專利名稱：用于治療或預(yù)防人乳頭瘤病毒感染的多型hpv肽的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案一般地涉及生物學(xué)和醫(yī)學(xué)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中涉及使 用多型(multitype)HPV多肽的組合物和方法。II.背景生殖器熱帶人乳頭瘤病毒(HPV)感染被認(rèn)為是美國最常見的性傳播感染(疾病預(yù) 防控制中心(CDC)向國會(huì)的報(bào)告，Prevention of GenitalHuman Papillomavirus，2004 年 1月)。肛門生殖器HPV的主要表現(xiàn)包括生殖器疣(尖銳濕疣)以及外陰、宮頸、肛門或陰 莖的上皮內(nèi)贅生物。小部分持續(xù)高風(fēng)險(xiǎn)HPV感染，如果未得到治療的話，將發(fā)展為癌癥(例 如，宮頸癌，偶爾是頭頸癌，以及某些類型的非黑素瘤皮膚癌)。據(jù)報(bào)道，全球范圍內(nèi)99. 7% 的宮頸癌中存在HPV的DNA，這提示HPV感染是這種癌癥的必要原因，并且可利用預(yù)防性 HPV疫苗接種來預(yù)防該疾病(Walboomers等，1999)。除了生殖器疣以外，HPV感染可導(dǎo)致尋常疣、跖疣或平疣(planarwart)。疣可以 不同的形式存在，這取決于相關(guān)的HPV類型和所涉及的上皮。尋常疣(Verruca vulgaris) 通常發(fā)生在手上，呈肉色至褐色、外生型的角化過度丘疹(hyperkeratotic papule)。跖疣 (verruca plantaris)出現(xiàn)在腳底，可能會(huì)非常疼。通過去除表層顯露出形成血栓的毛細(xì)血 管，可將它們與胼胝進(jìn)行區(qū)分。扁平疣或平疣(Verruca plana)在兒童中最常見，可發(fā)生于 面部、頸部、胸部以及前臂和腿的屈肌表面。在多于100種HPV亞型中約35種是特異性針對(duì)肛門生殖器上皮的并具有不同的 惡性病變潛能(Mimoz等，2003)。在15種致癌生殖器HPV類型中，HPV16是最常見的，其次 是HPV18和HPV45 (分別占宮頸癌病例的 50 %、 20 %和 10 % )。盡管通過實(shí)施宮頸細(xì) 胞學(xué)篩查方案來減少宮頸癌發(fā)生率和死亡率的公眾衛(wèi)生努力已取得成功，然而未接受定期 篩查的女性占侵襲性癌患者的大多數(shù)(Hoffman和Cavanagh，1995)，并且宮頸癌仍是全球 范圍內(nèi)第二常見的婦女癌癥死亡原因以及撒哈拉以南非洲、中美洲、南-中亞和美拉尼西 亞(大洋洲的分區(qū)，從西太平洋西側(cè)延伸至阿拉弗拉海(Arafura Sea)，澳大利亞以北和東 北；該稱謂最初用于指示區(qū)別于波利尼西亞和密克羅尼西亞的種族和地理集群)婦女中最 普遍的癌癥(Parkin，2001)。每年診斷出約471，000個(gè)侵襲性宮頸癌病例(Parkin，2001)。HPV基因組被60nm的無包膜二十面體衣殼所包繞(Baker等，1991)，所述衣殼包 含兩種遺傳上不相關(guān)的主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。重組L1自組裝成病毒樣顆 粒(VLP)，其在形態(tài)上和免疫學(xué)上與天然病毒粒子類似(Kirnbauer等，1992)?；贚1VLP的疫苗對(duì)用于產(chǎn)生該免疫原之乳頭瘤病毒類型對(duì)應(yīng)的感染具有高度保護(hù)性(同源疫苗)， 但是對(duì)除了最密切相關(guān)之HPV類型以外的所有HPV類型都無效(Roden等，2000)。經(jīng)許可 的HPV疫苗已通過設(shè)計(jì)多價(jià)疫苗制劑規(guī)避了這一障礙；CERVARIX 包含源自HPV16和HPV18 的L1VLP，而GARDASIL 還含有用于預(yù)防良性生殖器疣的HPV6和HPV11 LI VLP。遺憾的 是，目前這些L1VLP疫苗的費(fèi)用以及需要冷藏的事實(shí)使得將其用于最需要它們的資源缺乏 的偏遠(yuǎn)地區(qū)變得不實(shí)際。此外，由于這些疫苗對(duì)致癌HPV類型的相當(dāng)一部分是無效的，因此 昂貴的細(xì)胞學(xué)篩查方案仍是必要的。為了在全球范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)全面有效的HPV預(yù)防，疫苗應(yīng) 該是安全有效的，其在環(huán)境溫度下是穩(wěn)定的從而有利于運(yùn)送至偏遠(yuǎn)地區(qū)，制造成本低廉，無 需針即可施用，優(yōu)選采用單劑量制劑的形式。由眾多的HPV類型帶來的疾病負(fù)擔(dān)表明廣泛 保護(hù)的疫苗是必需的。因此，需要另外的交叉中和性HPV疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案涉及多型肽組合物。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案涉及這些多型 肽組合物作為免疫原或疫苗的用途。本發(fā)明的多型肽組合物包含代表病原生物之多種同 種型或類型或者生物之不同免疫原性肽的兩種或更多種肽(免疫原性肽，即誘導(dǎo)對(duì)象中免 疫應(yīng)答的肽)。所述生物可以是多種類型或變體的靶標(biāo)生物、同屬生物或同科生物。在另 一些方面，所述肽可來自不同的病原性生物(例如HPV和HSV)。在某些方面，不同的病原 性生物在傳播方式(例如性傳播疾病(sexually transmitted disease, STD))或者被感 染的器官或器官系統(tǒng)(例如生殖系統(tǒng)、皮膚等)方面是相關(guān)的。一方面，所述多型肽組合 物可以包含源自多種生物變體或類型的多種肽，使其具有廣泛的交叉中和性免疫應(yīng)答。HPV 類型的交叉中和是此類交叉中和性多型肽組合物的一個(gè)實(shí)例。在另一些方面，多型肽組合 物可包含源自不同病原體的肽，例如性傳播病毒、細(xì)菌或真菌，其包括但不限于乳頭瘤病毒 (PV)、HPV、巨細(xì)胞病毒(CMV)、皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV/AIDS)、卡波 西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV/HHV8)、軟下疳(軟下疳嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi))、 多諾萬病(donovanosis)(腹股溝肉芽腫(Granuloma inguinale)或肉芽腫鞘桿菌 (Calymmatobacterium granulomatis))(^fr^^^lif (Neisseriagonorrhoeae)) 巴肉芽月中(Lymphogranuloma venereum, LGV)(沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis))、 非淋球菌性尿道炎(non-gonococcalurethritis，NGU)(解尿素支原體(Ureaplasma urealyticum)或人型支原體(Mycoplasma hominis))、金黃色葡萄球菌、梅毒(梅毒螺旋體 (Treponemapallidum))等。HPV是可通過使用本文所述的多型肽組合物進(jìn)行靶向的生物的一個(gè)實(shí)例。HPV感 染導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)人類癌癥的5%。細(xì)胞學(xué)(Pap)篩查可鑒定并隨之切除宮頸癌癌前病 變。如經(jīng)許可疫苗GARDASIL (Merck)和CERVARIX (GSK)所描述地，預(yù)防HPV感染將消除 HPV相關(guān)癌癥及其癌前病變。然而，所述經(jīng)許可疫苗源自L1衣殼蛋白，并且僅靶向一部分致 癌HPV類型(因此仍然需要Pap篩查方案)。本發(fā)明人描述了基于施用多型HPV L2肽組合 物而廣泛地預(yù)防良性和致癌性HPV感染及其后遺癥的組合物和方法。所述多型HPV L2肽 組合物將包含源自兩種或更多種HPV類型的多種多肽區(qū)段。所述區(qū)段或肽可以來自同源多 肽的相應(yīng)區(qū)域(即，來自另一類型或變體之生物的、與第一多肽功能等價(jià)的多肽)，或者可 來自同源多肽的不同區(qū)段，或者可以來自不同類型的不同多肽。所述多肽區(qū)段(或肽)可 以通過綴合或制備成融合蛋白、脂質(zhì)體、納米顆粒、聚合物或肽樹狀分子(dendrimer)(分支多肽)來構(gòu)建成多型肽組合物。在某些實(shí)施方案中，分離的多肽組合物包含來自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、 100,200或更多種不同分離物或類型之感染性生物之對(duì)應(yīng)或同源多肽的至少2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、 60、70、80、90、100、200或更多種免疫原性肽，其中含有第一多肽之第一肽的氨基酸序列的 第一免疫原性肽可與來自第二多肽的第二對(duì)應(yīng)或同源免疫原性肽有效偶聯(lián)。“有效偶聯(lián)”是 指肽直接或間接地與第二肽連結(jié)。例如，與第二多肽連結(jié)的官能團(tuán)可通過其部分(例如肽 鍵)與第一肽或表面直接連結(jié)。或者，官能團(tuán)可經(jīng)由中間組分與肽或表面連結(jié)，所述中間組 分使官能團(tuán)與肽或表面連結(jié)。這種中間組分常稱為“接頭”。接頭是雙功能性分子，其可具 有與第一肽化學(xué)連結(jié)的一個(gè)部分以及與官能團(tuán)化學(xué)連結(jié)的第二部分。本發(fā)明涵蓋任意數(shù)目 的中間組分，并且這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明人描述了用于預(yù)防多種PV類型感染的多型PV肽組 合物。在某些方面，多型PV肽組合物是包含來自不同PV類型之兩種或更多種PV蛋白區(qū) 段或免疫原性肽的非天然多肽，其被構(gòu)建成線性(串聯(lián)體(concatamer))或分支多肽結(jié) 構(gòu)，多型PV L2多肽。所述PVL2肽可包括如下病毒之L2蛋白質(zhì)的所有或部分氨基酸序 列乳多空病毒科；多瘤病毒科；乳頭瘤病毒科和/或0屬或0、￥、5、￡、4、11、0、 i.k.A.u.v.^.o.ji 屬的乳頭瘤病毒(參見 de Villiers 等，Classification ofpapillomaviruses. Virology. 2004 年 6 月 20 日；324(1) 17-27)；和 / 或人乳頭瘤病 毒:HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100, HPV101, HPV102, HPV103, HPV104, HPV105, HPV106, HPV107, HPV108, HPV109, HPV110, HPV111 ；和/或動(dòng)物乳頭瘤病毒1型牛乳頭瘤病毒(BPV1)、2型牛乳頭瘤 病毒(BPV2)、4型牛乳頭瘤病毒(BPV4)、棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)、鹿乳頭瘤病毒(DPV)、歐 洲麋鹿乳頭瘤病毒(EEPV)、犬口腔乳頭瘤病毒(C0PV)、恒河猴乳頭瘤病毒(RhPV)和兔口腔 乳頭瘤病毒(R0PV)。本發(fā)明的PV抗原或表位或肽或多肽區(qū)段可包含乳頭瘤病毒L2多肽(例如SEQ ID No 1-70)的 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500 個(gè)連續(xù)氨基酸，
并包括其間的所有數(shù)值和范圍。在另一方面，多肽區(qū)段可包含L2多肽(例如SEQ ID NO :1_70)的至多、至少或大約 氨基酸位置 1,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25， 26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72,73,74,75,76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，93，94，95，96,97,98,99,100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，189，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211,212,213,214,215,216,217，218,219,220，221,222,223，224，225，226，227，228，229，230,231,232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251,252,253,254,255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268,269,270,271,272,273,274，275,276,277，278,289,280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291,292,293，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305,306,307,308,309,310,311，312,313,314，315,316,317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328,329,330，331,332,333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350,351,352，353,354,355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366,367,368，369,370,371，372,373,374，375，376，377，378，389，380，381,382,383，384，385，386，387，388，389，390，391,392,393，393，394，395，396，397，398，399，400，401,402,403,404,405，406,407,408，409,410,411，412，413，414，415，416，417，418,419,420,421,422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441,442,443，444,445,446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460,461,462，463，464，465，466,467,468，469，470，471，472，473，474，475,476,
477，478，489，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490 或更多至氨基酸位置 10， 11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35， 36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60， 61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，89，80，81，82，83，84，85， 86，87，88，89，90，91，92，93，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107， 108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126， 127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164， 165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，189，180，181，182，183， 184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，193，194，195，196，197，198，199,200,201, 202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220， 221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239， 240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258， 259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277， 278，289，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，293，294，295， 296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314， 315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352， 353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371， 372，373，374，375，376，377，378，389，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390， 391，392，393，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408， 409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427， 428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446， 447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465， 466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，489，480，481，482，483，484， 485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500 或更多。在又一方面中，L2肽包括這樣的多肽區(qū)段，所述多肽區(qū)段包含本文SEQ ID NO 1 中公開之L2多肽或SEQ ID NO :2_70之對(duì)應(yīng)區(qū)域或其共有序列的至多、至少或大約17-36、 13-45、11-88或11-200位氨基酸。每個(gè)位置可以是大致的氨基酸位置，并且可以在士 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)氨基酸位置內(nèi)變化。氨基酸位置的確定是基于針對(duì)HPV16L2蛋 白質(zhì)(SEQ ID N0:1)的編號(hào)。來自其它HPV類型的L2蛋白的氨基酸位置可以不同，但是本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⑷我釲2氨基酸序列與HPV16進(jìn)行比對(duì)，并確定對(duì)應(yīng)于HPV16L2氨基酸 位置的肽序列。在某些實(shí)施方案中，所述L2肽是HPV16L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 1)的區(qū)段、HPV18L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 2)的區(qū)段、HPV45L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 3)的區(qū)段、HPV6L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 9)的區(qū)段、HPV1L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 4)的區(qū)段、HPV2L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 5) 的區(qū)段、HPV63L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 62)的區(qū)段、HPV5L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 8)的區(qū)段、 HPV8L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 11)的區(qū)段、HPV11L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 14)的區(qū)段、HPV31L2 蛋白質(zhì)(SEQ IDN0 32)的區(qū)段、HPV33L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 34)的區(qū)段、HPV35L2蛋白質(zhì) (SEQ ID NO 36)的區(qū)段、HPV39L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 40)的區(qū)段、HPV51L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 50)的區(qū)段、HPV52L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 51)的區(qū)段、HPV56L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 55) 的區(qū)段、HPV58L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 57)的區(qū)段、HPV59L2蛋白質(zhì)(SEQ IDN0 58)的區(qū)段、 HPV68L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 66)的區(qū)段、HPV73L2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 69)的區(qū)段和/或 HPV82L2 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 70)的區(qū)段。在某些方面中，多型多肽具有如下通式[表位X (a) -L-表位 X+l (b) _L_ 表位 X+n (c) ] (d)，其中a和/或b和/或c和/或d彼此獨(dú)立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 ；n 獨(dú)立地是 1 98 ；肽 X、肽 X+1、肽 X+n 是選 自一種或多種性傳播生物的不同免疫原性表位；(L)可代表接頭、化學(xué)偶聯(lián)、肽鍵。該式的 肽可源自同種蛋白質(zhì)或源自同種生物或病原體的不同蛋白質(zhì)，或者這些肽可源自不同病原 生物的同源或異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽X是HPV多肽；肽X+1是不同的HPV肽或 來自另一病原生物的肽；肽X+n是來自任意HPV類型或其它病原生物的一種或多種其它不 同肽。