專利名稱：轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)的霍亂疫苗及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體地說是通過轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)霍亂疫苗，利用轉(zhuǎn)化的胡蘿卜下胚軸分化為完整植株，轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)霍亂毒素B亞單位(CTB)，制備具有生物活性和實(shí)用的霍亂口服疫苗。
隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物能夠表達(dá)多種蛋白質(zhì)，包括來源于動物、人類、病毒和細(xì)菌等的蛋白質(zhì)。而利用植物表達(dá)口服疫苗更有利于疫苗的分裝和服用；在植物的果實(shí)或疏菜中表達(dá)多肽疫苗，這只需將種子運(yùn)輸?shù)礁鞯?，再繁殖出植物的可食部分即可直接?yīng)用，從而可大大簡化疫苗的貯藏和分裝。因此利用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)安全、廉價、實(shí)用的口服疫苗，更有利于口服疫苗的推廣和腸道傳染病的預(yù)防[6]。
目前大多使用模式植物表達(dá)多肽疫苗，如煙草、馬鈴薯等，這些植物表達(dá)的多肽疫苗不能直接口服，需經(jīng)純化后才能使用；而選用能夠生吃的植物的組織或果實(shí)(如水果和蔬菜)生產(chǎn)口服疫苗，這樣才能發(fā)揮植物表達(dá)系統(tǒng)的作用[6]。在許多可以生吃的植物中，胡蘿卜具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和實(shí)用價值，它的種植范圍比較廣，能夠滿足大量生產(chǎn)外源蛋白的需要；胡蘿卜還含有豐富的維生素，在預(yù)防疾病的同時又可增加營養(yǎng)。因此，胡蘿卜生產(chǎn)口服疫苗具有重要的意義。在植物生產(chǎn)霍亂疫苗方面，Hein等只獲得了表達(dá)CTB的轉(zhuǎn)基因煙草，對CTB活性未作分析[5]。Arakawa等用馬鈴薯表達(dá)的CTB不能生吃，而加熱煮熟后CTB的活性大大降低[1，2]；這些研究都未能獲得有實(shí)用價值的CTB植物生產(chǎn)系統(tǒng)。
在改進(jìn)作物品質(zhì)或生產(chǎn)異源蛋白方面，轉(zhuǎn)基因方法已成為重要的手段。在已有的胡蘿卜轉(zhuǎn)化方法中，大多采用培養(yǎng)細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化的受體材料，如愈傷組織、懸浮細(xì)胞等[3，7，9]。由于這些材料不易被根癌農(nóng)桿菌侵染，轉(zhuǎn)化效率較低，并且懸浮細(xì)胞培養(yǎng)需要較嚴(yán)格的無菌培養(yǎng)條件，不利于操作。也有用胡蘿卜下胚軸作為轉(zhuǎn)化的受體材料[4，8]，但轉(zhuǎn)化的胡蘿卜下胚軸再生的愈傷組織須經(jīng)過懸浮細(xì)胞培養(yǎng)才能再生植株，轉(zhuǎn)化方法復(fù)雜并且周期長。在已報道的這些胡蘿卜轉(zhuǎn)化方法中，轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞再生成植株都要通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程。因此，這些胡蘿卜轉(zhuǎn)化方法還不夠完善，制約了胡蘿卜在基因操作方面的研究進(jìn)展。
本發(fā)明的目的在于提供一種口服疫苗的生產(chǎn)方法。即利用轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)CTB，通過表達(dá)載體的構(gòu)建、胡蘿卜的轉(zhuǎn)化、CTB的表達(dá)分析生產(chǎn)具有生物活性的CTB。本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡便的胡蘿卜轉(zhuǎn)化方法，即根癌農(nóng)桿菌與胡蘿卜下胚軸共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化的胡蘿卜下胚軸直接分化形成再生植株。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，選擇能夠直接生吃的胡蘿卜生產(chǎn)霍亂疫苗，即將霍亂疫苗基因表達(dá)在胡蘿卜的可食部位，通過口服胡蘿卜的直根，可達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下以pUC-CTB質(zhì)粒為模板，根據(jù)已報導(dǎo)的CTB編碼區(qū)5’端和3’端序列設(shè)計并合成一對引物，通過PCR擴(kuò)增CTB基因。純化PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，獲得含CTB基因的重組質(zhì)粒pGEB。測序表明CTB基因與霍亂弧菌569B株的CTB原始序列相同。將CTB基因的5’端與煙草病程相關(guān)蛋白PR1b信號肽序列同框融合，獲得pRBC重組質(zhì)粒。
從重組質(zhì)粒pRBC分離出含PR1b-CTB融合基因的DNA片段連接到植物組成型表達(dá)載體pBin438，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue獲得能在植物中組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒pBirc38及重組大腸桿菌XL1-Blue-pBirc38。
從上述重組大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒pBirc38，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得重組農(nóng)桿菌LBA4404-CTB。用重組農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化胡蘿卜下胚軸，通過選擇培養(yǎng)，獲得了抗卡那霉素植株。植株葉片總DNA的PCR分析表明得到了含CTB基因的植株。Western blot分析表明轉(zhuǎn)基因胡蘿卜能夠表達(dá)CTB蛋白。ELISA分析證明CTB能夠在轉(zhuǎn)基因胡蘿卜根部和葉片中有效表達(dá)。GM1結(jié)合的阻斷試驗(yàn)表明胡蘿卜中表達(dá)的CTB形成五聚體，CTB能夠有效地與GM1神經(jīng)節(jié)苷酯結(jié)合。結(jié)合附圖
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
