專(zhuān)利名稱(chēng)：瘧疾疫苗的制作方法
瘧疾疫苗本發(fā)明涉及用于治療瘧疾的穩(wěn)定化的脂蛋白粒子，其制備方法，其在醫(yī)藥中的 應(yīng)用，特別是在預(yù)防瘧疾感染中的應(yīng)用，包含所述粒子的組合物/疫苗，以及所述組合 物/疫苗特別是在治療中的應(yīng)用。瘧疾，是全世界主要的健康問(wèn)題之一，每年超過(guò)2-4百萬(wàn)人死于該病。該病的 最流行的形式之一由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)間日瘧原蟲(chóng)(Rvivax)所引起，該間日瘧原蟲(chóng)在熱帶 和亞熱帶地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。令人感興趣的是，該寄生蟲(chóng)可以在低至15°C的溫度下完成其蚊體 周期，這使得該病在溫帶氣候中得以蔓延。該病的最急性形式之一由原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)(Rfalciparam)所引起，該 惡性瘧原蟲(chóng)是導(dǎo)致由瘧疾造成的大多數(shù)死亡的原因。瘧原蟲(chóng)的生命周期是復(fù)雜的，需要兩種寄主即人和蚊用于完成生命周期。人的 感染開(kāi)始于子孢子通過(guò)被感染蚊子的叮咬被接種進(jìn)入血流中。所述子孢子移到肝并感染 那里的肝細(xì)胞，其中所述子孢子經(jīng)由紅細(xì)胞外的胞內(nèi)階段分化成裂殖子階段，其感染紅 細(xì)胞(RBC)以啟動(dòng)在無(wú)性血內(nèi)階段中的循環(huán)復(fù)制。該周期通過(guò)在RBC中許多裂殖子分 化成有性繁殖階段的配子體而完成，所述配子體被蚊子攝入，在蚊子體內(nèi)，所述配子體 在蚊子中腸內(nèi)經(jīng)由一系列階段發(fā)展生成子孢子，其移到唾液腺。由于由間日瘧原蟲(chóng)引起的疾病很少致命的事實(shí)，預(yù)防和治療瘧疾的努力已集中 于更加致命形式的由惡性瘧原蟲(chóng)引起的疾病。盡管由間日瘧原蟲(chóng)引起的疾病不常導(dǎo)致患者死亡，由于看起來(lái)日益增多的大量 的病例，對(duì)患者生命質(zhì)量的顯著影響，日益增加的關(guān)于該病導(dǎo)致貧血癥和死亡的嚴(yán)重事 件的報(bào)導(dǎo)，以及經(jīng)濟(jì)影響，仍然需要用于該病的有效疫苗。另外，對(duì)該病的兩種病因都 能夠提供防護(hù)的單一疫苗將是有利的。間日瘧原蟲(chóng)的特征在于，一些蟲(chóng)株能夠通過(guò)在進(jìn)入外周循環(huán)以顯現(xiàn)臨床癥狀之 前在肝內(nèi)保持潛伏而造成延遲感染。因此，當(dāng)例如穿過(guò)污染地區(qū)時(shí)，對(duì)象可被感染，但 是可能歷時(shí)數(shù)月不表現(xiàn)出癥狀。這是引起疾病蔓延的潛在原因，并且由于這一緣故，到 污染區(qū)域旅行的人在到該污染區(qū)域旅行之后的規(guī)定的一段時(shí)間內(nèi)不允許捐贈(zèng)輸血。間日瘧原蟲(chóng)瘧疾感染在肝內(nèi)保持潛伏，而所述寄生蟲(chóng)正經(jīng)歷紅細(xì)胞內(nèi)裂殖生長(zhǎng) 前(pre-erthrocytic shizogony)階段。如果所述寄生蟲(chóng)在其離開(kāi)肝之前在該階段受到控制， 在患者中觀察不到疾病的臨床癥狀。瘧原蟲(chóng)的子孢子階段被確定為是瘧疾疫苗的潛在的靶標(biāo)。使用去活化(經(jīng) 照射的)子孢子的疫苗已顯示誘導(dǎo)對(duì)實(shí)驗(yàn)人類(lèi)瘧疾的防護(hù)(AmJ，Trap.Med.Hyg 24 297-402，1975)。然而，根據(jù)這一方法論，采用經(jīng)照射的子孢子來(lái)生產(chǎn)用于一般人群的 瘧疾疫苗在實(shí)踐中和就后勤學(xué)而言是不可能的。所述子孢子的主要表面蛋白被稱(chēng)為環(huán)子孢子蛋白(CS蛋白)。認(rèn)為在子孢子從 被蚊子叮咬的最初接種位置進(jìn)入循環(huán)(在那里子孢子移到肝處)期間，所述蛋白參與子孢 子的移動(dòng)和侵入。瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的特征在于，側(cè)接非重復(fù)的氨基(N端)片段和羧基(C端)片段的中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域(重復(fù)區(qū))。間日瘧原蟲(chóng)的中央結(jié)構(gòu)域由重復(fù)單元、通常是九個(gè)串聯(lián) 氨基酸的若干區(qū)組組成。在某些亞洲株中，在所述中央重復(fù)區(qū)之后，存在大約12個(gè)氨基酸的附加序列 (參見(jiàn)SEQ ID No 11)。后者的功能是未知的。然而，據(jù)一些人假設(shè)，所述氨基酸可能 與疾病臨床癥狀的延遲發(fā)病相關(guān)聯(lián)，盡管尚未對(duì)此進(jìn)行考察。認(rèn)為N端的特征在于被稱(chēng) 為I區(qū)的5個(gè)氨基酸的序列(參見(jiàn)SEQ ID No 1)。還認(rèn)為C端的特征在于包括被稱(chēng)為II 區(qū)的12個(gè)氨基酸的序列。后者包含細(xì)胞粘附基序，其在所有的瘧疾CS蛋白中是高度保 守的(參見(jiàn)SEQIDNo.2)。若干研究小組已提出了基于環(huán)子孢子蛋白的亞單位疫苗。完全基于所述中央重 復(fù)區(qū)的這些疫苗中的兩個(gè)在二十世紀(jì)八十年代初經(jīng)歷臨床試驗(yàn)；一個(gè)疫苗是合成肽，另 一個(gè)疫苗是重組蛋白(Ballou等人，Lancet: June 6 (1987)，第1277頁(yè)起，和Herrington等 人，Nature 328: 257(1987))。這些疫苗在刺激抗子孢子應(yīng)答中獲得成功。盡管如此， 應(yīng)答幅度是令人失望的，一些疫苗根本不產(chǎn)生應(yīng)答。另外，在隨后的注射之后，抗體水 平“加強(qiáng)”的缺乏以及體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果暗示了，這些志愿者中大多數(shù)的T 細(xì)胞不識(shí)別免疫顯性重復(fù)(immuno-dominantrepeat)。另外，這兩個(gè)疫苗的效率勉強(qiáng)說(shuō)得 過(guò)去，只有一個(gè)被接種的志愿者沒(méi)有發(fā)展成寄生蟲(chóng)血癥。這些疫苗沒(méi)有作進(jìn)一步討論。WO 93/10152和WO 98/05355描述了來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的疫苗， 并且使用其中所述的方法在朝著抗惡性瘧原蟲(chóng)的疫苗方面似乎有了一些進(jìn)展，還參見(jiàn)， Heppner 等人，2005，Vaccine 23，2243-50。迄今為止，在臨床上最先進(jìn)的瘧疾疫苗基于被稱(chēng)作RTS，S的脂蛋白粒子(又名 病毒樣粒子)。該粒子包含惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的一部分，該部分實(shí)質(zhì)上與惡性瘧原蟲(chóng) (蟲(chóng)株NF54/3D7)的CS蛋白的氨基酸207-395相對(duì)應(yīng)，該部分通過(guò)線性接頭在框架內(nèi)融 合至來(lái)自乙型肝炎的S抗原的N端。所述接頭可包括來(lái)自S-抗原的preS2的一部分。 詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參見(jiàn)以下的討論。惡性瘧原蟲(chóng)內(nèi)的CS蛋白具有保守的中央重復(fù)區(qū)。相比之下，間日瘧原蟲(chóng)的CS 蛋白的至少兩種形式(被稱(chēng)為VK210或I型以及VK247或II型)是已知的。這使得更 難以鑒定具有全部所需性質(zhì)諸如免疫原性的CS蛋白的構(gòu)建體，該構(gòu)建體提供對(duì)間日瘧原 蟲(chóng)的總體防護(hù)而與CS蛋白的具體類(lèi)型無(wú)關(guān)，因?yàn)獒槍?duì)I型中央重復(fù)區(qū)的抗體未必識(shí)別相 應(yīng)的II型區(qū)上的表位，反之亦然。就本發(fā)明人所知曉的程度，尚未提議基于間日瘧原蟲(chóng)的單一蟲(chóng)株的與RTS，S相 當(dāng)?shù)牧Ｗ?。雜合間日瘧原蟲(chóng)CS蛋白描述于WO 2006/088597中。包含WO 2006/088597的雜合蛋白以及來(lái)自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白(本文 中被稱(chēng)作CSV-S)以及包含該融合蛋白的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057301中。包含CSV-S、RTS和任選的S單元的脂蛋白粒子描述于PCT/EP2007/057296中。目前，RTS，S瘧疾疫苗作為凍干抗原被提供，其在遞送之前不久用助劑進(jìn)行重 新構(gòu)成。這是因?yàn)樵摽乖?dāng)儲(chǔ)存歷時(shí)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)段時(shí)不穩(wěn)定，特別是在助劑的存在下。 所述不穩(wěn)定性自身表現(xiàn)為團(tuán)聚和/或降解。
到2018/2019年，據(jù)估計(jì)需要8300萬(wàn)劑量的瘧疾疫苗。目前的凍干(冷凍干 燥)方法花費(fèi)約40小時(shí)。因此，目前的方法不可能滿足未來(lái)的需求。有可能將生產(chǎn)周 期縮短到約28小時(shí)，但是這仍不大可能滿足所述需求。另外，進(jìn)一步縮短周期時(shí)間看來(lái) 導(dǎo)致出現(xiàn)不合格產(chǎn)品。瘧疾疫苗主要在基礎(chǔ)設(shè)施(infra-structure)和設(shè)備貧乏的國(guó)家中用于遞送，因 此，在直到給藥前是穩(wěn)定的疫苗提供形式是至關(guān)重要的，特別是如果提供的是液體制劑 時(shí)。由發(fā)明人提供的初始數(shù)據(jù)表明，在磷酸鹽緩沖鹽水中制備的、含有殘留量的聚 山梨醇酯80 (0.0062% w/w)且不含其它賦形劑的、pH為6.1的RTS，S純體積(purified bulk),在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)(即在37°C下儲(chǔ)存7天)后，顯示顯著的降解和氧化性聚集。 在4°C下儲(chǔ)存2個(gè)月后觀察到輕微聚集和降解?？疾炝艘韵碌倪x項(xiàng)· pH從6.1增加到7.4似乎降低了 S抗原降解，但是增加CS蛋白降解；·聚山梨醇酯80 (也稱(chēng)為吐溫80)濃度增加到0.05%、0.5%和1.0%似乎增加聚 集和降解二者，這是令人驚訝的，因?yàn)橥聹?0通常降低抗原聚集(據(jù)發(fā)明人假設(shè)，這是 由在土溫內(nèi)存在殘留的過(guò)氧化物所導(dǎo)致的，殘留的過(guò)氧化物可能催化蛋白/抗原內(nèi)的硫 醇基的催化氧化-使用本發(fā)明的還原劑似乎防止這一效果)；和·加入蔗糖(6.2% w/w)對(duì)聚集或降解沒(méi)有影響。據(jù)假設(shè)，所述聚集過(guò)程在許多階段中發(fā)生，并且如果這些階段之一可被成功地 阻止的話，則可以阻止聚集和/或降解(參見(jiàn)“Minimizingprotein inactivation “， D.B.Volkin 禾口 A.M.Klibanov， “ Protein function apractical approach “ , T.E.Creighton 編-IRL Press, Oxford University Press)。