所述“-L-”代表接頭、化學(xué)接頭、肽接頭、化學(xué)偶聯(lián)或多肽融合情形中的肽鍵，或者本 領(lǐng)域已知的肽_肽連接或肽_基質(zhì)連接的其它偶聯(lián)或連接方式。本發(fā)明的實(shí)施方案包括SEQ ID NO :71-92、94_106和/或110-112的兩種或更多 種肽序列的至多、至少或大約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、100、150、200、250、500或更多。在另一些方面，本發(fā)明的肽包括SEQ ID N0:l-70和其它HPV L2多肽的對(duì)應(yīng)序列。在某些方面，L2多肽區(qū)段與SEQ IDN0 :71_92、 94-106、110-112和/或SEQ ID NO :1_70的對(duì)應(yīng)序列和/或SEQID NO :1_70的區(qū)段和/或 其它PV L2多肽或其區(qū)段具有至少或大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性?？墒褂靡环N或多種所述多肽作為預(yù)防、治療或防止乳頭瘤病毒感染的疫苗組合 物。在某些方面中，所述組合物可以與藥物載體聯(lián)用。在暴露于乳頭瘤病毒之前向個(gè)體施 用所述疫苗組合物以最小化或防止乳頭瘤病毒感染，或者在患者已感染之后施用以降低感 染的嚴(yán)重程度以及延緩/阻止疾病的發(fā)展或者防止乳頭瘤病毒從被感染宿主向另一未被 乳頭瘤病毒感染的個(gè)體傳播。本文所用的術(shù)語“抗原”或“免疫原性肽”是能夠與抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子。 抗原還能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞和/或T淋巴細(xì)胞的產(chǎn) 生。引起生物應(yīng)答的抗原結(jié)構(gòu)方面在本文中稱作“抗原決定簇”。B淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生抗體 對(duì)外來抗原決定簇產(chǎn)生應(yīng)答，而T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的媒介物。因此，抗原決定簇或表位 是被抗體(在MHC情形中，是被T細(xì)胞受體)所識(shí)別的抗原部分。通常，抗原是源自病原生 物(例如HPV)表達(dá)之蛋白質(zhì)的肽。抗原決定簇不必是連續(xù)的蛋白質(zhì)序列或區(qū)段，其可包含 彼此不緊鄰的多種序列。在某些方面中，抗原決定簇是PV多肽區(qū)段、PV肽。對(duì)于特定的氨基酸序列來說，“表位”是這樣一組氨基酸殘基，其參與特定免疫球 蛋白的識(shí)別，或者在T細(xì)胞的情形中，其為T細(xì)胞受體蛋白和/或主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)受體識(shí)別所必需的那些殘基。表位的氨基酸殘基不必是連續(xù)的。在體內(nèi)或體外的免 疫系統(tǒng)設(shè)置中，表位是分子的綜合特征，例如一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)肽結(jié)構(gòu)以及電荷，其共同形 成被免疫球蛋白、T細(xì)胞受體或HLA分子識(shí)別的位點(diǎn)。在本公開通篇中，“表位”和“肽”常 互換使用。本文所用的“B細(xì)胞表位”或“靶表位”是指在針對(duì)含某抗原(例如HPV L2區(qū)段或 其亞區(qū)域)之肽的免疫應(yīng)答中被B細(xì)胞受體識(shí)別的該肽或蛋白質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)。本文所用的“HPV”和“人乳頭瘤病毒”是指能夠感染人類的乳頭瘤病毒(PV)屬的 成員。有兩個(gè)主要的HPV群(生殖器群和皮膚群)，其中每個(gè)群含有多種病毒“類型”或“毒 株”(例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV32等)。本發(fā)明中特別關(guān)注的是與生殖器感染和惡性 病變有關(guān)的HPV類型。術(shù)語“疫苗”是指含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種本發(fā)明多型HPV肽組合物
的制劑。所述多型HPV肽組合物通常采用能夠向?qū)ο笫┯玫男问?，并誘導(dǎo)保護(hù)性或治療性 免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答足以誘導(dǎo)免疫力來預(yù)防和/或改善感染和/或減少感染的至少一種癥 狀和/或增強(qiáng)另一抗HPV治療的功效和/或減弱HPV感染和/或減弱HPV的傳播性。通 常，疫苗含有本發(fā)明組合物混懸或溶解于其中的常規(guī)鹽水或緩沖水溶液介質(zhì)。在另一些方 面，所述疫苗可以是固體(例如粉末或凍干制劑)。本發(fā)明的組合物可方便地用于預(yù)防、改 善或治療感染。在引入宿主后，所述組合物能夠激發(fā)免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體和/或細(xì) 胞因子的產(chǎn)生和/或細(xì)胞毒T細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹突細(xì)胞的活化和/或其 它細(xì)胞應(yīng)答。本文所用的“預(yù)防性”疫苗或組合物是設(shè)計(jì)并施用以預(yù)防由病原生物(特別是HPV)引起或與之相關(guān)的感染、疾病和/或任何相關(guān)后遺癥的組合物。本文所用的“治療性”疫苗或組合物是設(shè)計(jì)并向已感染病原生物(例如至少一種 HPV毒株)的患者施用的組合物。治療性疫苗(例如治療性HPV疫苗)用于預(yù)防和/或治 療這些被感染對(duì)象中良性或惡性腫瘤的進(jìn)展。當(dāng)用于權(quán)利要求和/或說明書中時(shí)，術(shù)語“抑制”、“減少”或“預(yù)防”或這些術(shù)語的 任何變型包括任何可測(cè)量的降低或完全抑制以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果。在權(quán)利要求和/或說明書中，當(dāng)單數(shù)名詞與術(shù)語“包括(包含)”聯(lián)用時(shí)可表示“一 個(gè)(種)”，也可表示“一個(gè)(種)或更多”、“至少一個(gè)(種)”以及“一個(gè)(種)或多于一個(gè) (種)”的含義。在本申請(qǐng)通篇中，術(shù)語“約”用于表示數(shù)值包括用于確定該數(shù)值之設(shè)備或方法的標(biāo) 準(zhǔn)誤差。在權(quán)利要求中，術(shù)語“或”用于表示“和/或”，除非明確指明僅指替代方案中之一 或者各替代方案間相互排斥，但是本公開支持這樣的定義，即僅指替代方案以及“和/或”。 還應(yīng)考慮的是，使用術(shù)語“或”列出的任何內(nèi)容還可具體排除。如本說明書和權(quán)利要求中所用，表述“包含”(以及“包含”的任何形式，例如“含 有”和“含”)、“具有”(以及“具有”的任何形式，例如“有”)、“包括”(以及“包括”的任何 形式，例如“涵蓋”)或“含有”(以及“含有”的任何形式，如“包含”和“含”)是開放式的， 不排除其它未引述的元件或方法步驟。應(yīng)考慮，本文列出的一個(gè)或多個(gè)成員可以從本發(fā)明的保護(hù)范圍中特定排除或囊括 在其中。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案在本申請(qǐng)通篇中進(jìn)行了論述。就本發(fā)明之一個(gè)方面所討 論的任何實(shí)施方案也適用于本發(fā)明的其它方面，反之亦然。實(shí)施例部分中的實(shí)施方案應(yīng)當(dāng) 理解為可適用于本發(fā)明所有方面的本發(fā)明實(shí)施方案。通過如下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目 的、特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)涉及本發(fā)明具體實(shí)施方案時(shí)，所述詳細(xì)描述 和具體實(shí)施例僅通過舉例說明的方式給出，這是因?yàn)?，通過該詳細(xì)描述，本發(fā)明精神和范圍 內(nèi)的各種變動(dòng)和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。


以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，并進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考這 些附圖中的一幅或多幅并結(jié)合本文中對(duì)具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā) 明。圖1.用多型L2疫苗接種小鼠誘導(dǎo)出比單體L2疫苗或L1VLP更廣泛交叉中和性 的抗體。在第0、15、30天用PBS或者GPI-0100(50ii g)佐劑中的25y g不同的L2單體構(gòu) 建物和多型構(gòu)建物或者無佐劑的HPV16L1VLP或HPV45L1VLP皮下接種BALB/c小鼠。使用 所示基因型的HPV假病毒，利用從最終免疫兩周后的小鼠中收集的兩倍稀釋的抗血清進(jìn)行 體外中和測(cè)定。圖示實(shí)現(xiàn)50%中和的終點(diǎn)效價(jià)。圖2.單獨(dú)的多型L2蛋白質(zhì)是免疫原性的，并且對(duì)于廣泛中和性抗體應(yīng)答來 說，其不需要特別的佐劑。在第0、15和30天時(shí)，僅用明礬(Alum) (1. 3mg)或者僅用 ISS1018(10iig/小鼠)或者 PBS 或者僅用 25iigll-200X3(SEQ ID NO 113)或者與明礬(1. 3mg)或與 ISS1018 (10 u g/ 小鼠)或與 GPI-0100 (50 u g/ 小鼠或 200 u g/ 小鼠)或與 GPI-0100(50ii g/小鼠)+Tween 40(lmg/小鼠)或與明礬和 ISS1018 (10 y g/小鼠)一起配 制的25iig 11-200X3(SEQ ID NO: 113)皮下接種BALB/c小鼠。使用所示基因型的HPV假 病毒，利用從最終免疫兩周后的小鼠中所收集抗血清的兩個(gè)稀釋度進(jìn)行體外中和測(cè)定。圖 示實(shí)現(xiàn)50%中和的終點(diǎn)效價(jià)。圖3.用與不同佐劑聯(lián)用的L2 11-200X3(SEQ ID NO :113)接種小鼠4個(gè)月后， 進(jìn)行體內(nèi)HPV16假病毒攻擊。用PBS或不同佐劑中的25ii g L211-200X3(SEQ ID NO: 113)或僅用佐劑，以兩周為間隔，接種小鼠3次。以下列出從左至右的各組僅用PBS、 僅用明礬(1. 3mg)、僅用 ISS1018(10u g/ 小鼠)、僅用 11_200X3(SEQ ID NO :113)、 11-200X3(SEQ ID NO 113)+ISS1018 (10 ii g/ 小鼠)、11-200 X 3 (SEQ ID N0:113)+ 明 礬(1. 3mg) ,11-200X3 (SEQ ID NO : 113)+GPI-0100 (50 ii g/ 小鼠)、11-200 X 3 (SEQ ID NO :113)+GPI-0100(200ii g/ 小鼠)、11-200 X 3 (SEQ ID NO : 113)+GPI-0100 (50 ii g/ 小 鼠)+Tween 40 (lmg/小鼠)、11-200 X 3 (SEQID NO : 113) + 明礬+1018 (10 ii g/小鼠)。免疫 約4個(gè)月后，用電動(dòng)剃刀剃去每只經(jīng)麻醉BALB/c小鼠腹部上一小片毛發(fā)，但不傷到上皮。然 后，用10iU 0.6%羧甲基纖維素中的3X109HPV16假病毒粒子(lOOng)(帶有螢光素酶報(bào) 告構(gòu)建物)攻擊小鼠。三天后，麻醉小鼠并注射螢光素，使用Xenogen IVIS 200獲得10分 鐘圖像。使用Living Image 2. 20軟件分析包含接種位點(diǎn)的大小相等區(qū)域，并對(duì)較之于用 HPV16L1接種的小鼠受攻擊前的相對(duì)發(fā)光單位來作圖。圖 4.與 GARDASIL 相比，用 L211-200X3(SEQ ID NO 113)或 11-88 X 5 (SEQ ID NO 108)接種小鼠誘導(dǎo)出較低但更廣泛交叉中和性的抗體。在第0、15和30天時(shí)，用1/5人 劑量的 GARDASIL 或用 GPI-0100 (50 ii g)佐劑中的 25iig L211-200X3 (SEQ ID NO 113) 或11-88X5 (SEQID NO 108)接種小鼠3次。使用所示基因型的HPV假病毒，利用從最終免 疫兩周后的小鼠中所收集抗血清的兩個(gè)稀釋度進(jìn)行體外中和測(cè)定。圖示實(shí)現(xiàn)50%中和的終 點(diǎn)效價(jià)。發(fā)明詳述第一代HPV L1病毒樣顆粒疫苗花費(fèi)高并且保護(hù)類型受限，這使得有必要開發(fā)其 它廣泛保護(hù)性的第二代組合物和疫苗。次要衣殼蛋白L2通過誘導(dǎo)中和性抗體來保護(hù)動(dòng) 物免于乳頭瘤病毒的攻擊。盡管L2誘導(dǎo)交叉中和多種乳頭瘤病毒類型的抗體，然而本發(fā) 明人觀察到，較之于與進(jìn)化相關(guān)性小的類型，L2特異性抗體通常更有效地中和相關(guān)類型。 為了增強(qiáng)交叉保護(hù)，L2融合蛋白被設(shè)計(jì)成由不同HPV類型的已知交叉中和性表位組成。 將用包含17-36、1-88或11-200位殘基的HPV16L2多肽接種與用三種多型L2融合蛋白 (11-200X3(SEQ ID NO 113)類型(HPV6、16、18)、11-88 X 5 (SEQ ID NO 108)類型(HPV 1、 5、6、16、18)、17-36X22類型(5種皮膚類型、2種粘膜低風(fēng)險(xiǎn)類型和15種致癌類型))接種 進(jìn)行比較。用GPI-0100佐劑中的25iig抗原皮下接種小鼠三次。在所有單型(monotype) 多肽中，11-200產(chǎn)生最高的HPV16中和效價(jià)。然而，和與其它多型和單型融合蛋白相比， 11-200X3誘導(dǎo)出針對(duì)HPV45和HPV58以及HPV16、HPV18、HPV6的最高中和效價(jià)。用表達(dá) 螢光素酶的HPV16假病毒攻擊經(jīng)免疫小鼠。使用11-200X3(SEQ ID NO 113)接種保護(hù)小 鼠免于HPV16以及HPV16L1VLP的攻擊。對(duì)僅用25 y g 11-200X3 (SEQ IDN0 :113)蛋白或 者與明礬或與50 ii g或200 ii g GPI-0100或50 ii gGPI-0100+Tween-40 一起接種后所誘導(dǎo)的HPV中和抗體進(jìn)行比較。佐劑的存在顯著加強(qiáng)了針對(duì)11-200X3的體液應(yīng)答，但是佐劑 之間沒有顯著差異。本發(fā)明人得出結(jié)論，使用與佐劑一起配制的、包含由大腸桿菌產(chǎn)生的 HPV6L211-200 (SEQ ID NO :96)、HPV16L211-200 (SEQ ID NO :100)和 HPV18L211-200 (SEQ ID NO 101)的單一融合蛋白進(jìn)行接種是保護(hù)性的并且誘導(dǎo)廣泛交叉中和性的抗體。還考慮到，這種多型HPV組合物可用于其它病原生物(特別是那些與HPV感染方 式相同之疾病(如性傳播疾病)相關(guān)的病原生物)或用作其模型。因此，本申請(qǐng)有關(guān)HPV 或多型HPV L2肽的教導(dǎo)可以延伸至其它病原生物。I.治療性和預(yù)防性組合物本發(fā)明的實(shí)施方案包括含有來自兩個(gè)或更多HPV類型之兩種或更多種HPV多肽區(qū) 段的HPV肽組合物。在某些方面，所述HPV類型包括對(duì)于施用該組合物的特定生物或動(dòng)物 或人對(duì)象是致病性的所有或某些HPV類型。在某些實(shí)施方案中，所述HPV多肽包含至少兩 種L2表位或肽。在又一方面，所述HPV多肽包括來自至少兩個(gè)HPV類型的L2表位。HPV多 肽區(qū)段在本文中有詳細(xì)描述。本發(fā)明的方法包括治療由乳頭瘤病毒感染(例如HPV感染)引起的或與之相關(guān)的 疾病或病癥?？商峁┟庖咴远嘈虷PV肽組合物和/或與之結(jié)合的抗體在感染有HPV或者 疑似暴露于HPV或者處于感染或暴露于HPV風(fēng)險(xiǎn)的人中誘導(dǎo)或提供治療性應(yīng)答。該方法可 應(yīng)用于經(jīng)測(cè)試為HPV暴露或其它性傳播疾病呈陽性的個(gè)體、或者基于可能的暴露或?qū)淼?暴露被認(rèn)定具有感染風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。特別地，本發(fā)明包括治療HPV感染的方法。在某些實(shí)施方案中，所述治療在佐劑或載體或其它抗原(HPV抗原或來自其它病 原體(具有與HPV暴露風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)或一起發(fā)生的暴露風(fēng)險(xiǎn))的抗原存在下施用。此外，在一 些實(shí)例中，治療包括施用常用于抗病毒感染的其它藥劑，例如一種或多種抗病毒劑。在本發(fā)明的某些方面，對(duì)本發(fā)明的肽進(jìn)行構(gòu)建，從而使多種肽以彼此接近的形式 呈遞給免疫系統(tǒng)的組分。每種肽可刺激免疫系統(tǒng)的多種組分(兩種或更多種效應(yīng)細(xì)胞)或 免疫系統(tǒng)的單一組分(傾向于識(shí)別多種類型或變體之肽的效應(yīng)細(xì)胞)。所述肽可以構(gòu)建成 線性串聯(lián)體、分支串聯(lián)體(樹狀分子)、支持物或基底(例如納米顆粒、脂質(zhì)體、聚合物等) 的突起物(projection)。識(shí)別位點(diǎn)或肽的數(shù)目以整體呈現(xiàn)，其間距將決定肽的寡聚程度。 例如，四價(jià)實(shí)體(例如鏈親和素)會(huì)得到四聚體。然而，更高價(jià)也是可能的。優(yōu)選地，肽的 數(shù)目在2、3、4、5、6、7、8、9、10至10、20、25、50或更多的范圍內(nèi)(包括其間所有范圍)。在某些實(shí)施方案中，多型肽組合物是天然聚合物或其衍生物， 如蛋白質(zhì)、分支多 肽(樹狀分子)、多聚蛋白質(zhì)或編碼這些的核酸。多數(shù)肽可以附著至多糖例如葡聚糖、淀粉、 纖維素、透明質(zhì)酸、甲殼素或海藻酸或這些多糖的衍生物；合成聚合物例如聚丙二醇、聚乙 二醇(PEG)；磷脂膜，例如囊泡或脂質(zhì)體；以及無機(jī)顆粒例如聚苯乙烯或丙烯酸珠或磁珠。在某些方面，多型多肽是樹狀分子。這些樹狀分子可以例如根據(jù)Weng和Peter， White 編，"Fmoc solid phase peptide synthesis, A PracticalApproach，，Oxford University Press (2000)中 第 11 章"Chemoselective andorthogonal ligation techniques"以及美國專利公開20080207485”中公開的方案來制備，其通過引用并入本 文。用于合成分支多肽的一些其它方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。分支多肽在其 兩個(gè)或更多分支中的預(yù)定位點(diǎn)處并入肽。肽的每個(gè)分支可具有期望的長度。優(yōu)選地，各分 支的長度小于24個(gè)氨基酸。肽的分支可受到通過已知方法利用Lys殘基在合成期間對(duì)肽進(jìn)行分支的影響。以這種方式，肽在第一賴氨酸殘基上分成兩個(gè)分支，又在另一賴氨酸殘基 上進(jìn)行分支，從而形成四價(jià)實(shí)體。通過包括更多或更少的分支步驟可形成其它價(jià)(例如八 聚體)。通過對(duì)合成肽進(jìn)行部分分支還可以獲得奇數(shù)價(jià)。在某些實(shí)施方案中，多肽的一個(gè)或多個(gè)末端附著至支持物或基底，例如在一個(gè)方 面形成從支持物延伸出的多肽環(huán)。本發(fā)明的肽可包含在不同的遞送載體或形式(例如病毒 樣顆粒(VLP)或脂質(zhì)體)中，或者在生物可降解顆粒的表面上，或者在珠或微?；蚣{米顆粒 的表面上。A.感染性病原體本文所用的“感染”或“感染性疾病”是指由感染性生物經(jīng)表面、局部或系統(tǒng)性侵 入宿主而引起的疾病。感染性生物包括細(xì)菌、病毒、寄生物、真菌和原生動(dòng)物。細(xì)菌包括革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌的實(shí)例包括但 不限于巴氏桿菌屬(Pasteurella)物種、葡萄球菌屬(Staphylococcus)物種包括金 黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；鏈球菌屬(Streptococcus)物種包括A型 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenesgroup A)、草綠色鏈球菌(Streptococcus viridans group) > B M ^C L lillif (Streptococcus agalactiae group B)、牛 王求胃 (Streptococcus bovis)、厭氧鏈球菌(Streptococcus anaerobic species)、月市炎鏈球菌 (Streptococcuspneumoniae)禾口獎(jiǎng)鏈球菌(Streptococcus faecalis)；桿菌屬(Bacillus) 物種包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種包括白喉 桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、需氧棒狀桿菌屬物種和厭氧棒狀桿菌屬物種；類 白喉菌物種；李斯特氏菌屬(Listeria)物種包括單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ；胃M (Erysipelothrix)(Erysipelothrix rhusiopathiae)；梭菌屬(Clostridium)物種包括產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)和艱難梭菌(Clostridium difficile)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于奈瑟菌屬(Neisseria)物種包括淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrhoeae)禾口 腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)；布蘭漢氏菌 屬(Branhamella)物種包括粘膜炎布蘭漢氏菌(Branhamellacatarrhalis)；埃希氏菌 屬(Escherichia)物禾中包括大腸桿菌(Escherichiacoli)；腸桿菌屬(Enterobacter) 物種；變形菌屬(Proteus)物種包括奇異變形菌(Proteus mirabilis)；假單胞菌 屬(Pseudomonas)物種包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼻疽假單胞菌 (Pseudomonas mallei)禾口假鼻痕假單胞菌(Pseudomonas pseudomallei)；克雷伯氏 菌屬(Klebsiella)物種包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)；沙門氏菌 屬(Salmonella)物種；志賀氏菌屬(Shigella)物種；沙雷氏菌屬(Serratia)物種；不 動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)物種；嗜血桿菌屬(Haemophilus)物種包括流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)禾口杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)；布魯氏菌屬 (Brucella)物種；耶爾森氏菌屬(Yersinia)物種包括鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis) 和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)；弗朗西斯氏菌屬(Francisella) 物種包括土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)；巴氏桿菌屬物種包括多殺巴氏桿 菌(Pasteurella multocida)；霍舌匕弧菌(Vibrio cholerae)；黃桿菌屬(Flavobacterium) 物種；腦膜敗血黃桿菌(meningos印ticum)；彎曲菌屬(Campylobacter)物種包括空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)；類桿菌屬(Bacteroides)物種(口腔、咽部)包括脆 弱類桿菌(Bacteroides fragilis)；梭桿菌屬(Fusobacterium)物種包括具核梭桿菌 (Fusobacteriumnucleatum)；肉芽腫鞘桿菌；鏈桿菌屬(Str印tobacillus)物種包括念珠 狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)；軍團(tuán)菌屬(Legionella)物種包括嗜肺軍團(tuán) 菌(Legionella pneumophila)。