專(zhuān)利名稱(chēng)：：對(duì)抗肌肉病癥的方式和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：肌肉病癥是一種通常對(duì)個(gè)體生活有明顯影響的疾病。肌肉病癥可能有遺傳原因或非遺傳原因。與遺傳原因相關(guān)的一類(lèi)重要肌肉疾病是貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良(BeckerMuscularDystrophy,BMD)和杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DuchenneMuscularDystrophy，DMD)。這些病癥是由肌肉蛋白的基因缺陷引起的。貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良和杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是相對(duì)高發(fā)病率的遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良。在杜興氏和貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良兩者中，肌肉蛋白肌肉營(yíng)養(yǎng)不良蛋白受到影響。在杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良中缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，而在貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良中存在一些肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，但其產(chǎn)量大部分時(shí)候都是不夠的和/或存在的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白是異常形成的。兩種疾病都與隱性X連鎖遺傳相關(guān)。DMD是由DMD基因的移碼突變?cè)斐傻?。DMD基因中的移碼導(dǎo)致截短的非功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生，引起漸進(jìn)性肌肉萎縮和無(wú)力。當(dāng)突變不導(dǎo)致DMD基因的移碼時(shí)，發(fā)生BMD。在BMD中，存在一些肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，與此相反，DMD缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。BMD具有比DMD嚴(yán)重性更輕的癥狀。DMD的發(fā)作早于BMD。DMD通常在兒童早期就表現(xiàn)出來(lái)，而B(niǎo)MD是在十幾歲或成年早期。BMD的發(fā)展比DMD緩慢且更難以預(yù)測(cè)。BMD患者可存活至成年中期至晚期。DMD患者很少能存活超過(guò)三十歲。在肌纖維中，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白發(fā)揮著重要的結(jié)構(gòu)作用，聯(lián)接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架。N末端區(qū)結(jié)合肌動(dòng)蛋白，而C末端是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白糖蛋白復(fù)合物(DGC)的一部分，該復(fù)合物跨越肌膜。缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白時(shí)，機(jī)械應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肌漿破裂，使鈣未受控制地流入肌纖維內(nèi)部，由此觸發(fā)鈣激活的蛋白酶和纖維壞死。對(duì)于大部分遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良，目前沒(méi)有臨床可應(yīng)用的和有效的治療?，F(xiàn)在探索外顯子跳躍技術(shù)以對(duì)抗遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良。最近我們和其他人已報(bào)道了有關(guān)基因治療的可喜成果h1，該基因治療旨在恢復(fù)mdx小鼠和DMD患者的細(xì)胞中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA(pre-mRNA)的讀框(readingframe)。通過(guò)特定外顯子的靶向跳躍，DMD表型(缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白)被轉(zhuǎn)化成更輕度的BMD表型(部分轉(zhuǎn)化為大量功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白)。優(yōu)選通過(guò)靶向一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)或外顯子內(nèi)在序列的反義寡核糖核苷酸(AONs)的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)外顯子的跳躍。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)剪接位點(diǎn)由剪接體復(fù)合物所識(shí)別時(shí)，外顯子只內(nèi)含在mRNA中，因此剪接位點(diǎn)是AONs的明顯靶標(biāo)?？蛇x地，或另外，采用對(duì)一個(gè)或多個(gè)外顯子序列的至少一部分具有特異性的一個(gè)或多個(gè)AONs。采用對(duì)外顯子46序列具有特異的外顯子內(nèi)部AONs，我們以前就可以在外顯子45缺失的兩個(gè)不同DMD患者的培養(yǎng)的肌管中調(diào)節(jié)剪接模式11。AON處理之后，外顯子46發(fā)生跳躍，這在至少75%的細(xì)胞中導(dǎo)致讀框恢復(fù)并誘導(dǎo)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的合成。最近我們發(fā)現(xiàn)，采用外顯子內(nèi)部AONs，也可在人類(lèi)對(duì)照和患者肌肉細(xì)胞中針對(duì)39個(gè)不同DMD外顯子有效地誘導(dǎo)外顯子跳躍u’11—15。因此，在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因中應(yīng)用外顯子跳躍技術(shù)，可在DMD患者中生成至少部分功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白-雖然較短。因?yàn)镈MD是由功能失調(diào)的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白引起的，因此預(yù)期一旦給DMD患者提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白就足以緩解DMD的癥狀。然而，本發(fā)明提供的觀點(diǎn)是，即使外顯子跳躍技術(shù)能誘導(dǎo)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白合成，但仍然通過(guò)給予患者減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物，來(lái)進(jìn)一步緩解DMD癥狀。根據(jù)本發(fā)明，即使在DMD患者中恢復(fù)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷，組織炎癥和受損肌肉細(xì)胞的存在，仍持續(xù)促成DMD癥狀。因此，即使DMD的原因-即功能失調(diào)的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白得到緩解，但仍然還通過(guò)另外采用本發(fā)明的輔助治療改善DMD治療。而且，本發(fā)明提供的觀點(diǎn)是炎癥的減少不會(huì)造成肌肉細(xì)胞攝取AON的明顯減少。這是令人驚奇的，因?yàn)橥ǔＱ装Y會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞、血液和其他化合物的運(yùn)輸。結(jié)果，炎癥期間AON攝取/運(yùn)輸也增強(qiáng)。因此，在本發(fā)明之前，預(yù)期對(duì)抗炎癥的輔助治療涉及消極影響AON治療的風(fēng)險(xiǎn)。然而，情況并非如此。因此本發(fā)明提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括-給予所述個(gè)體向其提供(至少部分)功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物，以及-給予所述個(gè)體減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法包括，給予所述個(gè)體減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)使用針對(duì)外顯子或針對(duì)所述外顯子的一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)，如果也向表達(dá)mRNA的細(xì)胞提供減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物，則來(lái)自包括所述外顯子的所述前mRNA的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子的跳躍頻率得以增強(qiáng)。跳躍頻率的增強(qiáng)也增加了DMD或BMD個(gè)體肌細(xì)胞所產(chǎn)生的功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的水平。本發(fā)明還提供了在表達(dá)前mRNA的細(xì)胞中增強(qiáng)來(lái)自肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述前mRNA的外顯子跳躍的方法，該方法包括-使所述細(xì)胞中的所述前mRNA與使所述外顯子跳躍的寡核苷酸接觸，以及-使所述細(xì)胞與減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物接觸。因?yàn)槎排d氏和貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良在肌細(xì)胞中具有明顯表型，因此，優(yōu)選所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞包括編碼突變肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的基因。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是患有DMD或BMD的個(gè)體的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在患有杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體的表達(dá)前mRNA的細(xì)胞中增強(qiáng)來(lái)自肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的外顯子跳躍的方法，該方法包括-給予所述個(gè)體向其提供(至少部分)功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物，以及-給予所述個(gè)體減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物?？赏ㄟ^(guò)多種方式向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用外顯子跳躍技術(shù)。然而，可選的方法是可用的，例如通過(guò)慶大霉素或PTC124(也稱(chēng)為3-(5-(2_氟苯基)-1，2，4_惡二唑-3-基)苯甲酸)抑制終止密碼子16’17，和/或腺伴隨病毒(AAV)-介導(dǎo)的功能性小或微肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的基因送遞18_2°。PTC124是新澤西州PTCTherapeutics,Inc.(PTCTherapeutics,Inc.SouthPlainfield,NewJersey)的注冊(cè)商標(biāo)。如本文所定義的，功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白優(yōu)選是野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，其對(duì)應(yīng)具有SEQIDNO:1所確定的氨基酸序列的蛋白。功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白優(yōu)選是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，其具有N末端部分(在N末端的頭240個(gè)氨基酸)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361-3685)和C末端結(jié)構(gòu)域(C末端的最后325個(gè)氨基酸)，且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，每個(gè)這些結(jié)構(gòu)域都存在于野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白中。此處所示的氨基酸對(duì)應(yīng)由SEQIDNO:1表示的野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的氨基酸。換而言之，功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白是至少一定程度上表現(xiàn)出野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白活性的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白?！爸辽僖欢ǔ潭壬稀眱?yōu)選表示至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的相應(yīng)野生型功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的活性。在本文中，功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的活性是優(yōu)選與肌動(dòng)蛋白和與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)糖蛋白復(fù)合物(DGC)結(jié)合56?？赏ㄟ^(guò)對(duì)疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉的活檢進(jìn)行采用總蛋白提取物的免疫共沉淀或橫切片的免疫熒光分析，使肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白與肌動(dòng)蛋白和與DGC復(fù)合物的結(jié)合可視化，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；加卸排d氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體通常在編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的基因上有突變，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白可防止完整蛋白的合成即提前終止(prematurestop)防止C末端的合成。在貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良中，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因與野生型相比也包括突變，但其突變一般不包括提前終止，且C末端通常是合成的。結(jié)果合成了功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，其具有與野生型蛋白至少在種類(lèi)上相同的活性，盡管在活性水平上不一定相同。BMD個(gè)體的基因組通常編碼包括N末端部分(在N末端的頭240個(gè)氨基酸)、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361-3685)和C末端結(jié)構(gòu)域(C末端的最后325個(gè)氨基酸)的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，但它的中心桿狀結(jié)構(gòu)域可以比野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的短56。用于治療DMD的外顯子跳躍通常涉及，通過(guò)使桿結(jié)構(gòu)域狀的結(jié)構(gòu)域中的外顯子跳躍以矯正讀框并允許合成包括C末端的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的殘余部分，而克服前mRNA的提前終止，盡管由于桿結(jié)構(gòu)域較小，導(dǎo)致該蛋白有些小。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向患有DMD并通過(guò)上述定義的方法治療的個(gè)體提供至少一定程度上表現(xiàn)出野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白活性的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。更優(yōu)選地，如果所述個(gè)體是杜興氏患者或疑似是杜興氏患者，則功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白是患有BMD的個(gè)體的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白通常所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白能與肌動(dòng)蛋白和DGC兩者相互作用，但其中心桿狀結(jié)構(gòu)域比野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的短(Aartsma-Rusetal(2006,ref56)。野生型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的中心桿結(jié)構(gòu)域包括24個(gè)血影蛋白樣重復(fù)56。例如，本文所提供的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白中心桿狀結(jié)構(gòu)域可包括5-23個(gè)、10-22個(gè)或12-18個(gè)血影蛋白樣重復(fù)，只要它可與肌動(dòng)蛋白和與DGC結(jié)合。在本發(fā)明的方法中，緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀，可通過(guò)以下任何試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估喪失行走的時(shí)間延長(zhǎng)，肌肉強(qiáng)度的改善，舉重能力的改善，從平地站起所花時(shí)間的改善，九米行走時(shí)間的改善，攀登4層樓所花時(shí)間的改善，腿功能級(jí)別的改善，肺功能的改善，心臟功能的改善，生活質(zhì)量的改善。這些試驗(yàn)的每一種都是技術(shù)人員已知的。例如，Manzuratal(2008,ref58)的公開(kāi)，給出了每個(gè)這種試驗(yàn)的廣泛解釋。對(duì)于每種這些試驗(yàn)，一旦發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)所測(cè)量的參數(shù)的可檢測(cè)改善或延長(zhǎng)，就優(yōu)選表示，采用本發(fā)明的方法緩解了個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀?？蓹z測(cè)改善或延長(zhǎng)優(yōu)選是如Hodgettsetal(2006,ref57)所述統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改善或延長(zhǎng)?？蛇x地，個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的緩解，可通過(guò)測(cè)量本文之后所定義的肌纖維功能、完整性和/或存活的改善來(lái)評(píng)估。減少炎癥的輔助化合物包括能至少部分減少炎癥優(yōu)選由受損肌細(xì)胞引起的炎癥的任何治療。所述輔助化合物最優(yōu)選能減少肌肉組織炎癥。優(yōu)選通過(guò)檢測(cè)疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉組織中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞例如嗜中性粒細(xì)胞和/或肥大細(xì)胞和/或樹(shù)突細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加來(lái)評(píng)估炎癥。優(yōu)選在疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉組織的活檢57橫切片上經(jīng)過(guò)如上所述的特異性免疫細(xì)胞染色之后進(jìn)行這種評(píng)估。優(yōu)選在顯微鏡下進(jìn)行定量。