第一階段是天然蛋白解折疊，從而暴露出其疏水性更大的區(qū)域。該疏水性區(qū)域 的暴露導(dǎo)致若干蛋白組在一起。最后階段是所述蛋白通過(guò)二硫鍵的形成而發(fā)生不可逆變 性。還可能的是，為使所述抗原增溶而被加入的聚山梨醇酯80含有殘留的過(guò)氧化 物，殘留的過(guò)氧化物催化聚集和/或降解。本發(fā)明人嘗試了許多的穩(wěn)定試劑/穩(wěn)定方法，例如，糖，多元醇，共溶劑，聚 合物，離子，pH，緩沖劑，抗氧化劑，螯合劑和表面活性劑，它們都不提供所需效果。 例如，加入抗壞血酸產(chǎn)生顯著的聚集。使用單獨(dú)的EDTA或在抗氧化的存在下使用EDTA 不阻止聚集。另外，加入亞硫酸鹽不提供所需的穩(wěn)定效果。一些常見(jiàn)的穩(wěn)定劑與在最終 的瘧疾制劑中所采用的輔助制劑不相容。本發(fā)明人目前相信，瘧原蟲(chóng)CS蛋白(惡性瘧 原蟲(chóng)和/或間日瘧原蟲(chóng))的脂蛋白粒子可采用特定的穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定化用于儲(chǔ)存，例如， 包含至少一個(gè)硫醇(-SH)基團(tuán)的還原劑，諸如硫代硫酸鹽，N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘 油，半胱氨酸，還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉或其混合物，特別是N-乙酰半胱氨酸，一 硫代甘油，半胱氨酸，硫代乙酸鈉及其混合物，特別是一硫代甘油，半胱氨酸及其混合 物。作為這些包含至少一個(gè)硫醇(-SH)基團(tuán)的還原劑的替代物或者與這些還原劑相 組合，本發(fā)明使用的脂蛋白粒子可通過(guò)從它們被儲(chǔ)存在內(nèi)的容器中除去氧和/或使所述制劑避光(例如通過(guò)使用褐色玻璃容器)而被穩(wěn)定化或進(jìn)一步穩(wěn)定化，可保護(hù)/進(jìn)一步保 護(hù)所述抗原。因此，本發(fā)明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含a)免疫原性粒子RTS，S，和/或b)來(lái)源于一種或多種間日瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株的CS蛋白和來(lái)自乙型肝炎的S抗原以及任 選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和/或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括(或選自)具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的還原劑的穩(wěn)定劑，例如，如上所述 的還原劑，諸如一硫代甘油，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸或其混合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含上述的a)、b)、C)和任選 的d)，并且其中在其制備中采用諸如從容器中除去氧和/或通過(guò)例如使用褐色玻璃容器 使所述制劑避光的保護(hù)措施。有利地是，包含來(lái)自瘧原蟲(chóng)的CS蛋白以及來(lái)自肝炎的S抗原的脂蛋白粒子抗原 可通過(guò)采用一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物和/或諸如從小瓶中除去氧和/或通過(guò)例如 使用褐色玻璃容器使所述制劑避光而被足夠地穩(wěn)定化。序列表SEQ.ID.No.l 間日瘧原蟲(chóng)的N端的I區(qū)SEQ.ID.No.2是在間日瘧原蟲(chóng)的C端中的II區(qū)的高度保守部分SEQ.ID.No.3-9間日瘧原蟲(chóng)的I型CS蛋白的多種重復(fù)單元SEQ.ID.No.10間日瘧原蟲(chóng)的II型CS蛋白的主要重復(fù)單元SEQ.ID.No.ll在間日瘧原蟲(chóng)的亞洲株中發(fā)現(xiàn)的附加氨基酸SEQ.ID.No.12間日瘧原蟲(chóng)的雜合蛋白CSV的核苷酸序列(為在大腸桿菌中表達(dá)而被優(yōu)化)SEQ.ID.No.13 間日瘧原蟲(chóng)的雜合蛋白CSV的氨基酸序列SEQ.ID.No.14 間日瘧原蟲(chóng)的II型CS蛋白的次要重復(fù)單元SEQ.ID.No.15 間日瘧原蟲(chóng)的雜合蛋白CSV的核苷酸序列(為在酵母中表達(dá)而被優(yōu)化)SEQ.ID.No.16雜合融合蛋白CSV_S的核苷酸序列SEQ.ID.No.17雜合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列SEQ.ID No. 18 RTS表示盒的核苷酸序列SEQ.ID No. 19 來(lái)自 SEQ ID No. 18 的預(yù)期 RTS 融合蛋白SEQ ID Nos.20到25包含CpG的寡核苷酸的實(shí)施例。


圖lpRIT15546酵母游離型載體的質(zhì)粒圖譜；圖2通過(guò)在將所需抗原與來(lái)自乙型肝炎的S抗原“融合”中使用的GSK制備的 質(zhì)粒pGFl-S2的質(zhì)粒圖譜。(在切除12bp SmaI DNA片段之后)在SmaI位點(diǎn)之間的克 隆異源DNA序列與S基因產(chǎn)生符合讀框的融合；
圖3pRITl5582的質(zhì)粒圖譜；用XhoI消化釋放攜帶CSV-S表達(dá)盒加LEU2選擇性標(biāo)記的8.5kb的線形DNA片
段，用于插入所述酵母染色體內(nèi)；圖4用于整合CSV-S表達(dá)盒的線性XhoI片段的限制圖譜；圖5在蟲(chóng)株Y1835中產(chǎn)生的CSV-S，S混合粒子的電子顯微照片；CSV-S, S粒子從可溶性細(xì)胞抽提物(基于RTS，S純化法)純化并經(jīng)歷電子顯 微鏡分析。在用磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色之后可見(jiàn)到粒子。比例等于IOOnm ；圖6顯示在37°C +/-AOT-Novex凝膠中在非還原(左)和還原(右)條件下儲(chǔ) 存7天之后，在與ASOl混合之前(上)或與ASOl在25°C混合24小時(shí)之后(下)的SDS page分析，l.Mw2.PB TO3.PB7 天 37°C4.NaClP047 天 37°C5.NaCl P047 天 37 °C +AOT 褐色玻璃6.NaCl P047 天 37 °C +AOT 白色玻璃7.MTG 0.01 % 7 天 37°C8.MTG 0.01 % 7 天 37°C +AOT 褐色玻璃9.MTG 0.01 % 7 天 37°C +AOT 白色玻璃10.MTG 0.04% 7 天 37°C11.MTG 0.04% 7 天 37°C +AOT 褐色玻璃12.MTG 0.04% 7 天 37°C +AOT 白色玻璃；圖7顯示在還原(左)和非還原(右)條件下在37°C -Novex凝膠中儲(chǔ)存14天 之后，在與ASOl混合之前或與ASOl混合在25°C歷時(shí)24小時(shí)之后的SDS page分析；圖8顯示在還原(左)和非還原(右)條件下在37°C -Novex凝膠中儲(chǔ)存5周之 后，在與ASOl混合之前或與ASOl混合在25°C歷時(shí)24小時(shí)之后的SDS page分析；對(duì)于圖7圖8:l.Mw2.PB TO 還原3.RTS, S NaCl P045 周 37°C還原4.RTS, S MTG 0.01% 5 周 37°C還原5.RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C還原6. (RTS，S NaCl P045 周 37°C ) /ASOIE 24 小時(shí) 25°C還原7.(RTS，SMTG0.01% 5 周 37°C )/AS01E24 小時(shí) 25°C還原8. (RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C )/ASOIE 24 小時(shí) 25°C還原9.PB TO 非還原10.RTS, S NaCl P045 周 37°C非還原11.RTS, S MTG 0.01% 5 周 37°C非還原12.RTS, S MTG 0.04% 5 周 37°C非還原
13.(RTS，S NaCl P045 周 37°C )/ASOIE 24 小時(shí) 25°C非還原14. (RTS, SMTG001% 5 周 37°C )/AS01E24 小時(shí) 25°C非還原15.(RTS，S MTG 0.04% 5 周 37°C )/ASOIE 24 小時(shí) 25°C非還原圖9通過(guò)混合ELISA α CSP- α -S顯示在有或者沒(méi)有一硫代甘油的液體制劑中的 RTS，S抗原性；圖10顯示抗CS血清學(xué)結(jié)果；圖11顯示抗HBS血清學(xué)結(jié)果；圖12顯示CS特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答；圖13顯示HBs特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答；圖14顯示CS特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答；圖15顯示HBs特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答；發(fā)明詳述采用N-乙酰半胱氨酸、一硫代甘油、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉 或其混合物的本發(fā)明的方面具有另外的優(yōu)點(diǎn)，該優(yōu)點(diǎn)在于該實(shí)施方案提供了可行的替代 硫酸鈉的生產(chǎn)備選方案(可能希望避免硫酸鈉的使用)。盡管不希望束縛于理論約束，據(jù)本發(fā)明人假設(shè)，在穩(wěn)定劑/還原劑中的硫醇官 能團(tuán)與抗原中的硫醇官能團(tuán)結(jié)合，從而阻斷所述位點(diǎn)并防止該位點(diǎn)與不同抗原分子上的 硫醇官能團(tuán)發(fā)生鍵合/相互作用。另外，因?yàn)樗龇€(wěn)定劑/還原劑相對(duì)小，還認(rèn)為在所 述抗原內(nèi)的表位、特別是構(gòu)象表位不被破裂，從而所述抗原的免疫原性得以被保留，并 防止發(fā)生聚集。替代地或另外地，吐溫(tween)中的過(guò)氧化物被淬滅。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述穩(wěn)定劑是一硫代甘油。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述穩(wěn)定劑是半胱氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述穩(wěn)定劑是N-乙酰半胱氨酸。所述穩(wěn)定劑例如可以按如下范圍的量被使用0.01到10% w/v,諸如1到5%，