另外的細(xì)菌類型包括抗酸桿菌(acid-fast bacillus)、螺旋體和放線菌。抗酸桿 菌的實(shí)例包括分枝桿菌屬(Mycobacterium)物種，其包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriuml印rae)。螺旋體的實(shí)例包括密螺旋體 屬(Tr印onema)物種(包括梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum)、細(xì)弱螺旋體(Treponema pertenue))、疏螺旋體屬(Borrelia)物種(包括伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi) (萊姆病，Lyme disease)和回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis))以及鉤端螺旋體屬 (Leptospira)物種。放線菌的實(shí)例包括放線菌屬(Actinomyces)物種(包括伊氏放線菌 (Actinomyces israelii))和諾卡氏菌屬(Nocardia)物種(包括星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides))。病毒的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、人免疫缺陷病毒(包括HIV-1、HDTV_III、 LAVE、HTLV-III/LAV、HIV-III、HIV-LP)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、小 RNA 病毒、脊髓灰質(zhì)炎病 毒、甲型肝炎病毒、腸道病毒、人柯薩奇病毒(human Coxsackie virus)、鼻病毒、艾柯 病毒、杯狀病毒(Calcivirus)、披膜病毒、馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒、黃病毒(Flavirus)、 登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、皰疹性口腔炎病毒、狂犬病病 毒、線狀病毒、埃博拉病毒、副粘病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞 病毒(RSV)、正粘病毒、流感病毒、布尼亞病毒(Bungavirus)、漢坦病毒、白蛉病毒和納伊 羅病毒(Nairovirus)、沙粒病毒(Arena virus)、出血熱病毒、呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒、輪 狀病毒、雙RNA病毒(Bimavirus)、肝DNA病毒、乙型肝炎病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒科 (Papovaviridae)、乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、皰疹病毒包括1型和2型單純皰疹病毒、 水痘帶狀皰疹病毒、痘病毒、天花病毒、牛痘病毒、虹彩病毒(Irido virus)、非洲豬瘟病毒、 丁型肝炎病毒、非甲型非乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、諾沃克病毒、星狀病毒以及未分類 的病毒。真菌的實(shí)例包括但不限于隱球菌屬(Cryptococcus)物種包括新型隱球 菌(Crytococcus neoformans)；組織胞漿菌屬(Histoplasma)物種包括莢膜組織胞 漿菌(Histoplasma capsulatum)；球孢子菌屬(Coccidiodes)物種包括粗球孢子 菌(Coccidiodes immitis)；副球孢子菌屬(Paracoccidioides)物種包括巴西副球 ？包子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)；芽生菌屬(Blastomyces)物禾中包括皮炎 芽生菌(Blastomycesdermatitidis)；衣原體屬(Chlamydia)物種包括沙眼衣原體 (Chlamydiatrachomatis)；念珠菌屬(Candida)物種包括白色念珠菌(Candidaalbicans)； 孢子絲菌屬(Sporothrix)物種包括申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii)；曲霉屬 (Aspergillus)物種以及毛霉病的真菌。其它感染性生物包括寄生蟲。寄生蟲包括瘧原蟲屬(Plasmodium)物種，例如包 括惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、卵形皰 原蟲(Plasmodium ovale)和間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)的瘧原蟲屬物種以及剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)。血源性和/或組織寄生蟲包括瘧原蟲屬物種、巴貝蟲屬 (Babesia)物種包括田鼠巴貝蟲(Babesia microti)和分歧巴貝蟲(Babesia divergens)、 利什曼原蟲屬(Leishmania)物種包括熱帶利什曼原蟲(Leishmaniatropica)、巴西利 什曼原蟲(Leishmania braziliensis)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)；錐 蟲屬(Trypanosoma)物種包括岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)、羅得西亞錐蟲 (Trypanosoma rhodesiense)(非洲睡目民病(Africna sleeping sickness))禾口克氏維蟲 (Trypanosoma cruzi)(查力口斯病(Chagas，disease))。其它醫(yī)學(xué)相關(guān)微生物已在文獻(xiàn)中有廣泛地描述，例如參見Thomas，Medical Microbiology, Bail1iere Tindall, Great Britain 1983 禾口 Murray, Medical Microbiology (ISBN 0323033032)，2005，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。B. HPV 疫苗本發(fā)明包括預(yù)防或改善HPV感染的組合物。因此，本發(fā)明涉及用于主動(dòng)和被動(dòng)免 疫實(shí)施方案中的疫苗?？蓮暮蠬PV L2蛋白質(zhì)區(qū)段的多型HPV多肽制備計(jì)劃用作疫苗的免 疫原性組合物。在另一些實(shí)施方案中，多型HPV L2多肽可與其它HPV蛋白質(zhì)或其區(qū)段(例 如El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8和/或L1蛋白質(zhì))聯(lián)用。參見例如美國專利7，425，438、 7，416，846,7, 416，732,7, 407，807,7, 374，767,7, 201，908,7, 189，513 和 7，288，258，其均 通過引用全部并入本文。通常，疫苗以與疫苗制劑相容的方式并以治療有效量和/或產(chǎn)生免疫原性的量來 施用。待施用的量取決于待治療的對(duì)象，包括個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力以及期望的保 護(hù)程度。所需施用的活性成分的精確量取決于從業(yè)者的判斷。通常，每次接種或施用可施 用 0. 1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 至 100ng、y g 或 mg。首次施用和加強(qiáng)注射的合 適方案也可以不同，通常是在首次施用后隨后進(jìn)行接種或其它施用。1.HPV多肽和多肽區(qū)段在本發(fā)明的某些方面，HPV多肽的不同區(qū)段被用作多型HPV多肽疫苗的HPV肽組 分。在某些方面，HPV多肽是L2多肽。在另一方面，L2多肽是朋￥1，朋￥2，朋￥3，朋￥4，朋乂5， HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91，HPV92，HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99, HPV100 或更多(參見 SEQ ID NO 1-70)；以及動(dòng)物乳頭瘤病毒1型牛乳頭瘤病毒(BPV1)、2型牛乳頭瘤病毒(BPV2)、 4型牛乳頭瘤病毒(BPV4)、棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)、鹿乳頭瘤病毒(DPV)、歐洲麋鹿乳頭 瘤病毒(EEPV)、犬口腔乳頭瘤病毒(C0PV)、恒河猴乳頭瘤病毒(RhPV)或兔口腔乳頭瘤病毒 (R0PV)L2 肽表位。“人乳頭瘤病毒匯編在線版(The HumanPapillomaviruses Compendium On Line)”匯編并發(fā)布了與人乳頭瘤病毒(HPV)和相關(guān)動(dòng)物乳頭瘤病毒有關(guān)的相關(guān)分子 數(shù)據(jù)° 可通過互聯(lián)網(wǎng)訪 l、n] i亥夕[I編(hpv-web. lanl.gov/stdgen/viras/hpv/compendium/htdocs/HTML_FILES/HPVcompintro4. html)，從本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日和申請(qǐng)日起，其通過引用 并入本文。L2多肽的實(shí)例可以在公眾可獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫如GenBankfeb) .SwissPro (sp)、 EMBL等中找到。代表性的數(shù)據(jù)庫條目(按HPV類型列出，括號(hào)中為登記號(hào))包括但不限于 HPV2(gb/AAY86489, gb/ABN49461, gb/ABN49469, gb/AB014925, gb/NP_077121) ；HPV3 (sp/ P36744) ；HPV7(gb/NP_041858. 1) ；HPV10 (gb/NP_041745) ；HPV16(gb/AA085414, gb/ AA015703, gb/AA015711, gb/AAQ10726, gb/AAV91650) ;HPV18(gb/AAF14009，gb/ABP99710, gb/ABP99718, gb/ABP99726, gb/ABP99742, gb/ABP99766, gb/ABP99774, gb/ABP99782, gb/ABP99790, gb/ABP99798, gb/ABP99806, gb/NP_040316) ；HPV26(gb/NP_041786.1)； HPV27(dbj/BAE16268, sp/P36755) ；HPV28 (sp/P50799) ；HPV29(sp/P50800) ；HPV30(sp/ P36756) ；HPV33(sp/P06418) ；HPV39(gb/AAA47055) ；HPV40(sp/P36760) ；HPV43(sp/ Q705H5) ；HPV45(gb/AAY86493) ；HPV45(gb/ABP99814, gb/ABP99854, gb/ABP99862, gb/ ABP99870, gb/ABP99878, gb/ABP99894, gb/ABP99902, sp/P36761) ；HPV51(sp/P26539)； HPV52(sp/P36763) ；HPV53(gb/ABU54103, gb/ABU54117, gb/ABU54131, gb/ABU54152, gb/ABU54159, gb/ABU54173, gb/NP_041847) ；HPV56(gb/AB076808, gb/AB076815, gb/ AB076822, gb/AB076829, sp/P36765) ；HPV57(dbj/BAF80485, sp/P22164) ；HPV58(sp/ P26538) ；HPV59 (emb/CAA54855) ；HPV61 (ref/NP_043449) ；HPV62(sp/Q676U7) ；HPV66(gb/ AB076836, gb/AB076843, gb/AB076857, gb/AB076864, gb/AB076885, gb/AB076892, gb/ AB076899, sp/Q80960) ；HPV68a(gb/AAZ39497) ；HPV69(sp/Q9JH45) ；HPV70(gb/AAC54856)； HPV71(gb/AAQ95182,gb/AAQ95189,gb/AAQ95203,ref/NP_597937) ；HPV72(emb/CAA63878)； HPV77(emb/CAA75467) ；HPV81(emb/CAF05697) ；HPV82 (gb/AAK28455, sp/Q9IR53)； HPV83(gb/AAD38973) ；HPV84 (gb/AAK09276) ；HPV85(gb/AAD24187) ；HPV86(gb/AAL06740)； HPV87 (emb/CAC17717) ；HPV89(gb/AAM92156) ；HPV90(ref/NP_671508) ；HPV91(gb/ AAM89135) ；HPV94(dbj/BAD89178, emb/CAF05714) ；HPV97(gb/AAZ39505, gb/AB027082)； HPV102 (gb/AAZ39525)；或HPV106 (gb/AAZ39518)。自本申請(qǐng)的申請(qǐng)日起，所述登記號(hào)代表 的各氨基酸序列通過引用并入本文。在某些方面，來自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或更多 HPV 類型的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多種 L2肽偶聯(lián)在一起形成多型HPV多肽(參見SEQ ID NO :94、108、109和113)?？赏ㄟ^表達(dá)或 合成融合蛋白、或通過肽的相互化學(xué)綴合、或?qū)㈦呐c常規(guī)基質(zhì)或聚合物進(jìn)行化學(xué)綴合來進(jìn) 行區(qū)段偶聯(lián)。本發(fā)明的肽可包含從HPV L2多肽的第1,5,10,15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110， 120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300， 310，320330,340，350，360，370，380，390，400，410，420，43，440，450，460，470，480 或 490 位 氨基酸(包括其間的所有數(shù)值)開始的10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75， 80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250， 260，270,280,290,300,310,320330,340,350,360,370,380，390，400，410，420，43，440， 450，460，470，480或490個(gè)連續(xù)氨基酸(包括其間的所有數(shù)值和范圍)。在某些實(shí)施方案 中，HPV L2多肽包括但不限于SEQ ID NO :1至SEQ IDN0 :70。
在某些方面，所述多型HPV多肽包含選自如下的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多肽的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、60、70、80、90、100、200或更多HPV L2 17-36-DIYPSCKISNTCPPDIQNKI(SEQ IDN0 72), HPV L217-36-DLYRTCKQAG TCPPDIIPRV(SEQ ID NO 73),HPV L217-36-DIYPACKVANNCPPDIQNKI(SEQ ID NO 74),HPV L2 17-36-HIYQTCKQAGTCPPDVINKV(SEQ ID NO 75),HPV L2 17-36-HIYQTCKQAGTCPPDVINKV(SEQ ID NO 76), HPV L2 17-36-QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO 77), HPV L2 17-36-QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO78),HPV L2 17-36-QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(SEQ ID NO 71) , HPV L2 17-36-DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV (SEQ ID NO 79) , HPV L2 17-36-QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI(SEQ ID NO 80) ,HPV L2 17-36-QLYQTCKATGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO 81) , HPV L2 17-36-QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO 82) , HPV L2 17-36-DLYRTCKQSGTCPPDVVDKV(SEQ ID NO83),HPV L2 17-36-DLYRTCKQSGTCPPDVINKV(SEQ ID NO 84) , HPV L2 17-36-QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV (SEQ ID NO 85) , HPV L2 17-36-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO86),HPV L2 17-36-QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI(SEQ ID NO 87) , HPV L2 17-36-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO 88) , HPV L2 17-36-DLYKTCKQAGTCPSDVINKV(SEQ ID NO 89),HPV L2 17-36-DLYKTCKQSGTCPSDVINKV(SEQ ID NO 90) , HPV L2 17-36-QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV (SEQ ID NO 91)禾口 / 或 QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO :92)。又一方面，所述多型HPV多肽包含HPV L217-36x22的氨基酸序列-DIYPSCKISNTCP PDIQNKIDLYRTCKQAGTCPPDIIPRVDIYPACKVANNCPPDIQNKIHIYQTCKQAGTCPPDVINKVHIYQTCKQAG TCPPDVINKVQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVQLYQTCKATGTCPPDVIPKVQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVDLYKTCK QSGTCPPDVVPKVQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIQLYQTCKATGTCPPDVIPKVQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVDLYR TCKQSGTCPPDVVDKVDLYRTCKQSGTCPPDVINKVQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVQLYQTCKASGTCPPDVIPKVQ LYKTCKLSGTCPEDVVNKIQLYQTCKASGTCPPDVIPKVDLYKTCKQAGTCPSDVINKVDLYKTCKQSGTCPSDVIN KVQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVQLYSTCKAAGTCPPDVIPKV(SEQ ID NO :93)。