因此優(yōu)選通過(guò)在疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉組織的橫切片中檢測(cè)免疫細(xì)胞數(shù)量的減少來(lái)評(píng)估炎癥的減少。檢測(cè)減少優(yōu)選表示至少一種如上所述的免疫細(xì)胞的數(shù)量與治療前相同個(gè)體中免疫細(xì)胞相比，減少至少1%>2%,3%,5%,7%,10%,12%,15%,17%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%、90%或更多。最優(yōu)選地，在所述活檢橫切片中未檢測(cè)到浸潤(rùn)免疫細(xì)胞。改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物包括，與其他不存在所述輔助化合物的相似情況相比，可測(cè)量地增強(qiáng)肌纖維功能、完整性和/或存活的任何治療。肌纖維功能、完整性和/或存活的改善可采用以下試驗(yàn)中至少之一評(píng)估血液中可檢測(cè)到的肌酸激酶減少，疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉活檢橫切片中可檢測(cè)到的肌纖維壞死的減少，和/或疑似肌營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉活檢橫切片中可檢測(cè)到的肌纖維直徑同質(zhì)性的增加。這些試驗(yàn)中的每一個(gè)都是技術(shù)人員已知的。可以檢測(cè)血液中的肌酸激酶，如57所述?？蓹z測(cè)到的肌酸激酶的減少表示，與相同個(gè)體治療前肌酸激酶濃度相比，減少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多?？蓹z測(cè)到的肌纖維壞死的減少優(yōu)選采用活檢橫切片在肌肉活檢中進(jìn)行評(píng)估，更優(yōu)選如57所述進(jìn)行評(píng)估?？蓹z測(cè)到的壞死的減少表示采用活檢橫切片確定的壞死面積減少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。減少通過(guò)與相同個(gè)體治療前所評(píng)估的壞死進(jìn)行比較來(lái)測(cè)量。可檢測(cè)到的肌纖維直徑同質(zhì)性的增加優(yōu)選在肌肉活檢橫切片中評(píng)估，更優(yōu)選如57所述進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明所述方法的治療為大約至少一周、大約至少一個(gè)月，大約至少幾個(gè)月，大約至少一年，大約至少2、3、4、5、6年或更久。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用增加受損肌細(xì)胞更新的輔助化合物。增加受損肌細(xì)胞更新的輔助化合物包括，能至少部分誘導(dǎo)和/或增加受損肌細(xì)胞更新的任何治療。受損肌細(xì)胞是比健康完整的肌細(xì)胞具有顯著更小的臨床可測(cè)量功能性的肌細(xì)胞。在缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白時(shí)，機(jī)械應(yīng)激導(dǎo)致肌漿破裂，使鈣未受控制地流入肌纖維內(nèi)部，由此觸發(fā)鈣激活的蛋白酶類(lèi)和纖維壞死，產(chǎn)生受損肌細(xì)胞。受損肌細(xì)胞更新的增加表示，與受損肌細(xì)胞更新不增加的情況相比，受損肌細(xì)胞更快地被降解和/或移除。受損肌細(xì)胞的更新優(yōu)選采用活檢橫切片在肌肉檢中進(jìn)行評(píng)估，更優(yōu)選如57所述進(jìn)行評(píng)估?？蓹z測(cè)到的更新增加可以是采用活檢橫切片鑒定的更新的面積增加5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。增加通過(guò)與相同個(gè)體治療前所評(píng)估的更新進(jìn)行比較來(lái)測(cè)量。不希望受限于理論，認(rèn)為增加肌細(xì)胞的更新是優(yōu)選的，因?yàn)檫@減少了炎癥反應(yīng)。7根據(jù)本發(fā)明，向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的治療與減少個(gè)體炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助治療的組合，特別適宜用作藥物。這種組合甚至比向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的單一治療能更好地緩解杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀。這個(gè)實(shí)施方案也增強(qiáng)了來(lái)自包括外顯子的前mRNA的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子的跳躍頻率，在使用針對(duì)外顯子或針對(duì)所述外顯子的一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)。跳躍頻率的增強(qiáng)也增加了DMD或BMD個(gè)體肌細(xì)胞所產(chǎn)生的功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的水平。因此還提供了用作藥物的向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與減少所述個(gè)體炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物的組合。因此所述組合特別適宜對(duì)抗DMD，因此本發(fā)明也提供了向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與減少所述個(gè)體炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物用于制備緩解杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。優(yōu)選的減少炎癥輔助化合物包括，類(lèi)固醇、TNFα抑制劑、mIGF_l源和/或抗氧化劑。然而，如上所述能減少炎癥的任何其他化合物也可包括在本發(fā)明內(nèi)。這些化合物中的每一種將在隨后展開(kāi)描述。可單獨(dú)或相互組合和/或與改善肌纖維功能、完整性和/或存活的一種或多種輔助化合物組合使用所展開(kāi)描述的每種化合物。而且，向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的治療與改善個(gè)體肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助治療的組合，特別適宜用作藥物。這種組合甚至比向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的單一治療能更好地緩解杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀。因此還提供了用作藥物的向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與改善所述個(gè)體肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物的組合。這種組合還特別適宜對(duì)抗DMD。因此也提供了向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與改善所述個(gè)體肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物用于制備緩解杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。優(yōu)選用于改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物包括，離子通道抑制劑、蛋白酶抑制劑、L-精氨酸和/或血管緊張素II型I受體阻斷劑。然而，如上所述的能改善肌纖維功能、完整性和/或存活的任何其他化合物也可包括在本發(fā)明內(nèi)。這些化合物的每一種將在隨后展開(kāi)描述?？蓡为?dú)或相互組合和/或與用于減少炎癥的一種或多種輔助化合物組合使用所展開(kāi)描述的每種化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備了藥物制劑，其包括至少一種以上述組合，所述組合包括向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物以及本發(fā)明所述輔助化合物。因此還提供了藥物制劑，其包括-向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物，以及-減少所述個(gè)體炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或改善所述個(gè)體肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物，以及-藥物可接受載體、佐劑、稀釋劑和/或賦形劑。適宜載體和佐劑的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的，例如包括鹽溶液。本發(fā)明所述的藥物制劑所用化合物的劑量范圍是根據(jù)符合嚴(yán)格方案要求的臨床試驗(yàn)中上升劑量研究而設(shè)計(jì)的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與類(lèi)固醇組合。如實(shí)施例所示的，這種結(jié)合明顯緩解了DMD癥狀。因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體類(lèi)固醇與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用作藥物的類(lèi)固醇與向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，以及類(lèi)固醇與向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在使用針對(duì)外顯子或針對(duì)所述外顯子的一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)，該實(shí)施方案也增強(qiáng)了來(lái)自包括所述外顯子的前mRNA的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子的跳躍頻率。跳躍頻率的增強(qiáng)也增加了DMD或BMD個(gè)體肌細(xì)胞所產(chǎn)生的功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。類(lèi)固醇是萜類(lèi)脂質(zhì)，其特征在于碳骨架具有四個(gè)稠合的環(huán)并通常以6-6-6-5的方式排列。通過(guò)附于這些環(huán)的功能團(tuán)和環(huán)的氧化狀態(tài)，類(lèi)固醇可發(fā)生改變。類(lèi)固醇包括通常用于減輕腫脹和炎癥的激素和藥物，例如潑尼松、地塞米松和維生素D。根據(jù)本發(fā)明，輔助類(lèi)固醇治療在DMD患者中的補(bǔ)充作用包括，減少組織炎癥、抑制細(xì)胞毒性細(xì)胞和改善鈣平衡。在小男孩中獲得了大多數(shù)陽(yáng)性結(jié)果。優(yōu)選類(lèi)固醇是皮質(zhì)類(lèi)固醇(糖皮質(zhì)類(lèi)固醇)。優(yōu)選，在本發(fā)明的方法中使用潑尼松類(lèi)固醇(例如潑尼松、潑尼松龍或地夫可特)21。本文所述的治療應(yīng)用所用的(糖皮質(zhì))類(lèi)固醇的劑量范圍是根據(jù)符合嚴(yán)格方案要求的臨床試驗(yàn)中上升劑量研究而設(shè)計(jì)的。通常的劑量，對(duì)潑尼松和潑尼松龍而言是大約0.5-1.Omg/kg/天，優(yōu)選大約0.75mg/kg/天，而對(duì)地夫可特而言是大約0.4-1.4mg/kg/天，優(yōu)選大約0.9mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給予向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物之前，給予所述個(gè)體類(lèi)固醇。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選在給予向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物之前的至少一天、更優(yōu)選至少一周、更優(yōu)選至少兩周、更優(yōu)選至少三周，給予所述類(lèi)固醇。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與腫瘤壞死因子α(TNFa)抑制劑組合。腫瘤壞死因子a(TNFa)是刺激炎癥反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子。用中和抗體英夫利昔單抗(類(lèi)克)在藥理上阻斷TNFα活性，在臨床上高效減少炎癥疾病的癥狀。在mdx小鼠中，英夫利昔單抗和依那西普都延遲和減少營(yíng)養(yǎng)不良肌肉的壞死24’25，伴有對(duì)肌肉強(qiáng)度、氯離子通道功能和CK水平減少的附加生理優(yōu)勢(shì)，這在經(jīng)長(zhǎng)期治療實(shí)踐的成年mdx小鼠中得到證實(shí)26。這種設(shè)計(jì)用于其它臨床狀況的高度特異性消炎藥物是DMD所用類(lèi)固醇的有吸引力替代物。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)肌肉損傷和劣化特別明顯時(shí)，TNFa抑制劑的使用僅限于男孩肌肉密集生長(zhǎng)期。因而，本發(fā)明的一方面提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予向所述個(gè)體TNFα抑制劑和向所述給他提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用作藥物的TNFa抑制劑和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，以及TNFa抑制劑和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。優(yōu)選的TNFa抑制劑是二聚體融合蛋白，其由與人IgGl的Fc部分連接的TNFa的人p75受體的細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。更優(yōu)選的TNFα抑制劑是依那西普(Amgen，America)26。依那西普的通常劑量是一周兩次大約0.2mg/kg，優(yōu)選大約0.5mg/kg。優(yōu)選皮下給藥。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與mIGF-1源組合。如上所限定的，IGF-I源優(yōu)選包括mIGF-1本身，能增強(qiáng)mIGF-1表達(dá)和/或活性的化合物。此處的增強(qiáng)與增加是同義的。mIGF-1的表達(dá)與mIGF-1的量是同義的。mIGF-1通過(guò)增加衛(wèi)星細(xì)胞的活性促進(jìn)肌肉的再生，并減少炎癥和纖維化27。局部肌肉損傷導(dǎo)致mIGF-1表達(dá)增加。在具有額外的IGF-I基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中，可觀察到肌肉肥大和擴(kuò)大的肌纖維27O同樣，轉(zhuǎn)基因mdx小鼠顯示出肌纖維變性減少28。mIGF-1基因的上調(diào)和/或給予額外量的mIGF-1蛋白或其功能等同物(特別是mIGF-lEa同種型[如27所述，人類(lèi)同系物IGF-I同種型4:SEQIDNO2])從而促進(jìn)其他效果，優(yōu)選DMD的基因治療，包括反義誘導(dǎo)的外顯子跳躍。在上述轉(zhuǎn)基因小鼠中，其他mIGF-1水平不會(huì)誘導(dǎo)心臟問(wèn)題，也不會(huì)促成癌癥，并且沒(méi)有生理副作用。因而本發(fā)明的一個(gè)方面提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體向其提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物，和向所述個(gè)體提供mIGF-1源，優(yōu)選mIGF-1本身，能增加mIGF-1表達(dá)和/或活性的化合物。如之前所述，例如通過(guò)增強(qiáng)mIGF-1基因的表達(dá)和/或通過(guò)給予mIGF-1蛋白和/或其功能等同物(特別是mIGF-lEa同種型[如27所述，人類(lèi)同系物IGF-I同種型4:SEQIDN0:2])來(lái)增加mIGF-1的量。也提供了mIGF-1或能增強(qiáng)mIGF-1表達(dá)或mIGF-1活性的化合物和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，該組合用作藥物，以及mIGF-1或能增強(qiáng)mIGF-1表達(dá)或mIGF-1活性的化合物和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用這種組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。在本發(fā)明的上下文中，可通過(guò)增加IGF-I基因的基因表達(dá)水平，通過(guò)增加相應(yīng)IGF-I蛋白的量和/或通過(guò)增加IGF-I蛋白的活性，實(shí)現(xiàn)mIGF-1的量或活性的增加。優(yōu)選WmIGF-I蛋白如本文之前所限定的。所述蛋白活性的增加在本文理解為，表示與未經(jīng)治療的個(gè)體中所述活性或穩(wěn)定狀態(tài)相比，在由所述蛋白顯露的生物活性或在所述蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)水平上的任何可檢測(cè)到的改變。優(yōu)選通過(guò)檢測(cè)肌肉肥大生物標(biāo)記GATA-2表達(dá)的增加來(lái)評(píng)估m(xù)IGF-1的量或活性的增加(如27所述的)。優(yōu)選使用經(jīng)典分子生物技術(shù)例如(實(shí)時(shí))PCR、陣列或Northern分析評(píng)估基因表達(dá)水平。通過(guò)定量蛋白的量，直接測(cè)定蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)水平。通過(guò)任何已知技術(shù)例如Western印跡或使用針對(duì)蛋白而產(chǎn)生的抗體的免疫分析，可定量蛋白的量。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可選地或與基因表達(dá)水平和/或相應(yīng)蛋白的定量組合，相應(yīng)蛋白的底物或已知與相應(yīng)蛋白的功能或活性相關(guān)的任何化合物的定量或使用特定試驗(yàn)對(duì)相應(yīng)蛋白的所述功能或活性的定量，可用于評(píng)估蛋白的活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平的變化。在本發(fā)明的方法中，所述蛋白的活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平可在蛋白本身的水平上改變，例如通過(guò)從外部來(lái)源向細(xì)胞提供蛋白。優(yōu)選地，所述基因表達(dá)水平的增加或上調(diào)表示使用陣列所述基因的表達(dá)水平增加至少5%。更優(yōu)選地，所述基因表達(dá)水平的增加表示增加至少10%，甚至更優(yōu)選至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白表達(dá)水平的增加表示使用western印跡和/或使用ELISA或適宜試驗(yàn)，所述蛋白表達(dá)水平增加至少5%。更優(yōu)選地，蛋白表達(dá)水平的增加表示增加至少10%，甚至更優(yōu)選至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更^^ο在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽活性的增加表示使用適宜試驗(yàn)多肽活性增加至少5%。更優(yōu)選地，多肽活性的增加表示增加至少10%，甚至更優(yōu)選至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少70%、至少90%、至少150%或更多。優(yōu)選通過(guò)比較個(gè)體治療前的相應(yīng)活性來(lái)評(píng)估增加。提供mIGFl源的優(yōu)選方式是，導(dǎo)入編碼mIGFl優(yōu)選mIGFlEa同種型(如27所述的，人類(lèi)同系物IGF-I同種型4:SEQIDNO:2)的轉(zhuǎn)基因，更優(yōu)選在如本文隨后所限定的AAV載體中。特別是在如27所述的小鼠肌肉組織中表達(dá)這種mIGFl源。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與抗氧化劑組合。氧化應(yīng)激是DMD發(fā)展的重要因素并促進(jìn)了慢性炎癥和纖維化29。在杜興氏癥男孩中，氧化應(yīng)激的最常見(jiàn)產(chǎn)物，即過(guò)氧化脂質(zhì)平均增加了35%。超氧化物岐化酶和過(guò)氧化氫酶的酶水平增加減少了造成這些效果的過(guò)量自由基。事實(shí)上，對(duì)膳食補(bǔ)充劑Pratom/im(LifeVantage)進(jìn)行了臨床檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可增加超氧化物歧化酶(達(dá)30%)和過(guò)氧化氫酶(達(dá)54%)的水平，其在29個(gè)健康人中確實(shí)明顯抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化3°。因而這種氧化應(yīng)激的有效管理保留了肌肉質(zhì)量并由此促進(jìn)了DMD治療的積極作用。