2 至Ij 6 %，4 至Ij 7 %，3 至Ij 8 %，諸如 0.01 至Ij 1 %，0.2 至Ij 0.4 %, 0.1 % 至Ij 0.5 %，0.3 到 0.8%, 0.6 到 0.9%，例如實(shí)質(zhì)上是 0.2，0.4，0.5 禾口 0.8%，或者諸如 0.01 到 0.1 %，0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08%， 0.02 至Ij 0.05%， 0.02 至Ij 0.08%或 0.05 至Ij 0.08% w/v。替代地，所述穩(wěn)定劑例如可以按如下范圍的量被使用0.01到10%w/w，諸如 1 至丨J5%， 2 至Ij 6%，4 至Ij 7%， 3 至Ij 8%，諸如 0.01 至Ij 1 %，0.2 至Ij 0.4%，0.1%至Ij 0.5%， 0.3 至Ij 0.8%，0.6 到 0.9%，例如實(shí)質(zhì)上為 0.2，0.4，0.5 禾Π 0.8%，或者諸如 0.01 到 0.1 %， 0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08 %， 0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08 % 或 0.05 至Ij 0.08% w/w。半胱氨酸的適合量為總制劑重量的0.1到1.0%。因此，例如，在一個(gè)500μ1的 人用劑量中，半胱氨酸的量為IOOyg到5000 μ g范圍，諸如500 μ g。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了瘧疾疫苗的組分，其包含a)免疫原性粒子RTS，S，和/或b)來(lái)源于一種或多種間日瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株的CS蛋白和來(lái)自乙型肝炎的S抗原以及任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和C)穩(wěn)定劑，其包括一硫代甘油。本發(fā)明的這一方面可進(jìn)一步采用另外的保護(hù)措施，諸如從所述容器/小瓶除去 氧和/或通過(guò)例如使用褐色玻璃容器使所述制劑避光。一硫代甘油由式HSCH2CH (OH) CH2OH表示并且還被稱(chēng)作3-巰基-1，2-丙二醇 或1-硫代甘油。用于本發(fā)明的適合量包括但不限于以下的范圍0.01到10%，諸如0.01 至Ij 或 0.01 至Ij 0.1%， 0.01 至Ij 0.02%， 0.01 至Ij 0.05%， 0.01 至Ij 0.08%， 0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08 % 或 0.05 至Ij 0.08 % w/v，例如 0.011， 0.012， 0.013， 0.014， 0.015， 0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08% w/v。250 μ 1 的單一人用劑量可 含有例如10到2500 μ g，諸如25到250 μ g的一硫代甘油，例如50，125或200 μ g的一 硫代甘油。替代地，用于本發(fā)明的適合量包括但不限于以下的范圍0.01到10%諸如0.01 至ljl%，0.01 至Ij 0.1%，0.01 至Ij 0.02%，0.01 至Ij 0.05%，0.01 至Ij 0.08%，0.02 至Ij 0.05 %， 0.02 至Ij 0.08% 或 0.05 至Ij 0.08% w/w，例如 0.011， 0.012， 0.013， 0.014， 0.015， 0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08% w/w。有利地是，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用一硫代甘油時(shí)，似乎與輔助制劑例如水包油型乳 液或包含MPL和/或QS21的脂質(zhì)體制劑相容。另外，一硫代甘油降低了由MPL和QS21的脂質(zhì)體輔助制劑誘導(dǎo)的脂蛋白粒子 聚集，從而提供與制備之后不久經(jīng)純化的大體積的液體制劑相類(lèi)似的液體制劑。在本說(shuō)明書(shū)的背景下，經(jīng)純化的體積(purified bulk)是指在超過(guò)兩個(gè)劑量的大體 積量下經(jīng)純化的抗原。在本說(shuō)明書(shū)背景下，最終體積(final bulk)是指超過(guò)一個(gè)或兩個(gè)劑量的經(jīng)純化的 抗原和賦形劑諸如磷酸鹽緩沖鹽水，不包括輔助組分。當(dāng)使用0.01%的一硫代甘油、在缺乏助劑的條件下以50yg/ml配制RTS，S 時(shí)，其在37°C儲(chǔ)存7天之后具有與新鮮體積相同的特性。0.01% —硫代甘油也足夠避免 RTS, S發(fā)生由光催化的聚集。盡管如此，對(duì)于瘧原蟲(chóng)CS蛋白的脂蛋白粒子的、例如在100 μ g/ml的抗原和例 如最多1.0% w/v諸如0.02、0.05或0.08%的一硫代甘油的液體制劑而言，期待獲得其約 2或3年的貨架壽命。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述還原劑不是二硫蘇糖醇。所述疫苗的液體組分，包括其輔助組分，可要求在約4°C下儲(chǔ)存。本發(fā)明的所述制劑具有適于注射的pH和滲克分子濃度(osmolality)。適當(dāng)?shù)兀?所述液體制劑的pH為約6.5到7.2，諸如約6.6、6.7、6.8、6.9、7.0或7.1。本發(fā)明的所述制劑可進(jìn)一步包含防腐劑諸如硫柳汞，例如，當(dāng)超過(guò)10個(gè)劑量被 一起提供時(shí)。然而，在至少一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的制劑不含硫柳汞。研究顯示，與0.01或0.04% —硫代甘油一起儲(chǔ)存的例如在50 μ g/ml下的RTS， S在4°C或37°C下歷時(shí)5周之后，沒(méi)有可檢測(cè)的由非特異性吸收導(dǎo)致的抗原損失。另外，在加速穩(wěn)定性，即在37°C下儲(chǔ)存7天、然后暴露于強(qiáng)光下約15小時(shí)(在 本文被稱(chēng)作加速氧化試驗(yàn)AOT)之后，未觀察到RTS，S粒度分布發(fā)生改變。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了作為單獨(dú)的液體制劑的瘧疾疫苗用組分以及適于加 到該單獨(dú)液體制劑中的助劑，任選地作為包括每個(gè)成分(element)的單獨(dú)的小瓶的藥包 (kit)被提供。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，每個(gè)小瓶在視覺(jué)上是不同的，例如，在一個(gè)小 瓶上的卷邊蓋是有顏色的，從而使該小瓶與其它小瓶區(qū)分開(kāi)，和/或一個(gè)小瓶是琥珀色 的(諸如包含所述抗原的小瓶)并且另一個(gè)小瓶是透明的(諸如包含所述助劑的小瓶)。適合的小瓶包括例如3mL的玻璃小瓶。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含抗原和穩(wěn)定劑(或本文所述的還原劑)的凍干組 分，其然后可用液體助劑重新構(gòu)成。所述凍干組分和所述液體助劑(諸如MPL和QS21的 水包油型制劑或脂質(zhì)體制劑)可作為藥包被提供。本發(fā)明的這一方面具有以下的優(yōu)點(diǎn) 其不需要在重新構(gòu)成之后立即使用，而是在儲(chǔ)存至少24小時(shí)是穩(wěn)定的，例如，當(dāng)在混合 之后在25°C下儲(chǔ)存時(shí)抗原的抗原性保持至少24小時(shí)。在下文詳細(xì)地討論助劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了最終的液體制劑。最終的液體制劑是指包含最多 10個(gè)劑量諸如1或2個(gè)劑量并包含除助劑組分以外的全部賦形劑的液體制劑。在一個(gè)方面，所述組分或最終疫苗作為單劑量被提供。在本說(shuō)明書(shū)背景下的疫苗是包含全部所述組分的免疫原性制劑，所述組分包括 適于注射進(jìn)人體的輔助組分。在一個(gè)方面，所述組分或最終疫苗作為雙劑量被提供。這可能是有利的(例 如，當(dāng)對(duì)于一個(gè)劑量而言的量較小時(shí))，因?yàn)樘峁﹥蓚€(gè)劑量可以使得在重新構(gòu)成和/或給 予所述最終制劑時(shí)重要組分的損失最小化。因此，疫苗例如作為2個(gè)小瓶制劑的雙劑量形式被提供，其包含小瓶1 500μ1(2個(gè)劑量)的RTS，S，2 X濃縮(100 μ g/ml) +—硫代甘油 (0.02、0.05 或 0.08% )小瓶2 500μ1(2個(gè)劑量)的助劑，2Χ濃縮(ASOl)在重新構(gòu)成之后，所述制劑提供Iml(2個(gè)劑量)的在ASOl中的RTS，S， +0.01、0.025或0.04%的一硫代甘油。間日瘧原蟲(chóng)抗原本發(fā)明使用的CSV-S蛋白可包含來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的一部分 (CSV)。該CSV抗原可以是天然蛋白，諸如在間日瘧原蟲(chóng)的I型CS蛋白中發(fā)現(xiàn)的和/ 或在間日瘧原蟲(chóng)的II型蛋白中發(fā)現(xiàn)的。替代地，所述CSV蛋白可能是包含來(lái)自所述I型 和II型CS蛋白的成分的雜合蛋白或嵌合(chimeric)蛋白。當(dāng)后者被融合至所述S抗原 時(shí)，這在本文中被稱(chēng)作雜合融合蛋白。CSV-S在本文中作為通用術(shù)語(yǔ)被使用，用于涵蓋包含來(lái)自間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白 的序列/片段和來(lái)自乙型肝炎的S-抗原的序列的融合蛋白。所述雜合/嵌合蛋白通常包括至少一個(gè)來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的I型環(huán)子孢子蛋白的中央重復(fù)區(qū)段的重復(fù)單元，以 及至少一個(gè)來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的II型環(huán)子孢子蛋白的中央重復(fù)區(qū)段的重復(fù)單元。通常，所述雜合蛋白還將含有來(lái)自瘧原蟲(chóng)諸如間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的N端片 段，例如，包含I區(qū)諸如由SEQIDNal所示的氨基酸的片段。
