專利名稱：核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可持續(xù)地滯留在細(xì)胞內(nèi)、低毒性且高安全性的核酸復(fù)合體，及核 酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
背景技術(shù)：
近年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理活性功能的核酸。 例如已知siRNA(small interfering RNA 小干涉RNA)可引起存在于細(xì)胞內(nèi)的靶基因的 mRNA分解，阻礙靶基因表達(dá)(RNAinterference :RNA干涉)。由此RNA干涉產(chǎn)生的阻礙靶基 因表達(dá)的功能，在緩解或治療由特定的基因或基因組的異常表達(dá)而引起的疾病癥狀方面是 有用的，故人們期待將siRNA開發(fā)用作治療藥。但是，在包括siRNA治療的基因治療中，由 于核酸是具有負(fù)電荷的水溶性高分子，所以其具有非常低的向細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率，導(dǎo) 致無法得到有效的治療效果。目前，為了有效地將基因轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，已知有利用載體(運(yùn)載體)的技術(shù)。運(yùn)載 體分為病毒性運(yùn)載體及非病毒性運(yùn)載體。病毒性運(yùn)載體顯示出高核酸導(dǎo)入效率，但是在病 原性、免疫原性及細(xì)胞毒性等安全性方面存在許多不明之處。因此，在臨床應(yīng)用中期待使用 非病毒性運(yùn)載體。非病毒性運(yùn)載體的例子包括已經(jīng)市售的Lipofectamine 2000。進(jìn)而，報(bào)道了一 種具有特定結(jié)構(gòu)的陽離子性脂質(zhì)(參見專利文獻(xiàn)1)；一種含有兩親性化合物及聚陽離子的 組合物(參見專利文獻(xiàn)2)。利用非病毒性運(yùn)載體將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)如下進(jìn)行首先將應(yīng) 轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸與非病毒性運(yùn)載體混合形成復(fù)合體，然后使該復(fù)合體與靶細(xì)胞接觸。非病毒性 運(yùn)載體可以形成脂質(zhì)體時(shí)，核酸在被封入脂質(zhì)體內(nèi)的狀態(tài)下參入到細(xì)胞內(nèi)，從而使核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。但是，siRNA等核酸具有穩(wěn)定性低、電荷強(qiáng)的特有的性質(zhì)。因此，核酸與非病毒性 運(yùn)載體混合時(shí)，導(dǎo)致穩(wěn)定性降低、持續(xù)的核酸向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入被抑制。雖然已知通過形成 siRNA與陽離子性聚合物的復(fù)合體將核酸封入脂質(zhì)體內(nèi)的例子(參見非專利文獻(xiàn)1)，但從 陽離子性聚合物的細(xì)胞毒性的觀點(diǎn)考慮，一般認(rèn)為在實(shí)用性上并不可用。進(jìn)而，即使利用核 酸與現(xiàn)有的非病毒性運(yùn)載體形成穩(wěn)定的復(fù)合體時(shí)，該復(fù)合體也可能具有低的向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn) 運(yùn)能力或者可能迅速地被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。因此，上述現(xiàn)有的非病毒性運(yùn)載體無法將核酸持 續(xù)地保持在細(xì)胞內(nèi)，無法發(fā)揮基于核酸的所期望的效果。鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)，迫切期望開發(fā)出一種低毒性且高安全性、能有效地將核酸 (例如siRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)、并且持續(xù)地保持核酸的技術(shù)。專利文獻(xiàn)1 日本特表2002-529439號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特表2005-508394號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn) 1 :Kentaro Kogure et al. ， Development of a non-viral-multi functional-envelope-type nano device by a novel lipid filmhydration method, J. Control. Release，98(2004) 317—32
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)課題。具體而言，本發(fā)明的目的在于提供一 種低毒性且高安全性的、可以將siRNA等核酸持續(xù)地保持在細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)合體，以及能 夠有效地將核酸復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供 一種含有核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的藥物組合物，以及通過使核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸，將 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法。本發(fā)明人等為了解決上述問題，經(jīng)過反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的 核酸與高支化環(huán)糊精形成復(fù)合體，可以得到低毒性且高安全性的、能夠?qū)⒑怂岢掷m(xù)地保持 在細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)合體。本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)通過使用含有下述物質(zhì)的載體作為用于將該核 酸復(fù)合體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，可以進(jìn)一步提高安全性、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的有效性及 細(xì)胞內(nèi)核酸的持續(xù)性，所述物質(zhì)包括(A) 二?