專利名稱：霍亂毒素b亞基的表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)霍亂毒素B亞基(CTB)的表達(dá)系統(tǒng)、生產(chǎn)CTB和在表達(dá)系統(tǒng)中用作表達(dá)載體的分離的核酸構(gòu)建體的方法。
背景技術(shù)：
無毒的霍亂毒素B亞基(CTB)是有效的口服免疫試劑，在大范圍的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證明了為針對霍亂引起的腹瀉和產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌引起的腹瀉提供保護(hù)作用(Sanchez and Holmgren 1989 PNAS 86481-485)。因而，這使得CTB與滅活的完整霍亂弧菌(V.cholerae)細(xì)胞一同成為口服霍亂疫苗的重要成分。此外，近來，CTB作為用于各種其他肽或糖抗原的免疫原性載體和作為用于下調(diào)免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)物吸引了很多的注意。這些發(fā)現(xiàn)提高了對于提高大規(guī)模生產(chǎn)CTB的產(chǎn)量的需求，以在某種程度上促進(jìn)使用CTB的疫苗的開發(fā)。
選擇用于生產(chǎn)CTB的表達(dá)系統(tǒng)取決于許多因素，包括蛋白質(zhì)的蛋白水解穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)是否是可分泌的和最終CTB產(chǎn)品的可接受的成本?，F(xiàn)有四種主要的通常用來生產(chǎn)疫苗抗原的表達(dá)系統(tǒng)。它們是細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。此外，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)開始顯現(xiàn)出利用植物來生產(chǎn)亞單位疫苗和通過可食用植物來進(jìn)行疫苗遞送的目標(biāo)。舉例來說，WO 99/54452公開了包含CTB編碼序列和自身抗原編碼序列的嵌合基因構(gòu)建體，用所述嵌合基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物，和從這些植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物制備可食用疫苗的方法。
在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因最常見的通過將游離型自我復(fù)制元件(例如質(zhì)粒)導(dǎo)入宿主細(xì)菌中來實(shí)現(xiàn)，所述游離型自我復(fù)制元件編碼處在合適啟動(dòng)子控制下的目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。最常見地通過包含選擇性標(biāo)記基因來維持這種質(zhì)粒，所述選擇性標(biāo)記基因編碼賦予對特定抗生素(例如，氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素等)的抗性的蛋白質(zhì)。然后通過向培養(yǎng)基中添加適合的抗生素來在宿主中維持質(zhì)粒。
雖然大腸桿菌是用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的最常用的細(xì)菌，在除大腸桿菌以外的細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)重組抗原有時(shí)可能是有益的。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、霍亂弧菌和短小芽孢桿菌(芽孢桿菌brevis)是已經(jīng)用來表達(dá)用于疫苗生產(chǎn)目的的抗原的其他細(xì)菌的一些實(shí)例。
使用Vibrio cholerae宿主細(xì)胞來生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的已知表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于Sanchez和Holmgren，Proc.Natl.Acad.Sci.USA198986481-5中公開的CTB表達(dá)系統(tǒng)。在美國專利Nos 5268276、5834246、6043057和EP 0368819中也公開了這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)節(jié)。在這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中，由缺失編碼霍亂毒素A亞基(CTA)的霍亂弧菌基因的霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)編碼霍亂毒素B亞基的基因來獲得CTB亞基。
Lebens等(1993 Biotech 11；1574-8)描述了Sanchez和Holmgren(1989如上)制備CTB的方法的改良形式。對于此，通過缺失了CT基因并經(jīng)編碼CTB的多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的霍亂弧菌01突變株來生產(chǎn)重組CTB。如所述，通過鹽沉淀和層析法的組合從培養(yǎng)基純化所使用的CTB。
如Sanchez和Holmgren(1989)(如上)和Lebens等(1993)(如上)所示的使用細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如霍亂弧菌宿主細(xì)胞，來表達(dá)重組蛋白質(zhì)，已經(jīng)被證明比其他常用的原核表達(dá)系統(tǒng)有益，因?yàn)樘囟ǖ闹亟M產(chǎn)物可以大量地產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中，從而便于下游的純化過程?；魜y弧菌宿主細(xì)胞這種有效的CTB分泌不同于大腸桿菌細(xì)胞的分泌過程，在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物常常在周質(zhì)間隙中裝配(Neill等1983 Science。221289-290)。然而，近來，已經(jīng)鑒定了大腸桿菌的產(chǎn)腸毒素菌株用于分泌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)的蛋白質(zhì)分泌途徑(Tauschek等(2002)PNAS 997066-7071)，由此有望由大腸桿菌宿主細(xì)胞有效地分泌重組蛋白質(zhì)。
雖然在Sanchez和Holmgren 1989(如上)和Lebens等(如上)中公開的表達(dá)系統(tǒng)以看起來可接受的水平生產(chǎn)CTB，這些表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是，在培養(yǎng)基中需要抗生素，例如氨芐青霉素，通過選擇和維持包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒來維持最佳產(chǎn)量。在不存在氨芐青霉素的情況下，含有編碼CTB亞基蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒將不能穩(wěn)定地維持，CTB的產(chǎn)量將會降低。此外，需要進(jìn)一步的下游處理步驟來有效地從純化的產(chǎn)品中除去所有的抗生素殘留物。
由于許多原因，在重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中使用抗生素是不合需要的。除了由于添加抗生素作為生長培養(yǎng)基的補(bǔ)充物引起的成本明顯增加之外，在生產(chǎn)用于人類或獸醫(yī)用途的任何重組蛋白質(zhì)中，使用抗生素被認(rèn)為是成問題的。這主要有三個(gè)理由。第一，殘余的抗生素可能在敏感的個(gè)體中引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。第二，存在從利用這種產(chǎn)物的那些天然細(xì)菌群落中選出抗生素抗性細(xì)菌的可能性。最后，編碼抗生素抗性的DNA也可能轉(zhuǎn)移到使用該產(chǎn)物的個(gè)體中的敏感細(xì)菌中，從而在其間傳播不期望的抗生素抗性。
鑒于大規(guī)模生產(chǎn)沒有抗生素殘留物的重組蛋白質(zhì)，例如CTB，在制藥工業(yè)中有商業(yè)上的重要性，存在著以盡可能高的產(chǎn)量提供藥學(xué)上可接受的CTB的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及利用包含Vibrio cholerae宿主細(xì)胞的CTB生產(chǎn)系統(tǒng)來提高CTB產(chǎn)量，所述宿主細(xì)胞缺乏thyA基因功能，所述宿主細(xì)胞與新的表達(dá)載體一同使用來產(chǎn)生相對于用已知的細(xì)菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量出乎意料地高的CTB產(chǎn)量。
構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，在其中編碼胸苷酸合成酶(thyA)基因的基因被用作選擇和維持含CTB基因的質(zhì)粒的手段。相對于用于生產(chǎn)CTB的已知表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有減小了的大小，因?yàn)镃TB基因下游的基本上所有的非編碼霍亂弧菌DNA都被除去了。
使用這種表達(dá)系統(tǒng)獲得的意外的高CTB產(chǎn)量展現(xiàn)出了霍亂弧菌宿主細(xì)胞中異源基因的表達(dá)效率和霍亂弧菌宿主細(xì)胞株中通過互補(bǔ)thyA的缺失而維持的質(zhì)粒穩(wěn)定性。舉例來說，即使在通過液體培養(yǎng)重復(fù)傳代至100代，所有細(xì)胞都保持了質(zhì)粒以及表達(dá)重組蛋白質(zhì)的能力。
在此報(bào)道的表達(dá)系統(tǒng)是有益的，因?yàn)樗谝韵掠猛镜腃TB的生產(chǎn)，其包括但不限于針對霍亂和LT引起的大腸桿菌腹瀉的口服疫苗中的保護(hù)性免疫原；用于下調(diào)、調(diào)整、脫敏或重定向(re-directing)免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)物或耐受性誘導(dǎo)試劑或免疫偏離(immune-deviating)試劑；用于改變、增強(qiáng)、定向、重定向、強(qiáng)化或啟動(dòng)抗原特異性或非特異性免疫應(yīng)答的佐劑；刺激針對一種或多種獨(dú)立抗原的免疫反應(yīng)的載體；和用來產(chǎn)生用于診斷或免疫診斷測試中的抗體(例如單克隆的或多克隆的抗體)的診斷試劑。
從作為疫苗組分的CTB的純化和標(biāo)準(zhǔn)化的角度來看這是特別有益的，可以使用缺失thyA基因功能的穩(wěn)定的細(xì)菌宿主細(xì)胞株來獲得相對高的CTB產(chǎn)量。
特別地，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)霍亂毒素B亞基(CTB)的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)包含(a)缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主細(xì)胞；和(b)包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表達(dá)載體，所述CTB基因基本上不含作為CTB基因來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5′和3′末端的側(cè)翼序列。
在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞缺乏CTA基因的功能。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體的大小約3kb。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體包含大腸桿菌thyA基因。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼異源蛋白質(zhì)的至少一個(gè)另外的核苷酸序列，例如熱不穩(wěn)定大腸桿菌腸毒素LT的無毒部分或形式，優(yōu)選的所述LT的無毒部分是(LTB)的B亞基或其片段。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)CTB的方法，其中所述方法包括用包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主細(xì)胞，所述CTB基因基本上不含作為CTB來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5′和3′末端的側(cè)翼序列，和在允許產(chǎn)生CTB的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的霍亂弧菌宿主細(xì)胞，任選的隨后從所述宿主細(xì)胞分離和/或純化所述CTB。
用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)和方法的表達(dá)載體包括新的核酸構(gòu)建體。
因而，本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離的核酸構(gòu)建體，其包含thyA基因和CTB基因，所述CTB基因基本上不含作為CTB來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5′和3′末端的側(cè)翼序列，和所述核酸構(gòu)建體的大小小于5kb。
在根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的實(shí)施方式中，所述核酸構(gòu)建體大小約3kb。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒，例如以附

圖13中所示的限制性內(nèi)切酶圖譜為特征的pMT-ctxBthyA-2。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒具有核苷酸序列SEQ ID NOI。
因而，本發(fā)明提供了新的和改良的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，包括以下的組合(i)缺乏thyA基因功能的穩(wěn)定霍亂弧菌宿主細(xì)胞株；和(ii)包含功能性thyA基因和CTB基因的穩(wěn)定表達(dá)載體，所述CTB基因基本上不含作為CTB來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5′和3′末端的側(cè)翼序列。
該穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是有益的，因?yàn)樗?i)保證了CTB編碼質(zhì)粒的穩(wěn)定維持(保證例如，100％的質(zhì)粒保留在大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵罐中)，這是有益的因?yàn)樗ＷC了一致和可靠的CTB生產(chǎn)；和(ii)通過消除存在于CTB的N-末端的不均一性改良了CTB質(zhì)量，其保證了相同CTB終產(chǎn)物的一致性生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)CTB的分離的穩(wěn)定表達(dá)載體，其是對生產(chǎn)CTB的已知表達(dá)載體的改良，同時(shí)仍然包含功能性thyA基因。所述表達(dá)質(zhì)粒具有減小的大小，因?yàn)樗薈TB基因下游的基本上所有的霍亂弧菌DNA。不希望受理論的限制，據(jù)信，除去ctxB基因下游基本上所有的非編碼霍亂弧菌DNA引起了所述表達(dá)載體的大小減小，有助于改善穩(wěn)定性和改善CTB產(chǎn)物產(chǎn)量。對于改善質(zhì)粒穩(wěn)定性舉例來說，當(dāng)將霍亂弧菌宿主細(xì)胞用于所述表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，即使在通過液體培養(yǎng)重復(fù)傳代至100代之后，幾乎所有的霍亂弧菌細(xì)胞保持了(1)包含CTB基因的質(zhì)粒和(ii)表達(dá)重組CTB蛋白質(zhì)的能力。
在所述表達(dá)載體中功能性thyA基因的存在是有益的，因?yàn)樗鼜浹a(bǔ)了霍亂弧菌宿主菌株中的thyA缺失；它允許所述菌株在不含胸腺嘧啶的生長培養(yǎng)基中生長；以及由于質(zhì)粒的喪失導(dǎo)致宿主菌株的死亡，因此當(dāng)在缺少外來胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長時(shí)，它保證了霍亂弧菌宿主菌株的遺傳穩(wěn)定性。