通常，所述雜合蛋白將包含來(lái)自瘧原蟲(chóng)諸如間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的C端片段， 例如包含II區(qū)諸如由SEQ ID No 2所示的基序的片段。盡管不希望束縛于理論，認(rèn)為所述的N端和C端片段包括若干個(gè)T細(xì)胞和B細(xì) 胞表位。本發(fā)明可使用任何適合的間日瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株，包括拉丁，美洲(即，Sail， Belem)，朝鮮，中國(guó)，泰國(guó)，印度尼西亞，印度和越南。在SEQID No 13中的構(gòu)建體基 于朝鮮蟲(chóng)株(更準(zhǔn)確地說(shuō)，基于南朝鮮蟲(chóng)株)。具有I型CS蛋白的間日瘧原蟲(chóng)比具有II型CS蛋白的間日瘧原蟲(chóng)更普遍。因 此，在一個(gè)方面，本發(fā)明采用了來(lái)自I型的CS蛋白。在可供選擇的方面，本發(fā)明提供了 包含來(lái)自I型的重復(fù)單元和來(lái)自II型的重復(fù)單元的雜合蛋白，例如，其中在雜合蛋白中包 含了比II型重復(fù)單元更多的來(lái)自I型的重復(fù)單元。更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明的所述雜合蛋白可包含1到15個(gè)來(lái)自I型的重復(fù)單元，諸 如9個(gè)來(lái)自I型的重復(fù)單元。來(lái)自I型CS蛋白的適合的重復(fù)單元的實(shí)例在SEQ ID No.s3到9中給出。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有不同的I型重復(fù)單元的混合物的雜合蛋 白，諸如各自在SEQ ID No.s 3到9中被列舉的那些重復(fù)單元。一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元可在雜合蛋白中被復(fù)制，例如，SEQIDNo 3和/或4的兩 個(gè)重復(fù)單元可被并入所述構(gòu)建體中。a)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 3所示單元。b)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 4所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)段中的單元組合。c)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 5所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)和b)段中的單元組合。d)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 6所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)_c)段中的一個(gè)或多個(gè)單元組合。f)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 7所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)-d)段中的一個(gè)或多個(gè)單元組合。g)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 8所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)_f)段中的一個(gè)或多個(gè)單元組合。h)在一個(gè)方面，所述CS蛋白包含SEQ ID No 9所示單元，任選地與上面剛剛描 述的a)-g)段中的一個(gè)或多個(gè)單元組合。得自II型CS蛋白的適合的組分重復(fù)單元的實(shí)例在SEQ ID No.10和14諸如SEQ ID No.10中被給出。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了具有5個(gè)或更少的來(lái)源于II型的重復(fù)單元諸如例如 SEQ ID No.10所示的一個(gè)重復(fù)單元的雜合蛋白。所述雜合蛋白還可包含在某些間日瘧原蟲(chóng)的亞洲蟲(chóng)株中發(fā)現(xiàn)的在所述重復(fù)區(qū)末 端被發(fā)現(xiàn)的12氨基酸插入，例如SEQ ID No. 11所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合蛋白包含來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)CS蛋白的約257個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的來(lái)源于csv的抗原組分通常被融合至所述s蛋白的氨基端。據(jù)信，所述得自乙型肝炎的表面抗原的存在加強(qiáng)了所述cs蛋白部分的免疫原 性，有助于穩(wěn)定性，和/或幫助所述蛋白的可重現(xiàn)生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合融合蛋白包含約494個(gè)氨基酸，例如其中的約257 個(gè)氨基酸來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)CS蛋白。所述雜合融合蛋白還可包含另外的來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)和/或間日瘧原蟲(chóng)的 抗原，例如，其中所述抗原選自DBP，PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl 禾口 RBP，或其片段。來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的抗原的其它實(shí)例包括，PffiMP-1，Pfs 16抗原，MSP-1， MSP-3, LSA-I, LSA-3，AMA-1和TRAP。其它瘧原蟲(chóng)抗原包括惡性瘧原蟲(chóng)EBA， GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白(Sequestrin)，Ρβ32, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲(chóng)中的類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合融合蛋白(CSV-S)具有如SEQIDNo.17中所示的 氨基酸序列。在所述序列中，氨基酸6到262源自于CSV，以及氨基酸269到494源自 于S。剩余的氨基酸通過(guò)基因構(gòu)建被引入(其視具體情況而定是不同的)。這四種氨基 酸，即Met、MetAla Pro,特別地來(lái)源于質(zhì)粒pGFl_S2 (參見(jiàn)圖4)。SEQ id No 17所示蛋白的核苷酸序列在SEQIDNo 16中給出。編碼免疫原性cs多肽的多核苷酸序列可能是為哺乳動(dòng)物細(xì)胞而被優(yōu)化的密碼 子。這種密碼子優(yōu)化詳細(xì)描述于WO 05/025614中。rts，s被稱(chēng)作RTS的本發(fā)明的蛋白粒子的組分(即，來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng))可以根據(jù)WO 93/10152所述制備，該文獻(xiàn)包括RTS*的說(shuō)明(來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)NF54/3D7蟲(chóng)株-本文稱(chēng) 作 RTS)。在本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在所述融合蛋白中采用的來(lái)源于惡性瘧原 蟲(chóng)的抗原可實(shí)質(zhì)上是其全CS蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用了全長(zhǎng)s-抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用 了所述s-抗原的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的抗原在中央重復(fù)區(qū)中包含至少4 個(gè)重復(fù)單元。更準(zhǔn)確地說(shuō)，該抗原包含含有至少160個(gè)氨基酸的序列，其與所述CS蛋白 的C端部分實(shí)質(zhì)上同源。所述CS蛋白可缺乏自C端起最后的12到14個(gè)(諸如12個(gè))
氨基酸。更準(zhǔn)確地說(shuō)，所采用的來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的融合蛋白是由SEQ IDNo 18所示的 RTS表達(dá)盒的核苷酸序列編碼的融合蛋白。來(lái)自乙型肝炎的s-抗原適合的S抗原可包含preS2區(qū)。適合的血清型的實(shí)例是adw(Nature280 815-819， 1979)。通常，所述來(lái)自乙型肝炎的序列將是全長(zhǎng)s-抗原。通常，所述pres2區(qū)將不被 包括在內(nèi)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的所述雜合融合蛋白包含來(lái)源于突變s蛋白的一部分，例如，在美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)No.2006/194196(還作為W02004/113369公開(kāi))中所述的。該文獻(xiàn) 描述了突變標(biāo)記的HDB05。其特別地描述了在圖1和圖6中的突變蛋白和野生型蛋白的 比較以及在圖4和圖5中描述了突變蛋白的基因。其中的序列12到22描述了突變S蛋 白的特定多肽。上述每種作為參考并入本文。所述融合蛋白CSV-S可例如采用質(zhì)粒pGFl-S2(有關(guān)詳細(xì)情形參見(jiàn)圖2以及實(shí)施 例)制備，當(dāng)與CSV對(duì)應(yīng)的適當(dāng)?shù)男蛄斜徊迦朐赟amI克隆位點(diǎn)時(shí)，質(zhì)粒pGFl_S2可在適 合的條件下產(chǎn)生所述融合蛋白CSV-S。編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列可側(cè)接轉(zhuǎn)錄控制元件(優(yōu)選來(lái)源于酵母基因)并被 并入表達(dá)載體中。本發(fā)明所用雜合蛋白的表達(dá)盒可例如被構(gòu)建為包括以下特征·啟動(dòng)子序列，例如來(lái)源于釀酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。·編碼適當(dāng)?shù)娜诤系鞍椎男蛄??！け话谒鲂蛄袃?nèi)的轉(zhuǎn)錄終止序列，例如，來(lái)源于釀酒酵母ARG3基因。特定的啟動(dòng)子的實(shí)例是來(lái)自Musti等人的釀酒酵母TDH3基因的啟動(dòng)子。適合的質(zhì)粒則因此可被采用，以將編碼所述雜合融合蛋白的序列插入到適合的 合成用寄主中。適合質(zhì)粒的實(shí)例是pRIT 15546，即2微米基的用于攜帶適合表達(dá)盒的載 體，有關(guān)詳細(xì)情形參見(jiàn)圖1和實(shí)施例。所述質(zhì)粒通常包含內(nèi)裝標(biāo)記以幫助選擇，例如編碼抗生素抗性或LEU2或HIS營(yíng) 養(yǎng)缺陷型的基因。通常，所述寄主將具有用于所述粒子中各融合蛋白的表達(dá)盒，并且還可具有一 個(gè)或多個(gè)用于被整合到其基因組內(nèi)的S抗原的表達(dá)盒。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核的或真 核的，但優(yōu)選是酵母，例如酵母菌屬(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)諸如在 ATCC 數(shù)據(jù)庫(kù)中的 DC5(登錄號(hào) 20820)，名為 RIT DC5cir(o)。保藏人Smith Kline-RIT)
和非酵母菌屬酵母。這些包括裂殖糖酵母(例如粟酒裂殖糖酵母)，克盧費(fèi)氏酵母(例 如，乳克盧費(fèi)氏酵母)，畢赤氏酵母(例如巴斯德畢赤氏酵母)，漢遜氏酵母(例如多形 漢遜氏酵母)，脂耶氏酵母(例如解脂脂耶氏酵母)和許旺氏酵母(例如西方許旺氏酵 母)。適合的重組酵母菌株是用于表達(dá)所述融合蛋白的Y1834(以及其應(yīng)用構(gòu)成本發(fā)明 的一部分)，其制備參見(jiàn)實(shí)施例。本發(fā)明所使用的所述核苷酸序列或其部分(諸如編碼所述CS/雜合蛋白的部分， 但是任選不是編碼蛋白S的部分)可為在寄主諸如酵母中表達(dá)而被優(yōu)化的密碼子。所述宿主細(xì)胞可包含來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的融合蛋白所用的表達(dá)盒，和來(lái)源于惡 性瘧原蟲(chóng)的所述融合蛋白所用的表達(dá)盒，以及任選的S抗原。在某些寄主諸如酵母細(xì)胞中，一經(jīng)表達(dá)，所述融合蛋白(包含所述S抗原)自發(fā) 組裝成由所述融合蛋白的眾多單體組成的蛋白結(jié)構(gòu)/粒子。當(dāng)所述酵母表達(dá)兩種不同的 融合蛋白(或融合蛋白和S抗原)時(shí)，這些被認(rèn)為在粒子中進(jìn)行共組裝。當(dāng)被選擇的受體酵母菌株在其基因組中已攜帶若干乙型肝炎S表達(dá)盒的整合拷 貝時(shí)，則組裝的所述粒子還可包含未融合S抗原的單體。