艾迪苯醌(Idebenone)是另一種有效抗氧化劑，其具有源自天然輔酶QlO的化學(xué)結(jié)構(gòu)。它可保護(hù)線粒體，其中三磷酸腺苷即ATP通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生。在DMD中缺乏肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白在心臟中并且也可能在骨骼肌中消極地影響的這個(gè)過(guò)程。最近在美國(guó)和歐洲，將艾迪苯醌應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，證實(shí)了對(duì)Friedreich型共濟(jì)失調(diào)(Friedreich，sAtaxia)的神經(jīng)學(xué)方面的效果31。最近在比利時(shí)開(kāi)始了艾迪苯醌的IIa期雙盲安慰劑對(duì)照隨機(jī)臨床試驗(yàn)，包括21個(gè)8-16歲的杜興氏癥男孩。該研究的主要目的是測(cè)定艾迪苯醌對(duì)心臟肌肉功能的影響。另外，將進(jìn)行幾個(gè)不同的檢驗(yàn)，以檢測(cè)對(duì)患者肌肉強(qiáng)度的可能的功能性益處。若有效，則艾迪苯醌是用于本發(fā)明方法的優(yōu)選輔助化合物，以便增強(qiáng)DMD治療特別在心臟中的治療效果。因而本發(fā)明的一個(gè)方面提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體抗氧劑和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用作藥物的抗氧化劑和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，以及抗氧化劑和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。根據(jù)抗氧化劑的特性，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其優(yōu)選的使用量?？寡趸瘎┛砂亳R齒莧皂素(bacoside)、水飛薊素、姜黃素、多酚，優(yōu)選表沒(méi)食子酸兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯(EGCG)。優(yōu)選地，抗氧化劑是作為膳食補(bǔ)充劑(LifeVantage)的抗氧化劑的混合物。675mg的Pratonc^Vw日膠囊包括150mg的假馬齒莧(B.monniera)(45%假馬齒莧皂素)，225mg的水飛薊(S.marianum)(70-80%水飛薊素)，150mg的印度人參(W.somnifera)粉末，75mg的綠茶(98%多酚，其中45%的EGCG)和75mg的姜黃根素(95%的姜黃素)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與離子通道抑制劑組合。DMD中受損肌肉膜的存在攪亂了鈣離子進(jìn)入肌纖維的通道，由此破壞的鈣平衡激活了許多酶，例如蛋白酶，其引起其他損傷和肌肉壞死。直接促成鈣在營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中病理積累的離子通道是治療DMD的輔助化合物的潛在目標(biāo)。有證據(jù)顯示，一些藥物例如己酮可可堿阻斷運(yùn)動(dòng)靈敏性鈣通道32，且阻斷牽張激活通道的抗生素可減少mdx小鼠中的肌纖維壞死和DMD男孩中的CK水平33。因而一個(gè)實(shí)施方案提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體離子通道抑制劑與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用作藥物的離子通道抑制劑與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，以及離子通道抑制劑和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。優(yōu)選地，使用黃嘌呤類(lèi)的離子通道抑制劑。更優(yōu)選地，所述黃嘌呤是甲基黃嘌呤的衍生物，最優(yōu)選地，所述甲基黃嘌呤衍生物選自己酮可可堿、呋拉茶堿、利索茶堿、丙戊茶堿、噴替茶堿、茶堿、托巴茶堿、阿比茶堿、恩丙茶堿和其衍生物。最優(yōu)選使用己酮可可堿。當(dāng)使用針對(duì)外顯子或針對(duì)所述外顯子的一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)，黃嘌呤類(lèi)的離子通道抑制劑增強(qiáng)了來(lái)自包括所述外顯子的前mRNA的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子的跳躍頻率。跳躍頻率的增強(qiáng)也增加了DMD或BMD個(gè)體肌細(xì)胞所產(chǎn)生的功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的水平。根據(jù)離子通道抑制劑的特性，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其優(yōu)選的使用量。己酮可可堿的適宜劑量在大約lmg/kg/天至大約100mg/kg/天之間，優(yōu)選劑量是在大約10mg/kg/天至大約50mg/kg/天之間。人的一般使用劑量是20mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給予個(gè)體向其提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物之前，給予所述個(gè)體離子通道抑制劑。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選在給予向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物之前至少一天、更優(yōu)選至少一周、更優(yōu)選至少兩周、更優(yōu)選至少三周，給予所述離子通道抑制劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與蛋白酶抑制劑組合。鈣蛋白酶是鈣激活的蛋白酶，其在營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中增加并引起肌纖維變性。因此可應(yīng)用鈣蛋白酶抑制劑，例如鈣蛋白酶抑制蛋白、亮抑蛋白酶肽34、總鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin)、鈣蛋白酶抑制劑III或PD150606，減少變性過(guò)程。具有鈣蛋白酶抑制劑和抗氧化劑雙重作用的新化合物，BN82270(Ipsen)增加了肌肉強(qiáng)度，減少了血清CK并減少了mdx橫膈膜的纖維化，這表明這種新化合物具有治療效果35。最近已提議將另一化合物亮抑蛋白酶肽/卡尼汀(Myodur)用于DMD患者的臨床試驗(yàn)。MG132是另一種蛋白酶體抑制劑，其顯示出減少肌肉膜損傷，并改善肌營(yíng)養(yǎng)不良的組織病理學(xué)病征35。MG-132(CBZ-亮氨酰-亮氨酰-leucinal)是細(xì)胞滲透性，蛋白酶體抑制劑(Ki=4nM)，其通過(guò)防止IkappaB降解來(lái)抑制NFkappaB激活(IC50=3μM)。此夕卜，它是肽醛，通過(guò)與20S和26S蛋白酶體結(jié)合并使其失活來(lái)抑制遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白水解。MG-132顯示出在mdx小鼠模型中抑制肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白的蛋白酶體降解36。因而這種化合物也適宜用作DMD的輔助藥理化合物。因此還提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體蛋白酶抑制劑和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用作藥物的蛋白酶抑制劑與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，以及蛋白酶抑制劑和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。根據(jù)蛋白酶抑制劑的特性，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其優(yōu)選的使用量。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與L-精氨酸組合。肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷與纖維膜上DGC-復(fù)合物的喪失相關(guān)，包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)。在mdx小鼠中nNOS轉(zhuǎn)基因的表達(dá)大幅減少了肌肉膜的損傷。同樣，給予L-精氨酸(一氧化氮合酶的底物)增加了NO產(chǎn)生并在mdx小鼠中上調(diào)utrophin的表達(dá)。六周的L-精氨酸治療改善了mdx小鼠的肌肉病理并減少了血清CK37。使用以L-精氨酸作為輔助治療與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合尚未公開(kāi)過(guò)。因此還提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體L-精氨酸和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了L-精氨酸與向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，作為藥物，以及L-精氨酸和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦組合，氯沙坦可使肌肉結(jié)構(gòu)正?；托迯?fù)功能，如在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷的mdx小鼠模型中所示23。因而本發(fā)明的一個(gè)方面提供緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦與向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，該組合用作藥物，以及血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。根據(jù)血管緊張素II型I受體阻斷劑的特性，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其優(yōu)選的使用量。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑，優(yōu)選培哚普利組合。ACE抑制劑能降低血壓。以培哚普利盡早開(kāi)始治療與更低的DMD患者死亡率相關(guān)22。因而本發(fā)明的一個(gè)方面提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體ACE抑制劑優(yōu)選培哚普利和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了ACE抑制劑優(yōu)選培哚普利與向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，該組合用作藥物，以及ACE抑制劑優(yōu)選培哚普利和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。ACE抑制劑優(yōu)選培哚普利的通常劑量是大約2-4mg/天22。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將ACE抑制劑與至少一種前述確定的輔助化合物組合。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物與能增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體組裝和/或剪接的化合物組合。已經(jīng)證明小化學(xué)化合物，例如特異性吲哚衍生物，選擇性地抑制剪接體的組裝和剪接、例如通過(guò)干擾富含絲氨酸和精氨酸的蛋白與它們的同源剪接增強(qiáng)子(ISEs或ESEs)的結(jié)合和/或通過(guò)干擾剪接阻遏物與沉默子序列(ESSs或ISSs)的結(jié)合。因此這些化合物適宜用作增強(qiáng)外顯子跳躍的輔助化合物。因此還提供了緩解個(gè)體杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括給予所述個(gè)體用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體的組裝和/或剪接的化合物，和向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。也提供了用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體的組裝和/或剪接的化合物與向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物的組合，該組合用作藥物，以及用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體的組裝和/或剪接的化合物和向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物用于制備緩解DMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用所述組合，以緩解嚴(yán)重BMD的一個(gè)或多個(gè)癥狀，其中形成了功能不足的非常短的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。根據(jù)能增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體的組裝和/或剪接的化合物的特性，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其優(yōu)選的使用量。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體的組裝和/或剪接的化合物與ACE抑制劑和/或與前述確定的任何輔助化合物組合。也提供了藥物制劑，其包括向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物、任何上述輔助化合物，及藥物可接受載體、填充劑、防腐劑、佐劑、助溶劑、稀釋劑和/或賦形劑?？稍赗emington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥劑學(xué)的科學(xué)和實(shí)踐)，20thEdition.Baltimore,MD=LippincottWilliams&Wilkins，2000中查詢(xún)藥物可接受載體、填充劑、防腐劑、佐劑、助溶劑和/或賦形劑。因而本發(fā)明提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中所述輔助化合物包括類(lèi)固醇、ACE抑制劑(優(yōu)選培哚普利)、血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦、腫瘤壞死因子a6(TNFa)抑制劑、mIGF-1源優(yōu)選mIGF-1、用于增強(qiáng)mIGF-1表達(dá)的化合物、用于增強(qiáng)mIGF-1活性的化合物、抗氧化劑、離子通道抑制劑、蛋白酶抑制劑、L-精氨酸和/或用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體組裝和/或剪接的化合物。如本文之前所述，可通過(guò)多種方式向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，例如通過(guò)慶大霉素或PTC12416’17抑制終止密碼子，或通過(guò)腺伴隨病毒(AAV)-介導(dǎo)的功能性小或微肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的基因送遞18_2°。然而，向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物優(yōu)選包括寡核苷酸或其功能等同物，用于至少部分減少所述個(gè)體中異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生。異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA或異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白產(chǎn)生的減少優(yōu)選表示，異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA或異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白初始量的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更少仍可通過(guò)RTPCR(mRNA)或免疫熒光或western印跡分析(蛋白)檢測(cè)到。異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA或蛋白在本文中也稱(chēng)為非功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA或蛋白。非功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白優(yōu)選是不能與肌動(dòng)蛋白和/或DGC蛋白復(fù)合物的成員結(jié)合的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。非功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA通常不具有或不編碼具有完整的蛋白C末端的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。所述寡核苷酸優(yōu)選包括反義寡核糖核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用了外顯子跳躍技術(shù)。外顯子跳躍干擾真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的天然剪接過(guò)程。在高級(jí)真核生物中，在細(xì)胞DNA中的蛋白遺傳信息是由外顯子編碼的，所述外顯子通過(guò)內(nèi)含序列相互間隔開(kāi)。在一些情況下這些內(nèi)含子非常長(zhǎng)。真核生物的轉(zhuǎn)錄機(jī)制產(chǎn)生含有外顯子14和內(nèi)含子兩者的前mRNA，同時(shí)通常在產(chǎn)生前mRNA期間，剪接機(jī)制已通過(guò)將存在于前mRNA中的外顯子剪接在一起產(chǎn)生蛋白的實(shí)際編碼區(qū)。外顯子跳躍產(chǎn)生缺少至少一個(gè)跳躍外顯子的成熟mRNA。因此，當(dāng)所述外顯子編碼氨基酸時(shí)，外顯子跳躍會(huì)導(dǎo)致改變的產(chǎn)物的表達(dá)。目前外顯子跳躍技術(shù)涉及反義寡核苷酸(AONs)的使用。在杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的mdx小鼠模型中已經(jīng)進(jìn)行了大量這種操作。在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子23中攜帶無(wú)義突變的mdx小鼠已用作DMD的動(dòng)物模型。盡管應(yīng)該阻止功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白合成的mdx突變罕見(jiàn)，但在mdx肌肉組織中已觀察到天然存在的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性纖維。這些肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性纖維被認(rèn)為由于體細(xì)胞突變或通過(guò)可選的剪接而起源于明顯天然存在的外顯子跳躍機(jī)制。已經(jīng)證明，分別針對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的內(nèi)含子22和23的3’和/或5’剪接位點(diǎn)的AONs干擾通常參與內(nèi)含子23移除的因子，從而也從mRNA中移除外顯子233，5，6，39，40。通過(guò)特定外顯子的定向跳躍，將DMD表型轉(zhuǎn)化成更輕度的BMD表型。優(yōu)選通過(guò)靶向一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)或外顯子內(nèi)部序列的AONs的結(jié)合，誘導(dǎo)外顯子跳躍。針對(duì)外顯子內(nèi)部序列的寡核苷酸通常表現(xiàn)為與非外顯子序列無(wú)重疊。優(yōu)選其不與剪接位點(diǎn)重疊，至少在這些剪接位點(diǎn)存在于內(nèi)含子中時(shí)不重疊。針對(duì)外顯子內(nèi)部序列的寡核苷酸優(yōu)選不含有與鄰近內(nèi)含子互補(bǔ)的序列。因而還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物、用于抑制肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的外顯子包括于由所述前mRNA剪接產(chǎn)生的mRNA內(nèi)。優(yōu)選應(yīng)用外顯子跳躍技術(shù)以便由肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA產(chǎn)生的mRNA的外顯子的缺乏產(chǎn)生生功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白-雖然更短_的編碼區(qū)。