對于某些實(shí)施方式，編碼所述功能性胸苷酸合成酶(thyA)酶的核苷酸序列是大腸桿菌核苷酸序列或來自大腸桿菌。使用包含來源于大腸桿菌的編碼thyA酶的核苷酸序列的質(zhì)粒是有益的，因?yàn)榛魜y弧菌thyA基因與來自大腸桿菌的相應(yīng)thyA序列僅有約30％的同源性從而降低了重組事件的風(fēng)險(xiǎn)。
生產(chǎn)霍亂毒素B(CTB)亞基蛋白質(zhì)的方法包括將所定義的穩(wěn)定表達(dá)載體導(dǎo)入到缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌宿主細(xì)胞中，并在產(chǎn)生CTB的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，該方法具有以下的益處(i)改善CTB的產(chǎn)量，相對于已知的CTB表達(dá)系統(tǒng)(例如，使用如Sanchez和Holmgren(1989)(如上)中描述的已知CTB表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CTB水平)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的CTB產(chǎn)量提高4-5倍；(ii)簡化CTB的生產(chǎn)過程，因?yàn)榭梢韵龔腃TB除去抗生素殘留物的下游步驟。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)的成本方面的減少和消除了從表達(dá)的CTB產(chǎn)物除去任何抗生素殘留物的“下游處理步驟”由此由簡化的生產(chǎn)過程得到了更廉價(jià)的產(chǎn)物。
根據(jù)附隨的權(quán)利要求和以下的說明書和附圖，本發(fā)明的其他方面對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是顯而易見的。
詳細(xì)說明在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，需要理解的是本發(fā)明不限于具體例示的分子或處理參數(shù)，當(dāng)然地，這些都可以變化。還需要理解的是，在此使用的專有名詞僅是用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式的目的，不意味著限制本發(fā)明。此外，除非另有陳述，本發(fā)明的實(shí)踐將采用病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法，所有這些都在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)已經(jīng)在文獻(xiàn)中完整地說明了。參見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual(2nd Edition，1989)；DNA CloningA Practical Approach，vol.I& II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Aynthesis(N.Gait，ed.，1984)；A Practical Guide to Molecular Choning(1984)；和F undamentalVirology，2nd Edition，vol.I& II(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.)。
在此引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是在上文中還是在下文中的，為了各種目將其整體并入本發(fā)明作為參考。要注意的是，如在本說明書和附隨的權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)的指代物，除非上下文給出了明顯地指示。
為了避免疑問，用語“包含”涵蓋“包括”以及“組成”，舉例來說，“包含”X的組合物可以僅由X組成，也可以包括X以外的其他事物，例如包括X和Y。
除非另作說明，在本申請中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域常用的含義。遵循在例如E-L Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones，VCH Publishers New York(1987)中使用的標(biāo)準(zhǔn)命名，來定義DNA限制性內(nèi)切酶、限制性位點(diǎn)和限制性序列。寡脫氧核苷酸和氨基酸用常規(guī)的單字母和三字母縮寫代碼來表示。在實(shí)施例部分的開始處提供了IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會建議的單字母氨基酸符號。
如在本申請中使用的，以下的詞和用語具有指定的含義。
表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明涉及包含宿主細(xì)胞和表達(dá)載體的組合的生產(chǎn)CTB的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。
術(shù)語“表達(dá)系統(tǒng)”是指宿主細(xì)胞和在適合的條件下維持的兼容表達(dá)載休的組合，例如，由所述載體攜帶并被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的外源DNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。對在此描述的表達(dá)系統(tǒng)來說，細(xì)菌存活所必需的thyA基因在細(xì)菌宿主細(xì)胞染色體上被變成無功能的。功能性thyA基因在彌補(bǔ)質(zhì)粒上提供。thyA基因充當(dāng)選擇標(biāo)記，因?yàn)橘|(zhì)粒的喪失將意味著細(xì)菌宿主細(xì)胞不能存活。選擇thyA基因作為非抗生素選擇標(biāo)記提供了以上所列出的特別的益處。
術(shù)語“表達(dá)(express)”和“表達(dá)(expression)”包括容許或使得基因或DNA序列中的信息得以體現(xiàn)，例如通過激活與相應(yīng)基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的細(xì)胞功能產(chǎn)生RNA(例如rRNA或mRNA)或產(chǎn)生蛋白質(zhì)。由細(xì)胞表達(dá)DNA序列以形成“表達(dá)產(chǎn)物”，例如RNA(例如，mRNA或rRNA)或蛋白質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物本身，例如，產(chǎn)生的RNA或蛋白質(zhì)，可以稱作被所述細(xì)胞“表達(dá)”。
宿主細(xì)胞在此使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指任何有機(jī)體的任何細(xì)胞，其以任何方式被選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、生長或使用或操作用于通過所述細(xì)胞產(chǎn)生某一物質(zhì)。例如，宿主細(xì)胞可以是被操作以表達(dá)特定基因、DNA或RNA序列、蛋白質(zhì)或酶的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步用于篩選或其他分析。術(shù)語“宿主細(xì)胞”可以表示，例如，被用作或已經(jīng)被用作重組載體或其他轉(zhuǎn)化DNA的受體的細(xì)菌細(xì)胞，包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的原始細(xì)胞的子代。要理解的是，由于天然的、偶然的或故意的突變，單個(gè)親本細(xì)胞的子代不必在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA上與原始的親本完全相同。舉例來說，本發(fā)明的CTB可以在霍亂弧菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含霍亂弧菌細(xì)菌宿主細(xì)胞的CTB生產(chǎn)系統(tǒng)，所述宿主細(xì)胞缺乏thyA基因功能，所述宿主細(xì)胞與新的表達(dá)載體一同使用，來產(chǎn)生相對于用已知的細(xì)菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量出乎意料地高的CTB產(chǎn)量。
霍亂弧菌宿主細(xì)胞本領(lǐng)域公知的是，血清群(serogroup)O1和O139的霍亂弧菌在受感染個(gè)體的腸道內(nèi)增殖時(shí)，通過釋放霍亂毒素(CT)可以引起嚴(yán)重的腹瀉疾病，霍亂毒素引起腸上皮主動(dòng)分泌電解液和水。通過類似的機(jī)制，幾種其他的細(xì)菌，例如產(chǎn)腸毒素大腸桿菌細(xì)菌(ETEC)，也可以通過釋放其他腸毒素引起腹瀉，這些腸毒素可能與CT相關(guān)或無關(guān)。
CT是原型細(xì)菌腸毒素。它是由兩種類型的亞基構(gòu)建的蛋白質(zhì)分子量為28,000的單個(gè)A亞基，和五個(gè)每個(gè)的分子量為11,600的B亞基。B亞基通過緊密的非共價(jià)鍵聚集成環(huán)形；A亞基連接于其上，可能通過較弱的非共價(jià)相互作用部分地插入到B五聚物環(huán)中。這兩種亞基在中毒過程中具有不同的作用B亞基負(fù)責(zé)細(xì)胞結(jié)合，A亞基負(fù)責(zé)直接的毒性。
已經(jīng)非常詳細(xì)地闡明了毒素與腸細(xì)胞及其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合和隨后通過A亞基(和其A1片段)的細(xì)胞內(nèi)作用引起腺苷酸環(huán)化酶活化的事件的分子機(jī)制(參見，J Holmgren，Nature 292413-417，1981)。關(guān)于霍亂弧菌細(xì)菌的霍亂毒素合成、裝配和分泌的遺傳學(xué)和生物化學(xué)的更為新近的信息也是可獲得的。
CT由A和B亞基的染色體結(jié)構(gòu)基因分別編碼。已經(jīng)從幾個(gè)菌株克隆了這些基因，已經(jīng)測定了它們的核苷酸序列(參見，例如，Heidelberg等(2000)Nature 406477-483)。CT的A和B亞基的基因排列在單個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中，A順反子(ctxA)在B順反子(ctxB)之前。對典型的和EI Tor生物型的霍亂弧菌菌株中CT基因結(jié)構(gòu)的研究表明，在典型生物型菌株中存在兩個(gè)CT基因的拷貝，而在大多數(shù)El Tor菌株中僅存在一個(gè)拷貝(J J Mekalanos等，Nature 306551-557，1983)。CT的合成由toxR基因正調(diào)節(jié)，所述toxR增加ctx的表達(dá)拷貝數(shù)(V LMiller and J J Mekalanos，Proc Natl Acad Sci USA，813471-3475，1984)。ToxR在轉(zhuǎn)錄水平起作用，存在于典型的和El Tor生物型的菌株中。ToxR可能通過編碼正調(diào)節(jié)ctx啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)節(jié)蛋白來增強(qiáng)ctx轉(zhuǎn)錄。
缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌宿主細(xì)胞菌株可以通過本發(fā)明的方法、或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(Sambrook，J.E.F.Fritsch，andT.Maniatis，Molecular cloninga laboratory manual.2nd ed.1989ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y)來制備。制備缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌菌株的合適的已知方法包括WO99/61634中概述的方法。
在本發(fā)明的上下文中，例如，如果基因已經(jīng)通過，例如缺失而被除去，或如果通過例如鈍化或定點(diǎn)誘變thyA基因遺傳性地使基因失效，從而不表達(dá)thyA酶，則thyA基因功能缺失?？梢酝ㄟ^thyA陽性基因轉(zhuǎn)化thyA陰性載體，并選擇在缺乏胸腺嘧啶的情況下不生長的菌株，來確定thyA基因功能的缺失。
THYA選擇性標(biāo)記系統(tǒng)彌補(bǔ)細(xì)菌宿主細(xì)胞染色體損害已存在利用質(zhì)粒維持的手段。因而，霍亂孤菌染色體上無功能的thyA基因通過在彌補(bǔ)質(zhì)粒上提供的功能性thyA基因的存在來彌補(bǔ)，其充當(dāng)選擇性標(biāo)記并消除了對抗生素抗性選擇標(biāo)記的需求。由于質(zhì)粒的喪失意味著霍亂弧菌細(xì)菌不能存活，從而使thyA基因充當(dāng)了選擇標(biāo)記。
霍亂弧菌、E.coli和其他細(xì)菌的thyA基因編碼的胸苷酸合成酶(thyA)催化脫氧尿苷酸(dUMP)到脫氧胸苷酸(dTMP)的甲基化，是用于摻入DNA的脫氧胸腺嘧啶核糖核苷三磷酸鹽(dTTP)的生物合成中必需的酶。在缺乏這個(gè)酶的情況下，細(xì)菌將依賴外源的胸腺嘧啶，其通過由deo基因編碼的補(bǔ)救途徑摻入到dTTP中(Milton等1992J Bacteriol 1747235-7244)。
已知thyA基因是保守的基因，可以在噬菌體、原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)。因?yàn)閠hyA酶是保守的，來自例如大腸桿菌的thyA基因能夠彌補(bǔ)以下討論的相關(guān)細(xì)菌物種的染色體中的突變thyA基因。質(zhì)粒中的功能性thyA基因可以來自大腸桿菌以外的來源。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)宿主細(xì)胞是霍亂弧菌宿主細(xì)胞時(shí)，thyA基因與霍亂弧菌thyA基因具有低的同源性。
本領(lǐng)域的現(xiàn)有工作表明，在沒有抗生素選擇的情況下可通過用來自大腸桿菌的thyA基因彌補(bǔ)thyA突變，由此將重組質(zhì)粒維持在霍亂弧菌中。最初使用攜帶E.coli的thyA基因的質(zhì)粒和根據(jù)三甲氧芐二氨嘧啶抗性分離的自發(fā)的霍亂弧菌thyA突變體論證了這個(gè)原理(Morona等1991 Gene 107139-144)。
Carlin和同事們的進(jìn)一步的工作從霍亂弧菌克隆和表征了thyA基因座，產(chǎn)生了穩(wěn)定定義的受體霍亂弧菌菌株。Carlin和同事們測定的霍亂弧菌thyA基因的序列在EMBL(Genebank Accession NoAJ006514)中公開了。WO 99/61634教導(dǎo)了，所定義的霍亂弧菌thyA突變體可被用作適合的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌株，所述重組蛋白質(zhì)由通過thyA彌補(bǔ)來維持的質(zhì)粒編碼。
使用彌補(bǔ)質(zhì)粒上的、與霍亂弧菌thyA基因有低同源性的thyA基因是有益的，因?yàn)榕c霍亂弧菌染色體“交換”的風(fēng)險(xiǎn)降低了。
彌補(bǔ)質(zhì)粒上優(yōu)選的thyA基因是與霍亂弧菌thyA基因具有低同源性的大腸桿菌thyA基因。作為說明，大腸桿菌thyA基因的公開的序列可以在Genebank登記號No J01709中找到。Carlin等(參見Genebank登記號No AJ006514)測定的霍亂弧菌thyA基因的序列(283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì))和大腸桿菌thyA基因(參見Genebank登記號NoJ01709)僅顯示了32％的氨基酸同一性，在DNA水平上的454bp重疊區(qū)中僅反映約54％的同源性(參見WO 99/61634的附圖7)。這方面是通過GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI.)中的FASTA軟件在EMBLDNA和Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索。
