專利名稱：誘導(dǎo)dna縮合的釕多吡啶配合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景 ，
DNA分子從伸展態(tài)到緊縮態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變稱為DNA縮合。在病毒和真核細(xì) 胞的細(xì)胞核內(nèi)，高度縮合且高度有序排列的DNA結(jié)構(gòu)保持了基因組的穩(wěn)定性, 使復(fù)制得以順利完成。細(xì)胞中聚胺(polyamine)通過靜電相互作用與DNA結(jié) 合,促使了這種緊密堆積狀態(tài)的形成。DNA縮合不僅是自然界常見的生理現(xiàn) 象，也是介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵步驟。病毒基因載體雖然是較有效的DNA傳遞 工具，傳遞效率一般在90%以上，約有75%的基因治療應(yīng)用了病毒載體介導(dǎo)系 統(tǒng)，但該系統(tǒng)存在局限性即病毒性和免疫原性限制其廣泛應(yīng)用，其次，該系 統(tǒng)的DNA裝載量有限，載體組裝難度大，花費高。和病毒載體相比，非病毒 載體具有安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點。從上世紀(jì)60年代中期開始，由多 價陽離子和聚陽離子誘發(fā)的DNA體外縮合就受到了廣泛的關(guān)注。據(jù)報道,，聚 胺、陽離子脂質(zhì)體、帶正電的多肽、蛋白質(zhì)、陽離子表面活性劑以及無機(jī)陽離 子都可以引起DNA縮合。迄今為止，多數(shù)化合物主要是通過所帶正電荷與DNA 骨架上的負(fù)電荷之間的靜電作用導(dǎo)致DNA縮合。近來研究發(fā)現(xiàn)，通過鏈接一 些具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)基團(tuán)到載體，利用基團(tuán)與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的嵌插 作用，可以有效地促進(jìn)載體誘導(dǎo)DNA縮合的形成效率。但是已知的非病毒載 體如聚胺、陽離子脂質(zhì)體和陽離子表面活性劑具有不易被吸收及難排泄等缺 點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對已有技術(shù)的不足，提供了高穩(wěn)定性、低毒性、光物理 性質(zhì)豐富、容易吸收并在體內(nèi)能很快排泄的釕多吡啶配合物。 本發(fā)明的另 一 目的是提供上述配合物的制備方法。 本發(fā)明還有一個目的是提供上述配合物的應(yīng)用。
i秀導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物，是由釕與輔助配體和主配體配合而成，所述輔助配體為2，2-聯(lián)吡啶(用英文表示為bpy)，所述主配體為1， 2-二(咪唑 并[4, 5-幻[1, 10-鄰菲咯啉])苯(用英文表示為obpibH2 )或1, 2-二(咪唑并[4， 5-f][1, 10-鄰菲咯啉])萘(用英文表示為obnibH2)。
本發(fā)明釕與bpy和obpibH2的配合物的陽離子部分的4匕學(xué)結(jié)構(gòu)如式I所
示
<formula>formula see original document page 5</formula>
本發(fā)明釕與bpy和obnibH2的配合物的陽離子部分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式II所
示
<formula>formula see original document page 5</formula>
本發(fā)明的配合物的陰離子部分優(yōu)選為高氯酸根離子，也可以是不影響本發(fā) 明配合物化學(xué)性質(zhì)的其他陰離子。
本發(fā)明的釕多吡啶配合物是含咪唑和1,10-鄰菲咯啉基團(tuán)的多吡啶類衍生 物配體的雙核釘多吡啶配合物，和單核金屬配合物相比，雙核金屬配合物具有更大的電荷數(shù)，構(gòu)型和大小也更具可變性，可以進(jìn)一步增強(qiáng)配合物對DNA的