另一方面，所述多型HPV多肽包含選自如下的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多肽的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、60、70、80、90、100、200或更多:HPV L2 1l-88-KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTR PPTATDTLAP(SEQ ID NO 94)，HPV L2 11-88-KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQff SSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPT(SEQ ID NO 95), HPV L2 11-88-KRAAPKDI YPSCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPT(SEQ ID NO 96)，HPV L2 11-88-KRDSVTHIYQTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTG GATGYVPLGEGPGVRVGGTPT(SEQ ID NO 97), HPV L2 11-88-KRASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVE HNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLGTSAKPSITSGPM(SEQ ID NO 98)HPV L2 11-88 SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAK RA(SEQ ID NO 99), HPV L2 11-88SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFGGLGIGT GSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRA(SEQ ID NO 100), HPV L2 11-88SVTDLYKTCKQSGTCPPDVVP KVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRA(SEQ ID NO 101), HPVL2 11-88SATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTV SEASIPRA(SEQ ID NO 102), HPV L2 11-88SATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIF LGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRA(SEQ ID NO 103), HPV 12 11-88SVTQLYSTCKAA GTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARA(SEQ ID NO 104)， HPV L2 11-88SATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYV PLGSRPSTIVDVTPARKKRA(SEQ ID NO :105)，and/or HPV L2 11-88SATQLYKTCKQAGTCPPDVIPK VEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP(SEQID NO 106)。在某些實(shí)施方案中，多型HPV多肽包含HPV L211-88X5的氨基酸-KRASATQLYKT CKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPKRASVTDLYK TCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTKRAAPKDIYP SCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPTKRDSVTHIY QTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGATGYVPLGEGPGVRVGGTPTKRASATQL YQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGVPLGTSAKPSITSGPM(SEQ ID NO 107).在又一實(shí)施方案中，多型HPV多肽包含HPV L211-88X8的氨基酸-SATQLYQTCKLTG TCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRASATQLYKTCKQ AGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQ SGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQLYQTC KAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTVSEASIPRASATDLYRTC KQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYST CKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARASATQLYK TCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPARKKRASATQ LYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP(SEQ ID NO 108).在又一實(shí)施方案中，多型HPV多肽包含來自HPV6b、HPV16、HPV18、HPV31、HPV39、 HPV5UHPV56和HPV73之L2的同源區(qū)。HPV L211-88X8的氨基酸是MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAK PSITSGPMAKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTR PPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGR SNTVVDVGPTRKRASATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLS TRPSTVSEASIPRASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLG GRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLG GGGRPGVVDIAPARASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPL GSRPSTIVDVTPARKKRASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGY VPLSTGTPSKPVEIP(SEQ ID NO: 109)。在另一實(shí)施方案中，多型HPV多肽包含選自如下的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多 月太的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、60、70、80、90、100、200 或更多HPV L211 -200-KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTL ADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDSTIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEPSIVQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSV EDIPLDT(SEQ ID NO 110), HPV L2 11-200-KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGS MGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIP PDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVFTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDT(SE Q ID NO: 111)和 / 或HPV L2 ll-200-KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIF LGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGFID ITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAFSDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQT(SEQ ID N0:112)。在某些實(shí)施方案中，多型HPV多肽包含HPV L211-200 X 3的氨基酸序列KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPVQTAP RPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDSTIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTS IFKNPAFAEPSIVQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSVEDIPLDTKMSATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGIADQ ILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPT PVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPM DTKRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVG PTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGFDITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAF SDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQT(SEQ ID N0:113)。在某些實(shí)施方案中，多型多肽“FurinDKILKX15”包含來自HPV6b、HPVlU HPV16、 HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59 和 HPV73 的 L2蛋白質(zhì)序列。FurinDKILKX 15的氨基酸序列是MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKASATQLYQTCKATGTCPPDVIPKVEHTTIADQI LKASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQASATQ LYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRASATQLYQTCKATGTCPPDVIPKVEGSTIADQILKASATQLYRTCKA AGTCPPDVIPKVEGNTVADQILKASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQASATDLYRTCKQSGTCPPD VINKVEGTTLADKILQASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQASATQLYQTCKASGTCPPDVIPKVEG TTIADQLLKASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQASATQLYQTCKASGTCPPDVIPKVEGTTIADQI LRASATDLYKTCKQAGTCPSDVINKVEGTTLADKILQASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILK(SEQ ID NO 114)。本發(fā)明的肽通常使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽合成方法來合成和/或利用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的肽化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)。在另一些方面，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重 組技術(shù)表達(dá)和純化本發(fā)明的肽和多肽。2.接頭本發(fā)明涵蓋包含多種肽的寡聚體或融合蛋白。這種寡聚體可采用共價(jià)連接或非共 價(jià)連接多聚體(包括二聚體、三聚體或更高寡聚體)的形式。在本發(fā)明的一方面，所述寡聚 體保持刺激免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含通過肽之間共價(jià)或非共價(jià)接 頭連接之多個(gè)肽的寡聚體。此類接頭可以是肽接頭(間隔序列)或具有促進(jìn)寡聚化之特性 的肽。亮氨酸拉鏈和某些源自抗體的多肽屬于能夠促進(jìn)其所附著的肽寡聚化的肽。合適的 肽接頭包括美國專利4，751，180和4，935，233中所描述的那些，其通過引用并入本文。在 某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽通過肽鍵連接，在肽之間沒有可辨識(shí)的接頭。3.遞送載體
已知的疫苗制劑采用多種遞送載體用于向哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)呈遞這種抗原，從而 引發(fā)針對(duì)病原體的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。這種“遞送載體”包含作為疫苗的熱滅活或 化學(xué)滅活的完整病毒、完整病毒的蛋白質(zhì)顆粒、病毒載體(例如腺病毒和牛痘等)以及基于 DNA的載體或質(zhì)粒。病毒樣顆粒病毒樣顆粒(VLP)已被研究作為疫苗。一般地，包衣殼的病毒包含經(jīng) 組裝而含有病毒核酸蛋白質(zhì)的外層或“衣殼”。許多病毒具有能夠用分別表達(dá)的衣殼蛋白進(jìn) 行“自組裝”(在表達(dá)衣殼的細(xì)胞內(nèi)(“體內(nèi)組裝”)以及在分離和純化之后的細(xì)胞外(“體 外組裝”))以形成VLP的衣殼。病毒樣顆粒模擬病毒顆粒的整體結(jié)構(gòu)，而不需要包含感染性物質(zhì)。VLP可不含病毒 DNA或RNA基因組，但保留了真病毒的三維結(jié)構(gòu)。VLP能夠刺激B細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答、CD4增殖 性應(yīng)答和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。參見Schirmbeck等(1996) Intervirology 39，111-119 ； Paliard 等(2000)AIDSRes. Hum. Retroviruses 16，273-282 ;Murata 等(2000)PNAS USA 100,6753-6758。還可參見美國專利公開20070041999，其通過引用全部并入本文。已生產(chǎn)了針對(duì)感染人類和其它動(dòng)物的、超過30種不同病毒的VLP，所述病毒包括 諾沃克病毒、乙型和丙型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒和甲型流感病毒。還可以操作病毒樣顆粒用作載體分子來遞送其它病原體的表位。參見，Noad 等(2003)Trends in Microbiology 11(9)，438-444 ；Sadeyen 等(2003)Virology 309 32-40 ；PCT 公開 WO 2005/005614 ；美國專利公開 2004/0033585 和 2005/0048082 ；美國 專利 6, 448, 070,6, 110, 466,6, 171，591 ；Brinkman 等(2004) Lett. Drug Des. & Disc. 1 137-147?？尚揎椧職さ鞍资蛊浒乖噪?，產(chǎn)生重組病毒衣殼蛋白-抗原性肽的融合 物。然后可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)這種衣殼蛋白_抗原性肽融合產(chǎn)物，在體內(nèi)或體外組裝以 形成重組病毒或病毒樣顆粒，并施用給宿主從而引發(fā)免疫應(yīng)答。納米顆粒一方面，肽可以與非蛋白質(zhì)材料(例如，納米顆粒和其它基質(zhì))偶聯(lián)。納 米顆粒通常直徑約為Inm 200nm，其可用于提供給對(duì)象以遞送免疫原性肽。可通過共價(jià)或 非共價(jià)化學(xué)相互作用將一個(gè)或多個(gè)肽與納米顆粒附著。非共價(jià)化學(xué)相互作用可包括親合作 用(例如親合素/生物素、抗原/抗體、受體/配體)、離子相互作用和/或疏水相互作用。 用于將肽附著至固體支持物(如納米顆粒)的方法在例如美國專利公開2004/0258698中 有所描述。具有約50nm至約200nm之直徑的納米顆?？扇硇赃f送。本文所用的術(shù)語“納 米顆粒”是指納米尺寸范圍(約Inm 500nm)的、可制備成具有預(yù)定綁定分子規(guī)則排布之 表面的聚合物球或球狀體。優(yōu)選地，利用自組裝單體來形成納米顆粒。此外，術(shù)語“納米顆 ?！焙w了使用聚合和非聚合的脂質(zhì)體、bicelle和微團(tuán)以及病毒衣殼結(jié)構(gòu)。盡管納米顆粒 對(duì)于本發(fā)明的組合物和方法來說是優(yōu)選的，但是也可如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知地使用適合本 發(fā)明中配體的其它框架、支架及另外的“呈遞物(presenter)”，例如樹狀分子。多價(jià)納米顆 粒參見美國公開20030223938?？梢砸灾|(zhì)體組合物來施用本發(fā)明的肽。本發(fā)明的脂質(zhì)體可以是多層囊泡 (multilamellar vesicl^MLV)。所述脂質(zhì)體包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)，其具有親水性尾部以 及極性或化學(xué)反應(yīng)性部分(其又包含酸、醇、醛、胺或酯)。所述脂質(zhì)體還可表征為烴鏈或類 固醇尾部基團(tuán)以及極性頭部基團(tuán)。所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括磷脂。合適的磷脂的實(shí)例包 括但不限于磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
可包封于或偶聯(lián)至本發(fā)明脂質(zhì)體的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和肽。在一些實(shí)施方案中，所 述物質(zhì)包括多于一種化合物。本發(fā)明的肽可包含或綴合至將該肽定位于脂質(zhì)表面的親脂性 部分。多型肽可定位于脂質(zhì)體表面。參見美國專利公開20060035853。C.佐劑和其它免疫刺激或增強(qiáng)組分可通過使用其它非特異性免疫應(yīng)答刺激物(稱為“佐劑”)來增強(qiáng)多肽或肽或多型 HPV肽組合物的免疫原性。合適的佐劑包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如細(xì)胞因子、 毒素或合成組合物。多種佐劑可用于增強(qiáng)針對(duì)本文所述多型HPV多肽或任何其它組合物的抗體應(yīng)答。 佐劑可用于(1)誘捕體內(nèi)的抗原從而導(dǎo)致緩慢釋放；(2)將參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞吸引至施 用位點(diǎn)；(3)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的增殖或活化；或(4)改善抗原在整個(gè)對(duì)象體內(nèi)的傳播。佐劑制劑包括但不限于水包油乳劑、油包水乳劑、礦物鹽、多聚核苷酸和天然物 質(zhì)?？捎玫奶禺愋宰魟┌↖L-1、IL-2、IL-4、IL_7、IL-12和γ -干擾素、GMCSP、BCG、鋁鹽 (例如氫氧化鋁或其它鋁化合物)、MDP化合物(例如thur-MDP和nor_MDP)、CGP (MTP-PE)、 脂質(zhì)A和單磷酰脂A(MPL)。RIBI，其含有從細(xì)菌提取的三種組分，2%角鯊烯/吐溫80乳 劑中的MPL、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate，TDM)和細(xì)胞壁骨架(cell wall skeleton, CffS)、CpG1018和/或GPI-0100，包括其各種組合。在某些方面，佐劑是與TWEEN 或明礬或其組合之一種或多種聯(lián)用的CpG1018或GPI-0100。還可以使用MHC抗原。其它佐 劑或方法在美國專利6，814，971,5, 084，269,6, 656，462中舉例說明，其均通過引用并入本 文。獲得針對(duì)疫苗之佐劑作用的多種方法包括使用試劑(例如氫氧化鋁或磷酸鋁鹽 (明礬))，常以磷酸鹽緩沖鹽溶液中約0. 05至約0. 的溶液來使用，并混有以約0. 25% 溶液使用的糖的合成聚合物(CARBOPOL ),通過約70°c至約10 i°c下熱處理30秒至 2分鐘來實(shí)現(xiàn)疫苗中蛋白質(zhì)的聚集。為了獲得佐劑作用，還可通過用針對(duì)白蛋白的經(jīng)胃蛋白 酶處理的(Fab)抗體再活化來進(jìn)行聚集；與細(xì)菌細(xì)胞(例如小球隱孢子蟲(C.parvum))、革 蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素或脂多糖組分混合；在生理可接受的油介質(zhì)(例如二縮甘露醇一油 酸(Aracel A))中乳化；或與20%的全氟化碳溶液(FLUOSOL-DA )(用作封閉替代
物)乳化。典型的佐劑是完全弗氏佐劑(含有滅活的結(jié)核分枝桿菌)、不完全弗氏佐劑和氫