在此描述的CTB的表達(dá)可以由各種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。優(yōu)選的，啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。在此使用的，術(shù)語“異源”是指自然狀態(tài)下兩種生物成分不一起存在。所述成分可以是調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動(dòng)子。在此使用的，術(shù)語“異源啟動(dòng)子”是指與和它可操作連接的基因不相關(guān)的啟動(dòng)子。優(yōu)選的，啟動(dòng)子是異源的原核啟動(dòng)子。特別優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是適合于其所應(yīng)用的宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子。更優(yōu)選的，在此描述的表達(dá)系統(tǒng)中CTB基因的表達(dá)由tacP啟動(dòng)子或T7 RNA聚合酶依賴性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，CTB可以在異源啟動(dòng)子，例如tacP啟動(dòng)子的控制下，以可誘導(dǎo)的方式(如需要刺激來啟動(dòng)表達(dá))或組成型的方式(不斷地產(chǎn)生CTB)表達(dá)。對可誘導(dǎo)表達(dá)來說，在需要時(shí)可以通過，例如向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物質(zhì)，例如，地塞米松或異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來啟動(dòng)rCTB的產(chǎn)生，所述異丙基硫代半乳糖苷是乳糖操縱子的人工誘導(dǎo)物。
可以使用任何適合的轉(zhuǎn)錄終止序列，優(yōu)選的是容許最小的轉(zhuǎn)錄或不轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止序列。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，TrpA終止子位于CTB基因的下游，有效地終止mRNA轉(zhuǎn)錄。在實(shí)施例中描述的一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止子的核苷酸序列在附圖14中示出(從大約核苷酸2732到大約核苷酸2759)。
融合蛋白質(zhì)提供了直接表達(dá)的備選方案。通常，將編碼內(nèi)源細(xì)菌蛋白質(zhì)或其他穩(wěn)定蛋白質(zhì)的N-末端部分的DNA序列融合到異源編碼序列的5′末端。在表達(dá)時(shí)，這個(gè)構(gòu)建體將提供兩個(gè)氨基酸序列的融合物。例如，通過產(chǎn)生編碼融合蛋白質(zhì)的嵌合DNA分子，也可以由細(xì)胞分泌外源蛋白，所述融合蛋白質(zhì)包括用于在細(xì)菌中分泌外源蛋白的信號/前導(dǎo)區(qū)肽序列片段[參見例如美國專利No.4,336,336]。所述信號/前導(dǎo)序列片段通常編碼信號肽，所述信號肽包括指導(dǎo)細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的疏水氨基酸。蛋白質(zhì)被分泌到生長培養(yǎng)基中(例如，對于革蘭氏陽性細(xì)菌)或分泌到位于細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙中(例如，對于革蘭氏陰性細(xì)菌)。優(yōu)選的，在信號肽片段和外源基因之間編碼了加工位點(diǎn)，其可以在體內(nèi)或體外裂解。
編碼適合的信號序列的DNA可以來源于分泌的細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因，例如大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等(1983)，inExperimental Manipulation of Gene Expression；Ghrayeb等(1984)EMBO J.32437]和大腸桿菌堿性磷酸酶信號序列(phoA)[Oka等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。作為其他的實(shí)例，來自各種芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶基因的信號序列可用于從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)分泌異源蛋白質(zhì)[Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795582；EPO Publ.No.244 042]。
在此使用的，術(shù)語“前導(dǎo)序列”或“信號序列”是指任何核苷酸編碼序列或蛋白質(zhì)分子上編碼的肽序列，其促進(jìn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)或輸出，例如表達(dá)的CTB蛋白質(zhì)跨越細(xì)胞膜和細(xì)胞壁(如果存在細(xì)胞壁的話)的轉(zhuǎn)運(yùn)或輸出，或至少通過細(xì)胞膜進(jìn)入具有細(xì)胞壁的細(xì)胞的周質(zhì)間隙的轉(zhuǎn)運(yùn)或輸出。在此使用的，術(shù)語“前導(dǎo)序列”或“信號序列”是指編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作為更大的多肽或前肽序列的成分，指導(dǎo)在所述細(xì)胞中合成的所述更大的多肽通過細(xì)胞的分泌途徑(例如，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體，并進(jìn)一步到分泌小泡)。所述更大的多肽在轉(zhuǎn)運(yùn)通過分泌途徑期間通常被剪切以除去分泌肽。分泌信號序列可以編碼任何信號肽，所述信號肽保證有效的指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。所述信號肽可以是天然的信號肽、或其功能部分，或可以是合成的肽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述前導(dǎo)序列來自腸毒素，例如大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)前導(dǎo)序列。在表1列出的序列中、在列出的G1登記號中提供了LT前導(dǎo)序列的實(shí)例。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述前導(dǎo)序列是大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LTB)前導(dǎo)序列)。用于生產(chǎn)本發(fā)明的CTB的LTB信號序列在表2中示出，為MNKVKFYVLFTALLSS LCAHG(SEQ ID NO2)。前導(dǎo)序列的其他實(shí)例包括但不限于表2中示出的前導(dǎo)序列和附圖14中示出的序列的部分。
在所述實(shí)例中，CTB基因以可以利用天然的Sacl位點(diǎn)的方式與來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素的LTB信號肽融合。
DNA構(gòu)建體通常，將上述成分，包括啟動(dòng)子、信號序列(如果需要)、目標(biāo)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列一同置于表達(dá)構(gòu)建體中。具有插入或添加的DNA的DNA節(jié)段或序列，例如表達(dá)載體，也可稱為“DNA構(gòu)建體”或“核酸構(gòu)建體”。如果需要，增強(qiáng)子、具有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子、和前導(dǎo)序列也可以包括在表達(dá)構(gòu)建體中。表達(dá)構(gòu)建體通常維持在復(fù)制子中，例如能穩(wěn)定維持在細(xì)菌等宿主中的染色體外元件(例如，質(zhì)粒)。復(fù)制子具有復(fù)制系統(tǒng)，因而容許維持在原核宿主中，用于表達(dá)或用于克隆和擴(kuò)增。此外，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)質(zhì)粒或低拷貝數(shù)質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒一般具有約5到約200的拷貝數(shù)，通常是約10到約150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主優(yōu)選的將含有至少約10個(gè)，更優(yōu)選包含至少約20個(gè)質(zhì)粒。根據(jù)在宿主細(xì)胞上載體和外源表達(dá)的蛋白質(zhì)的效果，可以選擇高拷貝數(shù)載體或低拷貝數(shù)載體。做為選擇，上述成分中的某一些可以一同置于轉(zhuǎn)化載體中。如上所述，轉(zhuǎn)化載體通常包括選擇性標(biāo)記，所述選擇性標(biāo)記維持在復(fù)制子中，或衍化到整合載體中。
復(fù)制子在此使用的，“復(fù)制子”可以是任何遺傳元件，例如，質(zhì)粒、染色體、病毒、粘粒等，起到細(xì)胞內(nèi)多核苷酸復(fù)制的自主單元的作用。復(fù)制子能夠在自己的控制下復(fù)制，可以包括選擇性標(biāo)記。
載體在此使用的，“載體”是一種復(fù)制子，在其中連接了另一個(gè)多核苷酸片段，從而使所述連接的節(jié)段的復(fù)制和/或表達(dá)。術(shù)語“載體”包括表達(dá)載體和/或轉(zhuǎn)化載體。術(shù)語“表達(dá)載體”是指能在體內(nèi)或體外/先體外后體內(nèi)表達(dá)的構(gòu)建體。術(shù)語“轉(zhuǎn)化載體”是指能從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種的構(gòu)建體。載體的實(shí)例包括但不限于質(zhì)粒、染色體、人造染色體或病毒。
質(zhì)粒載體的常見類型是“質(zhì)?！?，其一般是獨(dú)立的、通常為細(xì)菌來源的雙鏈DNA分子，可以容易地接受其他(例如異源的)DNA，并可以容易地導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞中。已經(jīng)描述了用于在各種真核和原核宿主中復(fù)制和/或表達(dá)的許多載體，包括質(zhì)粒和真菌載體。用于本發(fā)明的質(zhì)粒可以是本領(lǐng)域已知的質(zhì)粒，例如但不限于質(zhì)粒如pBR322、pACYC177或pUC質(zhì)粒衍生物或pBLUESCRIPT載體(Stratagene，LaJolla，CA)。
例如pJS162(如Sanchez and Holmgren(1989)(如上)在描述的)和pML358(如Lebens等1993(如上)中描述的)的質(zhì)粒已經(jīng)被用于在霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)CTB。本發(fā)明的表達(dá)載體不同于Sanchez-Holmgren(pJS162)和Lebens(pML358)的表達(dá)質(zhì)粒，在于(i)因?yàn)橐呀?jīng)除去了CTB基因下游基本上所有的非編碼的霍亂弧菌DNA，該質(zhì)粒具有較小的大小；和(ii)該質(zhì)粒具有功能性thyA基因。
對此，表3提供了在此描述的表達(dá)載體與本領(lǐng)域已知的相關(guān)表達(dá)載體的比較分析。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此描述的穩(wěn)定的表達(dá)載體優(yōu)選大小小于5kb。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定的表達(dá)載體大小約2.5kb到4kb。在再更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定的表達(dá)載體大小約3kb。
術(shù)語“約”或“大約”是指處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的特定值的可接受誤差范圍之內(nèi)，其在某種程度上取決于在測定系統(tǒng)的限制條件下該數(shù)值是如何測量和測定的。例如，根據(jù)本領(lǐng)域的實(shí)踐，“約”可以指處于1或超過1的標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。做為選擇，“約”可以指給定值的20％、優(yōu)選的達(dá)到10％、更優(yōu)選的達(dá)到5％和更優(yōu)選的達(dá)到1％的范圍。做為選擇，特別是對于生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語可以指在一定數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選的在某一數(shù)值的5倍、更優(yōu)選的2倍以內(nèi)。
更小的質(zhì)粒大小是有益的，因?yàn)樗寡苌矬w外操作和構(gòu)建更易進(jìn)行，因?yàn)楦〉腄NA分子能更有效地連接在一起并轉(zhuǎn)入例如霍亂弧菌等原核宿主內(nèi)，提高了獲得正確構(gòu)建體的衍生物的機(jī)會。更小的大小還使得以更高的效率在通過例如轉(zhuǎn)化將構(gòu)建體導(dǎo)入受體細(xì)菌，以及提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。
表達(dá)載體在此使用的，術(shù)語“表達(dá)載體”是指運(yùn)載工具，通過它可以將核苷酸序列(例如，異源核苷酸序列)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化該宿主并促進(jìn)導(dǎo)入的序列的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄和翻譯)。
分離的表達(dá)載體在此使用的，術(shù)語“表達(dá)載體”包括分離的表達(dá)載體以及作為宿主細(xì)胞/表達(dá)載體組合的一部分的表達(dá)載體。術(shù)語“分離的”和“純化的”是指分子，可以是核酸或氨基酸序列、或是核酸構(gòu)建體，被從它們的天然環(huán)境移出和/或從與它們天然地結(jié)合的至少一個(gè)其他成分分離或隔離開。舉例來說，如減少或消除了不相關(guān)材料所制備的表達(dá)載體，則表達(dá)載體可以認(rèn)為是“分離的”，不相關(guān)材料例如，污染物，包括從中獲得該材料的天然材料。進(jìn)一步舉例來說，如果基本上不含在細(xì)胞中與之結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸，則純化的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的。同樣地，如果基本上不含在細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)或其他不相關(guān)核酸分子，則純化的核酸分子是分離的。蛋白質(zhì)可以與不干擾該物質(zhì)的預(yù)定目的的載運(yùn)體或稀釋劑混合，而仍認(rèn)為基本上是分離的。
異源核苷酸序列一般地，異源核苷酸序列被插入到載體DNA的一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)，然后與可傳遞的載體DNA一同由該載體運(yùn)送到宿主細(xì)胞中。在此使用的，術(shù)語“異源核苷酸序列”是指不是天然地位于細(xì)胞中或位于細(xì)胞的染色體位點(diǎn)中的、或不由細(xì)胞天然地表達(dá)的核苷酸序列。在此使用的，如果x不是以相同的方式與y相關(guān)；即，x不天然地與y相關(guān)，或不按與天然的方式相同的方式與y相關(guān)，則x對于y是“異源的”。在全文中，術(shù)語“異源核苷酸序列”與術(shù)語“外源”核苷酸序列或“客體”核苷酸序列或“細(xì)胞外”核苷酸序列或“外來”或“外源”核苷酸序列可互換地使用。異源核苷酸序列也可以是編碼序列。
在此使用的，術(shù)語“基因”、“編碼序列”或“編碼”表達(dá)產(chǎn)物的核苷酸序列，所述表達(dá)產(chǎn)物例如RNA、多肽、蛋白質(zhì)或酶，是指一種核苷酸序列，當(dāng)被表達(dá)時(shí)引起所述RNA、多肽、蛋白質(zhì)或酶的產(chǎn)生。也就是說，該核苷酸序列“編碼”所述RNA，或它編碼所述多肽、蛋白質(zhì)或酶的氨基酸序列。術(shù)語“核苷酸序列”與術(shù)語“多核苷酸”同義。在細(xì)胞中，當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成RNA，然后進(jìn)行反式RNA剪接(如果含有內(nèi)含子)，和如果該序列編碼蛋白質(zhì)，翻譯成蛋白質(zhì)，則基因序列或核苷酸序列“處在”轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“的控制之下”，或與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“可操作地連接”。核苷酸序列可以是基因組的或合成的或重組來源的DNA或RNA。不管是代表有義鏈或反義鏈還是它們的組合，核苷酸序列可以是雙鏈或單鏈的。
編碼序列在此使用的，“編碼序列”是一種多核苷酸序列，當(dāng)置于適合的調(diào)節(jié)序列的控制之下時(shí)其通常經(jīng)由mRNA翻譯成多肽。編碼序列的邊界由5′-末端的翻譯起始密碼子和3′-末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于，cDNA和重組多核苷酸序列。“開放閱讀框”(ORF)是編碼多肽的多核苷酸序列區(qū)域；這個(gè)區(qū)域可以代表編碼序列的一部分或整個(gè)編碼序列。