這些粒子還可被稱(chēng)作病毒樣粒子(VLP)。所述粒子還可被稱(chēng)作多聚體型脂蛋白 粒子，或被簡(jiǎn)稱(chēng)為免疫原性粒子。因此，提供了包含以下單體的免疫原性蛋白粒子a.包含來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列的融合蛋白(諸如CSV-S)，和/或b.包含來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列的融合蛋白(諸如RTS)，和C.任選的未融合S抗原，其中所述粒子與例如上文所定義的穩(wěn)定劑諸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合 物結(jié)合使用。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含如上所定義的單體a)和/或b)和C)的免疫原性 蛋白粒子，以及其中已從容納所述粒子的容器或小瓶中除去氧和/或其中例如通過(guò)褐色 玻璃容器使所述粒子避光保護(hù)的保護(hù)措施。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了與本文所定義的例如選自一硫代甘油、半胱氨酸 或其混合物的還原劑結(jié)合使用的包含以下各項(xiàng)的融合蛋白的應(yīng)用a)來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列(例如，來(lái)自I型和/或II型的重復(fù)區(qū)的 序列)，b)來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列(諸如來(lái)自其重復(fù)區(qū)的序列)，和c)來(lái)自乙型肝炎的S抗原的序列，當(dāng)其在適合的寄主中被表達(dá)時(shí)提供包含所述融合蛋白和任選的未融合S抗原的 病毒樣粒子，以生成粒子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在其中已除去氧和/或通過(guò)例如使用褐色玻璃容 器使所述蛋白/粒子避光保護(hù)的環(huán)境中，包含以下各項(xiàng)的融合蛋白的應(yīng)用a)來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列(例如，來(lái)自I型和/或II型的重復(fù)區(qū)的 序列)，b)來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的序列(諸如來(lái)自其重復(fù)區(qū)的序列)，和c)來(lái)自乙型肝炎的S抗原的序列，當(dāng)其在適合的寄主中被表達(dá)時(shí)提供包含所述融合蛋白和任選的未融合S抗原的 病毒樣粒子，以生產(chǎn)粒子。因此，本發(fā)明提供了具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的還原劑例如本文所述的諸如一 硫代甘油、半胱氨酸或其混合物、特別是一硫代甘油用于穩(wěn)定免疫原性脂蛋白粒子形式 的包含來(lái)源于間日瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的融合蛋白和/或來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白的融 合蛋白(諸如RTS)的蛋白粒子的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供可具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的還原劑，例如本文所述的諸如 一硫代甘油，用于穩(wěn)定包含CSV-S和/或RTS單元的VLP的應(yīng)用。在一個(gè)方面，本發(fā) 明提供了基本上由CSV-S和/或RTS單元組成的粒子。在可供選擇的方面，所述生成的 粒子包含或基本上由CSV-S和/或RTS以及S單元組成。據(jù)假設(shè)，本發(fā)明所使用的所述脂蛋白粒子可為在體內(nèi)進(jìn)一步刺激對(duì)所述抗原蛋 白的免疫應(yīng)答作貢獻(xiàn)。據(jù)進(jìn)一步假設(shè)，加入具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的穩(wěn)定劑例如本文所述的諸如一 硫代甘油、半胱氨酸及其混合物為每種粒子提供了內(nèi)穩(wěn)定化作用，從而所述試劑可在被給出的粒子內(nèi)被結(jié)合或內(nèi)在化。本發(fā)明還涉及包含與適合的賦形劑例如稀釋劑混合的免疫保護(hù)量的本發(fā)明的穩(wěn) 定化的蛋白粒子的疫苗。在本說(shuō)明書(shū)背景下的疫苗是指包含全部所述組分(包括輔助組分在內(nèi))并適于注 射進(jìn)人類(lèi)患者的制劑。在本發(fā)明背景下的穩(wěn)定化意欲表示其中具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的穩(wěn)定劑(本 文中還被稱(chēng)作還原劑)例如本文所述的諸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物被省略的 相應(yīng)制劑，例如當(dāng)在37°C下儲(chǔ)存7或14天和/或當(dāng)在加速穩(wěn)定性條件下儲(chǔ)存時(shí)諸如在 37°C下儲(chǔ)存7天、然后在強(qiáng)光存在下處理約15小時(shí)。穩(wěn)定性可涉及以下方面粒子大小(例如通過(guò)光散射技術(shù)、篩析(SizeExclusion) 色譜法或場(chǎng)流分級(jí)法測(cè)量的)和/或聚集/降解(例如通過(guò)SDS-page和蛋白質(zhì)印跡 (Western Blot)測(cè)量的)和/或抗原性(例如通過(guò)ELISA測(cè)量的)和/或免疫原性(例如 在體內(nèi)測(cè)量的)。在一個(gè)方面，穩(wěn)定性是指不存在聚集和降解的。組合物在本說(shuō)明書(shū)的背景下，賦形劑是指在藥物制劑中的自身沒(méi)有治療效果的組分。 助劑是一種賦形劑，因?yàn)楸M管在不存在治療性組分諸如抗原的條件下，存在由所述助劑 產(chǎn)生的生理作用，但是這一生理作用是非特異性的并且其自身是非治療性的。稀釋劑或 液體載體落入賦形劑的定義范圍內(nèi)。在本說(shuō)明書(shū)的背景下，免疫原性意欲是指能夠引發(fā)對(duì)所使用的融合蛋白的CS部 分和/或S抗原部分的特異性免疫應(yīng)答的能力。該應(yīng)答可以是例如當(dāng)所述脂蛋白粒子在 可能包含/要求適合的助劑的適當(dāng)?shù)闹苿┲斜唤o藥時(shí)?？赡芤蟀?lèi)似于或小于初始 劑量的劑量的加強(qiáng)劑，以獲得所需的免疫原性應(yīng)答。本發(fā)明的所述組合物/藥物制劑還可包含與一種或多種另外的抗原的混合物， 所述另外的抗原為諸如來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)和/或間日瘧原蟲(chóng)的那些，例如其中所述抗原 選自 DBP，PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl 和 RBP 或其片段。來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)的抗原的其它實(shí)例包括PffiMP-1，Pfs 16抗原，MSP_1， MSP-3, LSA-I, LSA-3，AMA-1和TRAP。其它瘧原蟲(chóng)抗原包括惡性瘧原蟲(chóng)EBA， GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白，Pf332，STARP, SALSA, PfEXP 1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲(chóng)中的類(lèi)似物。本發(fā)明的所述組合物/藥物制劑還可包含與含有CSV-S的粒子混合的RTS，S 的粒子(如WO 93/10152所述)。在本發(fā)明的疫苗中，可直接使用所述粒子的水性溶液。替代地，經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò) 先前冷凍干燥的蛋白可與助劑混合或被助劑所吸附。助劑適合的助劑是選自以下組中的那些金屬鹽，水包油型乳液，Toll樣受體激動(dòng) 劑(特別是Toll樣受體2激動(dòng)劑，Toll樣受體3激動(dòng)劑，Toll樣受體4激動(dòng)劑，Toll樣受 體7激動(dòng)劑，Toll樣受體8激動(dòng)劑和Toll樣受體9激動(dòng)劑)，皂草苷或它們的組合，前提條件是金屬鹽僅僅用于與另一種的助劑組合使用而非單獨(dú)使用，除非它們以至多約60% 的所述抗原被吸附到所述金屬鹽上的方式進(jìn)行配制。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述助劑不包 括金屬鹽作為唯一助劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述助劑不包括金屬鹽。在一實(shí)施方案中，所述助劑是Toll樣受體(TLR)4配體，例如諸如脂質(zhì)A衍生 物的激動(dòng)劑，所述脂質(zhì)A衍生物特別是單磷酰脂質(zhì)A或更特別是3-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì) A(3D-MPL)。3-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A從美國(guó)專(zhuān)利No.4,912,094和英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No.2,220,211 (Ribi)中已知并且可得自 Ribi Immunochem，Montana, USA。3D-MPL由Corixa公司以商標(biāo)MPL 銷(xiāo)售并且主要促進(jìn)具有IFN_g (Thl)表型 的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。其可以根據(jù)GB 2220211A中所公開(kāi)的方法制備。在化學(xué)上講，其 是3-去?；瘑瘟柞；|(zhì)A與3、4、5或6個(gè)?；湹幕旌衔?。在本發(fā)明的所述組 合物中優(yōu)選使用小粒子3D-MPL。小粒子3D-MPL具有使得其可被無(wú)菌過(guò)濾通過(guò)0.22 μ m 過(guò)濾器的粒度大小。這種制備物描述于WO 94/21292中。脂質(zhì)A的合成衍生物是已知 的并被認(rèn)為是TLR4激動(dòng)劑，包括但不限于OM174 (2-脫氧-6_0-[2-脫氧_2_[ (R) _3_十二碳?；趸奶减；?基]-4-o-膦酰基-β -D-吡喃葡糖基]-2_[ (R) -3-羥基十四碳?；被鵫 α -D-吡喃葡糖 基磷酸二氫酯)，(WO 95/14026)；OM 294DP (3S，9R) _3_[ (R)-十二碳?；趸奶减；被鵠-4_氧代_5_氮 雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四碳?