在本文中，抑制外顯子內(nèi)含優(yōu)選表示為通過(guò)RTPCR評(píng)估，原始、異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA的檢測(cè)減少至少大約10%，或通過(guò)免疫熒光或western印跡分析評(píng)估，減少至少大約10%。優(yōu)選減少至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。一旦向DMD患者提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，DMD的病因便消失。因此，預(yù)期DMD的癥狀足以獲得緩解。然而，如之前所述的，本發(fā)明提供的觀點(diǎn)是，盡管外顯子跳躍技術(shù)能提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，但仍然還通過(guò)給予DMD患者減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物來(lái)進(jìn)一步緩解DMD癥狀。而且，本發(fā)明提供的觀點(diǎn)是，對(duì)抗炎癥的輔助治療對(duì)AON治療沒(méi)有消極影響。本發(fā)明還提供了這樣的觀點(diǎn)，即當(dāng)使用針對(duì)外顯子或針對(duì)所述外顯子的一個(gè)或兩個(gè)剪接位點(diǎn)的寡核苷酸時(shí)，增強(qiáng)了來(lái)自包括所述外顯子的前mRNA的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子的跳躍頻率。跳躍頻率的增強(qiáng)也增加了DMD或BMD個(gè)體肌細(xì)胞所產(chǎn)生的功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的水平。因?yàn)樵趦蓚€(gè)剪接位點(diǎn)都被剪接體復(fù)合物識(shí)別時(shí)，只有肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的外顯子被內(nèi)含在所得的mRNA中，因此剪接位點(diǎn)是AONs的明顯靶點(diǎn)。因此一個(gè)實(shí)施方案提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的非外顯子區(qū)互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用僅與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的非外顯子區(qū)互補(bǔ)的Α0Ν。然而這不是必需的也可以使用包括內(nèi)含子特異性序列以及外顯子特異性序列的Α0Ν。這種AON包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的非外顯子區(qū)互補(bǔ)的序列，以及與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的外顯子區(qū)互補(bǔ)的序列。當(dāng)然，AON不需要與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子或內(nèi)含子的整個(gè)序列互補(bǔ)。優(yōu)選與這些外顯子或內(nèi)含子的一部分互補(bǔ)的AONs。AON優(yōu)選與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子和/或內(nèi)含子的至少一部分互補(bǔ)，所述部分具有至少13個(gè)核苷酸。經(jīng)過(guò)兩個(gè)連續(xù)的酯交換反應(yīng)發(fā)生肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的剪接。首先，在剪接體組裝期間限定的內(nèi)含子中特定分支點(diǎn)核苷酸的2'OH對(duì)5’剪接位點(diǎn)上的內(nèi)含子的第一個(gè)核苷酸進(jìn)行親核攻擊，形成套索中間體。其次，釋放的5’外顯子的3’OH對(duì)3’剪接位點(diǎn)上的內(nèi)含子的最后一個(gè)核苷酸進(jìn)行親核攻擊，從而連接外顯子并釋放內(nèi)含子套索。因而內(nèi)含子的分支點(diǎn)和剪接位點(diǎn)都參與了剪接過(guò)程。因此，包括與此類(lèi)分支點(diǎn)和/或剪接位點(diǎn)互補(bǔ)的序列的寡核苷酸，可優(yōu)選用于外顯子跳躍。因此還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的剪接位點(diǎn)和/或分支點(diǎn)互補(bǔ)的序列。因?yàn)榧艚游稽c(diǎn)含有共有序列，使用包括序列的寡核苷酸或其功能等同物(本文也稱(chēng)為Α0Ν)涉及混亂雜交的風(fēng)險(xiǎn)，所述序列與剪接位點(diǎn)互補(bǔ)。AONs與除待跳躍的外顯子位點(diǎn)之外的其他剪接位點(diǎn)雜交，容易干擾剪接過(guò)程的準(zhǔn)確性。為克服使用與內(nèi)含子序列互補(bǔ)的AONs相關(guān)的這些問(wèn)題和其他潛在問(wèn)題，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子互補(bǔ)的序列。優(yōu)選地，所述AON能特異性地抑制在所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA中的至少一個(gè)外顯子的外顯子內(nèi)含信號(hào)。干擾外顯子內(nèi)含信號(hào)(exoninclusionsignal,EIS)的優(yōu)勢(shì)在于，這種元件位于外顯子內(nèi)。通過(guò)為待跳躍外顯子內(nèi)部的提供Α0Ν，干擾外顯子內(nèi)含信號(hào)從而有效地掩蔽來(lái)自剪接裝置的外顯子是可能的。剪接裝置不能識(shí)別待跳躍的外顯子從而導(dǎo)致外顯子排除在終mRNA之外。該實(shí)施方案不直接干擾剪接機(jī)制的酶促過(guò)程(外顯子的連接)。認(rèn)為這可使該方法更具特異性和/或更可靠。認(rèn)為EIS是外顯子的特定結(jié)構(gòu)，其可使剪接受體和供體呈現(xiàn)特定空間構(gòu)象。在這個(gè)概念中，是特定空間構(gòu)象能使剪接機(jī)制識(shí)別外顯子。然而，當(dāng)然，本發(fā)明并不限于這個(gè)模式。已發(fā)現(xiàn)能與外顯子結(jié)合的試劑能夠抑制EIS。AON可在任何位點(diǎn)特異性地接觸所述外顯子，并仍能夠特異性地抑制所述EIS。采用對(duì)外顯子46序列具有特異性的外顯子內(nèi)部AONs，我們以前就能在來(lái)自缺失外顯子45的兩個(gè)不同的DMD患者的培養(yǎng)的肌管中調(diào)節(jié)剪接模式“。AON治療后，外顯子46跳躍了，其在至少75%的細(xì)胞中恢復(fù)了讀框并誘導(dǎo)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的合成。最近我們發(fā)現(xiàn)，采用外顯子內(nèi)部AONs，也可在人類(lèi)對(duì)照和具有不同突變包括缺失、復(fù)制和點(diǎn)突變的多個(gè)患者中針對(duì)39個(gè)不同DMD外顯子有效地誘導(dǎo)外顯子跳躍u’11—15。在本發(fā)明的上下文中，寡核苷酸的功能等同物優(yōu)選表示如本文所限定的寡核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸被取代，且所述功能等同物至少在某種程度上保留了活性。優(yōu)選地，所述功能等同物的活性提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。因此優(yōu)選通過(guò)定量功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的量來(lái)評(píng)估所述功能等同物的所述活性。本文優(yōu)選將功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白定義為能夠與肌動(dòng)蛋白和DGC蛋白復(fù)合物的成員結(jié)合的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。優(yōu)選通過(guò)RT-PCR或通過(guò)免疫熒光或Western印跡分析進(jìn)行寡核苷酸所述活性的評(píng)估。當(dāng)所述活性表示衍生出功能等同物的所述寡核苷酸的相應(yīng)活性的至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%或更高時(shí)，優(yōu)選在至少某種程度上保留所述活性。在本申請(qǐng)中，當(dāng)使用寡核苷酸這個(gè)詞時(shí)，其可被本文所限定的功能等同物替換。因此，包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子互補(bǔ)序列或由其組成的寡核苷酸或其功能等同物的使用，提供了良好的抗DMD結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子2、8、9、17、19、29、40-46,48-53,55或59的至少一部分互補(bǔ)的序列或由其組成，所述部分具有至少13個(gè)核苷酸。然而，所述部分也可具有至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，使用Α0Ν，其包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子51、44、45、53、46、43、2、8、50和/或52的至少一部分互補(bǔ)的序列或由其組成，所述一部分具有至少13個(gè)核苷酸。然而，所述一部分也可具有至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)核苷酸。最優(yōu)選的寡核苷酸可通過(guò)以下序列SEQIDNO:3_SEQIDNO:284的任一個(gè)來(lái)鑒別。因此，本文所用的最優(yōu)選的寡核苷酸由來(lái)自SEQIDNO:3-SEQIDNO284的序列表示。本文所用的最優(yōu)選的寡核苷酸選自SEQIDNO:3-SEQIDNO284。所述外顯子按患者群體適用性降序排列。因此，相對(duì)于包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子44以及其他互補(bǔ)的序列的Α0Ν，包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子51互補(bǔ)的序列的AON的用途，適宜用于DMD患者群體的更大部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的本發(fā)明的寡核苷酸，是這樣的互補(bǔ)部分，其是本發(fā)明寡核苷酸長(zhǎng)度的至少50%，更優(yōu)選至少60%，甚至更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%或甚至更優(yōu)選至少95%，或甚至更優(yōu)選至少98%或更長(zhǎng)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明寡核苷酸由與本文所限定的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的一部分互補(bǔ)的序列組成。例如，寡核苷酸可包括與本文所限定的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的一部分互補(bǔ)的序列和其他側(cè)翼序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的所述互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度是至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，其他側(cè)翼序列用于修飾蛋白與寡核苷酸的結(jié)合，或修飾寡核苷酸的熱力學(xué)特性，更優(yōu)選地修飾靶RNA結(jié)合親和力。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括-與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子的區(qū)域互補(bǔ)的序列，該區(qū)域可與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子的其他部分雜交(封閉結(jié)構(gòu))，以及_與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子的區(qū)域互補(bǔ)的序列，該區(qū)域不與所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA雜交(開(kāi)放結(jié)構(gòu))。對(duì)于該實(shí)施方案，可參照我們的專(zhuān)利申請(qǐng)W02004/083432。RNA分子顯示出牢固的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要是由于相同RNA內(nèi)部互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的一段序列的堿基配對(duì)。早就認(rèn)為RNA的結(jié)構(gòu)對(duì)RNA的功能發(fā)揮作用。在不受理論的限制的情況下，認(rèn)為外顯子RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在構(gòu)建剪接過(guò)程中發(fā)揮作用。通過(guò)它的結(jié)構(gòu)，外顯子被識(shí)別作為需要內(nèi)含于mRNA中的一部分。因此這種信號(hào)功能被稱(chēng)為外顯子內(nèi)含信號(hào)。該實(shí)施方案的互補(bǔ)寡核苷酸能干擾外顯子的結(jié)構(gòu)，從而能干擾外顯子的外顯子內(nèi)含信號(hào)。已發(fā)現(xiàn)許多互補(bǔ)寡核苷酸的確包括這種能力，有些比其他的更有效。該優(yōu)選實(shí)施方案的寡核苷酸，即具有針對(duì)天然外顯子RNA中開(kāi)放和封閉結(jié)構(gòu)的所述重疊的寡核苷酸，是從所有可能的寡核苷酸選擇的。選擇包括可有效干擾外顯子內(nèi)含信號(hào)的寡核苷酸。在不受理論的限制的情況下，據(jù)認(rèn)為，與開(kāi)放結(jié)構(gòu)的重疊可改善寡核苷酸的入侵效率(即增加寡核苷酸進(jìn)入結(jié)構(gòu)的效率)，而與封閉結(jié)構(gòu)的重疊隨后增加干擾外顯子RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的效率，從而干擾外顯子內(nèi)含信號(hào)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，與封閉和開(kāi)放結(jié)構(gòu)兩者的部分互補(bǔ)性的長(zhǎng)度是不受極端限制的。我們觀察到在任一結(jié)構(gòu)中具有可變長(zhǎng)度的互補(bǔ)性的寡核苷酸具有高效率。本文所用的術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)性是指在生理?xiàng)l件下可與另一段核苷酸互補(bǔ)的一段核苷酸。因而不會(huì)絕對(duì)要求互補(bǔ)性區(qū)域中的所有堿基都能與相反鏈上的堿基配對(duì)。例如，在設(shè)計(jì)寡核苷酸時(shí)，可能想并入例如不能與互補(bǔ)鏈上的堿基進(jìn)行堿基配對(duì)的殘基。如果在細(xì)胞環(huán)境中，一段核苷酸能與互補(bǔ)部分雜交，則可以允許某種程度的錯(cuò)配。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，互補(bǔ)部分(或與所述開(kāi)放或與所述封閉結(jié)構(gòu)互補(bǔ))包括至少3個(gè)、更優(yōu)選至少4個(gè)連續(xù)核苷酸?；パa(bǔ)區(qū)域優(yōu)選設(shè)計(jì)成在組合時(shí)它們對(duì)前mRNA中的外顯子是特異性的。這種特異性可由不同長(zhǎng)度的互補(bǔ)區(qū)域產(chǎn)生，因?yàn)檫@取決于體系中其他(前)mRNA的實(shí)際序列。通過(guò)增加寡核苷酸的大小可減少寡核苷酸也能與一個(gè)或多個(gè)其他前mRNA雜交的風(fēng)險(xiǎn)。顯然在互補(bǔ)區(qū)域包括錯(cuò)配但保留可與前mRNA中靶向區(qū)域雜交的能力的寡核苷酸可用于本發(fā)明。然而，優(yōu)選至少互補(bǔ)部分不包括這種錯(cuò)配，因?yàn)樗鼈兺ǔ１仍谝粋€(gè)或多個(gè)互補(bǔ)區(qū)域中具有這種錯(cuò)配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特異性。據(jù)認(rèn)為，更高的雜交強(qiáng)度(即增加與相反鏈相互作用的數(shù)量)有利于增加體系的干擾剪接機(jī)制的過(guò)程的效率。優(yōu)選地，互補(bǔ)性介于90-100%之間。這通常在約20個(gè)核苷酸的寡核苷酸中允許大約1或2個(gè)錯(cuò)配。在外顯子所在的前mRNA中，二級(jí)結(jié)構(gòu)是最好分析的?？稍趯?shí)際RNA中分析這種結(jié)構(gòu)。然而，目前采用結(jié)構(gòu)建模程序可以非常準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)RNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)(以最低能量成本)。適宜程序的非限制性示例是RNAmfoldversion3.Iserver410本領(lǐng)域技術(shù)人員在給予核苷酸序列后能夠以適宜的重現(xiàn)性預(yù)測(cè)可能的外顯子結(jié)構(gòu)。在向這種建模程序提供外顯子和側(cè)翼內(nèi)含子序列時(shí)，可獲得最佳預(yù)測(cè)。通常不需要對(duì)整個(gè)前mRNA結(jié)構(gòu)的建模。優(yōu)選寡核苷酸所涉及的開(kāi)放和封閉結(jié)構(gòu)相互鄰近。據(jù)認(rèn)為，以這種方式，寡核苷酸與開(kāi)放結(jié)構(gòu)的退火可誘導(dǎo)封閉結(jié)構(gòu)的開(kāi)放，借此退火發(fā)展至該封閉結(jié)構(gòu)中。通過(guò)這種作用，之前封閉的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的構(gòu)象。不同構(gòu)象造成外顯子內(nèi)含信號(hào)的破壞。然而，當(dāng)靶向外顯子內(nèi)存在潛在(隱含)的剪接受體和/或供體序列時(shí)，偶爾會(huì)產(chǎn)生新的外顯子內(nèi)含信號(hào)，從而限定具有不同5’端、不同3’端或兩者的不同(新)外顯子。這種類(lèi)型的活性落入本發(fā)明范圍內(nèi)，因?yàn)榘邢蛲怙@子被排除在mRNA之外。在mRNA中存在含有部分靶向外顯子的新外顯子，不會(huì)改變靶點(diǎn)外顯子被排除的事實(shí)。新外顯子的內(nèi)含可以看作僅偶爾發(fā)生的副作用。在使用外顯子跳躍來(lái)恢復(fù)由于突變而破壞的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的可讀框時(shí)，存在兩種可能。一種可能是新外顯子具有恢復(fù)讀框的功能，而另一種情況是未恢復(fù)讀框。當(dāng)通過(guò)外顯子跳躍方式為恢復(fù)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白讀框選擇寡核苷酸時(shí)，當(dāng)然很明顯的是，在這種條件下僅會(huì)選擇確實(shí)引起外顯子跳躍的寡核苷酸，所述外顯子跳躍在具有或不具有新外顯子的情況下恢復(fù)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白可讀框。還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子的RNA中的絲氨酸-精氨酸(SR)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。在我們的專(zhuān)利申請(qǐng)W02006/112705中，我們公開(kāi)了在外顯子內(nèi)部反義寡核苷酸(AON)誘導(dǎo)外顯子跳躍的效率與所述AON的靶前mRNA位點(diǎn)中存在所預(yù)測(cè)的SR結(jié)合位點(diǎn)(例如通過(guò)ESE探測(cè)器)之間存在相關(guān)性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生了寡核苷酸，所述實(shí)施方案包括測(cè)定肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子RNA中SR(Ser-Arg)蛋白的(假定)結(jié)合位點(diǎn)，并產(chǎn)生與所述RNA互補(bǔ)且與所述(假定)結(jié)合位點(diǎn)至少部分重疊的寡核苷酸。在本文中術(shù)語(yǔ)“至少部分重疊”定義成包括SR結(jié)合位點(diǎn)的僅單個(gè)核苷酸以及所述結(jié)合位點(diǎn)的多個(gè)核苷酸的重疊，以及所述結(jié)合位點(diǎn)的完全重疊。該實(shí)施方案優(yōu)選還包括由所述RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)確定與所述RNA另一部分雜交的區(qū)域(封閉結(jié)構(gòu))和在所述結(jié)構(gòu)中不雜交的區(qū)域(開(kāi)放結(jié)構(gòu))，并隨后生成與所述(假定)結(jié)合位點(diǎn)至少部分重疊、與所述封閉結(jié)構(gòu)的至少一部分重疊且與所述開(kāi)放結(jié)構(gòu)的至少一部分重疊的寡核苷酸。在這種方式中，我們?cè)黾恿双@得能干擾外顯子從前mRNA內(nèi)含于mRNA中的寡核苷酸的機(jī)會(huì)。