可操作地連接的控制序列可以可操作地與編碼序列連接。在此使用的，術(shù)語“可操作地連接”是指一種鄰接，在其中，如此描述的成分處于允許它們以它們預(yù)定的方式起作用的關(guān)系之中?？刂菩蛄信c編碼序列“可操作地連接”是以這樣的方式連接，從而在與所述控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)所述編碼序列的表達(dá)。
霍亂毒素(CT)和其B亞基(CTB)
在此使用的，術(shù)語“CT”是指霍亂毒素，“CTB”是指霍亂毒素的B亞基。在其他敘述中，它們有時(shí)分別稱為“CT”或“Ct”，和“CtxB”或“CtB”。由本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CTB也可稱為重組CTB(rCTB)。
術(shù)語“CTB”還包括重組CTB DNA序列，其是編碼其他序列的雜交CTB基因或其衍生物的部分。CTB衍生物可以是融合蛋白質(zhì)，例如CTB基因融合蛋白質(zhì)或連接了其他元件的CTB。
熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)和其B亞基(LTB)在此使用的，術(shù)語“LT”在此是指大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素，“LTB”是指LT的B亞基。在其他敘述中，它們有時(shí)分別稱為“Etx”或“Et”，和“EtB”或“EtxB”。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)的熱不穩(wěn)定毒素(LT)在結(jié)構(gòu)上、功能上和免疫學(xué)上類似于CTB。這兩種毒素是免疫學(xué)上交叉反應(yīng)的。
CTB基因CTB基因或編碼CTB的核苷酸序列基本上不含微生物中天然基因組中緊鄰CTB編碼序列的5′和3′末端的側(cè)翼序列，所述CTB編碼DNA來源于所述微生物。換句話說，所述CTB基因基本上不含與其宿主細(xì)胞基因組同源的5′和3′側(cè)翼序列。對于某些應(yīng)用，所述CTB基因或編碼CTB蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以與天然的或天然型或野生型CTB相同。
“天然CTB”在此使用的，術(shù)語“天然CTB”是指具有與天然發(fā)生型或野生型CTB分子基本上相同的性質(zhì)的CTB分子，所述性質(zhì)例如活性(例如，GM-1結(jié)合活性)和/或免疫原性和/或免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，所述天然發(fā)生型或野生型CTB分子能夠結(jié)合GM1和/或具有CTB分子的免疫原性或免疫調(diào)節(jié)能力。術(shù)語“天然”、“天然的”、“野生”型CTB在全文中可互換地使用。
在一個(gè)實(shí)施方式中(如以下的實(shí)施例中描述的)，基本上純的CTB基因被表述為附圖14中從約核苷酸2402到約核苷酸2710的核苷酸序列。
對于某些應(yīng)用，所述CTB基因或編碼CTB蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以是天然發(fā)生或天然型CTB的變體、同源物、衍生物或其片段。
在此使用的，術(shù)語天然CTB分子的“變體、同源物、衍生物和其片段”，包括結(jié)構(gòu)上不同于天然CTB分子(例如，就核苷酸序列而言)、但功能上表現(xiàn)得象天然CTB分子的CTB分子，特別在于其結(jié)合性質(zhì)，例如與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，和/或其免疫學(xué)性質(zhì)，例如根據(jù)ELISA或GM1-ELISA測試檢測的與CTB的抗血清反應(yīng)。天然CTB分子的這些變體、同源物、衍生物和其片段包括但不限于來自大腸桿菌B的熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞基(LTB)，和任何的或所有的突變、延伸、截?cái)?、或修飾型B亞基，或與GM1或所述類型的抗血清反應(yīng)的任何其他蛋白質(zhì)，以及編碼滿足這些條件但不具有任何ADP-核糖基化活性的蛋白質(zhì)的任何核酸制品。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，CTB基因被表述為附圖14中從約核苷酸2402到約核苷酸2710所示序列的變體、同源物、衍生物或片段。
“成熟CTB”在此使用的，術(shù)語“成熟CTB”是指缺少信號序列的表達(dá)的CTB亞基蛋白質(zhì)。
在此使用的，術(shù)語“氨基酸序列”是指肽、多肽序列、蛋白質(zhì)序列或其部分。
在此使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”與術(shù)語“氨基酸序列”和/或術(shù)語“多肽”同義。在有些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在有些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。
在此使用的，術(shù)語“多肽”是指氨基酸的聚合物，而不是指特定長度的產(chǎn)物。因而，肽、寡肽、和蛋白質(zhì)包括在多肽的定義之內(nèi)。這個(gè)術(shù)語也不指定或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。包括在該定義中的有，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括，例如，非天然氨基酸，等)的多肽，具有取代的鍵以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的肽，包括天然的和非天然的修飾。
多肽或氨基酸序列“來源于”指定的核酸序列，是指一種多肽，其具有與所述序列編碼的多肽相同的氨基酸序列，或具有所編碼的多肽的一部分，其中所述部分由至少3-5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選的至少8-10個(gè)氨基酸，再更優(yōu)選的至少11-15個(gè)氨基酸組成，或者這種多肽可用所述序列編碼的多肽免疫性地鑒定。這個(gè)專有名詞還包括從指定核酸序列表達(dá)的多肽。
N-末端突變蘇氨酸(T)是通常在來自天然或天然發(fā)生型CTB分子的成熟CTB中存在的第一個(gè)氨基酸。因而，一般地，成熟CTB分子的N-末端序列是Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr(TPQNIT)(SEQ ID NO3)。具有TPQNIT N-末端序列的成熟CTB分子的實(shí)例包括但不限于，來自霍亂弧菌菌株0395，classical Ogawa的CTB氨基酸序列，其在美國專利Nos 5268276、58234246和6043057、EP專利No 0368819和Sanchez與Holmgren(1989)(如上)的附圖2中示出了。描述的實(shí)施方式提供了使用霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的、具有TPQNIT N-末端序列的CTB序列的實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用CTB序列的變體，其有利地具有APQNIT(Ala-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr)(SEQ ID NO4)N-末端序列。舉例來說，也在附圖14中示出的CTB序列SEQ ID NO1，除了在蛋白質(zhì)序列的氨基末端的單個(gè)突變以外，與來自霍亂孤菌菌株0395，classical Ogawa的CTB天然序列相同，其中丙氨酸(Ala)殘基導(dǎo)入到CTB氨基酸序列的第一個(gè)位置替代蘇氨酸(Thr＝T)。導(dǎo)入這個(gè)特定氨基酸(Ala)是有益的，因?yàn)榕c野生型或天然型CTB的氨基末端的蘇氨酸(Thr)殘基相比，它產(chǎn)生了規(guī)定的信號序列裂解位點(diǎn)。這個(gè)裂解位點(diǎn)在翻譯后修飾中是很重要的。這個(gè)N-末端突變是有益的，因?yàn)橥ㄟ^消除使用已知CTB表達(dá)系統(tǒng)(例如Sanchez和Holmgren1989(如上)中描述的CTB表達(dá)系統(tǒng))生產(chǎn)的CTB N-末端中的不均一提高了CTB質(zhì)量，從而保證了相同CTB終產(chǎn)物的一致性生產(chǎn)。對此，修飾了eltBIctxB基因的連接，從而與用天然CTB分子獲得的(參見，美國專利Nos 5268276、58234246和6043057，EP專利No 0368819和Sanchez與Holmgren(1989)(如上))多達(dá)約兩種不同N-末端相比，在產(chǎn)生的CTB蛋白質(zhì)中僅獲得單一N-末端。
變體在此使用的，術(shù)語“變體”也可以用于表示不同于天然型序列的、修飾的或改變的基因、DNA序列、RNA、酶、細(xì)胞等。變體可以存在于相同的細(xì)菌菌株中，或可以存在于不同的菌株中。優(yōu)選的，所述變體與天然或天然發(fā)生型CTB序列具有至少90％的序列同一性。優(yōu)選的，所述變體在整個(gè)天然序列上具有20個(gè)或更少的突變。更優(yōu)選的，所述變體在整個(gè)天然CTB序列上具有10個(gè)或更少的突變、最優(yōu)選的5個(gè)或更少的突變。
突變體在此使用的，術(shù)語“突變體”和“突變”是指在遺傳物質(zhì)，例如，任何DNA上任何可檢測的變化，或這種變化的任何過程、機(jī)制或結(jié)果。這包括基因突變，其中基因的結(jié)構(gòu)(例如DNA序列)被改變，包括出自任何突變過程的任何基因或DNA，和由修飾的基因或DNA序列表達(dá)的任何表達(dá)產(chǎn)物(例如，RNA、蛋白質(zhì)或酶)。突變體可以天然地出現(xiàn)，或可以人工地產(chǎn)生(例如，通過定點(diǎn)誘變)。優(yōu)選的，所述突變體與天然或天然發(fā)生或野生型CTB序列具有至少90％的序列同一性。優(yōu)選的，所述突變體在整個(gè)野生型CTB序列上具有20個(gè)或更少的突變。更優(yōu)選的，所述突變體在整個(gè)野生型CTB序列上具有10個(gè)或更少的突變、最優(yōu)選的5個(gè)或更少的突變。
舉例來說，CTB變體可以包括任何亞基蛋白質(zhì)，所述亞基蛋白質(zhì)包括公開的CTB的位置1-103之間的殘基的至少一個(gè)突變、添加或缺失。這種突變的實(shí)例包括任何點(diǎn)突變、缺失或?qū)@些毒素、亞基或其他蛋白質(zhì)的插入，以及對這些蛋白質(zhì)的任何的肽延伸，不論是置于氨基末端、羧基末端或蛋白質(zhì)中的其它地方，不管這些肽是否具有作為能刺激或偏離免疫反應(yīng)的B細(xì)胞表位、T細(xì)胞表位等的免疫學(xué)性質(zhì)。例如，已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了許多這種突變體(Backstrom等；Gene 1995；165163-171；Backstrom等，Gene 1996；169211-217；Schodel等，Gene1991；99255-259；Dertzbaugh等Infect.Immun.1990；5870-79)。
同源性在此使用的，術(shù)語“同源性”是指x和y之間的相似程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)確定一種型式與另一種型式的序列之間的相關(guān)性。例如，可以通過直接比較多核苷酸的序列信息來確定。做為選擇，可以通過在同源區(qū)域直接形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下雜交多核苷酸(例如，在S1消化之前使用的那些)，隨后用單鏈特異性核酸酶消化，隨后測定消化的片段的大小，來確定同源性。
同源物任何CTB序列，例如但不限于附圖14中示出的，或在表1中的GI登記號碼中記載的那些，在本發(fā)明中可能是有用的。在一個(gè)實(shí)施方式中，由本發(fā)明的霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)的CTB蛋白質(zhì)可以由下列編碼(i)包含附圖14中所示的、或表1中GenBank登記號指定的CTB基因的核苷酸序列的DNA分子；(ii)與(a)中核苷酸序列的互補(bǔ)物雜交的DNA分子；或(iii)編碼與(a)或(b)的DNA分子相同的氨基酸序列、但是是(a)或(b)的DNA分子的簡并形式的DNA分子。
如在此定義的，術(shù)語“同源物”是指一種實(shí)體，其與天然或野生型氨基酸序列和天然或野生型核苷酸序列具有某種同源性。在此，術(shù)語“同源性”等同于“同一性”。(i)中多核苷酸序列的同源物可用于本發(fā)明中。一般地，同源物與相應(yīng)的指定序列具有至少40％的序列同一性，優(yōu)選的至少60％、70％、80％或85％，更優(yōu)選的至少90％、95％或99％的序列同一性。這種序列同一性可以在至少15個(gè)、優(yōu)選的至少30個(gè)、例如至少40個(gè)、60個(gè)或100個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的區(qū)域上存在。一般地，同源物將包含與目標(biāo)氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。盡管也可以根據(jù)相似性來考慮同源性(也就是說，具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的根據(jù)序列同一性來表述同源性。
測定多核苷酸同源性的方法是本領(lǐng)域已知的?？梢酝ㄟ^目測、或更常見地，借助易獲得的序列比較程序來進(jìn)行同源性比較。這些商業(yè)上可獲得的計(jì)算機(jī)程序能技術(shù)兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性百分比。可以在連續(xù)的序列上計(jì)算百分比同源性。也就是說，一個(gè)序列與另一個(gè)序列進(jìn)行比對，在一個(gè)序列上的氨基酸與另一個(gè)序列上的相應(yīng)氨基酸之間進(jìn)行比較，每次一個(gè)殘基。這稱為“無缺口”的比對。一般地，這種無缺口比對僅在相對短的殘基數(shù)上進(jìn)行。
盡管這個(gè)方法是非常簡單和一致的方法，它未能考慮到，例如，在不然就相同的序列對中，一個(gè)插入或缺失就將引起以后的氨基酸殘基脫離比對，因而當(dāng)進(jìn)行全局比對時(shí)可能引起同源性百分比的大幅降低。因此，大多數(shù)序列比較方法被設(shè)計(jì)以產(chǎn)生最佳的比對，考慮了可能的插入和缺失，而不過度地影響總體同源性分值。通過在序列比對中插入“缺口”設(shè)法將局部同源性最大化來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
然而，這些更復(fù)雜的方法為比對中出現(xiàn)的每個(gè)缺口分配“缺口罰分”，從而，對于相同數(shù)目的同一的氨基酸，具有盡可能更少缺口的、反映出兩個(gè)比較的序列間更高相關(guān)性的序列比對，比具有許多缺口的比對將得到更高的分值。一般使用“Affine gap costs”，為缺口的存在分配相對高的成本(cost)，并為缺口中每個(gè)隨后的殘基分配較少的罰分。
這是最常用的缺口計(jì)分系統(tǒng)。高的缺口罰分將當(dāng)然地產(chǎn)生具有更少缺口的比對。大多數(shù)比對程序容許修改缺口罰分。然而，當(dāng)使用這種軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選的是使用默認(rèn)值。例如，使用GCGWisconsin Besffit程序包時(shí)，氨基酸序列的默認(rèn)缺口罰分是一個(gè)缺口-12，每個(gè)延伸-4。
因而計(jì)算最大的同源性百分比首先需要產(chǎn)生最佳的比對，考慮到缺口罰分。用于進(jìn)行這種比對的適合的計(jì)算機(jī)程序是GCG WisconsinBestfit程序包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等1984，Nucleic Acids Research 12387-395)?？梢赃M(jìn)行序列比較的其他軟件的實(shí)例包括，但不限于，BLAST程序包(參見Ausubel等1999如上18章)、FASTA(Atschul等1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比較工具的GENEWORKS程序組。BLAST和FASTA都是可用于離線和在線檢索(參見Ausubel等1999如上，第7-58頁到7-60頁)和Altschul(1993)J Mol Evol 36290-300或Altschul等(1990)J Mol Biol 215403-10.然而，對于某些應(yīng)用，優(yōu)選的是使用GCG Bestfit程序。稱為BLAST 2 Sequences的新工具也是可獲得的，用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列。(參見FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)247-50；FEMSMicrobiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana & commat；ncbi.nlm.nih.gov)。