親和力和i秀導(dǎo)DNA縮合。
本發(fā)明還提供所述釕多吡啶配合物的制備方法，步驟如下 將釕和輔助配體的配合物二(2,2'-聯(lián)吡啶)-二氯-二水合釕(II)和主配體化合
物溶解于乙二醇，加熱反應(yīng)，冷卻后加水稀釋，再NaC104飽和溶液即產(chǎn)生沉
淀，過濾后沉淀依次用水、乙醚洗滌后干燥，即得。 干燥后的粗產(chǎn)品可經(jīng)氧化鋁柱色譜分離提純。
所述加熱反應(yīng)的優(yōu)選溫度為120 160°C,同時用氬氣保護(hù)更有利于配合物 的制備，反應(yīng)時間8~12小時反應(yīng)進(jìn)行較為充分。
本發(fā)明的釕配合物能應(yīng)用于新型基因藥物載體的設(shè)計或制備領(lǐng)域中。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的釕多吡啶配合物具有高穩(wěn)定性、低毒性、光物理性質(zhì)豐富、'容易 吸收并在體內(nèi)很快排泄等特點，本發(fā)明提供的雙核釕多吡啶配合物，通過靜電 結(jié)合和嵌插結(jié)合共同作用導(dǎo)致DNA縮合，并且在較強(qiáng)的鹽離子濃度(如人體 生理鹽濃度150 mM NaCl)下依然能誘導(dǎo)DNA縮合，該類化合物目前在國 內(nèi)外還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，為設(shè)計、制備非病毒基因載體提供了一種新的方法 和途徑。與現(xiàn)有技術(shù)中典型的無機(jī)陽離子[Co(NH3)6產(chǎn)相比，本發(fā)明的化合物 誘導(dǎo)DNA縮合的能力大大增強(qiáng)([Co(NH3)6產(chǎn)誘導(dǎo)DNA縮合的濃度大約為 lmM，本發(fā)明的化i合物誘導(dǎo)DNA縮合的濃度大約為lOpM)。
本發(fā)明的釕多吡啶配合物，合成簡單，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有良好的光電性質(zhì)和 強(qiáng)的DNA的親和力，可以誘導(dǎo)DNA縮合成納米粒子。本申請書中的化合物 屬于首例能誘導(dǎo)DNA縮合的雙核釕多吡啶配合物。與以往的經(jīng)典的陽離子縮 合劑相比，該新型DNA縮合試劑具有更強(qiáng)的縮合能力，及生理鹽濃度下(150 mM NaCl)該新型DNA縮合試劑縮合能力不受鹽離子濃度效應(yīng)影響。


圖1為配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2廣誘導(dǎo)pBR322DNA縮合的凝膠 電-泳實一險圖2為配合物
4+誘導(dǎo)pBR322 DNA縮合的凝 膠電泳實驗圖。
具體實施方式
以下通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 實施例1
1. 配體1, 2-二(咪唑并[4, 5-f][l, 10-鄰菲咯啉])苯(obpibH2)的制備
將0.34 g, 2.0 mM計量摩爾比的1, 2-鄰苯二曱酸(o-phthalic acid)和0.86 g, 4.1 mM的1, 10-菲咯淋-5, 6-二胺(1,10-phenanthroline-5,6-diamine)混合溶解于 多聚磷酸，在氬氣保護(hù)條件下和200。C加熱回流6小時。冷卻到室溫，用水稀 釋并加25o/。氨水中和，得深綠色沉淀，收集沉淀，真空干燥，產(chǎn)率62%。元素 分析C32HuN8，實驗值C, 74.54; H, 3.27; N, 22.24%;理論值C， 74.70; H， 3.53; N， 21.78。 FAB-MS:m/z = 516(M+l).
2. 配體1, 2-二(咪唑并[4, 5-幻[l, 10-鄰菲咯啉])萘(obnibH2)的制備 方法如1,用0.43g， 2.0 mM的1， 2-鄰萘二甲酸與0.86 g， 4.1 mM的1, 10-菲咯啉-5, 6-二胺反應(yīng) ， 得綠色固體，產(chǎn)率52%。元素分析C36H2oN8，實驗值C, 76.82; H, 3.27; N, 19.62%。理論值C, 76.58; H, 3.57; N, 19.85。 FAB-MS:m/z = 566 (M+l).