可能的是，首先選擇的SR結(jié)合區(qū)域不具有所要求的開(kāi)放_(tái)封閉結(jié)構(gòu)，在這種情況下選擇另一(第二)SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)，然后將其用于檢驗(yàn)開(kāi)放-封閉結(jié)構(gòu)的存在。持續(xù)這個(gè)過(guò)程，直到含有SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及(部分重疊的)開(kāi)放_(tái)封閉結(jié)構(gòu)的序列得到鑒定。然后用該序列設(shè)計(jì)與所述序列互補(bǔ)的寡核苷酸。也可通過(guò)反轉(zhuǎn)所述順序來(lái)實(shí)施產(chǎn)生寡核苷酸的這種方法，即首先產(chǎn)生寡核苷酸，包括由肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)確定呈現(xiàn)與所述RNA另一部分雜交的結(jié)構(gòu)的區(qū)域(封閉結(jié)構(gòu))和在所述結(jié)構(gòu)中不雜交的區(qū)域(開(kāi)放結(jié)構(gòu))，并隨后生成寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分與所述封閉結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，且其中所述寡核苷酸的至少另一部分與所述開(kāi)放結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。接下來(lái)確定SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)是否與所述開(kāi)放/封閉結(jié)構(gòu)至少重疊。以這種方式中改善了W02004/083432的方法。仍然在另一實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行選擇。在不期望受任何理論限制的情況下，目前認(rèn)為使用針對(duì)SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸(至少部分)影響SR蛋白與SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，這造成剪接受到破壞或削弱。優(yōu)選地，開(kāi)放/封閉結(jié)構(gòu)和SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)部分重疊，甚至更優(yōu)選開(kāi)放/封閉結(jié)構(gòu)與SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)完全重疊，或SR蛋白結(jié)合位點(diǎn)與開(kāi)放/封閉結(jié)構(gòu)完全重疊。這允許改善對(duì)外顯子內(nèi)含的破壞。除共有剪接位點(diǎn)序列之外，許多(如果并非所有)外顯子含有剪接調(diào)節(jié)序列例如外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)序列以有利于剪接體識(shí)別真正的剪接位點(diǎn)42’43。稱(chēng)為SR蛋白的剪接因子亞群可與這些ESEs結(jié)合并將其他剪接因子例如Ul和U2AF募集至(弱限定的)剪接位點(diǎn)。已經(jīng)詳細(xì)分析了四種最豐富的SR蛋白(SF2/ASF、SC35、SRp40和SRp55)的結(jié)合位點(diǎn)，且在ESE探測(cè)器中執(zhí)行這些結(jié)果，ESE探測(cè)器是可預(yù)測(cè)這些SR蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)的網(wǎng)路源42’43。在AON的效力與SF2/ASF、SC35和SRp40結(jié)合位點(diǎn)的存在/缺乏之間存在相關(guān)性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中所述SR蛋白是SF2/ASF或SC35或SRp40。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用能特異性地結(jié)合調(diào)節(jié)RNA序列的寡核苷酸或其功能等同物向DMD患者提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，所述調(diào)節(jié)RNA序列是在轉(zhuǎn)錄物中正確剪接肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子所必需的。幾個(gè)順式作用RNA序列也是在轉(zhuǎn)錄物中正確剪接外顯子所必需的。尤其是，附加元件例如內(nèi)含子或外顯子的剪接增強(qiáng)子(ISEs和ESEs)或沉默子(ISSs和ESEs)是經(jīng)鑒定，特異并有效地調(diào)節(jié)組成型外顯子和可選型外顯子的剪接。使用與該元件結(jié)合的序列特異性反義寡核苷酸(AONs)，其調(diào)節(jié)功能受到破壞，從而使外顯子跳躍，如DMD所示的。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用與內(nèi)含子的剪接增強(qiáng)子(ISE)、外顯子的剪接增強(qiáng)子(ESE)、內(nèi)含子的剪接沉默子(ISS)和/或外顯子的剪接沉默子(ESS)互補(bǔ)的寡核苷酸或其功能等同物。如本文之前所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中通過(guò)能特異性抑制所述外顯子的外顯子內(nèi)含信號(hào)的試劑，使肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子跳躍，以使所述外顯子不能被剪接機(jī)制識(shí)別為需要內(nèi)含于mRNA中的一部分。結(jié)果，形成無(wú)所述外顯子的mRNA。本發(fā)明方法所用的AON優(yōu)選與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子RNA或肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白內(nèi)含子RNA的13-50個(gè)核苷酸之間的連續(xù)部分互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的AON與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子RNA或肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白內(nèi)含子RNA的16-50個(gè)核苷酸之間的連續(xù)部分互補(bǔ)。優(yōu)選地，所述AON優(yōu)選與所述外顯子RNA的15-25個(gè)核苷酸之間的連續(xù)部分互補(bǔ)。更優(yōu)選地，使用包括這樣的序列的Α0Ν，該序列與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子RNA或肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白內(nèi)含子RNA的20-25個(gè)核苷酸之間的連續(xù)部分互補(bǔ)?？墒褂貌煌?lèi)型的核酸來(lái)產(chǎn)生寡核苷酸。優(yōu)選地，所述寡核苷酸包括RNA，因?yàn)镽NA/RNA雜交體(hybrid)非常穩(wěn)定。因?yàn)橥怙@子跳躍技術(shù)的目的之一是，針對(duì)受試者中的剪接，因此，優(yōu)選寡核苷酸RNA包括為RNA提供其他特性的修飾，例如內(nèi)切核酸酶和RNaseH抗性，其他雜交強(qiáng)度，穩(wěn)定性增加(例如在體液中)，靈活性增加或減少，毒性減少，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸增加，組織特異性等。優(yōu)選地所述修飾包括2’-0-甲基-硫代磷酸寡核糖核苷酸修飾。優(yōu)選地所述修飾包括2’-0-甲基-硫代磷酸寡脫氧核苷酸修飾。因而一個(gè)實(shí)施方案提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中使用包括RNA的寡核苷酸，該RNA含有修飾，優(yōu)選2’-0-甲基修飾的核糖(RNA)或脫氧核糖(DNA)修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括寡核苷酸和鎖核酸的雜交寡核苷酸，所述寡核苷酸包括2’-甲基-硫代磷酸寡(脫氧)核糖核苷酸修飾。這種具體組合與由鎖核酸組成的等同物相比，包括更好的序列特異性，且當(dāng)與由2’-甲基-硫代磷酸寡(脫氧)核糖核苷酸修飾組成的寡核苷酸相比，包括效率獲得改善。隨著核酸模擬技術(shù)的出現(xiàn)，可以生成具有與核酸本身在類(lèi)型上相似優(yōu)選相同而在數(shù)量上不一定的雜交特征的分子。這種功能等同物當(dāng)然也適宜用于本發(fā)明的方法中。寡核苷酸的功能等同物的優(yōu)選實(shí)例是肽核酸和/或鎖核酸。最優(yōu)選地，使用嗎啉代磷酸二酰胺(morpholinophosphorodiamidate)。本發(fā)明寡核苷酸等同物的適宜但非限制性實(shí)例可見(jiàn)于44-50中。當(dāng)然，一個(gè)或多個(gè)等同物相互之間和/或核酸之間的雜交體也是適宜的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用鎖核酸作為寡核苷酸的功能等同物，因?yàn)殒i核酸表現(xiàn)出更高的靶標(biāo)親和力和減少的毒性因此表現(xiàn)出更高的外顯子跳躍效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，將可以抑制肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子內(nèi)含于肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA中的寡核苷酸或其功能等同物，與至少一種可以抑制另一肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子內(nèi)含于肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白mRNA中的其他寡核苷酸或其功能等同物組合。以此方式，防止了肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的兩個(gè)或多個(gè)外顯子內(nèi)含于由該前mRNA產(chǎn)生的mRNA中。這個(gè)實(shí)施方案還稱(chēng)為雙或多外顯子跳躍2’15。在大部分情況中，雙外顯子跳躍可使僅兩個(gè)靶點(diǎn)外顯子排除在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA之外。然而，在其他情況中發(fā)現(xiàn)，所述前mRNA中的靶向外顯子和所述外顯子之間的整個(gè)區(qū)域不存在于所產(chǎn)生的mRNA中，甚至當(dāng)其他外顯子(干預(yù)外顯子)存在于所述區(qū)域時(shí)。對(duì)于源自DMD基因的寡核苷酸組合的多跳躍尤其如此，其中外顯子45的一寡核苷酸和外顯子51的一寡核苷酸被添加至轉(zhuǎn)錄DMD基因的細(xì)胞中。這種配置使產(chǎn)生的mRNA不含有外顯子45-51。顯然，在存在所述寡核苷酸的情況下，前mRNA結(jié)構(gòu)可刺激剪接機(jī)制，使外顯子44和52相互連接。因此還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中使用包括至少8個(gè)、優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，該連續(xù)核苷酸與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的第一外顯子互補(bǔ)，其中使用包括至少8個(gè)、優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，該連續(xù)核苷酸與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的第二外顯子互補(bǔ)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA中通過(guò)至少一個(gè)不與所述寡核苷酸互補(bǔ)的外顯子隔離所述第一和所述第二外顯子。通過(guò)提供兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸之間的連接，也可能特異性地促進(jìn)干預(yù)外顯子的跳躍。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)連接部分隔離與至少兩個(gè)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子互補(bǔ)的核苷酸段。因而在該實(shí)施方案中連接了至少兩段核苷酸以形成單個(gè)分子。因此還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中用于向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述寡核苷酸或其功能等同物，與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的至少兩個(gè)外顯子互補(bǔ)，所述寡核苷酸或其功能等同物包括至少兩個(gè)部分，其中第一部分包括具有至少8個(gè)優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，該連續(xù)核苷酸與所述至少兩個(gè)外顯子的第一個(gè)是互補(bǔ)，其中第二部分包括具有至少8個(gè)優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，該連續(xù)核苷酸與所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的第二外顯子互補(bǔ)。連接可通過(guò)任何方式但優(yōu)選通過(guò)核苷酸連接完成。在后種情況中，在一個(gè)或其他互補(bǔ)外顯子之間不含有重疊的核苷酸的數(shù)量可以是零，但優(yōu)選是4-40個(gè)核苷酸。連接部分可以是能夠連接寡核苷酸的任何類(lèi)型部分。優(yōu)選地，所述連接部分包括至少4個(gè)尿嘧啶核苷酸。目前，可獲得模擬寡核苷酸雜交特征的許多不同化合物。這種化合物本文稱(chēng)為寡核苷酸的功能等同物，如果該等同物包括在類(lèi)型上相似而數(shù)量上不一定相似的雜交特征其，則該等同物也適宜用于本發(fā)明。在說(shuō)明書(shū)之前提及了適宜的功能等同物。如所述，本發(fā)明的寡核苷酸不必由僅有利于與靶向外顯子雜交的寡核苷酸組成?？杉尤肫渌牧虾?或核苷酸。DMD基因是一個(gè)大基因，具有許多不同的外顯子?？紤]到該基因位于X染色體上，主要是男孩受到影響，盡管女孩也可受到該疾病的影響，因?yàn)樗齻兛赡芙邮諄?lái)自雙親的一個(gè)壞基因拷貝，或由于在她們的肌細(xì)胞中特別偏愛(ài)X染色體的失活而患有功能等位基因的特別偏愛(ài)失活。蛋白由超過(guò)至少2.6Mb的多個(gè)外顯子(79)編碼。缺陷可以發(fā)生在DMD基因的任何部分。特定單個(gè)外顯子或特定多個(gè)外顯子的跳躍常常形成編碼比正常更短的但具有至少部分功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的重建的mRNA。在開(kāi)發(fā)基于外顯子跳躍技術(shù)的藥物中的實(shí)際問(wèn)題是，可造成細(xì)胞中功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷的多個(gè)突變。盡管通過(guò)使單個(gè)外顯子跳躍可校正多個(gè)不同突變，但這種多個(gè)突變需要生成大量不同藥物，因?yàn)閷?duì)于不同的突變而言，需要跳躍不同的外顯子。能誘導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)外顯子跳躍的化合物的優(yōu)勢(shì)是，可以用單個(gè)藥物就使大于一個(gè)的外顯子跳躍。這個(gè)特性不僅在實(shí)踐中非常有用，因?yàn)閮H需要生成有限數(shù)量的藥物用于治療不同DMD或特別嚴(yán)重的BMD突變。現(xiàn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員可選的另一選擇是，選擇特定的功能性重建肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白并產(chǎn)生能生成這些優(yōu)選肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物。這種優(yōu)選的最終結(jié)果還稱(chēng)為輕度表型肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。本文定義用于本發(fā)明的每個(gè)化合物、寡核苷酸和/或輔助化合物都適宜直接給予患有DMD或BMD或具有患該病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體體內(nèi)的細(xì)胞、組織和/或器官，并可體內(nèi)、離體或體外直接給藥。可選地，現(xiàn)有技術(shù)中存在向細(xì)胞提供寡核苷酸或其等同物的適宜方式。例如寡核苷酸或其功能等同物可以以表達(dá)載體的形式提供給細(xì)胞，其中表達(dá)載體編碼包括所述寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選經(jīng)基因送遞媒介將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中。優(yōu)選的送遞媒介是病毒載體，例如腺伴隨病毒載體(AAV)，或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體例如慢病毒載體4’51’52，等等。質(zhì)粒、人工染色體、適宜人細(xì)胞基因組靶向同源重組和整合的質(zhì)粒，也可適宜應(yīng)用于送遞本文所限定的寡核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選的是這樣的載體，其中轉(zhuǎn)錄是由PolIII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，和/或轉(zhuǎn)錄子采用與Ul或U7轉(zhuǎn)錄子融合體的形式，其可產(chǎn)生送遞小轉(zhuǎn)錄物的良好結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)適宜轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選的是PolIII驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄物。優(yōu)選采用與Ul或U7轉(zhuǎn)錄物的融合轉(zhuǎn)錄物的形式4’51’52。如53，54所述，產(chǎn)生這種融合體。寡核苷酸可如是送遞。然而，寡核苷酸也可通過(guò)病毒載體編碼。通常是以RNA轉(zhuǎn)錄物的形式，其在部分轉(zhuǎn)錄物中包括寡核苷酸序列。鑒于迄今已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的進(jìn)展，預(yù)料對(duì)向細(xì)胞提供寡核苷酸或其等同物的方式進(jìn)行改善。當(dāng)然可并入這種未來(lái)改善，以采用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)對(duì)重建mRNA的所述效果。寡核苷酸或其等同物可照原來(lái)的樣子送遞至細(xì)胞。當(dāng)向個(gè)體給予寡核苷酸或其等同物，優(yōu)選將寡核苷酸溶解在與送遞方法相容的溶液中。對(duì)于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)和/或心室內(nèi)給藥，優(yōu)選的溶液是生理鹽水溶液。對(duì)于本發(fā)明的方法，特別優(yōu)選使用可輔助將本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起送遞至細(xì)胞和進(jìn)入細(xì)胞、優(yōu)選肌肉細(xì)胞的賦形劑。優(yōu)選賦形劑可以形成復(fù)合物、媒介和/或脂質(zhì)體，其能將本文所限定的這類(lèi)化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同復(fù)合或集結(jié)在媒介或脂質(zhì)體中的輔助化合物一起送遞通過(guò)細(xì)胞膜。許多這些賦形劑是本領(lǐng)域已知的。適宜賦形劑包括聚乙烯亞胺(PEI)，或類(lèi)似的陽(yáng)離子聚合物，包括聚丙烯亞胺或聚乙烯亞胺共聚物(PECs)和其衍生物，ExGen500，合成的兩親物(syntheticamphiphils，SAINT-18)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體TM(IipofectinTM)，DOTAP和/或病毒殼體蛋白，其能自我組裝成能將本文所限定的這類(lèi)化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起送遞至細(xì)胞優(yōu)選肌肉細(xì)胞的顆粒。已經(jīng)證明，這種賦形劑可將核酸(寡核苷酸例如反義)高效送遞至多種培養(yǎng)細(xì)胞，包括肌肉細(xì)胞。根據(jù)整體細(xì)胞存活，將它們高的轉(zhuǎn)染潛力與預(yù)期低至中度毒性相組合。結(jié)構(gòu)修飾的便利性可用于允許進(jìn)一步修飾和分析它們的其他(體內(nèi))核酸轉(zhuǎn)移特征和毒性。陽(yáng)離子脂質(zhì)體表示脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染介質(zhì)的實(shí)例。