雖然最終的同源性百分比可以根據(jù)同一性來測定，比對處理本身一般不根據(jù)或全或無的(all-or-nothing)配對比較。而是，一般使用換算的相似性計(jì)分矩陣，根據(jù)化學(xué)相似性或進(jìn)化差距為每個(gè)成對比對分配分值。通常使用的這種矩陣的實(shí)例是BLOSUM62矩陣，BLAST程序組的默認(rèn)矩陣。GCG Wisconsin程序一般使用公眾的默認(rèn)值，或如果提供的話使用常規(guī)的符號比較表格(進(jìn)一步的詳情參見用戶手冊)。對于某些應(yīng)用，優(yōu)選的是對GCG程序包使用公眾默認(rèn)值，或?qū)τ谄渌浖?，使用默認(rèn)矩陣，例如BLOSUM62。一旦軟件產(chǎn)生了最佳的比對，就可能計(jì)算出同源性百分比，優(yōu)選的序列同一性百分比。軟件一般進(jìn)行這個(gè)作為序列比較的部分并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。
所述同源物可以不同于相應(yīng)的指定序列，在同源物的至少30個(gè)、例如至少40、60或100或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域上，不同至少1、2、5、10或更多個(gè)替換、缺失或插入。因而，所述同源物可以不同于相應(yīng)的指定序列為至少1、2、5、10、30或更多個(gè)替換、缺失或插入?？梢酝ㄟ^在適合的宿主中表達(dá)基因并測試與特異于特定CTB抗原的抗體的交叉反應(yīng)性，來測試同源CTB基因。
用于本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)?？梢园芘c在此所示的核苷酸序列(包括在此所述序列的互補(bǔ)序列)雜交的核苷酸序列。同源物一般以顯著高于背景的水平與相應(yīng)的指定序列雜交。同源物和指定序列間的相互作用產(chǎn)生的信號水平一般是背景雜交的至少10倍，優(yōu)選的至少100倍。可以通過例如，用32P對探針進(jìn)行放射性標(biāo)記，來測定相互作用的強(qiáng)度。
一般使用高嚴(yán)格性的培養(yǎng)基條件，例如約50℃到約60℃的0.03M氯化鈉和0.003M檸檬酸鈉，來實(shí)現(xiàn)選擇性雜交。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涵蓋了能在嚴(yán)格條件(例如，65℃和0.1SSC)下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交、與在此所示的核苷酸序列(包括在此所示序列的互補(bǔ)序列)雜交的核苷酸序列。
片段術(shù)語“片段”表示多肽包含野生型氨基酸序列的小部分。它可以包含序列的一個(gè)或多個(gè)大的連續(xù)部分，或多個(gè)小部分。優(yōu)選的，多肽包含野生型序列的至少50％，更優(yōu)選的至少65％，最優(yōu)選的至少80％。
異源蛋白質(zhì)/分子與A亞基單獨(dú)的低免疫原性相比，LTB和CTB都是特別有效的免疫原。由于它們的免疫原性，LTB和CTB都已經(jīng)被用作其他表位和抗原的載運(yùn)體(Nashar等Vaccine 1993；11(2)235-40)，已經(jīng)用作針對霍亂和大腸桿菌介導(dǎo)的腹瀉疾病的疫苗成分(Jetborn等1992Vaccine 10130)。由在此描述的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CTB也可被用作其他免疫原性或耐受性分子例如異源分子的載運(yùn)體，其可以通過化學(xué)連接與CTB連接，或可以制備為嵌合蛋白質(zhì)的部分。
在此使用的，術(shù)語“異源分子”是指一種分子，其一般來自與宿主細(xì)胞不同的物種，但可以來自相同物種的不同或不相關(guān)的菌株?？梢詫λ拗骷?xì)胞工程化以表達(dá)超過一個(gè)異源多肽，在這種情況下，所述多肽可以來自相同的有機(jī)體或來自不同的有機(jī)體。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，異源核苷酸序列編碼病原體的異源抗原。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以表達(dá)來自不同病原體的兩種或多種異源抗原。異源DNA或異源多肽可以是完整蛋白質(zhì)或含有表位的蛋白質(zhì)的一部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，異源多肽可以是CT或LT的無毒的成分或形式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，異源抗原可以是ETEC抗原，例如CFA1、CFAII(CS1、CS2、CS3)、CFA IV(CS4、CS5、CS6)菌毛抗原。在又一個(gè)實(shí)施方式中，異源抗原可以表達(dá)或制備為融合蛋白質(zhì)的部分。對此，融合蛋白質(zhì)可以包括兩個(gè)或多個(gè)不同抗原或設(shè)計(jì)以提高異源多肽的免疫原性的抗原和區(qū)域。異源抗原可以選自由病毒、細(xì)菌、真菌、蛋白質(zhì)、多肽或其免疫原性部分構(gòu)成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫原性成分選自由百日咳鮑特氏菌(Bordetella pertussis)毒素亞基S2、S3、S4、S5，白喉毒素片段B，大腸桿菌菌毛K88，K99，987P，F(xiàn)41，CFA I，CFA II(CS1、CS2、CS3)；CFA IV(CS4、CS5、CS6)構(gòu)成的組。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，由需要穩(wěn)定化的質(zhì)粒編碼的異源多肽可以不同于編碼異源抗原的序列，或附加于編碼異源抗原的序列。例如，所述多肽可以調(diào)節(jié)或開啟由細(xì)菌染色體或第二質(zhì)粒上的序列編碼的異源抗原的表達(dá)。做為選擇，或附加地，由質(zhì)粒編碼的異源多肽可以是選擇標(biāo)記或是最優(yōu)化攜帶所述質(zhì)粒的細(xì)菌的生長所需的多肽。
對于起到調(diào)節(jié)作用的異源多肽來說，其可以結(jié)合于并激活，或提高編碼異源抗原的序列的表達(dá)。所述調(diào)節(jié)可以是可誘導(dǎo)的，從而抗原的表達(dá)僅在合適的時(shí)間激活，例如當(dāng)細(xì)菌處在合適的生長期時(shí)，或僅施與待接種的宿主。
這可以有助于避免、或降低對于攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌的早期選擇壓力，直到誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)。
如上所指出的，一個(gè)或多個(gè)異源分子可以通過化學(xué)連接與由在此描述的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CTB連接，或可以制備為嵌合蛋白質(zhì)的部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用功能性交聯(lián)試劑，例如異雙功能性交聯(lián)試劑，進(jìn)行化學(xué)連接。更優(yōu)選的，所述交聯(lián)劑是N-y(-馬來酰亞胺-丁氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS)或N-琥珀酰亞胺基-(3-吡啶基-二硫基)-丙酸(SPDP)。術(shù)語“連接”包括直接的或間接的連接，例如，通過提供適合的間隔區(qū)基團(tuán)。舉例來說，連接的成分可以是共價(jià)連接的，形成單個(gè)活性部分/實(shí)體。做為選擇，連接的成分也可以與另一個(gè)實(shí)體連接。WO 95/10301教導(dǎo)了抗原如何直接地或間接地與粘膜結(jié)合分子連接。
還描述了根據(jù)CTB或LTB制造融合蛋白質(zhì)的方法，其中編碼目標(biāo)異源抗原的T或B表位之一或兩者的核酸遺傳性地融合到CTB的N-末端或C-末端之一或兩者的編碼序列，或置于CTB或LTB編碼序列中的鏈內(nèi)位置，或融合到CTA或LTA中的相似位置(Backstrom等，Gene 1995；165163-171，Backstrom等，Gene 1994；149211-217，Schdel等，Gene 1991；99255259)。還描述了將肽與CTA或LTA的羧基或氨基末端融合、以及與CTB或LTB共表達(dá)這些融合蛋白質(zhì)的方法(Sanchez等FEBS Lett.1986；208194-198，Sanchez等FEBS Lett.1997；40195-97)。
舉例來說，可以使用載體來制備遺傳性融合物，所述載體含有用于表達(dá)融合蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子、霍亂毒素結(jié)合亞基CTB的DNA序列、和免疫原性肽編碼序列。連接CTB和免疫原性肽編碼序列，從而它們處在適當(dāng)?shù)拈喿x框中，產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。表達(dá)、分泌和純化融合蛋白質(zhì)，用作疫苗。也可以根據(jù)WO 96/34893中的教導(dǎo)或根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法來制備雜交CTB/LTB。這些表達(dá)的雜交蛋白可以包括成熟的CTB序列，在其中氨基酸殘基被成熟LTB的相應(yīng)氨基酸殘基替代，其將LTB特異性表位的特征賦予所述免疫原性成熟CTB(產(chǎn)生，例如，稱為LCTBA的雜交分子)。反之，這些表達(dá)的雜交蛋白可以包括成熟的LTB序列，在其中氨基酸殘基被成熟CTB的相應(yīng)氨基酸殘基替代，其將CTB特異性表位的特征賦予所述免疫原性成熟LTB(產(chǎn)生，例如，稱為LCTBB的雜交分子)。此外，設(shè)想了第三種雜交蛋白，其組合了LCTBA分子和LCTBB分子(參見WO 96/34893和Lebens等(1996)Infect and Immunity 64(6)；2144-2150)。
制造CTB的方法編碼CTB的基因的實(shí)例包括但不限于也在附圖14中示出的CTB基因SEQ ID NO1，和表1中的GI登記號指定的那些。將CTB基因插入到表達(dá)載體中?？梢允褂脗鹘y(tǒng)方法制造穩(wěn)定的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中。
在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”，是指將外源多核苷酸插入到宿主細(xì)胞、異源基因、核苷酸序列，例如DNA或RNA序列中，從而所述宿主細(xì)胞將表達(dá)導(dǎo)入的基因或序列，其一般是由導(dǎo)入的基因或序列編碼的RNA，也可以是由導(dǎo)入的基因或序列編碼的蛋白質(zhì)或酶。可以使用任何方法進(jìn)行插入，例如但不限于，直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f-接合、使用CaCl2或其他試劑，例如二價(jià)陽離子和DMSO，或電穿孔。異源或外源多核苷酸可以維持為非整合載體，例如，質(zhì)粒，或選擇性地，可以整合到宿主基因組中。
轉(zhuǎn)化過程通常根據(jù)待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌物種而變化。參見，例如，[Masson et al.(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273；Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPO Publ.Nos.036 259 and 063 953；PCTPubl.No.Wo 84/04541，Bacillus]，[Miller et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；Wang etal.(1990)J.Bacteriol.172949，Campylobacter]，[Cohen et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower et al.(1988)Nucleic Acids Res.166127；Kushner(1978)″An improvedmethod for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids.In GeneticEngineeringProceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)；Mandel et al.(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949318；Escherichia]，[Chassy et al.(1987)FEMS Microbiol.Lett.25 44173Lactobacillus]；[Fiedler et al.(1988)Anal.Biochem 17038，Pseudomonas]；[Augustin et al.(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203，Staphylococcus]，[Barany et al.(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)″Transformation of Streptococcus lactis by electroporation，inStreptococcal Genetics(ed.J.Ferretti and R.Curtiss III)；Perry et al.(1981)Infec.Immun.321295；Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti et al.(1987)Proc.4thEvr.Cong.Biotechnology 1412，Streptococcus]。
接受并表達(dá)導(dǎo)入的DNA或RNA的宿主細(xì)胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)化”，是“轉(zhuǎn)化體”或“克隆”。導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA或RNA可以來自任何來源，包括與不同屬或物種的宿主細(xì)胞或細(xì)胞是相同屬或物種的細(xì)胞。
將穩(wěn)定的表達(dá)載體導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞例如霍亂弧菌宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。適合的方法的實(shí)例包括但不限于電穿孔、接合和電泳?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的篩選和選擇步驟來篩選并選擇正確攝取了的轉(zhuǎn)化克隆。設(shè)計(jì)CTB的表達(dá)，從而使CTB在生長培養(yǎng)基中過度產(chǎn)生并積累。
在培養(yǎng)之后，通過例如層析、沉淀和/或密度梯度離心來純化由在此描述的本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CTB亞基蛋白質(zhì)。這樣獲得的CTB蛋白質(zhì)可以用作疫苗，或用于生產(chǎn)針對所述肽的抗體，所述抗體能用于被動(dòng)免疫。
可以使用典型的硫酸銨沉淀、離子交換和親和層析技術(shù)(如WO01/27144中概述的)從培養(yǎng)物濾液中純化由在此描述的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CTB。使用GM-1 ELISA、比色蛋白質(zhì)化驗(yàn)(A280，Lowry，Bradford，BCA)、Western印跡和單放射免疫擴(kuò)散(SRI)和Mancini測驗(yàn)(如實(shí)施例中描述的)來表征CTB。優(yōu)選的，純化的材料基本上沒有污染物，是至少50％的純度；更優(yōu)選的，至少90％的純度，和更優(yōu)選的至少99％的純度?？梢酝ㄟ^層析、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物測定、和本領(lǐng)域已知的其他方法評估純度。