氧化鋁。除了佐劑以外，理想的是共施用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(biological responsemodifier,BRM)來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。已顯示，BRM上調(diào)T細(xì)胞免疫性或下調(diào)抑制細(xì)胞 的活性。這樣的BRM包括但不限于西咪替丁(Cimetidine，CIM ;1200mg/天)(Smith/Kline， PA)；或低劑量環(huán)磷酰胺(CYP ;300mg/m2) (Johnson/Mead, NJ)和細(xì)胞因子如Y-干擾素、 IL-2或IL-12或編碼參與免疫輔助功能之蛋白質(zhì)(例如B-7)的基因。T輔助細(xì)胞表位-已描述了主要T淋巴細(xì)胞的兩種類型⑶8+細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞 (CTL)和⑶4輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)。⑶8+T細(xì)胞是通過T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別由(例如被 病毒或細(xì)菌感染之細(xì)胞上的)I型MHC分子呈遞的外來抗原的效應(yīng)細(xì)胞。識(shí)別外來抗原后， ⑶8+細(xì)胞經(jīng)歷活化、成熟和增殖過程。這種分化過程產(chǎn)生CTL克隆，其能夠破壞呈遞外來 抗原的靶細(xì)胞。另一方面，T輔助細(xì)胞參與體液和細(xì)胞介導(dǎo)形式的效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。就 體液(或抗體)免疫應(yīng)答而言，抗體由B淋巴細(xì)胞通過與Th細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生。具體來說，細(xì)胞外抗原(例如循環(huán)中的微生物)被專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)捕獲、加工并與II 型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子一起呈遞至⑶4+Th細(xì)胞上。這些Th細(xì)胞繼而活化B 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生。與此相反，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)于定居于細(xì) 胞內(nèi)的微生物(例如成功感染靶細(xì)胞后的微生物)發(fā)揮中和作用。外來抗原(例如微生物 抗原)在被感染細(xì)胞內(nèi)合成，并與I型MHC分子一起呈遞于該細(xì)胞的表面上。這些表位的 呈遞導(dǎo)致上述的⑶8+CTL的刺激，該過程繼而也受到⑶4+Th細(xì)胞的刺激。Th細(xì)胞由至少兩 個(gè)不同的亞群組成，稱為Thl和Th2細(xì)胞。Thl和Th2亞型代表接觸抗原后從共同前體分化 而來的Th細(xì)胞極化群。在某些方面，多型HPV多肽還可包含Thl或Th2型應(yīng)答的優(yōu)選誘導(dǎo)物。高水平 的Thl型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì) 胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。Thl和Th2型免疫應(yīng)答之間的區(qū)別不是絕 對(duì)的。事實(shí)上，個(gè)體將支持以Thl為主或以Th2為主的免疫應(yīng)答。然而，根據(jù)Mosmarm和 Coffman (Mosmann和Coffman，1989)在鼠CD4+T細(xì)胞克隆中所描述的細(xì)胞因子家族來考慮 是方便的。通常，Thl型應(yīng)答與由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-Y和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。常直 接與誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答有關(guān)的其它細(xì)胞因子(例如IL-12)不是由T細(xì)胞產(chǎn)生的。相反 地，Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-IO的分泌有關(guān)。在某些方面，Th表位包括但不限于源自細(xì)菌蛋白質(zhì)和毒素(例如破傷風(fēng)和白喉 毒素)的τ細(xì)胞表位。例如，來自破傷風(fēng)毒素的P2和P30表位、乙型肝炎核心抗原、結(jié)核、 結(jié)核分枝桿菌RA12(MTB32A的亞序列(192 323位氨基酸)(Skeiky等1999))、麻疹病 毒/犬瘟熱病毒的P25蛋白質(zhì)KLIPNASLIENCTKAEL(SEQ ID NO 117) ；PV(脊髓灰質(zhì)炎病 毒)序列 103-115 :KLFAVWKITYKDT (SEQ ID NO 118) ；M5 :NKLIAYPAVEALS (SEQ ID NO 119)； TT (破傷風(fēng)毒素)830-844 :QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 120) ；PADRE :aKXVMWTLKAAa (a = D-Ala、X = L-環(huán)己基-Ala) (SEQ ID NO 121) ；E7p20_29 :TDLYCYEQLN(SEQ ID NO 122)； E7p45-54:AEPDRAHYNI(SEQ ID NO : 123) ；E7p60-79 :KCDSTLRLCVQSTHVIRTL(SEQ ID NO: 124) ；E7p85-94 :GTLGIVGPIC(SEQ ID NO: 125) ；ras p5-17 :KLVVVGARGVGKS(SEQ ID NO: 126) ；neu p42_56 :HLDMLRHLYQGGQW(SEQ ID NO: 127) ；neu p783_797 :SRLLGICLTSTVQLV (SEQ ID NO: 128)和 MAGE_3121_134 :LLKYRAREPVTKAE (SEQ ID NO: 129)。Toll樣受體激動(dòng)劑_目前廣泛的共識(shí)是，保護(hù)性免疫的產(chǎn)生不僅取決于對(duì)抗原 的暴露，還取決于接觸抗原的環(huán)境。有許多這樣的實(shí)例，即向炎性環(huán)境下的宿主引入新抗 原會(huì)產(chǎn)生免疫耐受而非長期免疫，但是在炎性劑(佐劑)存在下暴露于抗原則誘導(dǎo)免疫性 (Mondino 等，1996 ；PuIendran 等 1998 Jenkins 等 1994 ；以及 Keamey 等，Immunity 1 :327， 1994)。由于可存在耐受與免疫的不同，因此對(duì)于發(fā)現(xiàn)在感染病原體(其刺激參與產(chǎn)生抗 原呈遞之合適免疫原環(huán)境的分子途徑)內(nèi)存在的“佐劑”方面已作出很多努力。目前已知， 許多佐劑活性是由于微生物和病毒產(chǎn)物與免疫細(xì)胞上表達(dá)之Toll樣受體(TLR)不同成員 之間的相互作用所致的(Beutler等，2004 ；Kaisho, 2002 ；Akira等2003 ；以及Takeda和 Akira, 2004) 0 TLR是根據(jù)其與果蠅中分子(稱為Toll，其在發(fā)育中發(fā)揮作用并參與抗微生 物免疫)的同源性來命名的(Lernaitre等，1996 ；以及Hashimoto等，1988)。早期工作顯示，Toll和Toll通路分子的哺乳動(dòng)物同源物對(duì)于固有免疫系統(tǒng)之細(xì) 胞響應(yīng)于微生物攻擊和微生物副產(chǎn)物的能力至關(guān)重要(Medzhitov等，1997 ；Medzhitov等，1998 ；Medzhitov 等，2000 ；Medzhitov 等，2000 ；以及 Janeway 等，2002)。自從 LPS 被鑒定 為TLR4激動(dòng)劑(Poltorok等，1998)之后，許多其它TLR激動(dòng)劑已被描述，例如三?；嘈?HPV多肽(TLRl)、肽聚糖、脂磷壁酸和Pam3Cys (TLR2)、dsRNA(TLM)、鞭毛蛋白(TLRS)、二酰 基多型HPV多肽如Malp-2 (TLR6)、咪唑喹啉和單鏈RNA (TLR7、8)、細(xì)菌DNA、未甲基化CpG DNA序列，甚至人類基因組DNA抗體復(fù)合物(TLR9)。Takeuchi等，2001 ；Edwards等，2002 ； Hayashi 等，2003 ；Nagase 等，2003。在某些方面，TLR2配體包括但不限于脂磷壁酸、甘露糖醛酸、肽聚糖、非典型LPS、 MALP-2 和 MALP-404(脂蛋白)、OspA、孔蛋白、LcrV、脂化甘露聚糖(Iipomannan)、GPI 錨、 溶血磷脂酰絲氨酸、脂磷聚糖(LPG)、糖磷脂酰肌醇(GPI)、酵母聚糖、血凝素及其類似物或 衍生物。另一方面，TLR2激動(dòng)劑包括來自結(jié)核分枝桿菌、伯氏疏螺旋體、梅毒螺旋體的細(xì) 菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌的肽聚糖；奈瑟菌孔蛋白、細(xì)菌菌毛、耶爾森氏菌毒力因 子、CMV病毒粒子、麻疹血凝素和來自酵母的酵母聚糖。在某些方面，TLR激動(dòng)劑是脂質(zhì)部分。脂質(zhì)部分包括但不限于脂肪酸，例如棕櫚 ?；?、豆蔻?；⒂仓；凸秕；蛘吒话愕厝魏蜟2 C30飽和、單不飽和或多不飽 和脂肪?；?。在某些方面，所述脂質(zhì)部分是Pam2Cys[S-[2，3-雙(棕櫚酰氧基)丙基]半 胱氨酸]或Pam3Cys[N-棕櫚?；?S-[2，3-雙(棕櫚酰氧基)丙基]半胱氨酸]部分。 Pam3Cys或Pam3Cys-OH(WiesmulIer等，1983)是跨越革蘭陰性細(xì)菌之內(nèi)外膜的布羅氏脂蛋 白(Braun' s lipoprotein)N端部分的合成版本(例如，美國專利5，700，910，其通過引用 全部并入本文)。在美國專利公開20080145375中描述了其它TLR激動(dòng)劑，其通過引用全部 并入本文。D.脂質(zhì)組分和部分在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含與多型HPV肽非共價(jià)結(jié)合的一種或多種脂質(zhì) 的組合物。脂質(zhì)是不溶于水并且可用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取的物質(zhì)。除了本文中特別指明的以 外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)將“化合物”理解為脂質(zhì)，并涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法中。脂質(zhì)可以是天然脂質(zhì)或合成脂質(zhì)。然而，脂質(zhì)通常是生物物質(zhì)。生物脂質(zhì)是本領(lǐng)域 眾所周知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油脂、類固醇、萜類、溶血磷脂、鞘糖脂、 糖脂、硫脂、帶有醚的脂質(zhì)(lipid Withether)、酯連接的脂肪酸以及聚合脂質(zhì)，及其組合。與脂質(zhì)有關(guān)的多型HPV肽可分散于含有脂質(zhì)的溶液中、用脂質(zhì)溶解、用脂質(zhì)乳化、 與脂質(zhì)混合、與脂質(zhì)組合、包含于脂質(zhì)混懸液中或者與脂質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明的脂質(zhì)相關(guān)組合物 不限于任何特定結(jié)構(gòu)。例如，它們還可以僅僅散布于溶液中，可能形成大小或形狀不均一的 聚集體。在另一實(shí)例中，它們可存在于雙層結(jié)構(gòu)(如微團(tuán))中或具有“塌陷”結(jié)構(gòu)。在另一 非限制性實(shí)例中，還考慮lipofectamine (Gibco BRL)或Superfect (Qiagen)復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，組合物可包含約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、 約 18 %、約 19 %、約 20 %、約 21 %、約 22 %、約 23 %、約 24 %、約 25 %、約 26 %、約 27 %、 約 28 %、約 29 %、約 30 %、約 31 %、約 32 %、約 33 %、約 34 %、約 35 %、約 36 %、約 37 %、 約 38 %、約 39 %、約 40 %、約 41 %、約 42 %、約 43 %、約 44 %、約 45 %、約 46 %、約 47 %、 約 48 %、約 49 %、約 50 %、約 51 %、約 52 %、約 53 %、約 54 %、約 55 %、約 56 %、約 57 %、 約 58 %、約 59 %、約 60 %、約 61 %、約 62 %、約 63 %、約 64 %、約 65 %、約 66 %、約 67 %、約 68 %、約 69 %、約 70 %、約 71 %、約 72 %、約 73 %、約 74 %、約 75 %、約 76 %、約 77 %、 約 78 %、約 79 %、約 80 %、約 81 %、約 82 %、約 83 %、約 84 %、約 85 %、約 86 %、約 87 %、 約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約99%重量百分比(或其間任何范圍或數(shù)值)脂質(zhì)的特定脂質(zhì)，脂質(zhì)類型或非脂質(zhì)組 分例如佐劑、糖、核酸或者本文公開的其它材料等是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，考慮到 本發(fā)明的組合物可包含采用任何組合或比例范圍的任何脂質(zhì)、脂質(zhì)類型或其它組分。II.多肽及其片段的產(chǎn)生A.多肽的合成和/或綴合在某些方面，可采用針對(duì)特定氨基酸序列而變化的常規(guī)方法來合成多肽。這樣的 技術(shù)包括但不限于肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，如液相合成(參見Firm和Hoffman， 1976)或固相合成(參見Barany和Merrifield，1979)或Merrifield報(bào)道的分步固相合 成(1963)，其內(nèi)容均通過引用并入本文。肽合成技術(shù)的其它參考包括利用Lu等(1981)公 開的Fmoc-聚酰胺模式固相肽合成而合成的肽、采用Fmoc/tBu方法合成的肽(Atherton和 Sheppard, 1989)?？蓮亩嗉夜?yīng)商獲得 Fmoc 氛基酸,例如 Chem-ImpexInternational (Wood Dale, 111. ,USA) >Merck Biosciences (Nottingham, UK) UR Bachem UK Ltd. (St. Helens, UK)。合成之后或合成期間，肽可與間隔序列、氨基酸、聚合物或脂質(zhì)綴合。在某些方面， 賴氨酸或賴氨酸類似物的末端側(cè)鏈基團(tuán)(例如內(nèi)部賴氨酸的ε氨基)由多種保護(hù)基團(tuán)中 的一種所保護(hù)。封閉基團(tuán)或保護(hù)基團(tuán)或遮蔽基團(tuán)用于保護(hù)具有參與偶聯(lián)反應(yīng)之活化羧基的 氨基酸的氨基基團(tuán)，或者保護(hù)具有參與偶聯(lián)反應(yīng)之?；被陌被岬聂然鶊F(tuán)。為了發(fā) 生偶聯(lián)，必須除去封閉基團(tuán)而不破壞肽鍵，或者除去與肽之另一部分結(jié)合的任何保護(hù)基團(tuán)。 可通過本領(lǐng)域公知的方法對(duì)肽進(jìn)行脂化。標(biāo)準(zhǔn)的縮合、加成、取代或氧化(例如，內(nèi)部賴氨 酸或賴氨酸類似物的末端氨基基團(tuán)與所引入的氨基酸或肽或脂氨基酸(lipoamino acid) 的羧基末端之間形成二硫橋或酰胺鍵)反應(yīng)使脂質(zhì)添加至肽。B.表達(dá)系統(tǒng)可通過任何合適的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽及片段的表達(dá)、分離和純化。本發(fā)明還提供了包含DNA的重組克隆和表達(dá)載體，以及包含該重組載體的宿主細(xì) 胞。包含DNA的表達(dá)載體可用于制備由所述DNA編碼的本發(fā)明多肽或片段。產(chǎn)生多肽的方 法包括在促使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(其轉(zhuǎn)化有編碼所述多肽的重組表達(dá) 載體)，然后從培養(yǎng)物中回收表達(dá)的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解，用于純化所表達(dá)之多肽 的方法將根據(jù)如下因素而有所變化，例如所應(yīng)用的宿主細(xì)胞類型以及所述多肽是結(jié)合于膜 亦或是從宿主細(xì)胞分泌的可溶形式。本發(fā)明的多肽可包含指導(dǎo)運(yùn)輸或輔助純化的各種前導(dǎo) 序列?？墒褂萌魏魏线m的表達(dá)系統(tǒng)。載體包含與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列(例 如源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因的那些)有效連接之編碼本發(fā)明多肽或片段的 DNA。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及控制 轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列在功能上與所述DNA序列相關(guān)時(shí)，使核苷 酸序列有效連接。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列控制DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子核苷酸序列 與DNA序列有效連接。表達(dá)載體中一般含有使其在期望的宿主細(xì)胞中具有復(fù)制能力的復(fù)制
25起點(diǎn)以及用于鑒定將選擇轉(zhuǎn)化子的選擇基因。此外，可將編碼合適信號(hào)肽(天然或異源)的序列并入表達(dá)載體中。可以將信號(hào) 肽(分泌型前導(dǎo)肽)的DNA序列與本發(fā)明的核酸序列同框融合，從而使DNA首先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄， 繼而mRNA翻譯成包含信號(hào)肽的融合蛋白。在目的宿主細(xì)胞中具有功能的信號(hào)肽促進(jìn)多肽 的細(xì)胞外分泌。多肽從細(xì)胞分泌后，信號(hào)肽從多肽中切除。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，信號(hào)肽被切除的位置可能與計(jì)算機(jī)程序所預(yù)測(cè)的不 同，并且可根據(jù)例如在表達(dá)重組多肽中所用宿主細(xì)胞之類型這樣的因素而有所變化。蛋白 質(zhì)制備物可包括具有不同N端氨基酸之蛋白質(zhì)分子的混合物，其由于在多于一個(gè)位點(diǎn)切割 信號(hào)肽而產(chǎn)生。用于表達(dá)多肽的合適宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或更高等的真核細(xì)胞。一 般優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。在例如Pouwels等(1985)中描述了 用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的合適的克隆和表達(dá)載體。使用源自本文公開之 DNA構(gòu)建物的RNA，還可應(yīng)用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)來產(chǎn)生多肽。1.原核系統(tǒng)原核生物包括革蘭氏陰性生物或革蘭氏陽性生物。用于轉(zhuǎn)化的合適原核宿主細(xì)胞 包括例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌 屬中的多個(gè)其它物種。在原核宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)中，多肽可包含N端甲硫氨酸殘基 從而有利于重組多肽在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)?？蓪端Met從所表達(dá)的重組多肽中切除。用于原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體一般包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記基因。表 型選擇標(biāo)記基因是例如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需求之蛋白質(zhì)的基因?？捎糜?原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的實(shí)例包括源自市售質(zhì)粒(如克隆載體pBR322(ATCC 37017)) 的表達(dá)載體。PBR322包含氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因，因而為鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供 了簡單的方法。將適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和DNA序列插入pBR322載體中。其它市售載體包括例 如 pKK223_3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)禾口 pGEMl(Promega Biotec, Madison, Wis.，USA)。常用于重組原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列包括內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、 乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，1978 ；和Goeddel等，1979)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel 等，1980 ；和EP-A-36776)和tac啟動(dòng)子(Maniatis，1982)。特別有用的原核宿主細(xì)胞表達(dá) 系統(tǒng)采用了噬菌體啟動(dòng)子和C1857ts熱不穩(wěn)定阻遏物序列。可從美國模式培養(yǎng)物保 藏中心(American Type Culture Collection)獲得的質(zhì)粒載體(其并入了 λ Pl啟動(dòng)子的 衍生物)包括PHUB2 (于大腸桿菌株JMB9中保存，ATCC 37092)和pPLc28 (于大腸桿菌RRl 中保存，ATCC 53082)質(zhì)粒。2.酵母系統(tǒng)作為替代，所述多肽可在酵母宿主細(xì)胞(優(yōu)選來自酵母菌屬(例如，釀酒酵母 (S. cerevisiae)))中表達(dá)。也可使用其它酵母屬，例如畢赤屬(Pichia)或克魯維酵母 屬(Kluyveromyces)。酵母載體常包含來自2 μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)序列、自主復(fù)制序列 (autonomously replicating sequence, ARS)、啟動(dòng)子區(qū)域、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止 序列和選擇標(biāo)記基因。