它由兩個(gè)脂質(zhì)成分組成，即陽(yáng)離子脂質(zhì)N-[1-(2，3二油酰氧基(dioleoyloxy))丙基]-N，N，N-三甲基銨氯(DOTMA)(cp.DOTAP其是甲基硫酸鹽)和中性脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性成分介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)釋放。另一組送遞體系是聚合的納米顆粒?？蓪⒆鳛楣腄NA轉(zhuǎn)染介質(zhì)而著稱(chēng)的聚陽(yáng)離子例如二乙胺乙基(DEAE)-葡聚糖與氰基丙烯酸丁酯(butylcyanoacrylate,PBCA)和氰基丙烯酸己酯(hexylcyanoacrylate,PHCA)組合，以配制陽(yáng)離子納米顆粒，所述陽(yáng)離子納米顆?？蓪⒈疚乃薅ǖ幕衔飪?yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起跨越細(xì)胞膜送遞通至細(xì)胞內(nèi)。除了這些常見(jiàn)的納米顆粒材料之外，陽(yáng)離子肽魚(yú)精蛋白提供了一種將本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起配制成膠體的可選途徑。這種膠體納米顆粒體系可形成所謂的顆粒(proticles)，其可通過(guò)簡(jiǎn)單的自我組裝過(guò)程制備，以包裝本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起，且介導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)釋放。技術(shù)人員可選擇并調(diào)整任何上述或其他商業(yè)可供選擇的賦形劑和送遞體系，以包裝并送遞本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起，供用于本發(fā)明以送遞所述化合物來(lái)治療人的杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良。此外，本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起，可共價(jià)或非共價(jià)連接于靶向配體，該配體經(jīng)特異性設(shè)計(jì)，促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞胞、細(xì)胞質(zhì)和/或其核內(nèi)的攝取。這類(lèi)配體可包括(i)識(shí)別促進(jìn)細(xì)胞攝取的細(xì)胞、組織或器官特異性元件的化合物(包括但不限于肽狀結(jié)構(gòu))和/或(ii)能促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的攝取和/或來(lái)自媒介例如內(nèi)體或溶酶體的本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起的細(xì)胞內(nèi)釋放的化學(xué)化合物。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起配制成藥物，該藥物提供有至少一種賦形劑和/或?qū)ぐ信潴w(targetingligand)和/或送遞裝置，用于將所述化合物送遞至細(xì)胞和/或增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)送遞。因此，本發(fā)明也包括藥物可接受組合物，其包括本文所限定的化合物優(yōu)選寡核苷酸和任選地連同輔助化合物一起，還包括至少一種賦形劑和/或?qū)ぐ信潴w和/或送遞裝置，用于將所述化合物送遞至細(xì)胞和/或增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)送遞。應(yīng)該理解的是寡核苷酸和輔助化合物可以不配制在單個(gè)組合物或制劑中。根據(jù)它們的特性，技術(shù)人員可知道哪種類(lèi)型的配制最適宜于每種化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了成套試劑盒，其包括向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物，和減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所限定的寡核苷酸的使用濃度為大約0.InM至大約1DM0更優(yōu)選地，所用的濃度為大約0.3nM至大約400nM，甚至更優(yōu)選大約InM至大約200nM。如果使用幾個(gè)寡核苷酸，該濃度是指寡核苷酸的總濃度或所加每種寡核苷酸的濃度。以上所給出的寡核苷酸濃度范圍是體內(nèi)或離體使用的優(yōu)選濃度。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)所用的寡核苷酸、待治療的靶細(xì)胞、基因靶點(diǎn)及其表達(dá)水平、所用的介質(zhì)以及轉(zhuǎn)染和孵育條件，還可改變寡核苷酸的濃度，并需要進(jìn)一步優(yōu)化。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明以預(yù)防、治療DMD或BMD的化合物優(yōu)選寡核苷酸，和輔助化合物，是合成產(chǎn)生的并以在藥物可接受組合物或制劑中的配制形式直接給予細(xì)胞、組織、器官和/或患者。優(yōu)選通過(guò)一次或多次非腸道注射，例如靜脈內(nèi)和/或皮下和/或肌肉內(nèi)和/或鞘內(nèi)和/或心室內(nèi)給藥，優(yōu)選在人體一個(gè)或多個(gè)部位注射，將藥物組合物送遞至受試者。除外顯子跳躍之外，通過(guò)基于終止密碼子通讀的治療向DMD患者提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白，也是可能的。能抑制終止密碼子的化合物特別適宜用于受到造成肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因內(nèi)形成終止密碼子的無(wú)意義突變(7%)影響的DMD患者亞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述能抑制終止密碼子的化合物包括抗生素慶大霉素。在最近的mdx小鼠研究中，慶大霉素治療誘導(dǎo)新的高達(dá)正常水平的20%的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白表達(dá)，盡管在動(dòng)物間具有差異性。但慶大霉素的人體試驗(yàn)卻是不確定的55。PTC124屬于一類(lèi)新的小分子，其可在較低濃度下模擬慶大霉素的通讀活性。PTC124給藥可在體外或mdx小鼠中產(chǎn)生全長(zhǎng)且功能活性的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。PTC124的I/II期試驗(yàn)?zāi)壳斑€在繼續(xù)，不僅應(yīng)用于DMD還可用于囊性纖維化16’17。參考文獻(xiàn)16和17也描述了用于本發(fā)明的PTC124化合物的優(yōu)選劑量。因此，還提供了本發(fā)明所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括用于抑制終止密碼子的化合物。優(yōu)選用于抑制終止密碼子的所述化合物包括慶大霉素、PTC124或其功能等同物。最優(yōu)選地，所述化合物包括PTC124。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用包括微小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的載體，優(yōu)選病毒載體，向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。最優(yōu)選地，使用重組腺伴隨病毒(rAAV)載體。AVV是單鏈DNA細(xì)小病毒，其是非致病性的并顯示出依賴(lài)輔助子的生命周期。與其他病毒(腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和單純皰疹病毒)相反，rAAV載體已經(jīng)證明可高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)成熟的骨骼肌。rAAV受限的包裝限制(<5kb)，阻礙了其在典型DMD“基因添加”研究中的應(yīng)用。因此，優(yōu)選將rAAV應(yīng)用于高效送遞小得多的微或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因。給予這種微或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因，造成至少部分功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的存在?？蓞㈤單墨I(xiàn)18-20?？砂慈魏雾樞?qū)⒈景l(fā)明的向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物和至少一種輔助化合物給予個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)給予向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物和所述至少一種輔助化合物(表示在10小時(shí)之內(nèi)優(yōu)選1小時(shí)之內(nèi)給予所述化合物)。然而這并不是必需的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給予向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物之前，將至少一種輔助化合物給給予需要其的個(gè)體。因此根據(jù)本發(fā)明還提供了一種方法，其包括-將減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物給予需要其的個(gè)體，和/或?qū)⒏纳萍±w維功能、完整性和/或存活的輔助化合物給予所述個(gè)體，以及，之后-將向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的化合物給予所述個(gè)體。仍然在另一實(shí)施方案中，在給予所述至少一種輔助化合物之前，給予向個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物。還提供了用于至少部分增加細(xì)胞中功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白產(chǎn)生的方法，所述細(xì)胞包括編碼異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的前mRNA，該方法包括向所述細(xì)胞提供用于抑制外顯子內(nèi)含于由所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的剪接產(chǎn)生的mRNA中的化合物，以及向所述細(xì)胞提供用于減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或向所述細(xì)胞提供改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物，該方法還包括允許由所述前mRNA的剪接產(chǎn)生的mRNA翻譯。在一個(gè)實(shí)施方案中，在體外例如使用細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)施所述方法。在本文中，增加功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生已在上文開(kāi)始進(jìn)行了定義。除非另有說(shuō)明，本文所述的每個(gè)實(shí)施方案都可與本文所述另一實(shí)施方案組合。在本文和其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包括”及其變化形式以其非限制性意義使用，表示包括該詞后的項(xiàng)目，但不排除未特定提及的項(xiàng)目。此外動(dòng)詞“由......組成”可以被“基本上由......組成”替換，其表示本文所限定的化合物或輔助化合物可包括除特別確定的組分之外的其他成分，而所述其他成分并不改變本發(fā)明的獨(dú)特特征。此外，以不定冠詞“a”或“an”提及一個(gè)元素時(shí)并不排除存在多于一個(gè)元素的可能性，除非文中明確要求有且只有一個(gè)元素。因而不定冠詞“a”或“an”通常表示“至少一當(dāng)與數(shù)值聯(lián)合使用時(shí)，詞語(yǔ)“約”或“大約”(約10，大約10)優(yōu)選表示數(shù)值可以是給定值10及該數(shù)值偏差1%。本說(shuō)明書(shū)所引用的所有專(zhuān)利和參考文獻(xiàn)都由此通過(guò)引用全文并入。以下實(shí)施例將進(jìn)一步解釋本發(fā)明。這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍，僅用于闡述本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.外顯子跳躍的圖示在缺失外顯子50的杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中，產(chǎn)生了框外轉(zhuǎn)錄物(out-of-frametranscript)，其中外顯子49被剪接成外顯子51(A面)。結(jié)果，在外顯子51中產(chǎn)生了終止密碼子，其過(guò)早地終止了肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的合成。外顯子內(nèi)部反義寡核苷酸PR0051的序列特異性結(jié)合干擾了剪接過(guò)程中外顯子51的正確內(nèi)含，使得該外顯子實(shí)際上跳躍了(B面)。這恢復(fù)了轉(zhuǎn)錄去的可讀框并可合成類(lèi)似于患有貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的患者(BMD)的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。圖2.四例患者的預(yù)篩選研究四例患者小腿(3號(hào)患者的左腿和其余三個(gè)患者的右腿)的磁性共振圖顯示了脛前肌的適當(dāng)狀況(小于50%的脂肪浸潤(rùn)和纖維化)(A面)。這些患者中杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的診斷通過(guò)之前由四頭肌獲取的活檢標(biāo)本橫切片的二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽染色證實(shí)(B面)。未觀察到肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白表達(dá)，除了在2號(hào)患者中的一個(gè)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性或回復(fù)纖維(剪頭)。對(duì)位于患者的突變和外顯子51側(cè)翼的轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析，在RNA水平證實(shí)了非處理的肌管(NT)中的個(gè)體突變和在處理的肌管(T)中的對(duì)PR0051(即外顯子51跳躍)的陽(yáng)性反應(yīng)(C面)。1號(hào)患者外顯子的跳躍效率是49%，2號(hào)患者的是84%，3號(hào)患者的是58%，而4號(hào)患者的是90%。在細(xì)胞培養(yǎng)物中通過(guò)PR0051有時(shí)可激活外顯子51內(nèi)隱含的剪接位點(diǎn)，形成額外的異常剪接產(chǎn)物，如在4號(hào)患者的處理樣品中所看到的。泳道M顯示了IOObp大小的標(biāo)記，泳道C為來(lái)自健康對(duì)照肌肉的RNA。來(lái)自處理和非處理的肌管的RT-PCR片段的序列分析確定了每個(gè)患者外顯子51的準(zhǔn)確跳躍(D面)。新的框內(nèi)轉(zhuǎn)錄物引起實(shí)質(zhì)性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白合成，如通過(guò)使用單克隆抗體NCL-DYS2對(duì)處理的肌管進(jìn)行免疫熒光分析所檢測(cè)的(E面)。在處理之前，未檢測(cè)到肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。圖3.從患者活檢標(biāo)本的連續(xù)切片中分離的RNA的RT-PCR分析以PR0051治療之后，逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析顯示了每個(gè)患者的新的、更短的轉(zhuǎn)錄片段。這些片段的大小和序列都證實(shí)了外顯子51的準(zhǔn)確跳躍。未觀察到其他的剪接變體。在第28天，仍可檢測(cè)到明顯的框內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄物，這表明了肌肉中PR0051的持久性得以延長(zhǎng)。由于少量的切片材料，使用了高靈敏性PCR條件，這個(gè)過(guò)程阻礙了跳躍效率和RNA與蛋白水平之間有意義相關(guān)性的準(zhǔn)確定量。M表示大小標(biāo)記，C為對(duì)照。圖4.PR0051的單次肌肉內(nèi)劑量的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)效果使用肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白抗體MANDYS106的免疫熒光分析明確顯示，在從每個(gè)患者獲取的活檢標(biāo)本中，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白在大部分纖維膜中的表達(dá)(A面)。在B面中以更高放大倍數(shù)顯示了正方形所示的區(qū)域。為了比較，來(lái)自未治療的杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)患者25的樣品和來(lái)自腓腸肌(HC)的健康對(duì)照樣品包括在患者樣品中。假定的回復(fù)纖維以剪頭表示。對(duì)含有肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白和層粘連蛋白α2的肌纖維總數(shù)進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)并對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白與層粘連蛋白α2的比例作圖(C面)。使用NCL-DYSl抗體對(duì)從患者活檢標(biāo)本分離的總蛋白提取物進(jìn)行Western印跡分析顯示，在所有患者中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白表達(dá)得以恢復(fù)(E面)。對(duì)于每個(gè)患者，裝載30μg(右泳道)和60yg(左泳道)；為了比較，還裝載了30yg來(lái)自健康腓腸肌樣品的總蛋白(以避免感光過(guò)度)。因?yàn)樵谶@些患者DMD基因中相對(duì)小的缺失，在蛋白大小上未觀察到差異。在1號(hào)患者中，轉(zhuǎn)移不規(guī)則擾亂了60μg泳道的信號(hào)檢測(cè)。為了校正不同橫切片中肌纖維的不同密度，將每個(gè)切片中總熒光肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)(面積百分比)圖示為與層粘連蛋白-α2面積百分比的比例(D面)。圖5.在以PS49單獨(dú)治療(第3組)或以PS49和潑尼松龍治療(第4組)的mdx小鼠(每組兩只小鼠)的不同肌肉組(Q四頭?。籘A脛前??；DIA橫膈膜肌)中，在RNA水平上的外顯子23跳躍水平圖6A、B.在肌細(xì)胞中，隨己酮可可堿濃度(0-0.5mg/ml)的增加，DMD基因外顯子44(A)或外顯子45(B)的跳躍水平得以增強(qiáng)。圖6C.在以PS49單獨(dú)治療(第3組)或以PS49和己酮可可堿治療(第4組)的mdx小鼠(每組兩只小鼠)的不同肌肉組(Q:四頭??；TA脛前?。籘ri三頭?。籋RT心肌)中，RNA水平上的外顯子23跳躍水平。圖7.肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(DMD)基因的氨基酸序列。圖8.人IGF-I同種型4的氨基酸序列。圖9.針對(duì)所示肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(DMD)基因外顯子的各種寡核苷酸。實(shí)施例實(shí)施例1在最近臨床研究中，評(píng)估了反義化合物PR0051的局部安全性、耐受性和肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)效果。最近公開(kāi)了該臨床研究。公開(kāi)的內(nèi)容復(fù)制于本文實(shí)施例IA中。簡(jiǎn)而言之，PR0051是合成的、修飾的RNA分子，具有序列5‘-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3‘，經(jīng)設(shè)計(jì)，特異性誘導(dǎo)外顯子51跳躍59。其攜帶了全長(zhǎng)2’-0-甲基取代的核糖部分和硫代磷酸核苷酸間連接。包括了四個(gè)具有可通過(guò)外顯子51跳躍來(lái)校正的不同特定DMD基因缺失的DMD患者。在第0天，評(píng)估了一系列安全性參數(shù)?；颊叩耐?即脛前肌)以定制的塑料模型進(jìn)行固定并仔細(xì)記錄它的位置。使用局部麻醉劑(EMLA)麻醉皮膚。使用2.5cm肌電圖針KMyoJect個(gè)生&電豐及(MyoJectDisposableHypodermicNeedleElectrode),TECAAccessories)，沿著在兩個(gè)小皮膚紋理之間1.5cm的線進(jìn)行4次PR0051注射，以確保肌肉內(nèi)送遞。每次注射的體積為200μ1，含有200μg的PR0051，在約30度的角度下等比例分散。在第28天，再一次評(píng)估相同系列的安全性參數(shù)。