分離的CTB可由在此描述的方法獲得的分離的穩(wěn)定表達(dá)的CTB基本上沒有抗生素殘留物，因?yàn)樵摫磉_(dá)系統(tǒng)不表達(dá)抗生素抗性標(biāo)記，因而在該表達(dá)系統(tǒng)中使用抗生素添加物是不必要的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)至少一個(gè)異源抗原。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，霍亂弧菌宿主細(xì)胞表達(dá)多個(gè)不同的抗原，從而Vibrio choleae宿主細(xì)胞是多價(jià)的。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述，其中參照附圖對具體實(shí)施方式
進(jìn)行描述。在說明書中任何地方使用這樣的實(shí)例僅是說明性的，不作為限制本發(fā)明的范圍和含義，或任何例示的術(shù)語的范圍和含義。
附圖的簡要說明附圖1顯示了pUC19中1.4kb EcoRI/HindIII片段的克??；附圖2顯示了將KanR抗性基因嵌段插入到pUC19中霍亂弧菌thyA基因的PstI位點(diǎn)；附圖3顯示了用于產(chǎn)生具有XbaI末端的thyA-Kan片段的PCR引物；附圖4顯示了將thyA Kan片段插入到XbaI限制性pNQ 705中；附圖5顯示了消除卡那霉素基因編碼區(qū)域的開始部分，和thyA基因的部分；附圖6顯示了將ΔthyA ΔKan片段插入到XbaI限制性pDM4中；附圖7顯示了在pUC19中大腸桿菌thyA基因的PCR擴(kuò)增和亞克??；附圖8顯示了pMT-thyA/cat的產(chǎn)生；附圖9顯示了將來自pML-LCTBλ2的eltb-ctxB編碼片段插入到pMT-thyA/cat中；附圖10顯示了將tac啟動(dòng)子插入到pMT-thyA/cat(ctxB)中，和pMT-ctxB/thyA(cat)的產(chǎn)生；附圖11顯示了除去cat基因，產(chǎn)生pMT-ctxB/thyA；附圖12顯示了從pMT-ctxB/thyA除去多余的霍亂弧菌DNA的PCR反應(yīng)、產(chǎn)生pMT-ctxBthyA-2；附圖13是已經(jīng)在Master Seed lot上進(jìn)行測序的pMT-ctxBthyA-2的部分和一致性批次(lot/lots)的圖示；附圖14示出了表達(dá)質(zhì)粒pMT-ctxBthyA-2的DNA序列；(204-295；大腸桿菌thyA編碼區(qū)；1192-1876；Col E1復(fù)制起點(diǎn)；2339-2710eltB-ctxB編碼區(qū)；2402-2710ctxB編碼區(qū)；和2732-2759trpA終止子)。
表1某些CTB/LTB序列

表2某些前導(dǎo)區(qū)/信號序列

表3已知的CTB質(zhì)粒和在此描述的CTB質(zhì)粒之間的比較


實(shí)施例IA.原材料ctxB基因的來源是霍亂弧菌血清型O1菌株395(Ogawa)[2]。eltB信號序列從質(zhì)粒pMMB68[3]獲得。在[4]中描述了eltB和ctxB基因的連接。
復(fù)制起點(diǎn)是從pBlueScript KS(Stratagene)獲得的ColE1。
pMT-ctxBthyA-2中使用的tac啟動(dòng)子來自質(zhì)粒pKK223-3(Pharmacia)。
用于PCR擴(kuò)增大腸桿菌thyA基因的DNA序列是大腸桿菌SY327[5]。
在染色體霍亂弧菌thyA基因座的滅活中使用的KanR抗性基因嵌段獲自pUC4K(Pharmacia)。
用于霍亂弧菌thyA基因座定點(diǎn)誘變的自殺載體是pNQ705[6]，和[7]中描述的pDM4。
由SBL Vaccin AB測定了霍亂弧菌thyA基因的序列，在EMBL/Genebank以登記號No AJ006514公開。
A.1構(gòu)建用于生產(chǎn)rCTB的霍亂弧菌Inaba菌株401典型生物型。
A.1.2.構(gòu)建宿主菌株霍亂弧菌JS1569 ΔthyAΔKan。
霍亂弧菌菌株JS1569 ΔthyAΔkan是典型的O1利福平抗性霍亂菌株，最初來源于霍亂弧菌菌株569B；ATCC No 25870。已經(jīng)通過定點(diǎn)誘變?nèi)笔Я藘蓚€(gè)拷貝的霍亂腸毒素基因。減毒包括缺失霍亂毒素A亞基基因。[9]。thyA基因的缺失和插入鈍化如下所述。
A.1.3.霍亂弧菌JS1569中thyA基因的鈍化。
在從JS1569[Carlin等，Genebank登記號no AJ006514)分離和測序thyA基因的過程中，將包括完整thyA基因的EcoRI-HindIII片段以1.4kb的DNA片段克隆到載體pUC19中。這個(gè)質(zhì)粒稱為thyA 1.4(附圖1)。
A.1.4通過插入KanR基因嵌段鈍化thyA基因。
用PstI裂解質(zhì)粒pthyA1.4，與來自pUC4K(Pharmacia Biotech)的KanR基因嵌段的PstI片段連接。將連接混合物電穿孔大腸桿菌HB101，通過涂布到含有氨芐青霉素和卡那霉素的Syncase瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。這個(gè)質(zhì)粒稱為pthyA Kan。(附圖2)。
使用產(chǎn)生高序列精確度的PCR片段的Taq和Pwo DNA聚合酶的混合物(ExpandTMHigh fidelity PCR系統(tǒng)，Boehringer Mannheim)從pthyA Kan PCR擴(kuò)增thyA KanR基因。使用的引物是thyA-10 GCT CTA GAG CCT TAG AAG GCG TGG TTC(SEQ ID NO7)和thyA-11GCT CTA GAG CTA CGG TCT TGA TTT ACG GTA T(SEQ ID NO8)，產(chǎn)生具有XbaI末端的PCR片段(附圖3)。
用XbaI消化這個(gè)片段，連接到已經(jīng)如上指出的用XbaI消化并脫去磷酸的載體pMAL-C2中。通過限制性內(nèi)切酶分析確認(rèn)片段大小和方向。
A.1.5通過定點(diǎn)誘變在霍亂弧菌染色體中進(jìn)行thyA基因的插入鈍化。
自殺載體pNQ705[6](附圖4)含有R6K復(fù)制起點(diǎn)，因而只能在攜帶pir基因的宿主中維持。它還含有mobRP4基因和CAT基因，允許氯霉素選擇。
從pMAL-C2切下thyA KanR基因XbaI片段，與XbaI消化的pNQ705相連(附圖4).將連接混合物電穿孔大腸桿菌SY327[Δ(lacpro)argE(Am)rif malA recA56]，在含有氯霉素的平皿上選擇轉(zhuǎn)化體。用限制性內(nèi)切酶分析重劃線的單個(gè)菌落，分析插入物的存在和方向。
通過電穿孔將產(chǎn)生的質(zhì)粒pNQ705thyA KanR轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1(thi pro hsdR hsdM+recA RP4-2-Tc∷Mu-Km∷Tn7)。
JS1569 thyA-(thyA基因[10]在攜帶單個(gè)點(diǎn)突變的JS1569的三甲氧基二氨嘧啶(三甲氧基二氨嘧啶)抗性變體和大腸桿菌S17-1(pNQ705 thyA KanR)之間的接合在37℃在補(bǔ)充有利福平(50μg/ml)、胸腺嘧啶(200μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂單作為劃線接合進(jìn)行。將由接合產(chǎn)生的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到上述具有利福平、胸腺嘧啶和卡那霉素補(bǔ)充物的液體LB肉湯，在這個(gè)培養(yǎng)基中傳代三天。
此時(shí)通過PCR檢測連接合子以確定測試轉(zhuǎn)化連接體，測試thyAKanR基因的插入。
將具有預(yù)期PCR片段的培養(yǎng)物挑到如上補(bǔ)充了的LB瓊脂上。
現(xiàn)在挑出單個(gè)菌落測試對氯霉素的敏感性(25μg/ml)和對卡那霉素的抗性。將這些菌落重劃線，冷凍單個(gè)菌落。在表型上，這個(gè)菌株的生長是胸腺嘧啶依賴性的。
A.1.6.KanR基因的插入鈍化和thyA基因的缺失。
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)用截短的非功能形式替換功能性KanR基因，并除去thyA基因的實(shí)質(zhì)部分，以進(jìn)一步保證這個(gè)菌株中胸腺嘧啶依賴性的穩(wěn)定性。對于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，將具有XbaI末端的thyA Kan片段亞克隆入XbaI消化的pNEB193(New England Biolabs)。設(shè)計(jì)兩個(gè)PCR引物thyA-14和thyA-15，其都包括XhoI可裂解末端。設(shè)計(jì)引物以消除thyA基因中的209個(gè)堿基對，并消除KanR基因中的144個(gè)堿基對(總共266bp來自KanR基因嵌段)。在KanR基因中的缺失包括KanR基因前48個(gè)氨基酸，這將產(chǎn)生成功的轉(zhuǎn)接合子Kans。用XhoI裂解產(chǎn)生的PCR片段，并容許自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有氨芐青霉素的瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。測試菌落的卡那霉素敏感性，用限制性內(nèi)切酶分析證實(shí)所述缺失。
從這個(gè)質(zhì)粒切除產(chǎn)生的ΔthyA ΔKan片段，作為XbaI片段。將這個(gè)片段插入到已經(jīng)用XbaI消化的自殺載體pDM4中。pDM4起源于pNQ705，其是通過替換多克隆位點(diǎn)并插入來自枯草芽孢桿菌的SacB基因所得。SacB基因編碼對革蘭氏陰性細(xì)菌致命的levansucrase基因。將連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SY327，通過氯霉素選擇轉(zhuǎn)化體。通過限制性內(nèi)切酶分析確認(rèn)插入物的大小和方向。對于接合實(shí)驗(yàn)，將質(zhì)粒pDM4 ΔthyAΔKan轉(zhuǎn)化大腸桿菌S-17。在含有利福平、氯霉素和胸腺嘧啶的LB平皿上，在大腸桿菌S-17(pDM4 ΔthyA ΔKan)和JS1569 ΔthyA Kan之間進(jìn)行接合。轉(zhuǎn)接合子進(jìn)一步在含利福平、氯霉素和胸腺嘧啶的LB肉湯中生長。在這個(gè)培養(yǎng)基中傳代三天后，將菌落涂布到含有胸腺嘧啶和5％蔗糖的的LB平皿上。在這些平皿上出現(xiàn)的菌落通過在有和沒有胸腺嘧啶、含有氯霉素的胸腺嘧啶平皿和含有卡那霉素的平皿上影印培養(yǎng)來測試生長情況。選出需要胸腺嘧啶的氯霉素和卡那霉素敏感性菌落，用合適的引物利用PCR中進(jìn)行測試，測試ΔthyA ΔKan插入物對thyA KanR基因嵌段的置換。這個(gè)菌株的單個(gè)菌落進(jìn)行重劃線。對于這些菌落，進(jìn)行基因型的再次確認(rèn)(利福平抗性、ctxA基因座的缺失、胸腺嘧啶依賴性、氯霉素和卡那霉素敏感性)，將菌株稱為JS1569 ΔthyA ΔKan。
進(jìn)一步的表征包括在這個(gè)菌株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增和對修飾的染色體thyA基因座的部分測序。發(fā)現(xiàn)，在用于第一接合實(shí)驗(yàn)的三甲氧基二氨嘧啶抗性thyA-菌株中的點(diǎn)突變已經(jīng)變成野生型，即，這個(gè)菌株的胸腺嘧啶依賴性是由更下游thyA基因的缺失所引起。DNA測序也證實(shí)了thyA和Kan基因嵌段的缺失(數(shù)據(jù)未顯示)。
B.表達(dá)質(zhì)粒pMT-ctxBthyA-2B.1.1.大腸桿菌thyA基因的克隆。
為了克隆大腸桿菌thyA基因的克隆，使用公開的序列(Genebank登記號no J01709)來設(shè)計(jì)PCR引物MLthyA-16′GGG GGC TCG AGG TTT GTT CCT GAT TGG TTA CGG3′(SEQ ID NO9)粗體字母顯示來自公開的序列的序列(有義鏈上堿基16-39)，斜體字母顯示添加到該序列的XhoI位點(diǎn)。
MLthyA-25′GGG GGG TCG ACG TTT CTA TTT CTT CGG CGC ATC TTC3′(SEQ ID NO10)粗體字母顯示來自公開的序列的序列(非有義鏈上堿基1152-1128)，斜體字母顯示添加到該序列的SalI位點(diǎn)。
這些引物用于從大腸桿菌SY327擴(kuò)增thyA基因。
產(chǎn)生的PCR片段用T4聚合酶進(jìn)行鈍末端修復(fù)，克隆到pBluescriptKS(Stratagene)中的EcoRV位點(diǎn)。將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene)。在補(bǔ)充有氨芐青霉素的LB平皿上，在存在X-Gal和IPTG的情況下根據(jù)藍(lán)色/白色菌落選擇轉(zhuǎn)化體。通過限制性內(nèi)切酶裂解確認(rèn)插入的片段大小和方向。通過將重組質(zhì)粒電穿孔入JS1569thyA-、選擇氨芐青霉素抗性、在不含胸腺嘧啶的改良syncase培養(yǎng)基上生長，來確認(rèn)thyA基因功能。這個(gè)質(zhì)粒稱為pML-thyA(XS)。
B.1.2.攜帶大腸桿菌thyA基因的克隆載體的產(chǎn)生。
為了克隆大腸桿菌基因，使用載體pML-X1(附圖8)。這個(gè)質(zhì)粒的來源是pBC SK-(Stratagene)。在pML-X1中，復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)的側(cè)翼是獨(dú)特的BglII和StuI位點(diǎn)，它也攜帶來自pBC SK-的氯霉素(cat)基因(附圖8)。用AgeI/StuI限制性內(nèi)切酶消化pML-X1 DNA，用T4聚合酶修復(fù)鈍末端。
用BamHI/SalI消化pML-thyA(XS)載體，也進(jìn)行鈍末端修復(fù)(附圖8)?；旌蟽蓚€(gè)DNA制備物，并進(jìn)行連接。將連接混合物電穿孔入JS15694.4(在其thyA基因中帶有單個(gè)點(diǎn)突變的JS1569三甲氧基二氨嘧啶抗性變體)，利用胸腺嘧啶依賴性和氯霉素抗性進(jìn)行選擇。產(chǎn)生的質(zhì)粒pMT-thyA/cat進(jìn)行重劃線，進(jìn)行擴(kuò)展的(extansive)限制性內(nèi)切酶分析來證實(shí)它的不同成分的大小和方向(附圖8)。
B.1.3.ctxB插入到pMT-thyA/cat中為了將期望的ctxB基因插入到pMT-thyA/cat質(zhì)粒中，從質(zhì)粒pML-LCTBλ2獲得1.2kb EcoRl/XhoI片段。早先已經(jīng)描述了質(zhì)粒pML-LCTBλ2[4]，簡要地說，從質(zhì)粒pCVD30[2]分離ctxB基因。在pCVD30質(zhì)粒[2]中含有的ctxB基因來源于霍亂弧菌血清型O1菌株395(Ogawa)。
pML-LCTBλ2中的ctxB基因利用天然的SacI位點(diǎn)上游融合到來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素的eltB信號肽(附圖9)。這也導(dǎo)入了丙氨酸作為N-末端氨基酸，而不是天然的蘇氨酸。N-末端序列和信號肽的這個(gè)修飾導(dǎo)致了與早先使用的pJS752-3相比，從這個(gè)新的rCTB表達(dá)載體僅產(chǎn)生單個(gè)N-末端序列(參見以下的C.2節(jié))。在來自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段上ctxB基因的下游設(shè)置了強(qiáng)力的trpA終止子，有效地終止m-RNA轉(zhuǎn)錄。將來自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段連接到已經(jīng)用相同的酶消化的pMT-thyA/cat質(zhì)粒中(附圖10)，產(chǎn)生質(zhì)粒pMT-thyA/cat(ctxB)，其缺少eltb信號肽上游的啟動(dòng)子。
B.1.4.將tac啟動(dòng)子插入到pMT-thyA/cat(ctxB)中。
將tac啟動(dòng)子插入，作為最初從克隆載體pKK223-3(Pharmacia)獲得的256堿基對的BamHI/EcoRI片段(附圖11)。將來自這個(gè)反應(yīng)的連接的DNA導(dǎo)入霍亂弧菌JS15694.4中，根據(jù)缺少胸腺嘧啶時(shí)的生長和對氯霉素的抗性選擇菌落。
通過對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析和通過CTB的生產(chǎn)來篩選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)GM1-ELISA的判斷選出具有最高rCTB生產(chǎn)力的單個(gè)菌落。該重組質(zhì)粒稱為pMTctxB/thyA(cat)。
B.1.5.cat基因的去除。
為了除去cat基因，即，為了獲得沒有任何抗生素選擇標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII消化pMT-ctxB/thyA(cat)質(zhì)粒。重新連接切下的質(zhì)粒，再次電穿孔入霍亂弧菌菌株JS1569 4.4。根據(jù)缺少胸腺嘧啶時(shí)和缺少氯霉素時(shí)的生長挑選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)對氯霉素的敏感性篩選單個(gè)菌落并在Wizard Miniprepps中檢查質(zhì)粒的存在。用限制性內(nèi)切酶分析質(zhì)粒。對來自這個(gè)菌落的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行GM1 ELISA。產(chǎn)生的質(zhì)粒是pMT-ctxB/thyA(附圖12)。