用于酵母載體的合適啟動(dòng)子序列包括用于金屬硫蛋白、3-磷酸甘油 酯激酶(Hitzeman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968 ；和Holland等，1978)例如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異 構(gòu)酶、3-磷酸甘油酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激 酶的啟動(dòng)子等。用于酵母表達(dá)中的其它合適載體和啟動(dòng)子在歐洲專利申請(qǐng)73，657中進(jìn)一 步描述。另一選擇方案是Russell等(1982)和Beier等(1982)描述的葡萄糖可阻遏ADH2 啟動(dòng)子。可通過將用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇和復(fù)制的來自PBR322之DNA序列(Amplr基 因和復(fù)制起點(diǎn))插入上述酵母載體中來構(gòu)建在酵母和大腸桿菌中均可復(fù)制的穿梭載體?？墒褂媒湍甫?-因子前導(dǎo)序列來指導(dǎo)多肽的分泌。所述α _因子前導(dǎo)序列常插至 啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)基因序列之間。參見例如Kurjan等，1982和Bitter等，1984。有利于重 組多肽從酵母宿主分泌的其它前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知地?？梢栽谇皩?dǎo)序列的 3’端附近進(jìn)行修飾，使其含有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)。這將有利于前導(dǎo)序列與結(jié)構(gòu)基因的 融合。酵母轉(zhuǎn)化方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是周知的。Hirmen等，1978描述了一個(gè)這樣 的方案。Hirmen等人的方案在選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp+轉(zhuǎn)化子，其中所述選擇性培養(yǎng)基由 0. 67%酵母氮源、0. 5%酪氨基酸、2%葡萄糖、10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶組成。用含有ADH2啟動(dòng)子序列之載體轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞可以在“營養(yǎng)”培養(yǎng)基中培養(yǎng) 以誘導(dǎo)表達(dá)。營養(yǎng)培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例是由酵母提取物、2%蛋白胨和葡萄糖并補(bǔ)充 有80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶組成的培養(yǎng)基。當(dāng)葡萄糖從培養(yǎng)基中耗盡時(shí)，發(fā)生ADH2 啟動(dòng)子的解阻遏作用(der印ression)。3.哺乳動(dòng)物或昆蟲系統(tǒng)還可以使用哺乳動(dòng)物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。Luckow和 Summers, Bio/Technology 6:47(1988)中對(duì)桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白進(jìn) 行了綜述。還可使用已建立的哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例 包括猴腎細(xì)胞的 C0S-7 系(ATCCCRL 1651) (Gluzman 等，1981)、L 細(xì)胞、C127 細(xì)胞、3T3 細(xì) 胞(ATCCCCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和BHK(ATCC CRL10)細(xì)胞系以及 McMahan等(1991)描述的源自非洲綠猴腎細(xì)胞系CVl的CVl/EBNA細(xì)胞系(ATCC CCL 70)。已描述了用于將DNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的已建立方法(Kaufman，1990)。使用市 售試劑(例如 Lipofectamine 脂質(zhì)試劑(Gibco/BRL)或 Lipofectamine-Plus 脂質(zhì)試劑) 的其它方案可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Feigner等，1987)。此外，可使用如Sambrook等(1989)中的 常規(guī)方法采用電穿孔來轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可使用本領(lǐng)域已知的方法(例如對(duì)細(xì)胞毒性藥 物的抗性)來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。Kaufman等，1990描述了幾種選擇方案，例如二氫葉酸還原 酶(dihydrofolate reductase, DHFR)抗性。用于DHFR選擇的合適宿主株可以是CHO株 DX-Bl 1，其缺乏 DHFR (Urlaub 和 Chasin，1980)?？梢詫⒈磉_(dá) DHFR cDNA 的質(zhì)粒引入 DX-Bll 株，只有含有該質(zhì)粒的細(xì)胞可以在合適的選擇培養(yǎng)基中生長?？梢圆⑷氡磉_(dá)載體的選擇標(biāo) 記的其它實(shí)例包括賦予抗生素(例如G418和潮霉素B)抗性的cDNA?；趯?duì)這些化合物的 抗性可以選擇出攜帶所述載體的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可從病毒基因組中切下。常用 的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列源自多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒。 源自SV40病毒基因組的DNA序列(例如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接和多 聚腺苷酸化位點(diǎn))可為在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)結(jié)構(gòu)基因序列提供其它的遺傳元件。病毒早期和晚期啟動(dòng)子特別有用，這是因?yàn)槎咭子谝云涡问綇牟《净蚪M中獲得，其還 可以含有病毒復(fù)制起點(diǎn)(Fiers等，1978 ；Kaufman, 1990)。來自哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的顯示增強(qiáng)異源基因表達(dá)的其它控制序列包括這樣的元 件，例如源自CHO細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)序列元件(expressionaugmenting sequence element, EASE)(Morris 等，Animal CellTechnology,1997,529-534 頁和 PCT 申請(qǐng) WO 97/25420) 以及來自腺病毒2的三聯(lián)前導(dǎo)序列(tripartite leader, TPL)和VA基因RNA (Gingeras 等，J. Biol. Chem. 257 13475-13491，1982)。病毒來源的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)序列允許雙順反子mRNA有效翻譯(Oh和 Sarnow，1993 ；Ramesh 等，1996)。作為雙順反子mRNA之一部分的異源cDNA (隨后是選擇標(biāo)記基因(例如DHFR)) 的表達(dá)已顯示出提高宿主的轉(zhuǎn)染能力和異源cDNA的表達(dá)(Kaufman，1990)。采用雙順反子 mRNA的示例性表達(dá)載體是Mosser等(1997)描述的pTR-DC/GFP和Morris等(1997)描述 的 p2A5I。Mosley等(1989)描述了有用的高表達(dá)載體pCAVNOT?？梢匀鏞kayama和 Berg(1983)中公開地構(gòu)建用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的其它表達(dá)載體。可以基本如Cosman 等(1986)中所述地來構(gòu)建在C127鼠乳腺上皮細(xì)胞中穩(wěn)定高水平表達(dá)哺乳動(dòng)物cDNA的有 用系統(tǒng)。Cosman等(1984)描述的有用的高表達(dá)載體PMLSV N1/N4已作為ATCC 39890進(jìn)行 保藏。其它有用的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體描述于EP-A-0367566和WO 91/18982中，其通過引用 并入本文。在另一替代方案中，所述載體可源自逆轉(zhuǎn)錄病毒。還可使用另一些有用的表達(dá)載體一pFLAG *pDC3ii。FLAG 技術(shù)關(guān) 鍵在于將低分子量(IkD)、親水性FLAG 標(biāo)記肽與口^1^^6⑧表達(dá)載體表達(dá)之重組蛋 白的N端融合。PDC311是另一種專門用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體。pDC311的特 征在于包含目的基因和二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的雙順反子序列(其具有用于DHFR翻 譯的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn))、表達(dá)增強(qiáng)序列元件(EASE)、人CMV啟動(dòng)子、三聯(lián)前導(dǎo)序列和多 聚腺苷酸化位點(diǎn)。關(guān)于可用的信號(hào)肽，需要時(shí)，可以用異源信號(hào)肽或前導(dǎo)序列代替天然信號(hào)肽。信號(hào) 肽或前導(dǎo)序列的選擇可取決于諸如產(chǎn)生重組多肽之宿主細(xì)胞類型等因素。為了舉例說明， 在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的異源信號(hào)肽的實(shí)例包括美國專利4，965，195中所述的 白介素-7(IL-7)的信號(hào)序列；Cosman等，Nature 312:768(1984)中所述的白介素_2受體 的信號(hào)序列；EP367，566中所述的白介素_4受體信號(hào)序列；美國專利4，968，607中所述的 白介素-1受體信號(hào)肽；以及EP 460，846中所述的II型白介素_1受體信號(hào)肽。C.分離和純化本發(fā)明還包括分離和純化所述多肽及其片段的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過將本發(fā)明的多肽或其片段與另一輔助純化本發(fā)明之多 肽或片段的多肽融合來實(shí)現(xiàn)對(duì)所述重組多肽或片段的純化。這樣的融合伴侶(partner)可 包括聚His或上述另一些抗原性識(shí)別肽以及Fc部分。就任何類型的宿主細(xì)胞而言，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知地，純化重組多肽或片段 的方法將根據(jù)如下因素而有所變化，例如所用宿主細(xì)胞的類型以及重組多肽或片段是否分 泌到培養(yǎng)基中。一般地，重組多肽或片段可以從宿主細(xì)胞中分離(如果不分泌的話)或者可以從培養(yǎng)基或上清液中分離(如果可溶并且分泌的話)，隨后是一個(gè)或多個(gè)的濃縮、鹽析、離子 交換、疏水相互作用、親和純化或體積排阻色譜步驟。就實(shí)現(xiàn)這些步驟的具體方法而言，首 先可使用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮培 養(yǎng)基。濃縮步驟之后，將濃縮物施加至純化基質(zhì)(如凝膠過濾介質(zhì))?；蛘撸蓱?yīng)用陰離子 交換樹脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)側(cè)基的基質(zhì)。所述基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂 糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質(zhì)純化中常用的其它類型?；蛘?，可采用陽離子交換步驟。合 適的陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基的多種不溶性基質(zhì)。此外，可以使用色譜聚焦 步驟(chromatofucusing st印)。或者，可以使用疏水相互作用色譜步驟。合適的基質(zhì)可以 是與樹脂結(jié)合的苯基或辛基部分。此外，可以使用具有選擇性結(jié)合重組蛋白之基質(zhì)的親和 色譜。所用此類樹脂的實(shí)例是凝集素柱、染料柱和金屬螯合柱。最后，可以使用一個(gè)或多個(gè) 采用疏水RP-HPLC介質(zhì)(例如硅膠或具有甲基、辛基、辛癸基或其它脂族基團(tuán)側(cè)基的聚合物 樹脂)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟來進(jìn)一步純化所述多肽。采用各種組合的上述 某些或全部純化步驟是公知的，并且可用于提供分離且純化的重組蛋白質(zhì)。也可使用包含多肽結(jié)合蛋白(例如針對(duì)本發(fā)明多肽產(chǎn)生的單克隆抗體)的親和 柱來親和純化所表達(dá)的多肽?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)從親和柱移走這些多肽，例如采用高鹽洗脫 緩沖液然后透析至較低濃度鹽緩沖液中備用來實(shí)現(xiàn)，或取決于所用的親和基質(zhì)通過改變PH 或其它組分來實(shí)現(xiàn)，或通過使用親和部分的天然底物(例如本發(fā)明的多肽)競爭性移除來 實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的這一方面中，多肽結(jié)合蛋白(例如可以與本發(fā)明多肽相互作用的本發(fā) 明抗多肽抗體或其它蛋白質(zhì))可以與固相支持物(例如適用于識(shí)別、分離或純化細(xì)胞(其 表面上表達(dá)本發(fā)明的多肽)的柱色譜基質(zhì)或類似基質(zhì))結(jié)合。可通過任何手段來實(shí)現(xiàn)將本 發(fā)明的多肽結(jié)合蛋白附著至固相接觸表面。從固相上釋放所選擇的細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的并 包括例如使用酶。這樣的酶優(yōu)選是無毒的且對(duì)細(xì)胞無損害的，優(yōu)選涉及切割細(xì)胞表面的結(jié) 合區(qū)域。期望的純度取決于蛋白質(zhì)的目的用途。例如，當(dāng)所述多肽將在體內(nèi)施用時(shí)，需要相 對(duì)高的純度。在這種情形中，純化所述多肽從而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分 析后檢測(cè)不到對(duì)應(yīng)于其它蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，由于不同的糖 基化、不同的翻譯后加工等原因，通過SDS-PAGE可觀察到對(duì)應(yīng)于所述多肽的多個(gè)條帶。最 優(yōu)選地，將本發(fā)明的多肽純化至基本均一，即通過SDS-PAGE分析顯示單一蛋白質(zhì)條帶?？?通過銀染、考馬斯藍(lán)染色或放射自顯影(如果蛋白質(zhì)經(jīng)放射性標(biāo)記的話)來觀察蛋白質(zhì)條帶οIII.制劑和施用本文所述組合物的施用方式可有所變化。施用疫苗的任何常規(guī)方法均是適用的。 相信這些包括利用固體生理可接受基質(zhì)的口服施加或采用生理可接受的分散劑、胃腸外注 射、吸入粉末、經(jīng)皮貼劑、經(jīng)陰道灌注等。疫苗的劑量取決于施用途徑，并根據(jù)對(duì)象的體積和 健康狀況而有所變化。制備含有作為活性成分之多肽或肽序列的疫苗是本領(lǐng)域普遍公知的，如美國專利 4，608，251 ；4，601，903 ；4，599，231 ；4，599，230 ；4，596，792 和 4，578，770 中所舉例說明地， 其均通過引用并入本文。通常，這種疫苗制備成液體溶液或混懸液的可注射形式；也可以制備適用于在注射前溶于或混懸于液體中的固體形式。所述制備物還可以進(jìn)行乳化?；钚悦?疫成分常與可藥用并與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑有例如水、鹽水、右旋葡 萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。此外，如果需要，疫苗可包含一定量的輔助基質(zhì)例如潤濕劑 或乳化劑、PH緩沖劑或增強(qiáng)疫苗有效性的佐劑。在一些具體的實(shí)施方案中，疫苗與基質(zhì)的 組合進(jìn)行配制，如美國專利6，793，923和6，733，754中所述，其通過引用并入本文。疫苗可通過吸入來施用。在一些實(shí)施方案中，疫苗可作為氣霧劑施用。本文所用 的術(shù)語“氣霧劑”或“氣霧組合物”是指氣體中的固體或液體顆粒懸浮物。該術(shù)語一般可用 于指經(jīng)汽化、霧化或者從固體或液體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榭晌胄问?包括懸浮的固體或液體藥物 顆粒)的組合物。這種氣霧劑可經(jīng)由呼吸系統(tǒng)來遞送疫苗。本文所用的“呼吸系統(tǒng)”是指 負(fù)責(zé)攝入氧并排出二氧化碳的機(jī)體器官系統(tǒng)。該系統(tǒng)一般包括從鼻至肺泡的所有氣道。在 哺乳動(dòng)物中，一般認(rèn)為包括肺、支氣管、細(xì)支氣管、氣管、鼻道和隔膜。就本公開內(nèi)容而言，將 疫苗遞送至呼吸系統(tǒng)是指將藥物遞送至呼吸系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)氣道(特別是肺)。適用于其它施用模式的其它制劑包括栓劑(肛門或陰道施用)以及在某些情況下 的口服制劑。對(duì)于栓劑而言，常規(guī)的粘合劑和載體可包括例如聚烷撐乙二醇或甘油三酯；可 以用含有約0. 5%至約10%、優(yōu)選約至約2%之活性成分的混合物形成這種栓劑?？诜?制劑包括如下這樣常用的賦形劑，例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末的形 式，并含有約10%至約95%、優(yōu)選約25%至約70%的活性成分?？蓪⑺龆嚯?、肽和脂肽組合物配制成中性或鹽形式的疫苗?？伤幱名}包括酸加 成鹽(與肽的游離氨基基團(tuán)形成)以及與無機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如醋酸、 草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。與游離羧基基團(tuán)形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿(例如， 鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、 普魯卡因等)。在許多情形中，理想的是具有多次疫苗施用，通常至多、至少或不超過1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次免疫接種(包括其間的所有范圍)。接種通常以每 周/每月/每年1、2、3、4、5、6至5、6、7、8、9、10、11至12次為間隔(包括其間的所有數(shù)值 和范圍)，更通常是以3至5周為間隔。通常，以1 15年、通常10年為間隔進(jìn)行定期加強(qiáng) 免疫是維持抗體的保護(hù)性水平所期望的。免疫過程后可對(duì)針對(duì)所述抗原的抗體進(jìn)行測(cè)定， 如上所述，美國專利3，791，932,4, 174，384和3，949，064，其對(duì)這些測(cè)定類型進(jìn)行了舉例說 明。A.聯(lián)合治療本發(fā)明的組合物和相關(guān)方法(特別是HPV表位的施用，包括向患者/對(duì)象施用HPV L2蛋白的多肽或肽)也可與常規(guī)HPV篩選和/或其它疫苗的施用(包括但不限于抗體或抗 體片段、Pap涂片、PCR、Southern印跡、施用CERVARIX 、GARDASIL 、針對(duì)HPV或其它感染 性病原體的疫苗、HPV病變的消融療法(ablative therapy)等)聯(lián)用。一方面，考慮將HPV肽組合物和/治療與HPV篩選和/或其它治療聯(lián)用。或者，所 述治療可在其它治療之前或之后、以數(shù)分鐘至數(shù)周為間隔來進(jìn)行。在其它試劑單獨(dú)施用的 實(shí)施方案中，一般要確保在每次遞送之間的主要時(shí)間段內(nèi)不失效，從而使所述藥劑和抗原 性組合物仍能針對(duì)對(duì)象發(fā)揮有利的組合作用。在這種情形中，可考慮將各形式在12 24小時(shí)內(nèi)施用，更優(yōu)選在約6 12小時(shí)內(nèi)施用。然而，在一些情形中，顯著延長施用的時(shí)間段 可以是理想的，其中在各施用之間間隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)月(1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12)或數(shù)年(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。可以采用各種組合，例如多型HPV肽治療是“A”，作為治療給出的另一種疫苗或抗 體或治療是“B”Α/Β/Α Β/Α/Β Β/Β/Α Α/Α/Β Α/Β/Β Β/Α/Α A/B/B/BB/A/B/BΒ/Β/Β/Α Β/Β/Α/Β Α/Α/Β/Β Α/Β/Α/Β Α/Β/Β/Α B/B/A/AΒ/Α/Β/Α Β/Α/Α/Β Α/Α/Α/Β Β/Α/Α/Α Α/Β/Α/Α A/A/B/A根據(jù)施用這種化合物的一般方法向患者/對(duì)象施用本發(fā)明的免疫原性組合物，并 考慮到多型HPV多肽組合物或本文所述任何其它抗原或抗原組合之組合物的毒性(如果有 的話)?？深A(yù)期的是，必要時(shí)可重復(fù)所述治療周期。還考慮到，可將多種標(biāo)準(zhǔn)療法(如水合 作用(hydration))與所述治療聯(lián)用。B.預(yù)防和/或治療方法在一些實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯盟幬锝M合物。本發(fā)明的不同方面涉及向?qū)ο笫┯?有效量的組合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，向患者施用多型HPV肽組合物來保護(hù)免受 或治療由至少一種或多種HPV病原體的感染。這樣的組合物一般溶于或分散于可藥用載體 或水性介質(zhì)中。