；被鵠癸烷-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氫酯) (W099/64301 和 WO 00/0462)；OM 197MP-AC DP (3S_，9R) _3_[ (R)-十二碳?；趸奶减；被鵠_4_氧 代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四碳?；被鵠癸烷-1，10-二醇，1-磷酸二氫酯10-(6_氨 基己酸酯)(WO 01/46127)。一般地，當(dāng)使用3D-MPL時(shí)，所述抗原和3D-MPL使用明礬遞送或者存在于水 包油型乳液或多相水包油型乳液中。并入3D-MPL是有利的，因?yàn)槠涫切?yīng)器T細(xì)胞應(yīng) 答的刺激物?？墒褂玫钠渌腡LR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)，諸如在WO 9850399或US 6303347中公開(kāi)的那些(也公開(kāi)了用于制備AGPs的方法)，或如在US 6764840中公開(kāi)的AGPs的藥學(xué)可接受的鹽。一些AGPs是TLR4激動(dòng)劑，以及一些是 TLR4拮抗劑。認(rèn)為二者都可用作助劑。另一種用于本發(fā)明的免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。Quil A是從南美樹(shù)木皂 樹(shù)Quilaja Saponaria Molina中分離的皂草苷制備物并且由Dalsgaard等人在1974首次描述 為具有助齊[|活性(〃 Saponin adjuvants “，Archiv.fiir die gesamte Virasforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, ρ243_254)。Quil A的經(jīng)純化的級(jí)分已通過(guò)HPLC被分離，其保
留了助劑活性而不具有與Quil A有關(guān)的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21 (又名QA7 和QA21)。QS21是來(lái)源于皂樹(shù)Quilaja Saponaria Molina的樹(shù)皮的天然皂草苷，其誘導(dǎo) CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTLs)、Thl細(xì)胞和支配性IgG2a抗體應(yīng)答。特定的QS21制劑已有描述，其進(jìn)一步包括甾醇(WO 96/33739)。QS21 甾醇 的比率一般為1 100到1 1重量/重量級(jí)別。通常，存在過(guò)量的甾醇，QS21 甾醇的比率為至少1 2w/w。一般對(duì)于人類(lèi)給藥而言，QS21和甾醇在疫苗中將以每劑量約 1 μ g到約100 μ g、諸如每劑量約10 μ g到約50 μ g的范圍存在。所述脂質(zhì)體通常包括中性脂質(zhì)，例如卵磷脂，其在室溫下通常是非晶體，例如 蛋黃卵磷脂，二油酰基卵磷脂或二月桂?；蚜字Ｋ鲋|(zhì)體還可包含帶電荷的脂 質(zhì)，其增加了用于由飽和脂質(zhì)構(gòu)成的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在這些情 況下，帶電荷脂質(zhì)的量通常是1-20% w/w,諸如5-10%。甾醇磷脂的比率是1-50% (mol/mol),諸如 20-25%。這些組合物可包含MPL (3-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A，又名3D_MPL)。3D-MPL 從GB 2220211 (Ribi)中已知是三種類(lèi)型的具有4、5或6個(gè)酰基化鏈的去_0_?；瘑瘟?酰脂質(zhì)A的混合物并且由Ribi Immunochem, Montana生產(chǎn)。所述皂草苷可以分別是膠束、混合膠束(通常然而并非唯一地具有膽汁鹽)的形 式，或者可為ISCOM基質(zhì)形式(EP 0109942)、脂質(zhì)體或相關(guān)的膠態(tài)結(jié)構(gòu)的形式諸如蝸桿 樣或環(huán)樣多聚體復(fù)合物以及當(dāng)使用膽固醇和脂質(zhì)進(jìn)行配制時(shí)的脂質(zhì)/層狀結(jié)構(gòu)和薄片的 形式，或者為水包油型乳液的形式(例如在WO 95/17210中)。通常，所述皂草苷以脂質(zhì)體制劑、ISCOM或水包油型乳液的形式存在。還可使用免疫刺激性寡核苷酸。用于本發(fā)明的助劑或疫苗中的寡核苷酸的實(shí)例 包括含有CpG的寡核苷酸，通常含有被至少三個(gè)、更優(yōu)選被至少六個(gè)或更多個(gè)核苷酸分 開(kāi)的兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸CpG基序。CpG基序是跟隨有鳥(niǎo)苷酸的胞嘧啶核苷酸。所 述CpG寡核苷酸一般是脫氧核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述寡核苷酸中的核苷酸間 鍵合是二硫代磷酸酯鍵，或更優(yōu)選是硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯鍵和其它的核苷酸間 鍵也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。還被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間鍵合的 寡核苷酸。用于產(chǎn)生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US 5,666,153、US 5,278,302 和 WO 95/26204 中。寡核苷酸的實(shí)例如下所示TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) -SEQ ID No.20TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) -SEQ ID No.21ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG-SEQ ID No.22TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) -SEQ ID No.23TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) -SEQ ID No.24TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) -SEQ ID No.25所述序列可包含用硫代磷酸酯改性的核苷酸間鍵合。替代的CpG寡核苷酸可包含上述的一種或多種序列，對(duì)所述序列進(jìn)行無(wú)關(guān)緊要 的缺失或附加。所述CpG寡核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法合成(例如，參見(jiàn)EP 468520)。方便地是，這種寡核苷酸可采用自動(dòng)合成器來(lái)合成。TLR 2激動(dòng)劑的實(shí)例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉類(lèi)諸如咪喹莫特和雷西 莫特是已知的TLR7激動(dòng)劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動(dòng)劑(在人類(lèi)中是TLR8，在 小鼠中是TLR7)，而雙鏈RNA和聚肌胞苷酸(聚肌苷酸-聚胞苷酸-病毒RNA的市售的 合成模擬物)是TLR 3激動(dòng)劑的示例。3D-MPL是TLR4激動(dòng)劑的實(shí)例，而CpG是TLR9激動(dòng)劑的實(shí)例。免疫刺激劑可替代地或附加地被加入。在一個(gè)實(shí)施方案中，該免疫刺激劑將是 3-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D_MPL)。在一個(gè)方面，所述助劑含有3D-MPL。在一個(gè)方面，所述助劑含有QS21。在一個(gè)方面，所述助劑含有CpG。在一個(gè)方面，所述助劑被配制為水包油型乳液。在一個(gè)方面，所述助劑被配制為脂質(zhì)體。助劑組合包括3D-MPL 和 QS21 (EP 0671948B1)，包含 3D-MPL 和 QS21 的水包 油型乳液(WO 95/17210，WO 98/56414),在脂質(zhì)體制劑中的3D-MPL和QS21，或與其 它載體進(jìn)行配制的3D_MPL(EP 0689454B1)。其它助劑系統(tǒng)包括3D-MPL、QS21和CpG 寡核苷酸的組合，如US6558670和US 6544518所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文所述的穩(wěn)定化的粒子與3D-MPL 和稀釋劑組合的疫苗。所述稀釋劑一般是水包油型乳液或明礬。疫苗制備物通常描述于New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人編 輯，University Park Press，Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978 中。在脂質(zhì)體內(nèi)的囊封 由例如Fullerton等人描述于美國(guó)專(zhuān)利4,235,877中。在每個(gè)疫苗劑量中存在的本發(fā)明的蛋白粒子的量被選擇為誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答而 無(wú)典型疫苗中的顯著的不良副作用的量。這種量將根據(jù)使用哪種特異性免疫原以及所 述疫苗是否采用助劑而異。通常，可以預(yù)期每個(gè)劑量將包含I-IOOOyg的蛋白，優(yōu)選 l-200yg的蛋白，最優(yōu)選IO-IOOyg的蛋白。對(duì)于特定疫苗的最佳量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究來(lái) 確定，所述標(biāo)準(zhǔn)研究涉及觀察對(duì)象中的抗體滴度以及其它應(yīng)答。在最初接種疫苗后，對(duì) 象優(yōu)選在約4周內(nèi)接受加強(qiáng)接種，然后只要存在感染風(fēng)險(xiǎn)，則每六個(gè)月重復(fù)進(jìn)行加強(qiáng)接 種。對(duì)本發(fā)明蛋白的免疫應(yīng)答通過(guò)使用助劑和/或免疫刺激劑得以被增強(qiáng)。使用的3D-MPL的量通常較小，但是根據(jù)疫苗制劑的不同而異，可為每劑量 1-1000 μ g，例如每劑量1-500 μ g，或每劑量1到100 μ g，諸如每劑量50或25 μ g。在本發(fā)明的助劑或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常較小，但是 根據(jù)疫苗制劑的不同而異，可為每劑量1-1000 μ g，例如每劑量l-500yg，諸如每劑量 1-100 μ g。在本發(fā)明的助劑中使用的皂草苷的量可為每劑量l-1000yg，例如每劑量 1-500 μ g，諸如每1-250 μ g，特別是每劑量1-100 μ g，尤其是每劑量50或25 μ g。制劑本發(fā)明的制劑可用于預(yù)防性或治療性目的。因此，本發(fā)明提供了本文所述的疫 苗組合物，其用于醫(yī)藥用途，例如，用于治療(或預(yù)防)瘧疾(或用于制備用于治療/預(yù) 防瘧疾的藥物)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了制備本發(fā)明的疫苗組分和疫苗以及包含各成分的藥 包的方法，該方法包括在適合的寄主例如酵母中表達(dá)編碼所述蛋白的DNA序列，并回 收作為脂蛋白粒子的產(chǎn)物，并將后者與本文所定義的至少一種穩(wěn)定劑、特別是一硫代甘 油、半胱氨酸及其混合物、諸如一硫代甘油混合。