B.1.6.從pMT-ctxB/thyA除去多余的霍亂弧菌DNA，產(chǎn)生pMT-ctxB/thyA-2。
來自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段包括大約1200個(gè)堿基對，在其中僅約400個(gè)堿基對編碼ctxB基因。在與ctxB相反方向上的閱讀框中存在一個(gè)開放閱讀框，可能編碼pyrF操縱子中的orfF蛋白質(zhì)。這個(gè)序列是不完整的，因而可能不表達(dá)。為了除去不編碼CTB的部分，設(shè)計(jì)PCR引物，設(shè)計(jì)第一個(gè)引物以包括ctxB基因的末端(以下的斜體)和SpeI位點(diǎn)(以下的粗體)。設(shè)計(jì)另一個(gè)引物包括trpA終止子(以下的斜體)和SpeI位點(diǎn)(以下的粗體)。
CTB3′5′GGG GGA CTA GTT TAA TTT GCC ATA CTA ATT GCG GCA ATC G3′(SEQ ID NO11)TrpA term5′GGG GGA CTA GTC AAT TGA AGC TTA AGC CCG CCT AAT GAG CG3(SEQ ID NO12)pMT-ctxB/thyA質(zhì)粒充當(dāng)PCR反應(yīng)的模板。獲得正確大小的PCR片段之后，進(jìn)行凝膠純化，并用SpeI消化。容許該質(zhì)粒自連和電穿孔入霍亂弧菌菌株JS1569 4.4。根據(jù)不含胸腺嘧啶時(shí)的生長選擇轉(zhuǎn)化體，分離單個(gè)菌落，進(jìn)行重劃線，通過限制性內(nèi)切酶分析來分析來自這個(gè)培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA。除去了包括完整orfF編碼序列的大約800堿基對的DNA。GM1 ELISA顯示了這對CTB的表達(dá)沒有影響。
產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pMT-ctxBthyA-2，是用于與宿主菌株霍亂弧菌JS1569 ΔthyΔkan共同使用以形成rCTB生產(chǎn)菌株霍亂弧菌菌株401的最終的構(gòu)建體。
B.1.7.pMT-ctxBthyA-2插入到霍亂弧菌JS1569 ΔthyAΔkan中。
將來自霍亂弧菌JS1569 4.4中的pMT-ctxBthyA-2的質(zhì)粒制備物電穿孔入霍亂弧菌JS1569 ΔthyΔAkan，從而形成菌株霍亂弧菌Inaba菌株401典型生物型。根據(jù)它們在不含胸腺嘧啶時(shí)的生長挑選轉(zhuǎn)化體。使用同時(shí)特異于CTB和LTB(大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素)的單克隆抗體菌落轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上進(jìn)行(如下所述的SBL測試方法PT00020)的單個(gè)菌株rCTB生產(chǎn)能力的測試。將菌落重劃線獲得單個(gè)菌落，來自這些菌落的和用于質(zhì)粒分析和擴(kuò)大的限制性分析，并最后進(jìn)行冷凍。
SBL測試方法PT00020這是用于區(qū)分能生產(chǎn)rCTB的rCTB生產(chǎn)菌株菌落和喪失了這種能力的菌落的方法。該方法包括，使待測試的菌落來瓊脂平板上生長，將菌落轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。將這個(gè)濾膜與特異于五聚rCTB的單克隆抗體孵化，洗滌，然后與抗小鼠IgG堿性磷酸酶共軛物孵化。洗滌之后，對濾膜進(jìn)行沉淀染色，rCTB菌落呈藍(lán)黑色，而非生產(chǎn)菌落基本上無色。
C.對攜帶pMT-ctxBthyA-2表達(dá)載體的霍亂弧菌JS1569 ΔthyA Δkan菌株菌株霍亂弧菌401的說明C.1.ctxB基因的核苷酸序列和翻譯的多肽的氨基酸序列。
C1.1.ctxB基因和側(cè)翼區(qū)域的詳細(xì)核苷酸序列。
使用CsCl梯度超速離心純化質(zhì)粒DNA并測序。質(zhì)粒pMT-ctxBthyA-2的完整核苷酸序列在附圖14中給出。在產(chǎn)生種子批次前的階段已經(jīng)測序了質(zhì)粒的95％(待完成)。在Master Working Seed批次中，已經(jīng)測序了來自Master Seed lot Bank的兩個(gè)不同試管的ctxB基因(如附圖13所示)。也已經(jīng)測序了來自三個(gè)一致的批次的生產(chǎn)細(xì)胞的末端。從Master Seed批次以及一致的批次獲得的序列顯示了100％的同一性。
C.2.成熟重組蛋白質(zhì)的氨基末端序列。
在附圖15中將由菌株霍亂弧菌401生產(chǎn)的rCTB的氨基酸序列與天然CTB和來自大腸桿菌的天然LTB毒素的氨基酸序列進(jìn)行比較。在附圖15中可見，LTB和rCTB 401的信號肽的氨基酸序列是相同的，成熟蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸也是一樣。天然CTB(典型生物型)和rCTB 401的比較顯示了唯一的差異是N-末端氨基酸(天然CTB中是蘇氨酸，rCTB 401中是丙氨酸)。這個(gè)修飾從先前rCTB 213分子的經(jīng)驗(yàn)[9]得以證明，其也具有與ctxB序列相連的eltB信號序列。由于當(dāng)時(shí)可用的DNA重組技術(shù)方法，在這個(gè)rCTB 213分子的序列連接區(qū)域中還包括四個(gè)其他的氨基酸[9]。
發(fā)酵規(guī)模的生產(chǎn)中使用rCTB 213的經(jīng)驗(yàn)表明，可以分離出多達(dá)六種帶有不同氨基末端的rCTB。
了解了這個(gè)知識后，設(shè)計(jì)rCTB 401的連接，從而在連接區(qū)域的額外氨基酸被除去，并且替換N-末端氨基酸使之與天然LTB的相同，即，丙氨酸。
這個(gè)修飾本身證明是有益的。在所有實(shí)驗(yàn)中和與發(fā)酵時(shí)間和條件無關(guān)的一致性rCTB 401批次中分離的rCTB 401中僅有一個(gè)N-末端。
C.3.表達(dá)方式。
帶有ctxB基因的pMT-ctxBthyA-2質(zhì)粒不含有強(qiáng)阻遏物的基因(lacIq)。在霍亂弧菌中，不知道基因組中是否存在阻遏物(lacI)?；魜y弧菌不發(fā)酵乳糖，但具有l(wèi)acZ基因[12]。合理的假定是，可能有的阻遏物將不會象lacIq一樣強(qiáng)力，并且它可能以比高拷貝數(shù)質(zhì)粒上的啟動(dòng)子(tacP)小得多的數(shù)量存在。結(jié)果，agctb的表達(dá)實(shí)際上是組成型的。
D.表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
D.1.保存穩(wěn)定性霍亂弧菌菌株401的Master和Working Seed批次已經(jīng)在-65℃或更冷的溫度分別保存了不到一年。在保存6個(gè)月后證明了Master和Working Seed批次的遺傳穩(wěn)定性，因?yàn)楫?dāng)進(jìn)行生長以產(chǎn)生一致性批次的產(chǎn)物時(shí)，100％的菌落都產(chǎn)生rCTB。
使用rCTB生產(chǎn)菌株霍亂弧菌213的Seed批次系統(tǒng)的先前的經(jīng)驗(yàn)顯示，該菌株的穩(wěn)定性是極好的，超過7年。將Mster和Working Seed批次包括在一個(gè)每5年進(jìn)行測試的穩(wěn)定性測試計(jì)劃中。
D.2.延長的培養(yǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性在設(shè)計(jì)以研究質(zhì)粒保留和rCTB生產(chǎn)的穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)中，霍亂孤菌菌株401在37℃Modified Syncase肉湯中在搖床上進(jìn)行生長。每天將培養(yǎng)物在新鮮培養(yǎng)基中稀釋10.000倍。這樣進(jìn)行11天。在第7和11天，將培養(yǎng)物涂布在Modified Syncase瓊脂上，使用特異于LTB并與CTB交叉反應(yīng)的單克隆抗體進(jìn)行菌落印跡技術(shù)[如下所述的SBLVaccin測試方法PT00020]測試菌落生產(chǎn)rCTB的能力。在超過100次傳代(11天的生長)后，100％的菌落保持了它們生產(chǎn)rCTB的能力。
SBL測試方法PT00020如上所指出(參見例如B.1.7節(jié))，PT00020是用于區(qū)分能生產(chǎn)rCTB的rCTB生產(chǎn)菌株菌落和喪失了這種能力的菌落的方法。該方法包括，使待測試的菌落來瓊脂平板上生長，將菌落轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。將這個(gè)濾膜與特異于五聚rCTB的單克隆抗體孵化，洗滌，然后與抗鼠IgG堿性磷酸酶共軛物孵化。洗滌之后，對濾膜進(jìn)行沉淀染色，rCTB菌落呈藍(lán)黑色，而非生產(chǎn)菌落基本上無色。
D.3.生產(chǎn)穩(wěn)定性霍亂弧菌菌株401的生產(chǎn)規(guī)模是500升。除了使用葡萄糖代替蔗糖外，培養(yǎng)基與以上使用的修飾的syncase培養(yǎng)基相同。為了研究質(zhì)粒保留并顯示一致性，從三個(gè)連續(xù)的500升生產(chǎn)發(fā)酵物中在停止點(diǎn)(breakpoint)采取樣品。在37℃生長約18小時(shí)后，在主要的500升發(fā)酵罐中100％的細(xì)胞保持了它們生產(chǎn)rCTB的能力。
D.4.在生產(chǎn)發(fā)酵期間遺傳構(gòu)建體的穩(wěn)定性。
為了顯示遺傳構(gòu)建體的穩(wěn)定性，從霍亂弧菌菌株401的停止點(diǎn)收獲物制備DNA。通過CsCl純化質(zhì)粒DNA并測序，如附圖13所列。共有序列中第一個(gè)堿基相應(yīng)于pMT-ctxBthyA-2DNA中的堿基No2210，最后一個(gè)堿基相應(yīng)于pMT-ctxBthyA-2中的堿基220。測序的區(qū)域包括tac啟動(dòng)子之前的區(qū)域、完整的eltB-ctxB和thyA基因編碼區(qū)域內(nèi)的末端18個(gè)堿基。從生產(chǎn)發(fā)酵期間采取的樣品測定的序列顯示了與從種子批次獲得的相同的tac啟動(dòng)子、eltb-ctxB基因和側(cè)翼DNA的DNA序列，從而證明了構(gòu)建體的穩(wěn)定性。
比較實(shí)施例I“401”菌株對“213”菌株213生產(chǎn)系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)的213霍亂弧菌表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的rCTB成分概括如下用含有處在異源啟動(dòng)子控制下的CTB的基因序列的質(zhì)粒(稱為pJS752-3)轉(zhuǎn)染缺失了ctxA的霍亂弧菌O1(JS1569)，其中CTB編碼序列與編碼異源前導(dǎo)區(qū)多肽的序列(大腸桿菌LT前導(dǎo)序列)連接，以促進(jìn)宿主細(xì)胞分泌CTB。通過切下質(zhì)粒JS162中的CTB基因并將該基因插入質(zhì)粒載體PKK223-1中來制備pJS752-3質(zhì)粒，質(zhì)粒載體PKK223-1含有tacP啟動(dòng)子，但不含有決定IPTG依賴性的、PJS162中存在的lacIq基因(關(guān)于制備和使用這些質(zhì)粒的方法的更多細(xì)節(jié)，在Sanchez和Holmgren(1989)如上和美國專利Nos 5268276、58234246和6043057和EP專利No 0368819B中提供和描述了)。
pJS752-3質(zhì)粒進(jìn)一步包含抗生素選擇性標(biāo)記(氨芐青霉素抗性標(biāo)記)，以允許選擇含有CTB序列的適合的質(zhì)粒。具有表達(dá)載體(pJS752-3)的霍亂弧菌生產(chǎn)菌株(JS1569)是霍亂弧菌213菌株。
從213生產(chǎn)菌株以單體形式過量表達(dá)和分泌CTB，此后它裝配成特征化的五體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，提供具有約58kDa分子量的rCTB。這樣，rCTB僅由霍亂腸毒素的無毒部分組成(因?yàn)橛卸镜腁亞基已經(jīng)從生產(chǎn)菌株遺傳性地缺失)，但維持了結(jié)合腸上皮細(xì)胞表明的GM-1受體的能力(對于這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)節(jié)，參見美國專利Nos 5268276、58234246和6043057，EP專利No 0368819和Sanchez等(1989)(ibid))。
“401”表達(dá)系統(tǒng)如在此所述的，已經(jīng)產(chǎn)生了缺乏thyA基因功能的JS 1569霍亂弧菌生產(chǎn)菌株的衍生物(例如，thyA基因可以除去或遺傳性地失效)。在表達(dá)質(zhì)粒中提供功能性的thyA基因，這允許選擇保持了該質(zhì)粒的霍亂弧菌宿主細(xì)胞，其在缺少胸腺嘧啶時(shí)不能生長(如WO 99/61634中所述)。如在此所述的具有表達(dá)載體(pMT-CtxBthyA-2)的衍生的霍亂弧菌生產(chǎn)菌株(JS1569 ΔthyΔkan)是產(chǎn)生CTB的401霍亂弧菌菌株。
表4三次連續(xù)發(fā)酵中rCTB-401和rCTB-213的產(chǎn)量比較

表4中的數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵周期的結(jié)尾，缺失thyA的霍亂弧菌菌株(稱為“401”菌株)的rCTB平均產(chǎn)量約1.4mg/ml，在“213”菌株的rCTB產(chǎn)量(0.4mg/ml)的3-4倍的范圍內(nèi)。
用于測定rCTB濃度的方法是單放射免疫擴(kuò)散法(SRI)，也稱為Mancini測試(Mancini等(1965)Immunochem 2235-254Immunochemical quantitation of antigen by single radialimmunodiffusion)，使用了針對高度純化的rCTB的抗血清。用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的rCTB標(biāo)準(zhǔn)是已經(jīng)由許多蛋白質(zhì)測試表征的高度純化的rCTB。
這個(gè)產(chǎn)量(1.4mg/ml)是報(bào)道的野生型霍亂弧菌569B菌株的約50倍，是Sanchez和Holmgren(1989)所報(bào)道的約20倍。
討論比較實(shí)施例I現(xiàn)有技術(shù)“213”生產(chǎn)系統(tǒng)和“401”系統(tǒng)中使用的表達(dá)質(zhì)粒之間的主要區(qū)別在表3中列出。“401”菌株相對于“213”菌株，這些區(qū)別包括沒有抗生素抗性標(biāo)記，較小的質(zhì)粒大小和較高的rCTB產(chǎn)量。
不希望受理論的限制，據(jù)信，除去ctxB基因下游的一部分非編碼霍亂弧菌DNA產(chǎn)生了減小的表達(dá)載體大小，有助于改善穩(wěn)定性和改善CTB終產(chǎn)物產(chǎn)量。對改善質(zhì)粒穩(wěn)定性舉例來說，含有表達(dá)盒的質(zhì)粒在甚至沒有抗生素選擇時(shí)100次傳代后的培養(yǎng)物中仍然在100％的細(xì)菌細(xì)胞中存在。在“401”菌株中抗生素抗性標(biāo)記的缺少，就安全性和更廉價(jià)的CTB終產(chǎn)物而言，也具有優(yōu)點(diǎn)。生產(chǎn)的rCTB也是有優(yōu)點(diǎn)的，因?yàn)楫a(chǎn)生了更為均質(zhì)化的CTB產(chǎn)物。在這方面，當(dāng)生產(chǎn)菌株是401菌株時(shí)，僅產(chǎn)生一種rCTB，這種rCTB序列不同于野生型CTB序列僅在于單個(gè)N-末端突變(蘇氨酸(Thr)替換成丙氨酸(Ala))。相反，當(dāng)產(chǎn)生菌株是213菌株時(shí)，最終的rCTB產(chǎn)物實(shí)際上含有稍有不同的rCTB氨基酸序列(參見Sanchez和Holmgren 1989(如上))，在CTB序列的N-末端殘基中發(fā)生了至少兩種不同的突變。
比較實(shí)施例II使用358菌株(Lebens)和401表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CTB水平Lebens等(1993)(如上)的生產(chǎn)系統(tǒng)和“401”系統(tǒng)中使用的表達(dá)質(zhì)粒之間的主要區(qū)別在表3中列出。
這些區(qū)別包括缺少抗生素抗性標(biāo)記和更小的質(zhì)粒大小。