A將胡蘿卜下胚軸在B5共培養(yǎng)培養(yǎng)基上2-3天后，轉(zhuǎn)入B5抑制培養(yǎng)基(B5無機(jī)鹽+B5維生素+1mg/L NAA+0.5mg/LBAP+20g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+8g/瓊脂)暗培養(yǎng)2周，以加快下胚軸傷口細(xì)胞的擴(kuò)增。再將下胚軸轉(zhuǎn)入B5篩選培養(yǎng)基(B5無機(jī)鹽+B5維生素+1mg/L NAA+0.5mg/LBAP+20g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L瓊脂)上培養(yǎng)，2周繼代一次。兩周后，可觀察到下胚軸兩端有明顯膨大，并長出愈傷組織小塊。轉(zhuǎn)化的下胚軸在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6周，下胚軸兩端的愈傷組織開始分化長出小綠點(diǎn)，并逐步長成分化芽(圖2-1)。當(dāng)分化芽長至1cm左右時，將生長狀態(tài)較好的小芽轉(zhuǎn)移到B5生根培養(yǎng)基(B5無機(jī)鹽+B5維生素0.1mg/L IBA+20g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L瓊脂)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，分化芽在B5生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4周后，能夠長出正常根，形成完整的植株(圖2-2)。在這種條件下，轉(zhuǎn)化的下胚軸細(xì)胞可直接分化形成分化芽，但分化芽要經(jīng)過生根培養(yǎng)才能形成完整的植株。
B胡蘿卜下胚軸在MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上2-3天后，轉(zhuǎn)入MS抑制培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+1.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+8g/L瓊脂)上暗培養(yǎng)2周，可見下胚軸的兩端有明顯膨大。再將下胚軸轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+1.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L瓊脂)上培養(yǎng)，2周繼代一次。在MS篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6周，端部膨大的下胚軸可誘導(dǎo)生長出愈傷組織。將生長較快的愈傷組織分成小塊轉(zhuǎn)移到MS分化培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽+30g/L蔗糖+400mg/L羧芐青霉素+50mg/L卡那霉素+8g/L瓊脂)上培養(yǎng)，兩周繼代一次。經(jīng)3-4周培養(yǎng)后，愈傷組織能夠分化，并同時長出芽和根(圖3-1)。當(dāng)分化芽生長至1cm左右時，選擇生長狀態(tài)較好的分化芽，轉(zhuǎn)移到新的MS分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4-5周后，分化芽可形成4-5cm的完整植株(圖3-2)。4．轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的PCR檢測取胡蘿卜葉片50-100mg，液氮冷凍研磨后，加入500μL提取緩沖液(2％CTAB，100mmol/L Tris pH8.0，50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，14mmol/L巰基乙醇)，65℃溫育1小時，每隔15分鐘輕輕混勻一下。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻；10,000rpm離心5分鐘，吸出上清。再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次；取出上清，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃沉淀1小時。13,000rpm離心15分鐘，棄上清，用75％酒精洗一次。涼干，加入適量的去離子水溶解DNA。PCR方法為取1μL(約200ng-1μg)總DNA，用PR1b SP 5’端引物和CTB基因3’端引物，按標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃5分鐘；94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘；循環(huán)30次。72℃10分鐘。取8μL PCR反應(yīng)混合物，在1％瓊脂糖膠上電泳。結(jié)果表明包括PR1b-CTB融合基因5’和3’端序列在內(nèi)，從轉(zhuǎn)基因胡蘿卜基因組DNA擴(kuò)增出一個400bp的片段(圖4)。5．轉(zhuǎn)基因胡蘿卜表達(dá)CTB的Western blot檢測取100mg新鮮葉片，液氮冷凍后，用研桿研成粉末。將粉末加入200μL提取緩沖液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巰基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)中，待樣品充分溶解后，于4℃、13,000rpm離心20分鐘。取上清用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。取50μL上清加入等體積的樣品緩沖液，100℃煮5分鐘。離心去沉淀后，樣品用于電泳分析。蛋白質(zhì)電泳時采用Tris-甘5系統(tǒng)。電泳結(jié)束后，用Bio-Rad半干電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)處理的PVDF膜上。恒壓9伏，轉(zhuǎn)移30分鐘。將膜置于封閉緩沖液(20mmol/L Tris-HClpH7.5，5 00mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ tween-20，3％BSA)中，室溫輕搖1小時。將膜置于兔抗CT血清中(1∶5000，20mmol/L Tris-HClpH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ Tween-20，1％BSA稀釋)室溫輕搖1小時；用洗滌緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ tween-20)洗膜三次，每次10分鐘。將膜置于堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗兔IgG中(1∶5000，20mmol/L Tris-HCl pH7.5，500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1％ Tween-20，1％BSA稀釋)室溫輕搖1小時。用洗滌緩沖液洗膜三次，每次10分鐘。用BCIP和NBT顯色。