使用患者自身模型對(duì)腿進(jìn)行定位，并使用具有兩個(gè)鋒利鋏口的鑷子(BlakesleyConchotoma,DKInstruments)，在局部麻醉下，在紋理之間取得半開(kāi)放肌肉活檢。將活檢在液氮冷卻的2-甲基丁烷中速凍。依次治療患者。研究期間，兩例患者(1號(hào)和2號(hào))也用皮質(zhì)類(lèi)固醇(潑尼松或地夫可特)，一個(gè)剛停止類(lèi)固醇治療(4號(hào))以及一個(gè)患者從未使用過(guò)類(lèi)固醇(3號(hào))(參見(jiàn)表1)。后面的患者與其他三例患者相比，是在最小年齡喪失救護(hù)的一個(gè)。分析活檢，以在RNA水平檢測(cè)特定外顯子跳躍(RT-PCR分析，未示出)和在蛋白水平檢測(cè)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的新表達(dá)(免疫熒光和western印跡分析，表1所示)。治療之前和之后對(duì)系列安全性參數(shù)進(jìn)行的評(píng)估(腎和肝功能的常規(guī)血漿和尿參數(shù)、電解質(zhì)水平、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、aPPT、AP50和CH50值)表明，PR0051化合物是局部安全的且可良好耐受的。對(duì)于免疫熒光分析，將丙酮固定的活檢橫切片與抗中心桿狀結(jié)構(gòu)域(MANDYS106，Dr.GMorris,UK,160)、C-末端結(jié)構(gòu)域(NCL-DYS2，NovocastraLaboratoriesLtd.，130)或作為參照的層粘連蛋白-a2(ChemiconInternational,Inc，1150)的單克隆抗體一起孵育90分鐘，之后與AlexaFluor488羊抗小鼠IgG(H+L)(分子探針，Inc,1250)抗體一起孵育一小時(shí)。將切片以Vectashield封片劑(VectashieldMountingMedium,VectorLaboratoriesInc.)進(jìn)行封片。對(duì)于定量圖像分析，按60，61所述，使用ImageJ(圖像J)軟件(W.Rasband，NIH,USA;http://rsb·info,nih.rov/i)。根據(jù)切片大小，將整個(gè)橫切片再分成6_10個(gè)鄰近圖像。為確保可靠的測(cè)量，使用固定的曝光裝置且避免像素飽和，在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行切片染色和記錄所有圖像。在杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良背景下，設(shè)置更低的強(qiáng)度閾值，為每個(gè)切片(面積百分比)，定量肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白和層粘連蛋白兩者的陽(yáng)性熒光。如1所述，在整個(gè)活檢切片中，使用來(lái)自四個(gè)連續(xù)50μm切片組的混合的勻漿物，進(jìn)行Western印跡分析。對(duì)于患者，應(yīng)用30和60yg的總蛋白，而對(duì)于對(duì)照樣品是3yg。將印跡與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白單克隆抗體NCL-DYSl(NovocastraLaboratories,1125)一起孵育過(guò)夜，之后與羊抗鼠IgG-HRP(SantaCruzBiotechnology,110.000)—起孵育一小時(shí)。使用ECLPlusWestern(ECLPlusWesternBlottingDetectionSystem,GEHealthcare)和HyperfilmECL(Amersham,Biosciences)使免疫反應(yīng)帶顯現(xiàn)。使用ImageJ測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度。在所有四例患者治療區(qū)內(nèi)的大部分肌纖維中都檢測(cè)肌膜中新的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白表達(dá)。對(duì)層粘連蛋白_α2染色之后，對(duì)每個(gè)切片的纖維進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，層粘連蛋白-α2是不受肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷影響的基礎(chǔ)層蛋白。個(gè)體數(shù)量是不同的，與活檢大小和患者肌肉質(zhì)量一致。在最大的切片中，2號(hào)患者有726個(gè)纖維，其中620個(gè)是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性的，而3號(hào)患者有120個(gè)纖維，其中117個(gè)是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性的。肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的強(qiáng)度通常低于健康肌肉活檢中的強(qiáng)度。Western印跡分析證實(shí)存在不同數(shù)量的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。掃描肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)并與對(duì)照關(guān)聯(lián)(每μg總蛋白)。數(shù)量的變化從具有最多營(yíng)養(yǎng)不良肌肉的3號(hào)患者的3%，至具有保留最好的肌肉的2號(hào)患者的12%。因?yàn)榛诳偟鞍椎倪@種比較不能校正杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的不同數(shù)量的纖維化和脂肪組織，因此，相對(duì)于每個(gè)切片中相似定位的層粘連蛋白-α2的熒光信號(hào)，我們還通過(guò)ImageJ分析對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的熒光信號(hào)進(jìn)行了定量。當(dāng)對(duì)照切片中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白/層粘連蛋白-α2的比例設(shè)定為100%時(shí)，以皮質(zhì)類(lèi)固醇共治療的兩個(gè)患者都顯示出肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的最高百分比，1號(hào)患者為32%和2號(hào)患者為35%(表1)。在3號(hào)患者中檢測(cè)到肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的最低百分比，為17%。在4號(hào)患者中觀察到中間百分比25%。這些百分比與靶肌肉的相對(duì)質(zhì)量相關(guān)，其在1和2號(hào)患者最好而3號(hào)患者最差。結(jié)論在也進(jìn)行皮質(zhì)類(lèi)固醇治療的患者中，PR0051反義化合物的效果是更明顯的。實(shí)施例IA^VanDeutekomJCetal,(2007)AntisenseOligonucleotidePR0051RestoresLocalDystrophininDMDPatients.NEnglJMed.，357(26):2677_86復(fù)制。方法患者和研究設(shè)計(jì)選擇年齡8-16歲的杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者參與研究。所有患者具有可通過(guò)外顯子51跳躍校正的缺失且在之前診斷的肌肉活檢中沒(méi)有肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。并允許并存的糖皮質(zhì)激素治療。視情況而定，從患者或其雙親處獲得了書(shū)面知情同意書(shū)。預(yù)篩選期間(長(zhǎng)達(dá)60天)，證實(shí)了每個(gè)患者的突變狀態(tài)和在體內(nèi)對(duì)PR0051的陽(yáng)性外顯子跳躍反應(yīng)，并通過(guò)T1-加權(quán)磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)確定脛前肌的狀況62。對(duì)于研究所包括的患者，纖維化組織和脂肪組織可占不大于50%的靶點(diǎn)肌肉。探查基線期間，評(píng)估安全性測(cè)量。將每個(gè)患者待注射的腿以定制塑料模型進(jìn)行固定并記錄其位置。使用局部麻醉劑的局部低熔混合物(EMLA)麻醉皮膚。使用2.5cm肌電圖針頭(MyoJect—次性皮下針頭電極，TECAAccessories)，在兩個(gè)小皮膚紋理之間1.5cm的線進(jìn)行4次PR0051注射，以確保肌肉內(nèi)送遞。每次注射體積為200μ1，含有200μg的PR0051，其在約30度的角度下等比例分散。在第28天，再次評(píng)估安全性參數(shù)。使用患者自身模型定位腿，并在局部麻醉下，使用具有兩個(gè)鋒利鋏口的鑷子(BlakesleyConchotoma,DKInstruments)在紋理之間進(jìn)行半開(kāi)放肌肉活檢63。將活檢標(biāo)本在液氮冷卻的2-甲基丁烷中速凍。從2006年5月至2007年3月依次對(duì)患者進(jìn)行治療，并遵循良好臨床試驗(yàn)規(guī)范準(zhǔn)則和赫爾辛基宣言條款。研究獲得涉及人個(gè)體研究的荷蘭中央委員會(huì)和在萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。所有作者對(duì)研究設(shè)計(jì)做出貢獻(xiàn)、參與數(shù)據(jù)收集和分析、完全和自由地使用數(shù)據(jù)、共同撰寫(xiě)手稿，并保證數(shù)據(jù)和所做分析的完整性和準(zhǔn)確性。PR0051的說(shuō)明PR0051是合成的、修飾的RNA分子，具有序列5‘-UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3'12。其攜帶了全長(zhǎng)的2’-0_甲基取代的核糖分子和硫代磷酸核苷酸間連接。該藥物是由ProsensaB.V.以Img在小瓶中的不含賦形劑的凍干材料提供的。將其溶解在無(wú)菌、新鮮的鹽水(0.9%氯化鈉)中并給藥。通過(guò)細(xì)菌Aems檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PR0051是不致突變的。在規(guī)范的良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范安全性研究中，接受每公斤體重高達(dá)8mg的肌肉內(nèi)單次給藥和每公斤50mg的靜脈內(nèi)給藥的大鼠未顯示出副作用；當(dāng)該藥物通過(guò)靜脈內(nèi)1小時(shí)注入或通過(guò)皮下注射給藥時(shí)，接受PR0051—個(gè)月的猴子顯示出耐受高達(dá)每周每公斤16mg的劑量，且在臨床上沒(méi)有相關(guān)副作用。體外預(yù)篩選將先前存在的初級(jí)成肌細(xì)胞培養(yǎng)物1用于4號(hào)患者的預(yù)篩選。對(duì)于其他三例患者，如之前所述工’64’65，注射含有肌原細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(MyoD)基因的腺病毒載體之后，成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成肌原細(xì)胞。按照的生產(chǎn)商有關(guān)EXGen500(MBIFermentas)的說(shuō)明書(shū)，以PR0051(IOOnM)和聚乙烯亞胺(2μ1每微克PR0051)轉(zhuǎn)染肌管培養(yǎng)物。48小時(shí)后，分離RNA。如之前所述u2，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、免疫熒光和Western印跡分析。采用2100生物分析儀(Agilent)分析PCR片段，并將其分離，用于由萊頓基因組技術(shù)中心進(jìn)行測(cè)序。安全性評(píng)估在基線和注射后2小時(shí)、1天和28天，所有患者接受完整身體檢查(包括測(cè)量生命體征)并做心電圖。此外，獲得血漿和尿，以經(jīng)典(CH50)和可選(AP50)途徑，測(cè)定腎和肝功能、電解質(zhì)水平、完全細(xì)胞計(jì)數(shù)、激活的部分凝血酶原時(shí)間和補(bǔ)體活性值。記錄伴隨藥物的使用。在基線和第28天，使用醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)標(biāo)度66評(píng)估了脛前肌的強(qiáng)度，以估算程序是否已影響肌肉性能。(在這種標(biāo)度中，0分表示不運(yùn)動(dòng)而5分表示正常肌肉強(qiáng)度)。因?yàn)閮H治療了小區(qū)域的肌肉，對(duì)有關(guān)肌肉強(qiáng)度增加的臨床益處沒(méi)有預(yù)期。每次探查時(shí)，記錄不良事件。RNA評(píng)估將冷凍肌肉活檢標(biāo)本的連續(xù)切片(50μm)在RNA-Bee溶液(CamproScientific)和MagNALyser綠色小球(RocheDiagnostics)中進(jìn)行均質(zhì)化。按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)，分離并純化總RNA0對(duì)于互補(bǔ)DNA,用轉(zhuǎn)錄者逆轉(zhuǎn)錄酶(Transcriptorreversetranscriptase,RocheDiagnostics)，使用500ngRNA，用人外顯子53或54特異性反向引物，在20μ1反應(yīng)中，55°C、30分鐘，完成合成。如之前所述ia2，進(jìn)行PCR分析。在2%瓊脂糖凝膠中分析產(chǎn)物并測(cè)序。此外，使用蛋白截?cái)鄼z驗(yàn)的引物組67的RT-PCR，用于在DMD基因中快速篩選非特異性異常剪接事件。蛋白水平的評(píng)估對(duì)于免疫熒光分析，將丙酮固定的切片與下述單克隆抗體一起孵育90分鐘以160稀釋的抗中心桿狀結(jié)構(gòu)域(MANDYS106，Dr.G.Morris，UK)的單克隆抗體，以130稀釋的抗C-末端結(jié)構(gòu)域(NCL-DYS2，NovocastraLaboratories)的單克隆抗體或(作為參照的)以1150稀釋的抗層粘連蛋白-a2(ChemiCOnInternational)的單克隆抗體，層粘連蛋白-α2是不受肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷影響的基礎(chǔ)層蛋白，之后與以1250稀釋的AlexaFluor488羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(分子探針)一起孵育一小時(shí)。將切片用Vectashield封片劑(VectorLaboratories)進(jìn)行封片。按之前所述6°’61，使用ImageJ軟件(W.Rasband,NationalInstitutesofHealth,http://rsb.info,nih.gov/i.j),進(jìn)行定量圖像分析。根據(jù)切片大小，將整個(gè)橫切片再分成6-10個(gè)鄰近圖像。為確?？煽康臏y(cè)量，使用固定的曝光裝置且避免像素飽和，在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行切片染色和記錄所有圖像。在杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良背景下，設(shè)置更低的強(qiáng)度閾值，為每個(gè)切片(面積百分比)，定量肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白和層粘連蛋白-α2兩者的陽(yáng)性熒光。在整個(gè)活檢標(biāo)本中，使用來(lái)自四個(gè)連續(xù)50μm切片組的混合勻漿物，如之前所述S進(jìn)行Western印跡分析。對(duì)于每個(gè)患者，應(yīng)用30μg和60μg的總蛋白，而對(duì)于對(duì)照樣品是3yg。將Western印跡與以1125稀釋的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白單克隆抗體NCL-DYSl(NovocastraLaboratories)—起孵育過(guò)夜，之后與以110000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(SantaCruzBiotechnology)一起孵育一小時(shí)。使用ECLPlusWestern印跡檢測(cè)系統(tǒng)(GEHealthcare)禾口HyperfilmECL(Amersham，Biosciences)使免疫反應(yīng)帶顯現(xiàn)。使用ImageJ軟件測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果患者預(yù)篩選計(jì)劃對(duì)4-6例患者進(jìn)行研究。邀請(qǐng)6例患者參與，并拒絕1例。對(duì)剩余5例患者進(jìn)行預(yù)篩選。首先，在MRI中評(píng)估脛前肌狀況。四例患者的肌肉狀況被認(rèn)為適宜用于研究(圖2A)，在患者原始活檢標(biāo)本中證實(shí)不存在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(圖2B)。其次，在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中證實(shí)了四例患者的突變狀態(tài)和對(duì)PR0051的陽(yáng)性外顯子跳躍反應(yīng)。對(duì)每個(gè)患者而言，PR0051治療生成了新的、更短的信使RNA片段，占總RT-PCR產(chǎn)物的46%(4號(hào)患者)-90%(1號(hào)患者)(圖2C)。由測(cè)序證實(shí)了準(zhǔn)確的外顯子-51跳躍(圖2D)。未發(fā)現(xiàn)被改變的其他轉(zhuǎn)錄區(qū)域。免疫熒光分析顯示肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性肌管占優(yōu)勢(shì)(圖2E)，并由Western印跡分析證實(shí)了該發(fā)現(xiàn)(未示出)。因而，四例患者被鑒定為可以用于PR0051治療。他們的基線特征由表2所示。安全性和不良事件所有患者都具有一個(gè)或多個(gè)不良事件。然而，僅一例患者報(bào)告在注射位點(diǎn)有輕度局部疼痛，這被認(rèn)為是與研究藥物相關(guān)的不良事件。其他事件包括肌肉活檢后輕度至中度疼痛。兩例患者在用于包扎傷口的繃帶下起泡。在注射和活檢之間的時(shí)期，兩例患者報(bào)告有幾天的流感樣癥狀，一例患者有1天的輕度腹瀉。在基線時(shí)，按醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)標(biāo)度，1、2、3和4號(hào)患者中被治療脛前肌的肌肉強(qiáng)度分分別為4、2、3和4。沒(méi)有患者顯示出在研究期間該肌肉強(qiáng)度的變化或標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量中的明顯改變或補(bǔ)體裂解產(chǎn)物或激活的部分凝血酶原時(shí)間的測(cè)量增加。在患者的肌肉切片中未檢測(cè)到局部炎癥或毒性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未示出)。3號(hào)患者在完成研究之后的一個(gè)月成功地進(jìn)行脊柱側(cè)凸的預(yù)先計(jì)劃的手術(shù)。RNA和蛋白水平在第28天，對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行了治療區(qū)的活檢。從整個(gè)活檢標(biāo)本的連續(xù)切片中分離總肌肉RNA。在所有患者中，RT-PCR鑒定了由外顯子-51跳躍形成的新的、更短的片段，如測(cè)序所證實(shí)的(圖3)。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄物分析顯示沒(méi)有其他改變(數(shù)據(jù)未示出)。每個(gè)患者整個(gè)活檢標(biāo)本的切片的免疫熒光分析表明在大部分肌纖維中有明顯的肌漿肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)(圖4A和4B)。所用的遠(yuǎn)離和接近缺失的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白抗體包括MANDYS106(圖4A和4B)和NCL-DYS2(類(lèi)似于MANDYS106，未示出)。層粘連蛋白-α2染色68之后，對(duì)每個(gè)切片中的纖維進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)。個(gè)體數(shù)量是不同的，與活檢標(biāo)本大小和肌肉質(zhì)量一致。在最大的切片中，2號(hào)患者有726個(gè)纖維，其中620個(gè)是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性的，而3號(hào)患者有120個(gè)纖維，其中117個(gè)是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性的(圖4A和4C)。肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白強(qiáng)度通常低于健康肌肉活檢標(biāo)本的強(qiáng)度(圖4B)。2和3號(hào)患者中具有更強(qiáng)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)的單個(gè)纖維極有可能是回復(fù)纖維(圖4B)。Western印跡分析證實(shí)存在不同數(shù)量的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(圖4E)。