Lebens等(1993)中描述的CTB表達(dá)系統(tǒng)只要使有機(jī)體生長就需要抗生素的存在。抗生素抗性標(biāo)記是氨芐青霉素抗性標(biāo)記。氨芐青霉素抗性是由于表達(dá)了裂解抗生素的酶，β-內(nèi)酰胺酶。在Lebens表達(dá)系統(tǒng)中使用的稱為“358”菌株的霍亂弧菌菌株需要培養(yǎng)基中持續(xù)存在氨芐青霉素來維持最佳產(chǎn)量。因而，使用Lebens表達(dá)系統(tǒng)獲得的CTB產(chǎn)量僅在使用“選擇壓力和存在氨芐青霉素時(shí)”才獲得。
使用WO 01/27144中公開的表達(dá)系統(tǒng)和“401”表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的CTB水平細(xì)菌中重組CTB的生產(chǎn)表達(dá)質(zhì)粒MS-0(參見WO 01/27144的附圖2)被用于表達(dá)rCTB和其變體。含有rCTB基因的MS-0稱為pML-CTBtacl。質(zhì)粒pML-CTBtacl令人驚訝地產(chǎn)生了多達(dá)比較質(zhì)粒(Sanchez和Holmgren1989，如上，中公開的載體pJS162)所產(chǎn)生的五倍的產(chǎn)物。通過將CTB基因組區(qū)域的一部分和完整的CTB編碼區(qū)域克隆入質(zhì)粒MS-0，產(chǎn)生3.66Kb的表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建了pML-CTBtacl。在克隆期間多聚接頭中的PvuII位點(diǎn)被破壞。該質(zhì)粒含有來自pKK223的tac啟動(dòng)子，EcoRI-BamHI多聚接頭片段，可以在Genbank登記號No M77749找到。
編碼的蛋白質(zhì)與來自霍亂弧菌菌株569B(SEQ ID NO2)的序列相同。信號序列(SEQ ID NO3)也來自CTB霍亂弧菌典型菌株569BCTB基因?；魜y弧菌菌株569BCTB基因的完整核苷酸序列在WO01/27144的附圖1(SEQ ID NO1)中示出。LTB的信號序列(SEQ IDNO13)是MNKVKCYVLFTALLSSLCAYG，也在WO 01/27144的序列表中示出，可用于產(chǎn)生LTB的突變體或變體。
與401表達(dá)系統(tǒng)比較WO 01/27144中公開的CTB生產(chǎn)系統(tǒng)和“401”系統(tǒng)中使用的表達(dá)質(zhì)粒之間的主要區(qū)別在表3中列出。這些區(qū)別包括沒有抗生素抗性標(biāo)記，較小的質(zhì)粒大小和與WO 01/27144中公開的表達(dá)系統(tǒng)獲得產(chǎn)量相比“401”菌株的更高的rCTB產(chǎn)量。
綜述已知高水平的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯取決于許多因素。這些因素包括但不限于啟動(dòng)子強(qiáng)度、翻譯起始序列、密碼子選擇、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄終止、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒穩(wěn)定性和宿主細(xì)胞的生理機(jī)能。因而，不同蛋白質(zhì)的表達(dá)可能顯著地變化，僅使用強(qiáng)啟動(dòng)子不能保證成功地過量表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明公開了如何改善CTB產(chǎn)量，使用具有抗生素抗性標(biāo)記以外的標(biāo)記和合適的宿主細(xì)胞菌株的CTB生產(chǎn)系統(tǒng)，消除了對抗生素選擇的需要。該CTB生產(chǎn)系統(tǒng)包含缺乏thyA基因功能的細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞與新的表達(dá)載體一同使用來產(chǎn)生相對于用已知的細(xì)菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量出乎意料地高的重組霍亂毒素B亞基(rCTB)產(chǎn)量。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明教導(dǎo)了如何使用一種CTB生產(chǎn)系統(tǒng)來改善CTB產(chǎn)量，所述CTB生產(chǎn)系統(tǒng)包含缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞與新的表達(dá)載體一同使用來產(chǎn)生相對于用已知的霍亂弧菌生產(chǎn)系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量出乎意料地高的重組霍亂毒素B亞基(rCTB)產(chǎn)量。
構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，在其中大腸桿菌的胸苷酸合成酶(thyA)基因被用作選擇和維持含CTB基因的質(zhì)粒的手段。相對于用于生產(chǎn)CTB的已知表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有減小了的大小，因?yàn)镃TB基因下游的基本上所有的非編碼霍亂弧菌DNA都被除去了。
使用這種表達(dá)系統(tǒng)獲得的意外高的CTB產(chǎn)量表明了霍亂弧菌菌株中異源基因的表達(dá)效率和通過彌補(bǔ)thyA缺失而維持的質(zhì)粒穩(wěn)定性。
此外，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒是極其穩(wěn)定的。即使在通過液體培養(yǎng)重復(fù)傳代至100代以后，所有細(xì)胞都保持了質(zhì)粒以及表達(dá)重組蛋白質(zhì)的能力。
在此報(bào)道的表達(dá)系統(tǒng)是有益的，因?yàn)樗阌谟糜谝韵掠猛镜腃TB的生產(chǎn)，包括但不限于針對霍亂和LT引起的大腸桿菌腹瀉的口服疫苗中的保護(hù)性免疫原；用于下調(diào)/調(diào)整/脫敏/重定向(re-directing)免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)物或耐受性誘導(dǎo)試劑或免疫偏離(immune-deviating)試劑；用于改變、增強(qiáng)、定向、重定向、強(qiáng)化或啟動(dòng)抗原特異性或非特異性免疫應(yīng)答的佐劑；刺激針對一種或多種獨(dú)立抗原的免疫反應(yīng)的載運(yùn)體；和用來產(chǎn)生用于診斷或免疫診斷測試中的抗體(例如單克隆的或多克隆的抗體)的診斷試劑。
從CTB的純化和標(biāo)準(zhǔn)化的角度這是特別有益的，因?yàn)榭梢允褂萌狈hyA基因功能的穩(wěn)定的細(xì)菌宿主細(xì)胞株來獲得相對高的CTB產(chǎn)量的疫苗成分。
本發(fā)明還教導(dǎo)了如何獲得穩(wěn)定的、基本上沒有抗生素殘留物的CTB制品，產(chǎn)生用于人類使用的安全的產(chǎn)物。
本發(fā)明的精神和范圍本發(fā)明不應(yīng)被限定于在此描述的特定實(shí)施方式的范圍中。實(shí)際上，除此處描述的之外本發(fā)明的各種修飾根據(jù)上述的說明書和附圖對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的修飾將處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
進(jìn)一步需理解的是，所有數(shù)值都是近似的，是為了說明而提供的。在本申請中引用的專利、專利申請、出版物、產(chǎn)品說明和方案，為了各種目的通過引用將其中公開的內(nèi)容在此全部引入作為參考。如果存在不一致，當(dāng)前公開的，包括定義，是優(yōu)先的。
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序列表<110>SBL Vaccin AB<120>霍亂毒素B亞基的表達(dá)系統(tǒng)<130>110116401<160>13<170>Patentin version 3.1<210>1<211>2759<212>DNA<213>質(zhì)粒pMT-ctxBthyA-2<400>1ctcgaggttt gttcctgatt ggttacggcg cgtttcgcat cattgttgag tttttccgcc 60agcccgacgc gcagtttacc ggtgcctggg tgcagtacat cagcatgggg caaattcttt120ccatcccgat gattgtcgcg ggtgtgatca tgatggtctg ggcatatcgt cgcagcccac180agcaacacgt ttcctgagga accatgaaac agtatttaga actgatgcaa aaagtgctcg240acgaaggcac acagaaaaac gaccgtaccg gaaccggaac gctttccatt tttggtcatc300agatgcgttt taacctgcaa gatggattcc ggctggtgac aactaaacgt tgccacctgc360gttccatcat ccatgaactg ctgtggtttc tgcagggcga cactaacatt gcttatctac420acgaaaacaa tgtcaccatc tgggacgaat gggccgatga aaacggcgac ctcgggccag480tgtatggtaa acagtggcgc gcctggccaa cgccagatgg tcgtcatatt gaccagatca540ctacggtact gaaccagctg aaaaacgacc cggattcgcg ccgcattatt gtttcagcgt600ggaacgtagg cgaactggat aaaatggcgc tggcaccgtg ccatgcattc ttccagttct660atgtggcaga cggcaaactc tcttgccagc tttatcagcg ctcctgtgac gtcttcctcg720
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<211>6<212>PRT<213>霍亂弧菌<400>3Thr Pro Gln Asn Ile Thr1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>霍亂弧菌<400>4Ala Pro Gln Asn Ile Thr1 5<210>5<211>21<212>PRT<213>大腸桿菌<400>5Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala Tyr Gly20<210>6<211>28
<212>PRT<213>霍亂弧菌<400>6Met Asn Lys Val Lys Phe Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala His Gly Ala Pro Gly Tyr Ala His Gly20 25<210>7<211>27<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>7gctctagagc cttagaaggc gtggttc 27<210>8<211>31<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>8gctctagagc tacggtcttg atttacggta t31<210>9<211>33<212>DNA<213>大腸桿菌<400>9gggggctcga ggtttgttcc tgattggtta cgg 33
<210>10<211>36<212>DNA<213>大腸桿菌<400>10ggggggtcga cgtttctatt tcttcggcgc atcttc36<210>11<211>40<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>11gggggactag tttaatttgc catactaatt gcggcaatcg40<210>12<211>41<212>DNA<213>霍亂弧菌<400>12gggggactag tcaattgaag cttaagcccg cctaatgagc g 41<210>13<211>21<212>PRT<213>大腸桿菌<400>13
Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala Tyr Gly20
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)霍亂毒素B亞基CTB的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)包含(a)缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)宿主細(xì)胞；和(b)包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表達(dá)載體，所述CTB基因基本上不含作為CTB基因來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5’和3’末端的側(cè)翼序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述宿主細(xì)胞缺乏CTA基因的功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)載體大小約3kb。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任何一項(xiàng)的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)載體包含大腸桿菌thyA基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的任何一項(xiàng)的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)載體具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任何一項(xiàng)的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼異源蛋白質(zhì)的至少一個(gè)另外的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼熱不穩(wěn)定大腸桿菌腸毒素LT的無毒部分或形式的核苷酸序列，優(yōu)選的所述LT的無毒部分是LTB的B亞基或其片段。
8.生產(chǎn)CTB的方法，其中所述方法包括用包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化缺乏thyA基因功能的霍亂弧菌宿主細(xì)胞，所述CTB基因基本上不含作為CTB基因來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5’和3’末端的側(cè)翼序列，和在允許CTB產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的霍亂弧菌宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括從所述宿主細(xì)胞分離和/或純化所述CTB。
10.一種分離的核酸構(gòu)建體，其包含thyA基因和CTB基因，所述CTB基因基本上不含作為CTB基因來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5’和3’末端的側(cè)翼序列，且所述核酸構(gòu)建體的大小小于5kb。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體大小約3kb。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體，其中所述質(zhì)粒是以附圖13中限制性內(nèi)切酶圖譜為特征的pMT-ctxBthyA-2。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體，其中所述質(zhì)粒具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于獲得改善的霍亂毒素B亞基(CTB)產(chǎn)量的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述表達(dá)系統(tǒng)包括缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主細(xì)胞；和包含功能性thyA基因和CTB基因的表達(dá)載體，所述CTB基因基本上不含作為CTB基因來源的宿主細(xì)胞天然基因組中緊鄰CTB基因的5’和3’末端的側(cè)翼序列。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)CTB的方法，和在表達(dá)系統(tǒng)中用作表達(dá)載體的分離的核酸構(gòu)建體。
文檔編號C12N15/74GK1902316SQ200480039628
公開日2007年1月24日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者N·卡林, M·勒本斯 申請人:Sbl疫苗有限公司