本文所用的術(shù)語“可藥用”或“藥理學(xué)可接受”是指這樣的化合物、材料、組合物和 或劑型，其在安全的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適于與人和動(dòng)物的組織接觸并且無過度的毒性、刺激、 過敏反應(yīng)或其它疑難并發(fā)癥(相當(dāng)于合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比)。術(shù)語“可藥用載體”表示參與 攜帶或運(yùn)輸化學(xué)劑的可藥用材料、組合物或運(yùn)載體(vehicle)，例如液體或固體填充劑、稀 釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。可藥用載體包括任何以及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗 細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是 本領(lǐng)域公知的。除非任一常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分不相容，否則考慮將其用于免疫原性 組合物和治療性組合物。本發(fā)明的活性化合物可配制成用于胃腸外施用，例如配制成用于經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮下或腹膜內(nèi)途徑注射。除了配制成用于氣霧劑或胃腸外施用的化合物(例如用于靜脈內(nèi) 或肌內(nèi)注射的那些)，其它可藥用形式包括例如片劑或用于口服施用的其它固體；延時(shí)釋 放膠囊。作為游離堿或可藥用鹽的活性化合物的溶液可以在水中制備，并適當(dāng)混有表面活 性劑(例如羥丙基纖維素)。分散制劑也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制 備。在普通的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以防止微生物的生長。適于注射用的藥物形式包括無菌水溶液或分散制劑；制劑包括芝麻油、花生油或 水性丙二醇；以及用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散制劑的無菌粉末劑。在所有情形中，所 述形式必須是無菌的，并且必須是易于注射的流體。其還應(yīng)當(dāng)在制備和儲(chǔ)存條件下保持穩(wěn) 定，且必須抵抗微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染作用。所述多型HPV多肽組合物可配制成中性或鹽形式?？伤幱名}包括酸加成鹽(與蛋 白質(zhì)的游離氨基基團(tuán)形成)以及與無機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如醋酸、草酸、 酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽。與游離羧基基團(tuán)形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿(例如，鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。載體也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等) 及其適當(dāng)混合物以及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。例如通過使用包衣(如卵磷脂)、通過維持 分散時(shí)所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可通過各種抗細(xì)菌 劑和抗真菌劑(如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)防止微生物的作用。在許多 情形中，優(yōu)選包括等滲劑(例如糖或氯化鈉)?？赏ㄟ^在組合物中使用吸收延遲劑(例如單 硬脂酸鋁和明膠)來延長注射組合物的吸收。無菌注射溶液通過將所需量的所述活性化合物摻入含上述各成分的適當(dāng)溶劑中 來制備，需要時(shí)在隨后進(jìn)行過濾滅菌。一般地，分散制劑通過將各無菌活性成分摻入含有上 述基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需其它成分的無菌載體中來制備。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉 末劑的情形中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其得到活性成分以及來自先 前無菌過濾溶液的任何其它期望成分的粉末。通常，通過任意常見途徑來施用本發(fā)明的組合物。這包括但不限于口服、經(jīng)鼻或頰 內(nèi)施用?；蛘?，可通過原位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肛門栓劑、陰道內(nèi)、呼吸道或靜脈內(nèi)施 用。在某些實(shí)施方案中，可以吸入疫苗組合物(例如美國專利6，651，655，其通過引用具體 并入本文)。這樣的組合物通常作為包含生理可接受載體、緩沖劑或其它賦形劑的可藥用組 合物來施用。例如，對(duì)于采用水溶液形式的胃腸外施用來說，必要時(shí)，所述溶液應(yīng)當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)緩 沖，并且液體稀釋劑首先用足量鹽水或葡萄糖進(jìn)行等滲處理。這些特定的水溶液尤其適用 于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容會(huì)知曉可 用的無菌水性介質(zhì)。例如，可將一劑量溶于等滲NaCl溶液中，并添加到皮下注射液中或注 射至期望的輸注位點(diǎn)(參見例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences，1990)。取決 于對(duì)象的狀況，必然會(huì)出現(xiàn)劑量的某些改變。在任何情況下，負(fù)責(zé)施用的人員確定針對(duì)個(gè)體 對(duì)象的合適劑量?；陬A(yù)期目的來確定治療性或預(yù)防性組合物的有效量。術(shù)語“單位劑量”或“劑 量”是指適用于對(duì)象的物理離散單元，各單元含有預(yù)定量的組合物，經(jīng)計(jì)算其能產(chǎn)生與施用 (即合適的途徑和方案)有關(guān)的上述期望應(yīng)答。根據(jù)治療次數(shù)和單位劑量的待施用的量取 決于所期望的保護(hù)。所述組合物的精確量還取決于從業(yè)者的判斷，并且對(duì)每個(gè)個(gè)體是獨(dú)特的。影響劑 量的因素包括對(duì)象的身體和臨床狀態(tài)、施用途徑、治療的預(yù)期目的(緩解癥狀亦或治愈)以 及具體組合物的效力、穩(wěn)定性和毒性。配制后，溶液以與制劑劑型相容的方式、以治療或預(yù)防有效量進(jìn)行施用。所述制劑 易于采用多種劑型(例如上述注射溶液類型)施用。1.體外、離體或體內(nèi)施用本文所用的術(shù)語“體外施用”是指利用從動(dòng)物中取出或在動(dòng)物以外的細(xì)胞(包括 但不限于培養(yǎng)的細(xì)胞)進(jìn)行的操作。術(shù)語“離體施用”是指將已經(jīng)體外操作的細(xì)胞隨后施 用于活的動(dòng)物。術(shù)語“體內(nèi)施用，，包括所有在動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行的操作。在本發(fā)明的某些方面中，可以體外、離體或體內(nèi)施用所述組合物。在一些體外實(shí)施 方案中，用多型HPV組合物孵育自體B淋巴細(xì)胞系或樹突細(xì)胞。然后，可將活化細(xì)胞用于體外分析，或者任選地用于離體施用。2.抗體和被動(dòng)免疫本發(fā)明的另一方面是制備用于預(yù)防或治療HPV感染的免疫球蛋白的方法，其包括 如下步驟用本發(fā)明的疫苗免疫受者，從該受者中分離免疫球蛋白或抗體和/或重組產(chǎn)生 這種免疫球蛋白或其片段。本發(fā)明的另一方面是通過這種方法制備的免疫球蛋白。本發(fā)明 的又一方面是包含本發(fā)明免疫球蛋白和可藥用載體的藥物組合物，其可以用于制備治療或 預(yù)防HPV感染的藥物。本發(fā)明的另一方面是治療或預(yù)防HPV感染的方法，其包括向患者施 用有效量的本發(fā)明藥物制備物的步驟。產(chǎn)生多克隆抗體的接種物通常通過將抗原性組合物分散到生理可耐受稀釋劑 (如鹽水或適用于人的其它佐劑)中形成水性組合物來制備。向哺乳動(dòng)物(例如人)施用免 疫刺激量的接種物，然后使經(jīng)接種的對(duì)象維持一段足以使該抗原性組合物誘導(dǎo)出保護(hù)性抗 體的時(shí)間。可通過公知技術(shù)(例如親和色譜)將抗體分離至期望的程度(Harlow和Lane， Antibodies :A Laboratory Manual 1988)?？贵w可包括來自多種常用動(dòng)物(例如山羊、靈長類、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠)或人的 抗血清制備物。給這些動(dòng)物放血并回收血清。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的免疫球蛋白可以包括完整抗體、抗體片段或亞片段?？贵w可以 是任何類型的完整免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有針對(duì)本發(fā)明兩種或更多 種抗原的雙特異性嵌合抗體或雜合抗體。其也可以是片段，例如F(ab' )2、Fab' ,Fab,Fv 等，包括雜合片段。免疫球蛋白還可包括通過結(jié)合特異性抗原形成復(fù)合物從而發(fā)揮抗體作 用的天然、合成或遺傳改造的蛋白質(zhì)?？梢韵蚴苷呤┯帽景l(fā)明的HPV組合物或疫苗，所述受者然后作為免疫球蛋白的來 源，所述免疫球蛋白響應(yīng)于所述HPV組合物的攻擊而產(chǎn)生。經(jīng)此處理的對(duì)象提供血漿，超免 疫球蛋白通過常規(guī)血漿分離方法從該血漿中獲得。向另一對(duì)象施用所述超免疫球蛋白從而 賦予針對(duì)HPV感染的抗性或治療HPV感染。本發(fā)明的超免疫球蛋白特別適用于治療或預(yù)防 嬰兒、免疫力低下之個(gè)體中的HPV感染，或者有治療需求但沒有時(shí)間響應(yīng)于接種而產(chǎn)生抗 體之個(gè)體中的HPV感染。本發(fā)明的另一方面是包含一種或多種對(duì)本發(fā)明免疫組合物之組分具有反應(yīng)性的 單克隆抗體(或其片段；優(yōu)選人的或人源化的)的藥物組合物，其可用于治療或預(yù)防多種 HPV類型的感染。制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域周知的，可包括脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合 (Kohler和Milstein，1975 ；Harlow和Lane，1988)?；蛘?，可通過篩選合適的噬菌體展示文 庫獲得單克隆Fv片段(Vaughan等，1998)。單克隆抗體可以是人的、利用已知方法人源化 的或部分人源化的。IV.藥盒本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行接種或治療的藥盒。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述藥盒包含小瓶/管和可選的施用說明包裝插頁，所述小瓶/管包含用于根據(jù)本發(fā)明 方法施用的多型HPV多肽組合物或疫苗。藥盒中可包含本文所述的任何組合物。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，用于制備多型HPV 多肽、配制多型HPV多肽和/或施用多型HPV多肽的試劑可包括在藥盒內(nèi)。所述藥盒還可
33包含用于在體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)脂肽活性的試劑。因此，所述藥盒包括在合適容器裝置中的多 型HPV多肽組合物。在某些方面，所述藥盒可包括用于施用的試劑和/或裝置，例如吸入器 或噴霧器。其還可包括一種或多種用于制備所施用組合物的緩沖劑、化合物或裝置。藥盒的各組分可采用水性介質(zhì)或凍干形式進(jìn)行包裝。藥盒的容器裝置一般包括至 少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器裝置，組分可置于所述容器裝置中(優(yōu)選經(jīng) 過適當(dāng)分裝)。當(dāng)藥盒中有多于一種組分時(shí)，所述藥盒一般還包含第二、第三或另外附加的 容器(另外的組分可單獨(dú)置于其中)。然而，組分的各種組合也可包含在小瓶/管中。通 常，本發(fā)明的藥盒還包括用于將各容器緊密排放便于出售的裝置。這樣的容器可包括容納 期望小瓶的注塑或吹塑塑料容器。當(dāng)藥盒的組分以一種和/或多種液體溶液提供時(shí)，所述液體溶液是水性溶液，特 別優(yōu)選是無菌水性溶液。然而，藥盒的組分可作為干粉提供。當(dāng)試劑和/或組分作為干粉 提供時(shí)，可通過添加合適的溶劑使所述粉末重溶?？稍O(shè)想到，所述溶劑也可以提供在另一容 器裝置中。在其它方面，藥盒或裝置可包含針對(duì)本發(fā)明多肽的多克隆或單克隆抗體。這樣的 藥盒或裝置可用于檢測(cè)或鑒定或純化各種樣本和/或患者中的病毒。藥盒還包括使用該藥盒組分以及使用不包括在藥盒內(nèi)的任何其它試劑的說明。說 明可包括可實(shí)施的變動(dòng)。應(yīng)當(dāng)理解，這些試劑是本發(fā)明藥盒的實(shí)施方案。然而，這樣的藥盒不限于上述具體 條目，其可包括用于制備和/或施用多型HPV多肽疫苗的任何試劑。V.實(shí)施例以下給出的實(shí)施例目的在于舉例說明本發(fā)明的各實(shí)施方案，而不意在以任何方式 限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，本發(fā)明經(jīng)適當(dāng)調(diào)整以實(shí)現(xiàn)所提及的多種目的并 獲得結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)以及本文固有的這些目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)施例連同本文所述的方法代 表了優(yōu)選的實(shí)施方案，是示范性的，不意在限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到涵 蓋在本發(fā)明宗旨(如權(quán)利要求的范圍所限定的)內(nèi)的變化及其它用途，。A.結(jié)果基于方便的限制性位點(diǎn)而非免疫原性的考慮，選擇早期研究中使用的包含殘基 11-200 和 1-88 的 L2 疫苗(Campo 和 Jarrett, 1994 ；Roden 等 1994)。因此，它們可以不包 含所有相關(guān)的中和性表位或者具有最佳的免疫原性和穩(wěn)定性。但是，這些研究表明中和性 L2特異性抗體的存在對(duì)于保護(hù)性免疫是足夠的(Embers等，2002 ；Gambhira等，2007)。實(shí) 際上，用L211-200接種在BPV4、CRPV和ROPV攻擊模型中誘導(dǎo)出交叉中和性抗體和保護(hù) (Gambhira等，2007 ；Campo和Jarrett, 1994)。用L21-88肽接種也是保護(hù)性的，但也有些 提議認(rèn)為，其交叉中和性和交叉保護(hù)可能不如用L211-200接種的動(dòng)物有效(Gambhira等， 2007)。與此觀點(diǎn)一致，用來自94-112和107-122的L2肽進(jìn)行接種對(duì)同源攻擊都具有保護(hù) 性(Embers等，2002)。因此，為了評(píng)價(jià)L2疫苗中包含這些區(qū)域的益處，我們制備了在88、 107或200位處終止的N端L2多肽用于疫苗研究(表1)。表1 用不同大小的單體或多聚體L2多肽接種之兔的抗體應(yīng)答。使用CFA/IFA作為佐劑，用300 μ g的HPV16L2多肽(A)或多聚L2構(gòu)建體(B)對(duì) 兔接種4次。在最后一次免疫后的一個(gè)月收集超免疫血清，并用全長HPV16L2(16L2ELISA)或HPV16L2/L2假病毒粒子(HPV16ELISA)包被的微滴定板通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 測(cè)試L2特異性抗體。還測(cè)試所述血清針對(duì)所示HPV假病毒粒子類型的體外中和(invitro neutralization, IVN)效價(jià)。在免疫前血清中未檢測(cè)到中和效價(jià)。#蛋白質(zhì)表現(xiàn)出在大腸 桿菌中顯著降解?！癛b”兔個(gè)體?！盁o”對(duì)應(yīng)于在所測(cè)試的最低稀釋度(1 50)下小于50% 中和?！癬”未測(cè)試。
L2對(duì)于感染是必需的(Roden等，2001)，并且可具有多種不同的功能(Richards 等，2006 ；Bossis等，2005 ；Kamper等，2006)。在感染期間，L2必須經(jīng)弗林蛋白酶切割從而除去1-13位殘基(Richards等，2006)，這使得保守的中和性表位(17-36位殘基之間)更 易于接近單克隆抗體RG-I (Day等，2008)。此外，針對(duì)L21-88或11-200多肽的抗血清交叉 中和皮膚以及黏膜乳頭瘤病毒類型(Pastrana等，2005)。因此，我們制備了從1、11、13或 89位殘基起始的N端L2多肽用于疫苗研究(表1)。用單體和多型L2多肽接種之兔中的應(yīng)答為了對(duì)交叉中和性表位進(jìn)行描繪，在大 腸桿菌中表達(dá)了帶有6-His標(biāo)簽的7種HPV16 L2多肽(表1)，進(jìn)行親和純化以用于免疫 接種研究。盡管所有多肽均易于純化，但是HPV16 L2 13-88和89-200在儲(chǔ)藏期間不穩(wěn)定。 用300 μ g的每種多肽對(duì)兔進(jìn)行5次免疫，最初采用CFA，在加強(qiáng)免疫采用IFA。首先通過 在HPV16L2全長ELISA和HPV16L1/L2假病毒粒子ELISA中測(cè)試超免疫血清來驗(yàn)證每次免 疫成功與否。針對(duì)各HPV16 L2多肽均得到高效價(jià)的血清抗體，但是針對(duì)兩種不穩(wěn)定抗原 (L213-88和89-200)之抗血清的抗HPV16假病毒粒子效價(jià)較低。然后，測(cè)定了由L2多肽 誘導(dǎo)的每只兔抗血清的HPV16中和效價(jià)以及HPV6、HPV18、HPV31、HPV45和HPV58的交叉中 和性效價(jià)。與早前的研究(Gambhira等，2007) —致，HPV16L211-200和1_88肽誘導(dǎo)出強(qiáng) 的HPV16中和抗體效價(jià)。在針對(duì)HPV16 L2 13-200、1-107、13-107的抗血清中也觀察到相 似的強(qiáng)HPV16中和抗體效價(jià)。用HPV16 L289-200接種產(chǎn)生顯著較弱的中和應(yīng)答，盡管其 在兩只兔之一中誘導(dǎo)出具有高L2 ELISA效價(jià)的抗體。由各種HPV16 L2肽誘導(dǎo)的L2特異 性抗血清不僅中和HPV16，還中和廣泛的異源乳頭瘤病毒類型，包括已進(jìn)行測(cè)試的致癌類型 HPV18、HPV31、HPV45和HPV58 (表2)。然而，針對(duì)HPV16的中和抗體效價(jià)顯著高于針對(duì)其它 類型的中和抗體效價(jià)，盡管在效價(jià)與HPV16遺傳距離之間沒有明顯的關(guān)系。表2 多型L2構(gòu)建物的總結(jié) *殘基命名基于HPV16氨基酸的編號(hào)，同源肽的實(shí)際殘基編號(hào)可能會(huì)有所不同，但可以通過與HPV16肽進(jìn)行序列比對(duì)來確定。由于替代的HPV16L2肽基本上不提高針對(duì)異源病毒的中和效價(jià)，我們檢測(cè)了由 源自不同的醫(yī)學(xué)上顯著HPV基因型的數(shù)種同源L2肽組成的串聯(lián)(concatenated)融合 蛋白?；诒敬魏拖惹暗慕Y(jié)果，選擇對(duì)應(yīng)于HPV16L2 17-36、11-88和11-200的L2多肽 用于融合構(gòu)建物。由于細(xì)菌產(chǎn)生較大尺寸重組蛋白常常不很高效，因此我們測(cè)試了包含 3 拷貝 11-200(稱為 11-200X3)、5 拷貝 11_88(稱為 11-88X5)和 22 拷貝 17_36(稱為 17-36X22)的多型構(gòu)建物，如表2所示，其中每個(gè)拷貝均源自醫(yī)學(xué)上相關(guān)的各種HPV基因 型(de Villiers等，2004)。蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)，在變性條件下進(jìn)行親和純化，并如 針對(duì)HPV16L2多肽所述地用于免疫兔。與單型L2肽(表1A)相比，用各多型L2融合蛋白 (11-200X3、11-88X5和17-36X22)(采用CFA/IFA佐劑)對(duì)兔進(jìn)行接種誘導(dǎo)出更強(qiáng)的交 叉中和效價(jià)(表1B)，而不減弱HPV16中和效價(jià)。特別地，11-88X5誘導(dǎo)出針對(duì)所有測(cè)試 HPV類型(包括三種未用于產(chǎn)生融合蛋白的HPV類型(HPV31、45和58))顯著高的中和抗體 效價(jià)。用GARDASIL 接種之兔的應(yīng)答用LlVLP接種可誘導(dǎo)出交叉中和相關(guān)性非常近之 乳頭瘤病毒類型(例如HPV18和HPV45)的抗體(Smith等2007 ；Lin等，1992 ；Richards等， 2006)。因此，我們?cè)噲D比較由用兩種不同濃度的GARDASIL (在明礬中配制)接種與用CFA/ IFA中配置的多型L2蛋白接種的交叉中和抗體的水平(表3)。用GARDASIL 接種產(chǎn)生針 對(duì)包含在疫苗中的致癌性HPV類型(HPV16和HPV18)的高效價(jià)中和抗體。盡管用L2融合 蛋白產(chǎn)生更高的HPV16和HPV18效價(jià)，但是這發(fā)生在更高劑量抗原以及使用更強(qiáng)效的佐劑 時(shí)。用GARDASIL 接種之兔的血清均含有顯著水平的HPV45中和抗體，偶爾有HPV31中和 抗體，但是未檢測(cè)到HPV58中和抗體效價(jià)。因此，在GARDASIL 接種后，針對(duì)不包含在疫苗 中之HPV類型的中和抗體效價(jià)非常低或偶有出現(xiàn)或檢測(cè)不到。表3 用GARDASIL 接種之兔的抗體應(yīng)答。用多聚L2構(gòu)建物11_88Χ5(使用CFA/IFA作為佐劑)或者用30 μ g或 12 μ g的GARDASIL 對(duì)兔進(jìn)行3次接種。最后一次免疫后1個(gè)月收集超免疫血清，并測(cè)試針 對(duì)所示HPV假病毒粒子類型的體外中和(IVN)效價(jià)。在免疫前血清中未檢測(cè)到中和效價(jià)。 “Rb”兔個(gè)體?！盁o”對(duì)應(yīng)于在所測(cè)試的最低稀釋度(1 50)下小于50%中和?！癬”未測(cè)試 用單體和多型L2多肽接種之小鼠的應(yīng)答可以用HPV假病毒粒子攻擊小鼠，通過 遞送報(bào)告基因(如螢光素酶)來定量感染(Gambhira等，2007 ；Roberts等，2007)。以兩周 為間隔，用包含17-36，1-88或11-200位殘基的HPV16L2多肽、或三種串聯(lián)多型L2融合蛋白 (11-200 X 3、11-88 X 5或17-36 X 22)之一種接種小鼠3次，其中使用基于皂苷的GPI-0100 佐劑(Marciani等，2000)。