；字Ｄ憠A、(B)膽固醇及/或其衍生物、 以及(C)脂肪族伯胺。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)通過進(jìn)一步深入研究而完成的。本發(fā)明提供下述項(xiàng)項(xiàng)1、一種核酸復(fù)合體，其特征在于，含有核酸及高支化環(huán)糊精。項(xiàng)2、如項(xiàng)1所述的核酸復(fù)合體，其中，相對于1重量份核酸，高支化環(huán)糊精的量為 1 4000重量份。項(xiàng)3、如項(xiàng)1或2所述的核酸復(fù)合體，其中，核酸為siRNA。項(xiàng)4、如項(xiàng)1 3中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體，其中，高支化環(huán)糊精是具有內(nèi)支環(huán)結(jié) 構(gòu)部分和外支化結(jié)構(gòu)部分的、聚合度為50 5000的葡聚糖，所述內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分由a -1， 4-糖苷鍵及至少一個(gè)a-1，6_糖苷鍵形成，所述外支化結(jié)構(gòu)部分與所述內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分連接。項(xiàng)5、如項(xiàng)1 4中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體，上述核酸復(fù)合體是通過將核酸與高 支化環(huán)糊精在水溶液中混合而得到的聚集體。項(xiàng)6、一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，含有項(xiàng)1 5中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用載體。項(xiàng)7、如項(xiàng)6所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為含有下述物質(zhì)的 組合物(A) 二酰基磷脂酰膽堿；(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種；及(C)脂肪族伯胺。項(xiàng)8、如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(A)為?；?部分的碳原子數(shù)為4 23的二酰基磷脂酰膽堿。項(xiàng)9、如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(B)為膽固醇。項(xiàng)10、如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(C)為碳 原子數(shù)為10 20的烷基胺。項(xiàng)11、如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，成分(A)成分(B)成分(C)的 摩爾比為5 9 1 5 1。
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項(xiàng)12、如項(xiàng)7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，所述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體是由成分 (A) (C)形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。項(xiàng)13、一種藥物組合物，含有項(xiàng)6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。項(xiàng)14、如項(xiàng)13所述的藥物組合物，其中，核酸為siRNA。項(xiàng)15、項(xiàng)6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物在制備用于將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞 內(nèi)的藥物中的應(yīng)用。項(xiàng)16、如項(xiàng)15所述的應(yīng)用，其中，核酸為siRNA。項(xiàng)17、一種將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法，包括使項(xiàng)6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸的步驟。項(xiàng)18、如項(xiàng)17所述的方法，其中，核酸為siRNA。通過使用高支化環(huán)糊精將核酸形成復(fù)合體可以得到本發(fā)明的核酸復(fù)合體，由此可 以高安全性、且長時(shí)間地將核酸復(fù)合體穩(wěn)定地保持在細(xì)胞內(nèi)，持續(xù)地發(fā)揮基于該核酸的有 用效果。另外，本發(fā)明的核酸復(fù)合體易于與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體形成復(fù)合體，即使為脂質(zhì)體形態(tài) 的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，也易于被封入其中。因此從核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物制備的容易性方面考慮， 本發(fā)明的復(fù)合體也優(yōu)異。進(jìn)而，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以將上述核酸復(fù)合體導(dǎo)入細(xì) 胞內(nèi)。為了將本發(fā)明的核酸復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，通過使用含有下述物質(zhì)的載體作為細(xì) 胞轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，可以提高核酸復(fù)合體向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，并且可以進(jìn)一步提高向細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)運(yùn)的持續(xù)性及安全性，所述物質(zhì)包括(A) 二酰基磷脂酰膽堿、(B)膽固醇及/或其衍生 物、以及(C)脂肪族伯胺。