選取PCR陽性植株進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株可表達(dá)分子量與預(yù)期的CTB相當(dāng)，并可與抗CT血清起特異免疫反應(yīng)的蛋白5(圖5)。6．胡蘿卜中CTB與GM1神經(jīng)節(jié)苷酯的結(jié)合分析取50mg胡蘿卜葉片，加入500μL PBST(pH7.4，0.1％ Tween-20)研碎，10,000rpm離心5分鐘，取上清用于ELISA檢測。用100μL含2μg神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的碳酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH9.6)包被96孔酶聯(lián)板，用2％的BSA封閉后，加入不同稀釋倍數(shù)的樣品，4℃過夜。經(jīng)PBST洗滌后，加100μL的兔抗CT血清(1∶5,000)，37℃保溫1小時。PBST洗滌三次，加100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶7,500)，37℃保溫2小時。TMB顯色，2M H2SO4終止后，405nm測紫外吸收值。在GM1-ELISA結(jié)合分析中，將胡蘿卜產(chǎn)CTB與天然CTB直接加樣或加熱變性后做ELISA，結(jié)果表明，與天然CTB蛋白一樣，胡蘿卜產(chǎn)CTB與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂有較強(qiáng)的親和性，而加熱變性的天然CTB和胡蘿卜產(chǎn)CTB與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合能力較弱(圖6)，這表明胡蘿卜產(chǎn)CTB具有結(jié)合GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的能力，這種結(jié)合性表明，在CTB形成GM1結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸和GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的多糖分子之間，保持了特異的蛋白質(zhì)-神經(jīng)節(jié)苷脂的相互結(jié)合作用。7．轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中CTB蛋白的含量葉片總蛋白的提取和測定方法同5。ELISA方法同6。選取CTB表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因植株，分析CTB在轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中的含量。分別6蘿卜的葉片和根部，用PBS緩沖液提取葉片和根部總蛋白，以Bradford法測定總蛋白的含量。同時，將提取蛋白以不同的稀釋度做ELISA測定，以天然CTB為標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度作為對照。將ELISA測出的CTB絕對量與植物總蛋白量相比，即可得出CTB在總可溶蛋白中的含量。在表達(dá)載體pBirc38轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的葉片和根部，CTB蛋白積累的水平都比較高，分別占總可溶蛋白的0.120％和0.103％，這表明CTB在轉(zhuǎn)基因胡蘿卜葉片和根部中的積累水平相近(圖7)。
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權(quán)利要求
1．一種疫苗生產(chǎn)方法，其特征在于將霍亂疫苗基因表達(dá)在胡蘿卜中，通過攝取胡蘿卜直根獲得免疫作用。
2．轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)霍亂疫苗，其特征在于轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)具有生物活性且便于口服的霍亂疫苗。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的霍亂疫苗，其特征是霍亂疫苗可以是霍亂毒素B亞單位(CTB)疫苗。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的霍亂毒素B亞單位疫苗，其特征是霍亂毒素B亞單位疫苗可以是口服植物組織或口服制劑。
5．一種能在植物中組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒，其特征在于將CTB基因與PR1b SP融合，插入到pBin438獲得pBirc38。
6．重組微生物，含有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，其中所述微生物是農(nóng)桿菌。
8．制備組成型表達(dá)CTB的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜方法，其特征在于將權(quán)利要求7所述的含有能在植物中組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與胡蘿卜下胚軸共培養(yǎng)，然后再生為植株。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的胡蘿卜下胚軸的轉(zhuǎn)化，其特征是胡蘿卜下胚軸的轉(zhuǎn)化可以是轉(zhuǎn)化的胡蘿卜下胚軸直接分化形成再生植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)的霍亂疫苗及其方法,采用PCR的方法將CTB基因克隆到植物表達(dá)載體中,獲得了CTB的植物表達(dá)載體pBirc38。。將載體pBirc38轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌中,用攜帶有pBirc38的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化胡蘿卜下胚軸,經(jīng)過B5和MS兩種選擇培養(yǎng)途徑;獲得了具有卡那霉素抗性的胡蘿卜植株。在B5培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)化的下胚軸細(xì)胞可直接分化形成分化芽,分化芽經(jīng)過生根培養(yǎng)形成完整的轉(zhuǎn)基因植株。MS中形成的愈傷組織直接分化,同時長根和芽。CTB蛋白能夠在胡蘿卜中高效表達(dá),并且胡蘿卜直根表達(dá)的CTB具有生物活性。
文檔編號C12N15/09GK1286120SQ9911950
公開日2001年3月7日 申請日期1999年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月1日
發(fā)明者方榮祥, 王新國, 張國華, 肖成祖, 劉傳暄 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所