3. 誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡咬配合物的制備
(1) [(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的制備
釕和輔助配體的配合物二(2,2'-聯(lián)吡啶)-二氯-二水合釕(11)(0.31 g, 0.58 mM) 和主配體obpibH2 (0.15g, 0.29 mM)溶解于乙二醇，加熱至120。C氬氣保護(hù)下反 應(yīng)12小時后，得到暗紅色清夜，冷卻至室溫，加水稀釋后，加入NaC104飽和 溶液即產(chǎn)生大量紅色沉淀，抽濾，用水，乙醚洗滌數(shù)次后干燥。將干燥后的粗 產(chǎn)品經(jīng)氧化鋁柱色譜分離提純，產(chǎn)率及元素分析如下(C104)2:產(chǎn)率70%。
元素分析C72H50N16Cl4O16Ru2,實驗值C, 50.05; H, 3.0; N， 12.60 %, 計 算值C, 49.72; H; 2.90; N, 12.89, NMR (DMSO-1/6): 9.18 (s， 2H)， 9.02 (d, 4H), 8.87 (d， 4H), 8.83 (d, 4H), 8.20 (t， 4H), 8.08 (t, 4H)， 7.98 (d, 4H)， 7.85 (d, 4H), 7.81 (t， 4H), 7.61 (d, 4H), 7.60 (t, 4H)， 7.52 (t, 2H), 7.38 (t， 4H), ES-MS [CH3CN, m/z〗 771.5 ([M - 2C104]2+), 480.7 ([M - 3C104]3+), 720.5 ([M - 3C104-H]2+)， 447.7([M -4C104-H]3+), 335.8 ([M - 4C104]4+)。
(2 ) [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2的制備
釕和輔助配體的配合物二(2，2'-聯(lián)吡啶)-二氯-二水合釘(II) (0.31 g, 0,58 mM)和主配體obnibH2 (0.16g， 0.29 mM)溶解于乙二醇，加熱至120匸氬氣{呆護(hù)下反 應(yīng)]2小時后，得到暗紅色清夜。冷卻至室溫，加水稀釋后，加入NaC104飽和 溶液即產(chǎn)生大量紅色沉淀。抽濾，用水，乙醚洗滌數(shù)次后干燥。將干燥后的粗 產(chǎn)品經(jīng)氧化鋁柱色譜分離提純，產(chǎn)率及元素分析如下 [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2:產(chǎn)率68%。
元素分析C76H52N16Cl4016Ru2,實驗值C, 51.25; H, 3.0; N， 12.20 %,計算 值C, 51.02; H, 2.93; N, 12.53，H NMR (DMSO-d6) :9.18 (s， 2H)， 9.02 (d， 4H)， 8.87 (d, 4H)， 8.83 (d， 4H), 8.20 (d， 4H), 8.08 (t, 4H), 7.98 (d, 4H)， 7.91 (t, 2H), 7.85 (d， 4H)， 7.83 (d, 4H), 7.61 (d, 4H),7.60 (t， 4H), 7.52 (t， 2H)， 7.38 (t, 4H)， ES-MS [CH3CN, m/z]: 795.2 ([M — 2C104f+)， 497.0 ([M — 3C104]3+), 744.9 ([M — 3C104-H產(chǎn))，463.5 [M— 4C104-H]3+), 347.9 ([M — 4C104]4+)。 實施例2 釕多吡咬配合物誘導(dǎo)DNA縮合的表征 (1)瓊脂糖凝膠電泳實驗
向含有相同量的pBR322 DNA(5 ng/^L)的溶液中加入不同量的釕多吡啶配 合物的溶液(O， 9, 13， 18, 27, 36, 45， 54 or 63 ng/pL)，混合均勻，加入緩沖液(50 mM Tris, 18 mM NaCl buffer, pH 7.2)使反應(yīng)液的最終體積保持在10|iL。將反應(yīng) 混合物靜置于黑暗的環(huán)境中30分鐘，然后加入2iiL溴酚藍(lán)緩沖終止液。上樣 至1%瓊脂糖凝膠板。在TBE中以卯V電泳1.5小時。以l叫/mL的EB染色 液染色30分鐘，用Alpha Innotech IS-5500化學(xué)熒光成l象分析系統(tǒng)記錄電泳圖 片，見圖1、圖2。
圖1和圖2分別為配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+誘導(dǎo)pBR322 DNA 縮合的凝膠電泳實驗圖和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2廣誘導(dǎo)pBR322 DNA縮 合的凝膠電泳實驗圖。圖1和圖2中附圖標(biāo)記均表示為0泳道DNA空白， 1-8泳道DNA+Ru酉己合物。每個泳道DNA的濃度是5 ng/(iL，從第1泳道到 第8泳道配合物的濃度依次分別為9, 13， 18, 27， 36， 45， 54 and 63 ng/^L。從電 泳圖片中得出[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2誘導(dǎo)DNA縮合的濃度為36 ng L, [(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2誘導(dǎo)DNA縮合的濃度為27 ng/|iL。
(2)原子力顯微鏡(AFM)實驗
①云母片(1 cm x l cm)新鮮解離后，滴加20|iL的二次水溶液于其上，10 秒鐘后，移去溶液。②滴力口 20|iL 1 mMMgCl2溶液于云母片，10秒鐘后，移去溶液。③將DNA溶液(5ixL)或DNA和釕多吡啶配合物的混合溶液滴在云母 片的基底上，IO分鐘后，移去溶液，用二次水充分淋洗，進(jìn)行AFM掃描。AFM 掃描結(jié)果表明
不加入本發(fā)明誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物的單純DNA呈現(xiàn)的是松弛 的環(huán)形；當(dāng)加入本發(fā)明誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物時，環(huán)形的DNA均 呈現(xiàn)出不同大小納米顆粒。加入的[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的濃度為 140ng4iL,顆粒直徑為176 nm;加入的[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2的 濃度為140ng/|iL，顆粒直徑為128 nm。