最終體積通常被無(wú)菌地分配在3ml玻璃小瓶中，然后將玻璃小瓶寬松地塞上并 轉(zhuǎn)移到冷凍干燥器中經(jīng)歷約40小時(shí)的凍干循環(huán)。在制備所述抗原組分的過(guò)程中，所述賦形劑通常被加入并混合，以及作為最終 步驟，所述抗原/脂蛋白粒子將被加入。對(duì)于該制備物，也可最后施加保護(hù)措施諸如從 小瓶中除去氧或通過(guò)使用褐色玻璃容器使所述疫苗避光，并結(jié)合使用穩(wěn)定劑或作為備選 措施。在本發(fā)明的其中除去氧的方面中，所述制劑/組分/粒子等可在氮?dú)庀聝?chǔ)存。所述助劑經(jīng)常被加入到所述抗原的液體制劑(或所述抗原的凍干制劑)中以形成疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)方面在于通過(guò)給予如上所述的有效量的疫苗治療容易受瘧原蟲(chóng) 感染的患者的方法。在另一個(gè)方面，提供了用于本發(fā)明的治療用的疫苗的抗原成分或疫苗(或它們 在制備用于治療/預(yù)防瘧疾的藥物的用途)。本發(fā)明還包括初免加強(qiáng)方案，包括本文所述的各種組分中的一種或多種。在本說(shuō)明書(shū)的背景下，“包括”被解釋為“包含”。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在3mL玻璃小瓶例如琥珀小瓶中的本文所述的穩(wěn)定 化的瘧疾抗原，所述小瓶任選地在填充之前用氮?dú)獯祾咭猿バ∑恐械难跷镔|(zhì)。使用的小瓶可以是硅化的或非硅化的。本發(fā)明還延伸到由或基本上由本文所述的本發(fā)明的各方面組成的單獨(dú)的實(shí)施方 案，其視情況而定包括某些要素。顯示了以下的實(shí)施例用于說(shuō)明所述方法，其用于制備本發(fā)明的粒子。
實(shí)施例
實(shí)施例1
用于RTS，S瘧疾疫苗的單一兒科劑量(2小瓶制劑)的組分的處方
組分量
RTS，S25 μ g
NaCl2.25mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM
一硫代甘油125 μ g
注射用水使體積達(dá)250 μ L
以上處方的制備方法為將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、
鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當(dāng)稀釋50倍時(shí)為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的 混合物中。最后，調(diào)節(jié)pH到7.0 士0.1。這可作為與助劑(例如，MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑)的單獨(dú)的小瓶在一起的小
瓶被提供。組分量1，2- 二-油?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ g
MPL25 μ gQS2125 μ gNaCl2.25mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM注射用水使體積達(dá)250 μ L對(duì)于給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進(jìn)行， 然后振搖。然后，以常規(guī)方式給予所述劑量。最終液體制劑的ρΗ為約6.6+/-0.1。 實(shí)施例IA
本發(fā)明的最終兒科液體制劑(1小瓶)可根據(jù)以下處方制備。 組分量
RTS, S25 yg
4.5mg
IOmM 125 μ g
NaCl
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) 一硫代甘油1，2- 二-油?；?sn-甘油基_3_磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ gMPL25 μ gQS2125 μ g注射用水使體積達(dá)500 μ L上述液體制劑的ρΗ或者被調(diào)節(jié)到7.0+/-0.1 (其對(duì)于抗原穩(wěn)定性而言是有利的， 但是對(duì)于MPL的穩(wěn)定性而言完全沒(méi)有利)，或者被調(diào)節(jié)到6.1+/-0.1 (其對(duì)于MPL穩(wěn)定性 而言是有利的，但是對(duì)于RTS，S穩(wěn)定性而言完全沒(méi)有利)。因此，該制劑意欲在制備后 迅速使用。上述制劑如下制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC1 1500mM、磷酸鹽緩 沖液(Na/K2)500mM(當(dāng)稀釋50倍時(shí)為ρΗ 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的混合 物中。然后，加入包含MPL與QS21的脂質(zhì)體的預(yù)混合物，并且最后調(diào)節(jié)ρΗ。實(shí)施例IB本發(fā)明的RTS，S的最終成人劑量(1小瓶制劑)可如下制備組分量RTS, S50 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油250 μ g1，2- 二-油酰基-sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 1000 μ g膽固醇250 μ gMPL50 μ gQS2150 μ g注射用水使體積達(dá)500 μ L
實(shí)施例IC可例如在填充之前用氮?dú)獯祾哏晷∑慷髮?shí)施例1、IA或IB置于該小瓶中 來(lái)制備實(shí)施例IC。實(shí)施例2本發(fā)明的組分還可作為用于兒科人群的二劑量(2小瓶制劑)被提供。組分量RTS, S50 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油250 μ g注射用水使體積達(dá)500 μ L上述制劑的制備方法為將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷酸 鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當(dāng)稀釋50倍時(shí)為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液的 混合物中。最后，調(diào)節(jié)pH到7.0 士0.1。這可作為與助劑(例如，MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑)的單獨(dú)的小瓶在-
瓶被提供。組分量1，2- 二-油?；?sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 1000 μ g 然后振搖最終液體制劑的pH為約6.6+/-0丄
-起的小
250 μ g 50 μ g 50 μ g
膽固醇 MPL QS21
NaCl4.5mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM
注射用水使體積達(dá)500 μ L
對(duì)于給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進(jìn)行， 然后以常規(guī)方式吸取單一劑量(500 μ L)并給藥。
實(shí)施例2Α
本發(fā)明的最終兒科液體制劑(1小瓶)可根據(jù)以下處方被制備為雙劑量。
組分量
RTS, S50 yg
NaCl9mg
磷酸鹽緩沖液(Na/K2)IOmM
-硫代甘油
250 μ g
1，2- 二-油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC) IOOOyg
膽固醇
MPL
QS21
注射用水
250 μ g 50 μ g 50 μ g 使體積達(dá)1000 μ L
上述液體制劑的pH或者被調(diào)節(jié)到7.0+/-0.1 (其對(duì)于抗原穩(wěn)定性而言是有利的， 但是對(duì)于MPL的穩(wěn)定性而言完全沒(méi)有利)，或者被調(diào)節(jié)到6.1+/-0.1 (其對(duì)于MPL穩(wěn)定性 而言是有利的，但是對(duì)于RTS，S穩(wěn)定性而言完全沒(méi)有利)。因此，該制劑意欲在制備后 迅速使用。上述制劑按如下方法制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷 酸鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當(dāng)稀釋50倍時(shí)為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液 的混合物中。然后，加入包含MPL與QS21的脂質(zhì)體的預(yù)混合物，并且最后調(diào)節(jié)pH。
實(shí)施例2B
本發(fā)明的RTS，S的最終成人劑量(1小瓶制劑)可如下被制備成雙劑量 組分量
RTS, SIOOyg
9mg
IOmM 500 μ g
NaCl
磷酸鹽緩沖液(Na/K2) 一硫代甘油1，2- 二-油酰基-sn-甘油基 _3_ 磷酸膽堿(DOPC) 2000 μ g膽固醇500 μ gMP100 μ gQS21100 μ g注射用水使體積達(dá)1000 μ L實(shí)施例2C可例如在填充之前用氮?dú)獯电晷∑慷髮?shí)施例2、2Α或2Β置于該小瓶中來(lái) 制備實(shí)施例2C。實(shí)施例3用于填充體積為500 μ 1的RTS，S瘧疾疫苗的單一兒科劑量(2小瓶制劑)的組 分的處方。組分量RTS, S25 UgNaCl4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2) IOmM一硫代甘油50 μ g 或 200 μ g注射用水使體積達(dá)500 μ L上述制劑按如下方法制備將RTS，S抗原加入到注射用水、NaC11500mM、磷 酸鹽緩沖液(Na/K2)500mM(當(dāng)稀釋50倍時(shí)為pH 6.8)和一硫代甘油的10%的水性溶液 的混合物中。最后，調(diào)節(jié)pH到7.0士0.1。這可作為與助劑(例如，填充體積為500 μ 1的MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑)的 單獨(dú)的小瓶在一起的小瓶被提供。組分量1，2- 二-油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC) 500 μ g膽固醇125 μ g
MPLQS21NaCl
25 μ g 25 μ g 4.5mg磷酸鹽緩沖液(Na/K2)注射用水
IOmM 使體積達(dá)500 μ L為了給藥，將所述助劑制劑加入到所述組分制劑中，例如，使用注射器進(jìn)行， 然后振搖。然后以常規(guī)方式給藥所述劑量。最終液體制劑的ρΗ為約6.6+/-0.1并且注射體積為1ml。實(shí)施例4加速穩(wěn)定性結(jié)果指示如下· ρΗ和滲克分子濃度與注射相容；·關(guān)于RTS，S含量在4°C或37°C歷時(shí)5周后，沒(méi)有由非特異性吸附導(dǎo)致的 抗原損失；·關(guān)于抗原完整性(參見(jiàn)圖6、7和8)·在加速穩(wěn)定性之后(37°C 士AOT歷時(shí)7天，37°C歷時(shí)14天)沒(méi)有顯著降解；·沒(méi)有惰化(without inerting)，要求抗氧化劑(一硫代甘油)以避免在加速穩(wěn)定 性(37°C 士AOT歷時(shí)7天，37°C歷時(shí)14天)之后發(fā)生氧化性聚集；ο在37°C 0.01%足以避免聚集；ο對(duì)于在37°C +AOT下的穩(wěn)定性需要0.04% ；·琥珀色玻璃確?？乖芄?在AOT之后觀察到的)；·在加速穩(wěn)定性(37°C歷時(shí)7天)之后RTS，S粒度分布不發(fā)生改變；·關(guān)于抗原性(參見(jiàn)圖9)；·沒(méi)有惰化(withoutinerting)，要求抗氧化劑(一硫代甘油)以避免在加速穩(wěn)定