掃描肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)并與對(duì)照關(guān)聯(lián)(每yg總蛋白)。數(shù)量變化從具有最多營(yíng)養(yǎng)不良肌肉的3號(hào)患者的3%，至具有保留最好肌肉的2號(hào)患者的12%。因?yàn)榛诳偟鞍椎倪@種比較不能校正杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者的不同數(shù)量的纖維化組織和脂肪組織，相對(duì)于相似定位的層粘連蛋白-α2的熒光信號(hào)，我們還通過(guò)ImageJ分析對(duì)每個(gè)切片肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白熒光信號(hào)進(jìn)行定量。當(dāng)對(duì)照切片中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白/層粘連蛋白α2比例設(shè)定為100時(shí)，1、2、3和4號(hào)患者分別具有33、35、17和25的比例(圖4D)。討論我們的研究表明，局部肌肉內(nèi)注射PR0051，即與外顯子51內(nèi)20個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)的20MePS反義寡核糖核苷酸，誘導(dǎo)外顯子-51跳躍，校正讀框，以及因此在接受治療的患有杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的所有四個(gè)患者的肌肉中導(dǎo)入肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。在整個(gè)患者活檢標(biāo)本中都發(fā)現(xiàn)了肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白陽(yáng)性纖維，這表明化合物在注射區(qū)內(nèi)分散。因?yàn)槲词褂盟瓦f增強(qiáng)賦形劑，PR0051攝取看起來(lái)并不是主要的潛在限制因素。我們不能排除營(yíng)養(yǎng)不良纖維膜滲透性增加具有有利影響?；颊弋a(chǎn)生的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白水平是健康對(duì)照肌肉中水平的3-12%，如總蛋白的Western印跡分析所示。因?yàn)槔w維化和脂肪的存在可能導(dǎo)致總蛋白提取物中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白被低估一些，我們測(cè)定了橫切片中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白與層粘連蛋白-α2的比例，與對(duì)照肌肉中的100相比，其為17-35。PR0051的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)效果限制在治療區(qū)內(nèi)，未觀察到整個(gè)肌肉的強(qiáng)度改善。未來(lái)的全身治療將需要重復(fù)給藥以增加并保持肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白更高水平的表達(dá)并獲得臨床效果。由于未成年人干預(yù)的醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范，我們不能從患者未經(jīng)注射的對(duì)側(cè)肌肉獲得活檢標(biāo)本。然而，在研究啟動(dòng)之前5-9年所獲得的原始診斷活檢標(biāo)本中，患者顯示出小于的回復(fù)纖維(表2和圖2Β)。我們認(rèn)為很有可能是，我們觀察到的效果與PR0051試劑的特性和序列相關(guān)，而與回復(fù)纖維的明顯增加不相關(guān)。事實(shí)上，在2號(hào)患者和3號(hào)患者中都觀察到了肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白信號(hào)增加的單個(gè)可能的回復(fù)纖維(圖4Β)?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研表明，對(duì)四個(gè)杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者肌肉局部給予PR0051，使肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)至3-12%或17-35%的水平，這取決于相對(duì)于總蛋白或肌纖維含量的定量。與治療的明顯局限性特性一致，未觀察到功能性改善。在患有最久嚴(yán)重疾病的3號(hào)患者中結(jié)果總是更差，表明當(dāng)相對(duì)少的肌肉組織被纖維變性和脂肪組織所取代時(shí)，在相對(duì)年輕的患者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)的重要性。我們的發(fā)現(xiàn)表明，反義介導(dǎo)的外顯子跳躍可以是恢復(fù)杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良患者肌肉中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白合成的潛在途徑。實(shí)施例2在mdx小鼠(DMD的動(dòng)物模型)的臨床前研究中，評(píng)估了輔助化合物潑尼松對(duì)AON-誘導(dǎo)的外顯子跳躍的作用。從查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(CharlesRiverLaboratories，荷蘭)獲得Mdx小鼠(C57Bl/10ScSn-mdX/J)。由于外顯子23上的無(wú)意義突變，這些小鼠是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷的。通過(guò)移除無(wú)意義突變并校正可讀框，AON誘導(dǎo)的外顯子23跳躍在mdx小鼠中是治療性的。每組兩個(gè)mdx小鼠皮下注射第1組)生理鹽水(1-8周)，第2組)潑尼松龍(lmg/kg，l-8周)，第3組)經(jīng)設(shè)計(jì)特異性誘導(dǎo)外顯子23跳躍的小鼠特異性反義寡核苷酸PS49(100mg/kg，4周(5次)，5-8周(2次)，第4組)潑尼松龍(lmg/kg，1-8周)+PS49(100mg/kg,4周(5次)，5-8周(2次)。PS49(5，GGCCAAACCUCGGCUUACCU3，)具有全長(zhǎng)的硫代磷酸骨架和2'0-甲基修飾的核糖分子。在最后一次注射之后的一周處死所有小鼠。分離不同的肌肉組，包括四頭肌、脛前肌和橫膈膜肌，并在液氮冷卻的2-甲基丁烷中冷凍。對(duì)于RT-PCR分析，將肌肉樣品在RNA-Bee溶液(CamproScientific，荷蘭)中均質(zhì)化。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，分離并純化總RNA。對(duì)于用逆轉(zhuǎn)錄酶(RocheDiagnostics，荷蘭)的cDNA合成，在20μ1反應(yīng)中，使用300ngRNA，該反應(yīng)于55°C下用小鼠DMD基因特異性引物反向引發(fā)，進(jìn)行30分鐘。首先，以外引物組進(jìn)行PCRs，PCR條件是94°C(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，20次循環(huán)。然后使用直接位于外顯子23側(cè)翼的外顯子內(nèi)的巢式引物組合，對(duì)μ該反應(yīng)物(110稀釋)進(jìn)行再擴(kuò)增，條件是94°C(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，30次循環(huán)。在2%瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物。使用DNA10001^1)0119@試劑盒和48116壯2100生物分析儀(AgilentTechnologies，荷蘭)，通過(guò)定量PCR產(chǎn)物測(cè)定跳躍效率。在僅以生理鹽水或潑尼松龍治療的小鼠肌肉中，未觀察到外顯子23跳躍(第1和2組)。檢測(cè)外顯子23跳躍水平，并在僅以PS49治療的小鼠(第3組)和以PS49和輔助化合物潑尼松龍治療的小鼠(第4組)之間比較每個(gè)肌肉組。在四頭肌(Q)、脛前肌(TA)和橫膈膜肌(DIA)中，與第3組相比，第4組的外顯子23跳躍水平通常更高(圖5)。這表示，輔助化合物潑尼松龍確實(shí)增強(qiáng)以PS49治療的mdx小鼠中外顯子23的跳躍水平。實(shí)施例3Α.、B.在0-0.5mg/ml己酮可可堿的存在下，使用轉(zhuǎn)染試劑聚合物UNIFectylin(在0.15MNaCl中，每μgΑ0Ν,2.0μ1UNIFectylin)，以250nMPS188([5，UCAGCUUCU⑶UAGCCACUG3，;SEQIDNO10]優(yōu)化用來(lái)使外顯子44特異性跳躍的AON)或250nMPS221([5'AUUCAAUGUUCUGACMCAGUUUGC3，;SEQIDNO:60]優(yōu)化用來(lái)使外顯子45特異性跳躍的AON)轉(zhuǎn)染來(lái)自健康對(duì)照個(gè)體的分化的肌肉細(xì)胞培養(yǎng)物(肌管)。如果核酸是帶負(fù)電荷的(例如2’-0_甲基硫代磷酸AONs),UNIFectylin便與核酸發(fā)生靜電相互作用。將己酮可可堿(SigmaAldrich)溶解在水中。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染之后24小時(shí)在RNA-Bee溶液(CamproScientific,荷蘭)中分離總RNA。對(duì)于用逆轉(zhuǎn)錄酶(RocheDiagnostics，荷蘭)的cDNA合成，在20μ1反應(yīng)中，使用500ngRNA，該反應(yīng)于55°C下用DMD基因特異性引物反向引發(fā)，進(jìn)行30分鐘。首先，以外引物組進(jìn)行PCRs，PCR條件是-MV(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，20次循環(huán)。然后使用直接位于外顯子44或45側(cè)翼的外顯子內(nèi)的巢式引物組合，對(duì)1μ1該反應(yīng)物(110稀釋)進(jìn)行再擴(kuò)增，條件為94°C(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，30次循環(huán)。在2%瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物。使用DNA1000LabChip試劑盒和Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies，荷蘭)，通過(guò)定量PCR產(chǎn)物測(cè)定跳躍效率。對(duì)于用PS188和PS221，當(dāng)與在未與己酮可可堿共治療的細(xì)胞中獲得的外顯子44或45跳躍水平相比時(shí)，隨著輔助化合物己酮可可堿濃度的增加，獲得外顯子44或45跳躍水平的增加(參見(jiàn)圖6)。這樣的結(jié)果表明，己酮可可堿增強(qiáng)肌細(xì)胞中外顯子跳躍水平。C.在mdx小鼠(DMD的動(dòng)物模型)的臨床前研究中，評(píng)估了輔助化合物己酮可可堿對(duì)AON-誘導(dǎo)的外顯子跳躍的作用。從查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(荷蘭)獲得Mdx小鼠(C57Bl/10ScSn-mdx/J)0由于外顯子23上的無(wú)意義突變，這些小鼠是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷的。通過(guò)移除無(wú)意義突變并校正可讀框，AON誘導(dǎo)的外顯子23跳躍在mdx小鼠中是治療性的。每組兩個(gè)mdx小鼠皮下注射第1組)己酮可可堿(50mg/kg，l-2周)，第2組)經(jīng)設(shè)計(jì)特異性誘導(dǎo)外顯子23跳躍的小鼠特異性反義寡核苷酸PS49(100mg/kg，2周(2次)，第3組)己酮可可堿(50mg/kg，1-2周)+PS49(100mg/kg,2周(2次)。PS49(5’GGCCAAACCUCGGCUUACCU3’)具有全長(zhǎng)的硫代磷酸骨架和2‘O-甲基修飾的核糖分子。在最后一次注射之后的一周處死所有小鼠。分離不同的肌肉組，包括四頭肌、脛前肌、三頭肌和心肌，并在液氮冷卻的2-甲基丁烷中冷凍。對(duì)于RT-PCR分析，將肌肉樣品在RNA-Bee溶液(CamproScientific，荷蘭)中均質(zhì)化。按照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)，分離并純化總RNA。對(duì)于用逆轉(zhuǎn)錄酶(RocheDiagnostics，荷蘭)的cDNA合成，在20μ1反應(yīng)中，使用300ngRNA，該反應(yīng)于55°C下用小鼠DMD基因特異性引物反向引發(fā)，進(jìn)行30分鐘。首先，以外引物組進(jìn)行PCRs，PCR條件是94°C(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，20次循環(huán)。然后使用直接位于外顯子23側(cè)翼的外顯子內(nèi)的巢式引物組合，對(duì)μ該反應(yīng)物(110稀釋)進(jìn)行再擴(kuò)增，條件是94°C(40秒)、60°C(40秒)和72°C(60秒)，30次循環(huán)。在2%瓊脂糖凝膠中分析PCR產(chǎn)物。使用DNA10001^&011@試劑盒和48116壯2100生物分析儀(AgilentTechnologies，荷蘭)，通過(guò)定量PCR產(chǎn)物測(cè)定跳躍效率。在僅以己酮可可堿治療的小鼠肌肉中，未觀察到外顯子23跳躍(第1組)。檢測(cè)外顯子23跳躍水平，并在僅以PS49治療的小鼠(第2組)和以PS49和輔助化合物己酮可可堿治療的小鼠(第3組)之間比較每個(gè)肌肉組。在四頭肌(Q)、脛前肌(TA)、三頭肌(Tri)和心肌(HRT)中，與第2組相比，第3組的外顯子23跳躍水平通常更高(圖6c)。這表明，輔助化合物己酮可可堿確實(shí)增強(qiáng)了以PS49治療的mdx小鼠中外顯子23的跳躍水平。不同DMD患者的培養(yǎng)肌肉細(xì)胞中的治療性反義誘導(dǎo)外顯子跳躍).HumMolGenet2003；12(8)907-14.2.Aartsma-RusA,JansonAA,KamanWE,etal.Antisense-inducedmultiexonskippingforDuchennemusculardystrophymakesmoresense(杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的反義誘導(dǎo)多外顯子跳躍很合理).AmJHumGenet2004；74(1)=83-92.3.AlterJ,LouF,Rabinowit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yōu)選(糖)皮質(zhì)類(lèi)固醇、ACE抑制劑(優(yōu)選培哚普利)、血管緊張素II型I受體阻斷劑氯沙坦、腫瘤壞死因子α(TNFa)抑制劑、mIGF-1源、抗氧化劑、離子通道抑制劑、蛋白酶抑制劑、L-精氨酸和/或用于增強(qiáng)外顯子跳躍和/或抑制剪接體組裝和/或剪接的化合物。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于至少部分減少所述個(gè)體中異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生。7.如權(quán)利要求1-6中任一中所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于抑制肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子內(nèi)含于由所述前mRNA剪接產(chǎn)生的mRNA中，其中優(yōu)選缺乏來(lái)自由肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA所產(chǎn)生的mRNA的所述外顯子，產(chǎn)生了功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的編碼區(qū)。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子的至少一部分或肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA非外顯子區(qū)的至少一部分互補(bǔ)的序列，所述部分具有至少13個(gè)核苷酸。9如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括抑制終止密碼子的化合物，優(yōu)選該化合物包括慶大霉素、PTC124或其功能等同物。10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，用于特異性結(jié)合在轉(zhuǎn)錄物中校正肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白外顯子剪接所需要的調(diào)節(jié)RNA序列，并優(yōu)選其中所述寡核苷酸或其功能等同物與內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ISE)、外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)、內(nèi)含子剪接沉默子(ISS)和/或外顯子剪接沉默子(ESS)互補(bǔ)。11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述化合物包括寡核苷酸或其功能等同物，所述寡核苷酸包括與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA外顯子RNA的13-50個(gè)核苷酸優(yōu)選14-25個(gè)核苷酸之間的連續(xù)部分互補(bǔ)的序列。12.如權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中所述寡核苷酸包括RNA，并優(yōu)選所述RNA含有修飾，優(yōu)選2’-0-甲基修飾的核糖(RNA)或脫氧核糖(DNA)修飾，或其中所述寡核苷酸的所述功能等同物包括肽核酸、鎖核酸、嗎啉代磷酸二酰胺或其任意組合，最優(yōu)選嗎啉代磷酸二酰胺。13.如權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中所述外顯子包括外顯子51、44、45、53、46、43、2、8、50和/或52。14.如權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的方法、組合、用途或藥物制劑，其中向所述個(gè)體提供功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的所述寡核苷酸與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA中的至少兩個(gè)外顯子互補(bǔ)，所述寡核苷酸包括至少兩部分，其中第一部分包括具有至少8個(gè)優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，該連續(xù)核苷酸與所述至少兩個(gè)外顯子的第一個(gè)是互補(bǔ)的，其中第二部分包括具有至少8個(gè)優(yōu)選16-80個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，該連續(xù)核苷酸與所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA的第二外顯子是互補(bǔ)的，其中優(yōu)選在所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA中，通過(guò)至少一個(gè)不與所述寡核苷酸互補(bǔ)的外顯子隔離所述第一和所述第二外顯子。15.至少部分增加細(xì)胞中功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白產(chǎn)生的方法，所述細(xì)胞包括編碼異常肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因的前mRNA，該方法包括向所述細(xì)胞提供用于抑制外顯子內(nèi)含于由所述肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白前mRNA剪接產(chǎn)生的mRNA中的化合物，以及向所述細(xì)胞提供減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物和/或向所述細(xì)胞提供改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物，該方法還包括允許由所述前mRNA剪接產(chǎn)生的mRNA翻譯。全文摘要本發(fā)明提供了緩解杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方式和方法。將利用提供給患者功能性蛋白的化合物的治療與至少一種減少炎癥優(yōu)選減少肌肉組織炎癥的輔助化合物，和/或至少一種改善肌纖維功能、完整性和/或存活的輔助化合物組合。文檔編號(hào)A61P21/00GK101896186SQ200880120198公開(kāi)日2010年11月24日申請(qǐng)日期2008年10月27日優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日發(fā)明者安妮姆耶克·阿斯馬-魯斯,朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬(wàn)多伊特科姆,杰勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格,蓋瑞特-揚(yáng)·保德維金·萬(wàn)歐門(mén),約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼申請(qǐng)人:萊頓教學(xué)醫(yī)院;普羅森那技術(shù)公司