(3)激光動態(tài)光散射(DLS)實驗
含有相同量的pBR322 DNA(l ng/)LiL)的溶液中加入不同量的Ru(II)配合 物的溶液，混合均勻，加入緩沖液(50 mM Tris, 18 mM NaCl buffer, pH 7.2)使反 應(yīng)液的最終體積保持在50(iL。樣品溶液被轉(zhuǎn)移到石英池中，在測量前靜置2 分鐘。設(shè)定激光角度為90。，激發(fā)波長為660nm。每份樣品平行測量三次，取 其平均值。測量條件為配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2廣濃度為140 ng/pL,配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2廣濃度為140 ng/|iL;激光角度為90°, DNA的濃度是1 ng/|iL;測得的誘導(dǎo)pBR322 DNA縮合形成的納米顆粒直徑分 布結(jié)果為當(dāng)[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](C104)2的濃度為140ng/pL時，誘導(dǎo) pBR322 DNA縮合納米顆沖立直徑為261nm, [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](C104)2 的濃度為140 ng/pL時，誘導(dǎo)pBR322 DNA縮合納米顆粒直徑分別為216 nm。 實施例3 釕多吡啶配合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染實驗
將生長良好的HeLa細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，在37 。C, 5%002條件下孵育 18~24 11后至細(xì)胞融合度為60%口80%，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP。轉(zhuǎn)染前2 h，將完全培 養(yǎng)基吸去，用無血清培養(yǎng)基洗滌兩次，加入不同比例的釕配合物/DNA復(fù)合物 (每孔含l |ig DNA)孵育5 h后，將無血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基.48 h后檢驗轉(zhuǎn) 染結(jié)果。采用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。 基因轉(zhuǎn)染實驗證實，以配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+和 [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+為載體，成功介導(dǎo)了質(zhì)粒pEGFP在HeLa細(xì)胞中的 基因轉(zhuǎn)染。
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物，其特征在于由釕與輔助配體和主配體配合而成，所述輔助配體為2，2-聯(lián)吡啶，所述主配體為1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])苯或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])萘；所述配合物中的陰離子部分為高氯酸根離子；所述釕與輔助配體2，2-聯(lián)吡啶和主配體1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])苯的配合物的陽離子部分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式I所示所述釕與輔助配體2，2-聯(lián)吡啶和主配體1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])萘的配合物的陽離子部分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式II所示
2.權(quán)利要求1所述配合物的制備方法，其特征在于步驟如下:將釕和輔助配體的配合物二(2,2'-聯(lián)吡啶)-二氯-二水合釕(II)和主配體化合物溶解于乙二醇，加熱反應(yīng)，冷卻后加水稀釋，再NaC104飽和溶液即產(chǎn)生沉 淀，過濾后沉淀依次用水、乙醚洗滌后干燥，即得。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于干燥后的粗產(chǎn)品采用氧化 鋁柱色譜分離提純。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述加熱反應(yīng)的溫度為 120 160°C,同時用氬氣保護(hù)；反應(yīng)時間為8 12小時。
5. 權(quán)利要求1所述配合物在基因藥物載體制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)DNA縮合的釕多吡啶配合物及其制備方法與應(yīng)用，所述配合物是由釕與輔助配體和主配體配合而成，所述輔助配體為2，2-聯(lián)吡啶，所述主配體為1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])苯或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-鄰菲咯啉])萘；所述配合物中的陰離子部分為高氯酸根離子；所述制備方法是將釕和輔助配體的配合物二(2，2′-聯(lián)吡啶)-二氯-二水合釕(II)和主配體化合物溶解于乙二醇，加熱反應(yīng)，冷卻后加水稀釋，再NaClO₄飽和溶液即產(chǎn)生沉淀，過濾后沉淀依次用水、乙醚洗滌后干燥，即得。本發(fā)明還提供所述配合物在基因藥物載體制備中的應(yīng)用。本發(fā)明的釕多吡啶配合物具有高穩(wěn)定性、低毒性、光物理性質(zhì)豐富、容易吸收并在體內(nèi)很快排泄等特點，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61K48/00GK101555253SQ20091003933
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者劉朋昕, 暉 巢, 廖國亮, 麗 徐, 計亮年, 相 陳 申請人:中山大學(xué)