兩周后收獲其血清，測(cè)定針對(duì)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58 (四 種常見致癌HPV類型)和HPV6(良性生殖器疣中最常見的類型)的體外中和效價(jià)。如在兔 中所觀察到地，用HPV16 L21-88或HPV16 L2 11-200接種誘導(dǎo)出顯著效價(jià)的針對(duì)同源病毒 類型HPV16的中和抗體。然而，用含有HPV16L217-36殘基的合成肽接種則未誘導(dǎo)出中和 抗體或L2特異性抗體(未顯示)，這可能因?yàn)槠淙狈υ撔∈蠓N系的T輔助表位(Alphs等， 2008)。在無佐劑的情況下用HPV16L1VLP接種，陽性對(duì)照誘導(dǎo)出比HPV16L2構(gòu)建物更高的 效價(jià)。相反地，用HPV45L1VLP接種未能誘導(dǎo)出HPV16中和抗體，這與針對(duì)LlVLP疫苗的類 型限制性應(yīng)答是一致的(圖1)。L211-88X5構(gòu)建物得到比HPV16L21-88肽增加的HPV16 中和抗體效價(jià)，但是這在11-200X3對(duì)比HPV16L211-200中未觀察到。17-36X22更加低效 (圖1)，可能由弱的T輔助細(xì)胞導(dǎo)致(Alphs等，2008)。出人意料的是，在用HPV16L2多肽 接種的小鼠中觀察到的交叉中和抗體應(yīng)答不如接受同樣接種的兔中產(chǎn)生的抗體應(yīng)答強(qiáng)。然 而，當(dāng)比較多型L2與HPV16L211-200和1-88構(gòu)建物時(shí)，用11-200X3和11-88X5進(jìn)行免 疫在誘導(dǎo)針對(duì)HPV6、HPV18、HPV45和HPV58的中和抗體方面更加有效(圖1)。很明顯，所 述11-200X3和11-88\5多肽不包含來自朋￥45或朋￥58的序列，然而卻觀察到了顯著的 交叉中和作用。添加佐劑的L2多型多肽潛在地比明礬更有效的或與明礬互補(bǔ)的數(shù)種佐劑 已在臨床疫苗試驗(yàn)中顯現(xiàn)出前景，例如免疫刺激序列(immunostimulatory sequence, ISS) 1018 ( 一種激活 toll 樣受體 9 的寡核苷酸)(Halperin 等，2005 ；Halperin 等，2003) 和基于皂苷的佐劑GPI-0100 (Marciani等，2003 ；Slovin等，2005)。為了確定特定佐劑在 與多型L2疫苗一起配制時(shí)是否對(duì)誘導(dǎo)HPV中和抗體更加有效，我們一一比較了針對(duì)與多種 佐劑及其組合一起配制的25 μ g 11-200X3的免疫應(yīng)答。第三次免疫兩周后從小鼠獲得血 清，測(cè)定HPV16、HPV18、HPV45和HPV58的體外中和效價(jià)(圖2)。在該時(shí)間點(diǎn)，各佐劑組之 間的體外中和效價(jià)非常相似，并且無一顯著優(yōu)于11-200X3在明礬中的制劑。除了峰值效價(jià)以外，佐劑還可以延長抗體應(yīng)答的時(shí)間。為了評(píng)估佐劑間的差異隨 著體液反應(yīng)之減弱會(huì)愈加明顯的可能性，在接種4個(gè)月后用HPV16假病毒粒子攻擊小鼠。在 施用攜帶有螢光素酶報(bào)告基因的HPV16假病毒粒子3天后，用螢光素酶的底物(螢光素)注 射被攻擊的小鼠來檢測(cè)皮膚感染的生物發(fā)光信號(hào)。單因素方差分析(帶有Bonferroni比 較的AN0VA)顯示單獨(dú)用11-200 X 3保護(hù)免受HPV16感染與PBS對(duì)照免疫具有顯著差異(P< 0. 05 ；圖4)。用任意測(cè)試佐劑中的11-200X3接種與PBS對(duì)照免疫具有更加顯著的差異 (P < 0. 001 ；圖4)。特別地，11-200父3外加明礬+1551018的制劑比單獨(dú)的11-200 X 3更有 效(Ρ<0· 01)。所測(cè)試的GPI-0100制劑外加11-200X3比單獨(dú)的11-200 X 3 (P < 0. 001)或 11-200X3聯(lián)合明礬(P <0.01)更有效。與僅用11-200X3相比，僅用明礬外加11-200X3 或僅用ISS1018外加11-200X3在保護(hù)方面未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。單獨(dú)用HPV16L1VLP (而非HPV45VLP)接種也得到與用11-200 X 3外加明礬 +ISS1018或GPI-0100 (P < 0.001 ；未顯示)接種相似的保護(hù)水平。因此，我們?cè)噲D比較由 用GARDASIL 接種之小鼠誘導(dǎo)與用佐劑GPI-0100中的11 -200 X 3或11 -88 X 5接種之小 鼠誘導(dǎo)的體外中和抗體效價(jià)。與用多型L2構(gòu)建物接種相比，針對(duì)HPV16和HPV18產(chǎn)生的體 外中和效價(jià)在用GARDASIL 接種之小鼠的血清中顯著更高(其中LlVLP包含在GARDASIL 中)。然而，在用GARDASIL 接種之小鼠的血清中沒有檢測(cè)到HPV45或HPV58中和抗體(圖 4)。相反地，在用11-200X3或11-88X5接種的小鼠血清中檢測(cè)到強(qiáng)的中和抗體效價(jià)，盡 管這兩種構(gòu)建物都不含源自HPV45或HPV58的L2序列。幾種佐劑在臨床試驗(yàn)中已被測(cè)試并證明有效且安全，包括明礬、GPI-0100、 明礬和免疫刺激序列1018(激活toll樣受體9的CpG寡核苷酸)。為了確定多 聚L2疫苗是否需要特定的佐劑以及佐劑對(duì)多聚L2疫苗產(chǎn)生的中和抗體應(yīng)答加強(qiáng) 的程度，對(duì)數(shù)種佐劑一一進(jìn)行了比較。因此，用2514在不同佐劑中的L211-200X3 或只用佐劑接種小鼠。各組分別為⑴只有明礬(1. 3mg氫氧化鋁/小鼠， SigmaA-8222)，(2)單獨(dú)的 CpG 1018 (10 μ g/ 小鼠)，(3) PBS, (4)單獨(dú)的 11-200X3， (5) 11-200X3+ 明礬(50 % 懸浮液)，(6) 11-200 X 3+CpG1018 (10 μ g/小鼠，Dynavax, Berkley, CA), (7) 11—200X3+GPI—0100 (50 μ g/ 小鼠，Hawaii Biotech，Maui，HI)， (8) ll-200X3+GPI-0100(200y g/ 小鼠)，(9) 11-200 X 3+GPI-0100 (50 μ g/ 小鼠)+Tween 40(lmg/鼠，Sigma P-1504)，(10) 11-200 X 3+明礬+CpG1018 (10 μ g/小鼠)。最后一次免 疫兩周后獲得血清，并測(cè)試HPV6、HPV16和HPV18的體外中和。當(dāng)與單獨(dú)的蛋白質(zhì)相比時(shí)， 各佐劑組之間的體外中和效價(jià)非常相似，這表明多聚L2蛋白本身是免疫原性的以及在接 種后緊接著不需要特定的佐劑用于獲得廣泛的中和抗體應(yīng)答。表4.佐劑組的ANOVA分析 B.方法抗原制備如前所述，通過PCR產(chǎn)生HPV16L2多肽表達(dá)構(gòu)建物(Pastrana等， 2005)。通過最低自由能計(jì)算將多型L2構(gòu)建物進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)，并通 過Blue Heron Inc.合成5' BamHI和3' Xhol位點(diǎn)以便于克隆。將L2基因亞克隆至pET28a 載體(Novagen)中，所得六組氨酸(6His)標(biāo)記的重組多肽表達(dá)于大腸桿菌BL21 (Rosetta cells, Novagen)中(Pastrana等，2005)。通過在8M尿素中結(jié)合鎳-氨基三乙酸(Ni-NTA) 柱(Qiagen)親和純化所述重組L2多肽(使用變性條件的QiaExpressionist標(biāo)準(zhǔn)純化方 法)，然后在盒(Pierce)中對(duì)Dulbecco' s磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行透析。通過SDS-PAGE 來監(jiān)測(cè)純度，使用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)通過二喹啉甲酸測(cè)試(Pierce)來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)在4 °C，用大腸桿菌中制備的IOOng/孔的 6His-HPV16L2或293TT細(xì)胞中產(chǎn)生并在PBS中稀釋的HPV16L1/L2假病毒粒子過夜包被Immobilon板(Nunc)。然后，用牛血清白蛋白(BSA)-PBS在室溫下對(duì)孔封閉1小時(shí)， 并用2倍稀釋的抗血清在室溫下孵育1小時(shí)。用PBS-0. 01% (體積/體積)Tween 20清 洗后，加入BSA-PBS中以1 5000稀釋的經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記之山羊抗兔IgG(KPLInc， Gaithersburg,MD)維持1小時(shí)。然后，再次清洗板，用2，2 ‘-次偶氮基-二(3-乙基苯并噻 唑啉-6-磺酸溶液(Roche)中顯影10分鐘(Viscidi等，2005)。在ELISA讀板器(Bio-rad, Benchmark Plus)中測(cè)量 405nm 處的吸光度(A405)。中和測(cè)定如先前所述進(jìn)行乳頭瘤病毒假病毒粒子的體外中和測(cè)定(Pastrana 等，2004)，使用溶于二乙醇胺中的對(duì)硝基苯磷酸鹽(Sigma，St. Louis, MO)測(cè)定澄清上清液 中分泌的堿性磷酸酶的活性，并在405nm處測(cè)量吸光度(A4tl5)。用于制備假病毒粒子的構(gòu)建 物和詳細(xì)操作步驟可在互聯(lián)網(wǎng)上找到(home. ccr. cancer, gov/lcc^。效價(jià)定義為引起A4tl5 減少50%的最高稀釋度的倒數(shù)，效價(jià)< 50視為不顯著。動(dòng)物研究根據(jù)約翰霍普金斯動(dòng)物飼養(yǎng)和使用委員會(huì)以及動(dòng)物倫理委員會(huì) (IAEC, Inida)的政策和批準(zhǔn)進(jìn)行研究。以兩周為間隔、用所示佐劑中25 μ g抗原(或化學(xué) 合成制備的HPV16L217-36肽(Sigma))對(duì)Balb/c小鼠(NCI Frederick)接種三次，每組5 只動(dòng)物。在最后一次免疫兩周后，由尾靜脈放血獲得血液樣品。在第1、28、42、60和76天 時(shí)用300yg L2多肽(最初在完全弗氏佐劑中，隨后在不完全弗氏佐劑中)接種兔。在第 1、21、35和56天時(shí)用12或30μ g的GARDASIL 進(jìn)行接種。最終加強(qiáng)一周后給兔放血。皮膚HPV攻擊用電動(dòng)剃刀剃去經(jīng)麻醉BALB/c小鼠腹側(cè)軀干的一小片毛發(fā)，同時(shí) 留心不傷到上皮。通過將3 X IO9個(gè)假病毒粒子顆粒(IOOng)(其含有10 μ 1 0.6%羧甲基 纖維素中的pYLUC)施加到經(jīng)剃毛的皮膚上進(jìn)行攻擊。三天后，再次麻醉小鼠，注射螢光素 (100μ l，7mg/ml)，利用 IVIS200 生物發(fā)光成像系統(tǒng)(Xenogen, Cranbury, NJ)獲得它們 10 分鐘的圖像。利用Living Image 2. 20軟件(Xenogen)分析含病毒接種位點(diǎn)的大小相等區(qū) 域，通過用缺少L2的非感染性HPV假病毒粒子攻擊來測(cè)定生物發(fā)光背景。統(tǒng)計(jì)方法通過帶有Boneferroni比較的單因素ANOVA(GraphPadPrism，版本4)， 比較小鼠模型中各組之間的效價(jià)和感染水平。參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)通過引用具體并入本文，其提供了補(bǔ)充本文描述的示范性方法或其 它細(xì)節(jié)。美國專利3，791，932
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權(quán)利要求
分離的多肽組合物，其包含來自感染性生物之至少兩種分離物的至少兩種同源性免疫原性肽，其中第一免疫原性肽與來自感染性生物之第二分離物的第二同源性免疫原性肽有效偶聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述免疫原性肽被構(gòu)建為線性排列。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述免疫原性肽通過接頭部分有效偶聯(lián)。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中所述融合蛋白包含偶聯(lián)免疫原性肽的肽接頭。
6.權(quán)利要求1的多肽，其中所述感染性生物是性傳播生物。
7.權(quán)利要求6的多肽，其中所述性傳播生物選自乳頭瘤病毒(PV)、巨細(xì)胞病 毒(CMV)、皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV/AIDS)、卡波西氏肉瘤相 關(guān)皰疹病毒(KSHV/HHV8)、軟下疳嗜血桿菌(Haemophi lus ducreyi)、腹股溝肉芽腫 (Granuloma inguinale)、肉芽月中銷桿菌(Calymmatobacterium granulomatis)、淋病奈 瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、解尿素支原體 (Ureaplasma urealyticum)、人型支原體(Mycoplasma hominis)、金黃色葡萄球菌或梅毒螺旋體(Treponema pallidum)。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述感染性生物是乳頭瘤病毒。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述乳頭瘤病毒是選自a、旦、Y、5、￡、ζ、n、θ、l、 k、入、u、v、ξ、0或31乳頭瘤病毒的乳頭瘤病毒屬成員。
10.權(quán)利要求8的所述多肽，其中所述感染性生物是人乳頭瘤病毒(HPV)。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中所述HPV是皮膚HPV。
12.權(quán)利要求10的多肽，其中所述HPV是粘膜高風(fēng)險(xiǎn)HPV。
13.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性肽是選自如下一種或多種的免疫原性HPV肽 HPV1, HPV2, HPV3, HPV4, HPV5, HPV6, HPV7, HPV8, HPV9, HPV10, HPV11, HPV12, HPV13, HPV14, HPV15, HPV16, HPV17, HPV18, HPV 19，HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV25, HPV26, HPV27, HPV28, HPV29, HPV30, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV36, HPV37, HPV38, HPV39, HPV40, HPV41, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV46, HPV47, HPV48, HPV49, HPV50, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV57, HPV58, HPV59, HPV60, HPV61, HPV62, HPV63, HPV64, HPV65, HPV66, HPV67, HPV68, HPV69, HPV70, HPV71, HPV72, HPV73, HPV74, HPV75, HPV76, HPV77, HPV78, HPV79, HPV80, HPV81, HPV82, HPV83, HPV84, HPV85, HPV86, HPV87, HPV88, HPV89, HPV90, HPV91, HPV92, HPV93, HPV94, HPV95, HPV96, HPV97, HPV98, HPV99 或HPV100多肽。
14.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性肽選自如下一種或多種多肽HPV1、HPV2、HPV5、 HPV6、HPV8、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、 HPV58、HPV59、HPV68、HPV73 或 HPV82 多肽。
15.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性肽選自如下一種或多種多肽HPV6、HPV16、 HPV18、HPV31、HPV39、HPV51、HPV56 和 / 或 HPV73 多肽。
16.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性肽選自HPV1、HPV5、HPV6、HPV16和/或HPV18多肽。
17.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性肽選自HPV6、HPV16或HPV18多肽中的一種或多種。
18.權(quán)利要求13的多肽，其中免疫原性HPV肽是HPVL2多肽區(qū)段。
19.權(quán)利要求13的多肽，其中所述HPVL2肽區(qū)段對(duì)應(yīng)于SEQIDN0 1的13-45、17-36、 1-88、11-88或11-200位氨基酸位置。
20.權(quán)利要求18的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV16L2肽。
21.權(quán)利要求18的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV18L2肽。
22.權(quán)利要求18的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV6L2肽。
23.權(quán)利要求18的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV45L2肽。
24.權(quán)利要求18 的多肽，其包含至少 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22或更多種免疫原性肽。
25.權(quán)利要求18的多肽，其包含至少3種免疫原性肽。
26.權(quán)利要求18的多肽，其包含至少5種免疫原性肽。
27.權(quán)利要求18的多肽，其包含至少20種免疫原性肽。
28.權(quán)利要求25的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV16L2肽。
29.權(quán)利要求25的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV18L2肽。
30.權(quán)利要求25的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV6L2肽。
31.權(quán)利要求25的多肽，其中至少一種HPVL2肽是HPV45L2肽。
32.權(quán)利要求25的多肽，其中第一HPVL2肽是HPV16L2肽，第二 HPVL2肽是HPV18L2肽。
33.權(quán)利要求25的多肽，其中第一HPVL2肽是HPV16L2肽，第二 HPVL2肽是HPV6L2肽。
34.權(quán)利要求25的多肽，其中第一HPVL2肽是HPV18L2肽，第二 HPVL2肽是HPV6L2肽。
35.權(quán)利要求25的多肽，其中第一HPVL2肽是HPV16L2肽，第二 HPVL2肽是HPV18L2 肽，第三HPVL2肽是HPV6L2肽。
36.權(quán)利要求18的多肽，其中所述HPVL2肽具有選自SEQIDN0 :71_92和/或SEQ ID NO 94-106 和 / 或 SEQ ID NO 110-112 的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求1的多肽，其中所述HPVL2肽包含與SEQID NO 93或SEQ ID N0:107或 SEQ ID NO: 108 或 SEQ ID NO: 109 或 SEQ IDN0:113 或 SEQ ID NO : 114 的氨基酸序列具有 至少60%同一性的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求1的多肽，其中所述HPVL2肽包含與SEQID NO 93或SEQ ID N0:107或 SEQ ID NO 108 或 SEQ ID NO 109 或 SEQ IDN0 :113 或 SEQ ID NO : 114 的氨基酸序列具有 至少70%同一性的氨基酸序列。
39.權(quán)利要求1的多肽，其中所述HPVL2肽包含與SEQID NO 93或SEQ ID N0:107或 SEQ ID NO: 108 或 SEQ ID NO: 109 或 SEQ IDN0:113 或 SEQ ID NO : 114 的氨基酸序列具有 至少80%同一性的氨基酸序列。
40.權(quán)利要求1的多肽，其中所述HPVL2肽包含SEQID NO 93或SEQ ID NO 107或 SEQ ID NO 108 或 SEQ ID NO 109 或 SEQ ID NO 113 或 SEQ ID NO 114 的氨基酸序列。
41.權(quán)利要求18的多肽，其還包含非HPVL2肽。
42.權(quán)利要求41的多肽，其中所述非HPVL2肽是HPVL1肽或HPVL1蛋白質(zhì)。
43.權(quán)利要求41的所述多肽，其中所述非HPVL2肽是Th活化表位、載體蛋白質(zhì)或佐劑。
44.包含權(quán)利要求1之多肽的藥盒。
45.編碼權(quán)利要求1之多肽的核酸。
46.包含權(quán)利要求1之多肽的顆粒組合物。
47.權(quán)利要求46的顆粒組合物，其中所述顆粒是病毒顆粒。
48.權(quán)利要求46的顆粒組合物，其中所述顆粒是病毒樣顆粒。
49.權(quán)利要求46的顆粒組合物，其中所述顆粒是病毒衣殼。
50.誘導(dǎo)針對(duì)乳頭瘤病毒之免疫應(yīng)答的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求8之分離 多肽。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。
52.預(yù)防乳頭瘤病毒感染的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求8之多肽。
53.包含權(quán)利要求1之多型組合物的藥盒。
54.包含與權(quán)利要求1之組合物結(jié)合的抗體的藥盒。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及多型HPV多肽的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101896194SQ200880120046
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者理查德·B·S·羅登, 蘇布哈希尼·雅古 申請(qǐng)人:約翰霍普金斯大學(xué)