí)資料的統(tǒng)計(jì)使用卡方檢驗(yàn)，經(jīng)比較pO.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，pO.Ol認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果CpGODN抑制博萊霉素所致肺纖維化病理學(xué)檢査肺臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組肺組織未見異常改變；模型組中2例為重度纖維化，4例為中度，5例為輕度，l例未見明顯纖維增生。在模型組除肺纖維組織增生外，肺泡腔有不等的巨噬細(xì)胞，間質(zhì)有灶性炎性細(xì)胞浸潤，與假手術(shù)組相比有顯著差異(pO.01)。CpG組、干擾素組均能明顯減輕肺纖維化，與模型組相比有非常顯著性差異(PO.Ol)。而GpC組對(duì)減輕肺纖維化無明顯差異。圖18為HE染色病理學(xué)檢查結(jié)果，圖19為Masson染色病理學(xué)檢查結(jié)果，結(jié)果顯示CpGODN、干擾素都能夠不同程度的降低博萊霉素所致小鼠肺纖維化。病理影像學(xué)分析肺組織經(jīng)Massoii特殊染色后，膠原呈現(xiàn)特殊顏色。通過測定Masson特殊染色后視野下膠原絕對(duì)面積以及膠原相對(duì)面積反應(yīng)藥物治療的效果。膠原絕對(duì)面積百分比是指視野下呈現(xiàn)特殊染色的膠原組織占總視野的百分比。分析結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組能顯著增加膠原絕對(duì)面積百分比(pO.Ol，圖20A)。與模型組相比，CpGODN、干擾素均能顯著降低膠原絕對(duì)面積百分比(pO.Ol，圖20A);GpC無明顯差異(p〉0.05，圖20A)。膠原相對(duì)面積百分比是指膠原絕對(duì)面積百分比與實(shí)質(zhì)組織面積百分比的比值，可準(zhǔn)確地反映肺實(shí)質(zhì)組織纖維化水平。分析結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組能顯著增加膠原相對(duì)面積百分比(pO.Ol，圖20B)。與模型組相比，CpGODN、干擾素均能顯著降低膠原相對(duì)面積百分比(pO.Ol，圖20B);GpC無明顯差異(pX).O5，圖2013)。羥脯氨酸測定博萊霉素所致肺纖維化模型組引起肺組織羥脯氨酸含量的增加(圖21)。CpGODN能顯著降低肺組織羥脯氨酸和膠原的含量。與假手術(shù)組相比，模型組(博萊霉素)可顯著增加小鼠肺組織羥脯氨酸和膠原的含量(p<0.01，圖21)。藥物干預(yù)后，與模型組相比，CpGODN、干擾素均能非常明顯地降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸和膠原的含量(圖21)。肺組織MMPs、TIMPs以及ProColImRNA表達(dá)PCR檢測MMP是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中必不可少的酶，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。其中，在肺纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中，明膠酶A(MMP2)和明膠酶B(MMP9)發(fā)揮著重要作用。TIMP是近年來發(fā)現(xiàn)的MMP的天然抑制物，是一組能抑制MMP活性的多功能因子家族，是體內(nèi)細(xì)胞分泌的一類蛋白酶抑制劑，通過對(duì)MMPs的抑制，在正常細(xì)胞外基質(zhì)改建和各種病理過程中發(fā)揮重要作用。TIMP1是一種糖蛋白，可與活化的MMP9形成1:1的復(fù)合物而抑制其活性，降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解。TIMP2是一種非糖蛋白，與MMP2有很強(qiáng)的親和力，主要抑制MMP2活性，對(duì)MMPs家族其他成員的活性也有抑制作用，能阻斷所有被激活的MMPs的水解酶活性。PCR檢測博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺臟組織mRNA發(fā)現(xiàn)，MMP2(圖22A)、MMP9(圖22B)表達(dá)水平降低，TIMP1(圖22C)、TIMP2(圖22D)表達(dá)增強(qiáng)，ProC01I表達(dá)水平亦增強(qiáng)(圖22E)。藥物干預(yù)后，CpGODN、干擾素均可增強(qiáng)小鼠肺臟MMP2(圖22A)、MMP9(圖22B)的表達(dá)水平，降低小鼠肺臟TIMP1(圖22C)、TIMP2(圖22D)、ProC01I(圖22E)的表達(dá)水平。MMPs/TIMPs的失衡也是促使肺纖維化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素，TIMPs在平衡中占優(yōu)勢，膠原降解能力下降。模型組(博萊霉素)所致肺纖維化小鼠與假手術(shù)組相比，肺組織MMP9/TIMPl(p<0.05，圖23C)、MMP9/TIMP2(p<0.05，圖23D)顯著降低，MMP2/TIMP2無差異性降低(圖23B)，MMP2/TIMP1表達(dá)沒有明顯差異。藥物干預(yù)后，CpGODN、干擾素均可增強(qiáng)MMP9/TIMP1、MMP9/TIMP2以及MMP2/TIMP2之間的平衡(圖23)，在纖維化期維持較強(qiáng)的膠原降解能力?？偨Y(jié)本實(shí)驗(yàn)中，通過病理學(xué)檢查和病理影像學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpGODN能顯著抑制博萊霉素引起的肺纖維化；降低肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸、膠原的含量；并降低與肺纖維化相關(guān)的TIMPs、ProCo11表達(dá)，增強(qiáng)與肺纖維化相關(guān)的MMPs表達(dá)，改變MMPs/TIMPs的平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CpGODN在肺纖維化疾病方面具有一定的治療前景。權(quán)利要求1、具有CpG基序的核酸在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的具有CpG基序的核酸包括細(xì)菌DNA和人工合成的具有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸。3、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人工合成的具有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸是經(jīng)過硫代磷酸?；揎椀墓丫勖撗鹾塑账?。4、如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人工合成的具有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸選自A型、B型和C型。5、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的纖維化包括腎纖維化，肺纖維化，心血管組織纖維化、肝纖維化和胰腺纖維化。6、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腎纖維化包括急性或慢性腎衰。7、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肺纖維化包括慢性阻塞性肺病、特發(fā)性肺纖維化和間質(zhì)性肺炎。8、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的心血管組織纖維化包括高血壓、高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、擴(kuò)張性心肌病、肥厚性心肌病和慢性心衰。9、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝纖維化包括病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化。全文摘要本發(fā)明公開了具有CpG基序的核酸在制備抗纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明為現(xiàn)有的具有CpG基序的核酸提供了一種新用途，用于制備抗纖維化藥物。該藥物可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)組織纖維化，特別是腎纖維化，肺纖維化，心血管組織纖維化和肝纖維化。纖維化疾病一直沒有有效的藥物和治療方法，長期困擾著諸如慢性腎臟病、高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺病、肝硬化等病人及其家屬和醫(yī)生。具有CpG基序的核酸作用疫苗或治療性小分子物質(zhì)用于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)組織纖維化，將切實(shí)有效的解除這些病人痛苦，為人類健康帶來福音，具有廣闊的治療前景以及重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。文檔編號(hào)A61P9/00GK101524362SQ20091004567公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年1月21日優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日發(fā)明者呂曉希,楊紅振,王曉星,胡卓偉,辛冰牧申請(qǐng)人:胡卓偉