性(37°C 士AOT歷時(shí)7天)之后發(fā)生氧化性聚集和抗原性增加；ο 0.01%允許很穩(wěn)定的抗原性(80-120% )；ο 0.04%在加速穩(wěn)定性之后誘導(dǎo)輕微的抗原性降低(-10% )；·在與ASOl (含有MPL和QS21的脂質(zhì)體助劑制劑)混合時(shí)·在混合之后RTS，S完整性和抗原性在25°C保持至少24小時(shí)。在有或者沒(méi)有一硫代甘油時(shí)將這些RTS，S液體制劑在37°C儲(chǔ)存7天、14天， 圖8或甚至5周之后，已進(jìn)行了 SDS-Page分析。圖6表明·在沒(méi)有一硫代甘油的條件下在37°C儲(chǔ)存7天之后發(fā)生輕微的RTS，S聚集 (孔3和4)；在暴露于AOT下之前在37°C在白色小瓶中儲(chǔ)存7天后完全聚集和輕微降解 (孔6)，而琥珀色玻璃避免RTS，S發(fā)生由光誘導(dǎo)的降解和氧化性聚集(孔5)；·在有一硫代甘油0.01 %的條件下該濃度足夠使RTS，S在37°C下儲(chǔ)存時(shí)穩(wěn) 定7天(孔7)，但是在加速氧化試驗(yàn)(AOT)累積下該濃度不足夠(孔9)，除了與琥珀色 玻璃組合使用之外(孔8)； 在有一硫代甘油0.04%的條件下該濃度足夠使RTS，S在37°C下儲(chǔ)存時(shí)穩(wěn) 定7天(孔10)，當(dāng)使用加速氧化試驗(yàn)累積時(shí)也是如此(孔12)；在這種情況下，不要求填充到琥珀色玻璃小瓶中(孔11)；·與ASOl混合對(duì)RTS，S特性沒(méi)有影響，即使在25°C儲(chǔ)存24小時(shí)之后。圖7顯示需要一硫代甘油來(lái)避免RTS，S聚集，但是兩個(gè)濃度都能夠使RTS，S 在37°C儲(chǔ)存時(shí)穩(wěn)定至少14天(孔11和12，相對(duì)于孔10)。圖8顯示在37°C歷時(shí)5周之后，在全部制劑中都發(fā)生RTS，S聚集和降解；ASOl 在全部制劑中加重聚集。實(shí)施例5對(duì)于包含0、0.01 %或0.04 %的一硫代甘油的制劑，通過(guò)混合 ELISAa CSP-α S,在 TO (士 AOT)或在 37°C儲(chǔ)存 7 天(士 AOT)或 5 周時(shí)，測(cè)定 RTS，S 抗原性；已經(jīng)在與ASOl重新構(gòu)成之前、剛剛重新構(gòu)成之后和重新構(gòu)成之后在25°C 24小 時(shí)測(cè)量RTS，S抗原性。圖9表明·在沒(méi)有一硫代甘油的條件下ο暴露于675W下歷時(shí)15小時(shí)(AOT)促使抗原性增加50-60% (這可以與在 SDS-Page中觀察到的氧化性聚集相關(guān)聯(lián))，但是裝入琥珀色玻璃小瓶將這一抗原性增加 限制到 20% ；ο在37°C儲(chǔ)存7天促使抗原性增加 30-40% (這也可以與在SDS-Page中觀察 到的氧化性聚集相關(guān)聯(lián))；ο在37°C下7天到5周之間，抗原性降低 30% ；ο在25°C歷時(shí)24小時(shí)之后，ASOl促使抗原性增加 20 這也可以與在 SDS-Page中觀察到的聚集增加相關(guān)聯(lián))； 在有0.01%—硫代甘油的條件下ο —硫代甘油保護(hù)RTS，S避免發(fā)生由于在37°C儲(chǔ)存7天、AOT誘導(dǎo)的(使琥 珀色玻璃無(wú)用)或與ASOl混合所誘導(dǎo)的抗原性增加(但是當(dāng)在ASOl中在25°C儲(chǔ)存24小 時(shí)累積到在37°C儲(chǔ)存7天時(shí)，該增加為 20%);ο在37°C下7天和5周之間抗原性降低 20% (—不合格(out ofspec))； 在有0.04%—硫代甘油的條件下ο —硫代甘油保護(hù)RTS，S避免發(fā)生由AOT誘導(dǎo)的抗原性增加，使褐色玻璃無(wú) 用；ο在37°C儲(chǔ)存7天促使抗原性降低 20% ；ο在37°C下7天到5周之間不發(fā)生抗原性降低；ο在25°C歷時(shí)24小時(shí)之后，ASOl促使抗原性增加 30-40%。實(shí)施例6為了考察一硫代甘油被固定到RTS，S上對(duì)單克隆抗體識(shí)別RFl-表位(S)的影 響，在使用或未使用一硫代甘油(MTG)進(jìn)行穩(wěn)定的RTS，S液體制劑中，在TO (時(shí)間0) 或在37°C儲(chǔ)存7天之后(7天)，通過(guò)ELISA抑制試驗(yàn)測(cè)定了 RTS，S對(duì)RFl腹水的反應(yīng) 性(參見(jiàn)表1)。表權(quán)利要求
1.瘧疾疫苗用組分，其包括a)免疫原性粒子RTS，S和/或b)來(lái)源于一種或多種間日瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任選的 未融合S抗原的免疫原性粒子，或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的穩(wěn)定劑或其混合物的穩(wěn)定劑。
2.權(quán)利要求1所述的組分，其中所述穩(wěn)定劑是N-乙酰半胱氨酸，一硫代甘油，半胱 氨酸，還原型谷胱甘肽和硫代乙酸鈉，或其混合物。
3.權(quán)利要求2所述的組分，其中所述穩(wěn)定劑是一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述組分是液體制劑。
5.權(quán)利要求4所述的組分，其中所述液體制劑的pH為約6.5到7.2。
6.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述組分經(jīng)過(guò)凍干。
7.權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述穩(wěn)定劑是半胱氨酸并在0.1到1.0% w/w的范圍內(nèi)存在。
8.權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述穩(wěn)定劑是一硫代甘油，其在所述制 劑中在0.01到w/w的范圍內(nèi)存在。
9.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述組分被儲(chǔ)存在玻璃小瓶中。
10.權(quán)利要求9所述的組分，其中所述玻璃小瓶是琥珀色的。
11.權(quán)利要求9或10所述的組分，其中所述玻璃小瓶是硅化的。
12.權(quán)利要求9或10所述的組分，其中所述玻璃小瓶是非硅化的。
13.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述組分包含除助劑組分以外的一個(gè) 劑量的注射用成分。
14.權(quán)利要求13所述的組分，其中所述一個(gè)劑量包括25μ g的RTS，S。
15.權(quán)利要求14所述的組分，其進(jìn)一步包含2.25mg的氯化鈉。
16.權(quán)利要求14或15所述的組分，其進(jìn)一步包括125μ g的一硫代甘油。
17.權(quán)利要求13到16中任一項(xiàng)所述的組分，其進(jìn)一步包含250μ L的注射用水。
18.權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的組分，其中所述組分包含除助劑組分以外的兩個(gè) 劑量的注射用成分。
19.權(quán)利要求1到12和18所述的組分，其中所述一個(gè)劑量包含50μ g的RTS，S。
20.權(quán)利要求19所述的組分，其進(jìn)一步包含4.5mg的氯化鈉。
21.權(quán)利要求19或20所述的組分，其進(jìn)一步包含250μ g的一硫代甘油。
22.權(quán)利要求1到12或19到21中任一項(xiàng)所述的組分，其進(jìn)一步包含500μ L的注射用水。
23.權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的組分，其進(jìn)一步包含其它的瘧疾抗原。
24.權(quán)利要求23所述的組分，其中所述其它的瘧疾抗原源自于惡性瘧原蟲(chóng)和/或間日 瘧原蟲(chóng)，其中所述抗原選自DBP諸如Pv RII，即DBP的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，PvTRAP， PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, Pv ΑΜΑ, RBP 或其片段，PffiMP-1，Pfsl6 抗原，MSP-1，MSP-3，LSA-I, LSA-3，AMA-1 和 TRAP, EBA, GLURP, RAPl, RAP2,鉗合蛋白，Ρβ32，STARP, SALSA, PfEXPl,Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230以及它們的在其它的瘧原蟲(chóng)中的類(lèi)似物。
25.瘧疾用疫苗，其包含權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的組分和選自以下的助劑a.包含QS21和3D-MPL的水包油型制劑，或b.包含QS21和3D-MPL的脂質(zhì)體制劑。
26.用于制備權(quán)利要求1到24中任一項(xiàng)所述的組分的方法，包括在適合的寄主中表達(dá) 編碼所述蛋白的DNA序列，回收產(chǎn)物并將所回收的產(chǎn)物與穩(wěn)定劑混合。
27.權(quán)利要求1到24中任一項(xiàng)所述的瘧疾疫苗用組分或權(quán)利要求25所述的疫苗，其 用于預(yù)防或治療瘧疾。
28.權(quán)利要求1到24中任一項(xiàng)所述的組分或權(quán)利要求25所述的疫苗在制備用于預(yù)防 或治療瘧疾的藥物中的應(yīng)用。
29.通過(guò)給予有效量的權(quán)利要求25所述的疫苗來(lái)治療易感瘧原蟲(chóng)感染的患者的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了瘧疾疫苗用組分，其包括a)免疫原性粒子RTS，S和/或b)來(lái)源于一種或多種間日瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株的CS蛋白和得自乙型肝炎的S抗原以及任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，或c)包含RTS、CSV-S和任選的未融合S抗原的免疫原性粒子，和d)包括具有至少一個(gè)硫醇官能團(tuán)的穩(wěn)定劑或其混合物的穩(wěn)定劑。本發(fā)明還公開(kāi)了制備所述組分的方法，所述組分的藥物用途，特別是在預(yù)防瘧疾感染中的應(yīng)用，包含所述組分的組合物/疫苗，以及所述組合物/疫苗的應(yīng)用，特別是在治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/015GK102026657SQ200880127241
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者D·I·勒穆瓦, F·E·J·F·沃特斯 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司