如上所述，本發(fā)明的核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以有效且持續(xù)地發(fā)揮基于 該核酸的有用效果，并且具有高安全性，因此該復(fù)合體及組合物作為基因治療中使用的藥 物特別有用。因此，本發(fā)明中的藥物組合物或?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法可以更有效地將 核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)地說明本發(fā)明。(1)核酸復(fù)合體本發(fā)明的核酸復(fù)合體的特征在于含有核酸及高支化環(huán)糊精。本發(fā)明的核酸復(fù)合體中使用的核酸只要是需要轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的核酸即可，對類型 或結(jié)構(gòu)沒有特別限定。上述核酸的具體例包括siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA (微 RNA)、核酶、反義寡核苷酸、誘餌寡核苷酸(decoy oligonucleotide)、質(zhì)粒DNA、肽核酸、三 鏈形成性寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides (TFOs))、適體(aptamer)、基因 等，其中優(yōu)選為siRNA。雖然siRNA在與現(xiàn)有的非病毒性運(yùn)載體的共存的條件下具有穩(wěn)定性 低的缺點(diǎn)，但將siRNA形成為本發(fā)明的核酸復(fù)合體時(shí)，兼有優(yōu)異的穩(wěn)定性和持續(xù)地向細(xì)胞 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。本發(fā)明的核酸復(fù)合體中使用的核酸可以是來自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等 的核酸，或者也可以是通過化學(xué)合成制備得到的核酸。上述核酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈中 的任一種，并且對其分子量也沒有特別限定。另外，在本發(fā)明中，核酸也可以是被化學(xué)物質(zhì)、 酶或肽修飾的核酸。進(jìn)而，在本發(fā)明中，核酸可以單獨(dú)使用，或者也可以組合兩種以上進(jìn)行使用。本發(fā)明的核酸復(fù)合體中使用的高支化環(huán)糊精是使分支酶作用于例如支鏈淀粉等 具有a-1，4_糖苷鍵及至少一個(gè)a-1，6_糖苷鍵的糖類而生產(chǎn)得到的，是具有內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu) (inner branched cyclic structure)部分及夕卜支化結(jié)構(gòu)(outer branched structure) 部分的、聚合度為50 5000的葡聚糖。內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分是由a-1，4_糖苷鍵及至少一個(gè) a-1，6_糖苷鍵形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分，外支化結(jié)構(gòu)部分是與內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分連接的非環(huán)狀 結(jié)構(gòu)部分。外支化結(jié)構(gòu)部分通過至少一個(gè)a-1，6_糖苷鍵與內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分連接。高支化 環(huán)糊精的優(yōu)選方案包括上述葡聚糖的內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分的聚合度為10 100，上述葡聚糖 的外支化結(jié)構(gòu)部分的聚合度為40以上，上述葡聚糖的外支化結(jié)構(gòu)部分的單元鏈的聚合度 的平均值為10 20。上述高支化環(huán)糊精例如如圖1所示，圖1中(i)表示內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部 分，(ii)表示外支化結(jié)構(gòu)部分。可以從已知聚合度的原料的洗脫部位使用差示折光儀采用凝膠過濾測定聚合度。 在該測定中，差示折光儀的輸出與葡聚糖的濃度成比例，小角激光散射光度計(jì)的輸出與聚 合度的產(chǎn)生及葡聚糖的濃度成比例。因此，葡聚糖的聚合度可以通過測定如差示折光儀及 小角激光散射光度計(jì)兩種檢測器的輸出比率來確定。具體條件如US6248566B1(日本專利 第3107358號(hào))所示。上述高支化環(huán)糊精及其制備方法如US6248566B1 (日本專利第3107358號(hào))所示， 高支化環(huán)糊精由Ezaki Glico株式會(huì)社以“ClusterDextrin”為注冊商標(biāo)銷售。本發(fā)明的核酸復(fù)合體中，上述高支化環(huán)糊精與上述核酸的比率沒有特別限定，但 相對于1重量份核酸，高支化環(huán)糊精通常為1 4000重量份，優(yōu)選為10 1000重量份，更 優(yōu)選為100 400重量份。從摩爾比的觀點(diǎn)考慮，作為該比率例如可以舉出相對于1摩爾 核酸，高支化環(huán)糊精為0. 1 1000摩爾、優(yōu)選為1 100摩爾、更優(yōu)選為10 20摩爾。通 過滿足上述比率，可以使通過核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體獲得的向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的持續(xù)性、及安全 性越發(fā)顯著。本發(fā)明的核酸復(fù)合體的平均粒徑通常為6 60nm，優(yōu)選為8 30nm，更優(yōu)選為 10 20nm。核酸復(fù)合體的平均粒徑使用激光動(dòng)態(tài)光散射法作為體積平均粒徑進(jìn)行測定。本發(fā)明的核酸復(fù)合體是由上述核酸與上述高支化環(huán)糊精聚集而形成的復(fù)合體。本 發(fā)明的核酸復(fù)合體，通過在可以穩(wěn)定地分散上述核酸與上述高支化環(huán)糊精的溶液中將兩者 混合進(jìn)行制備。作為可以穩(wěn)定地分散上述核酸與上述高支化環(huán)糊精的溶液，具體而言可以 舉出Tris等緩沖液。上述緩沖液可以含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑。作為上述核酸 與上述高支化環(huán)糊精混合的條件，可以舉出在上述溶液中，將例如0. liiM lOOiiM左右、 優(yōu)選liiM 10iiM左右的核酸與liiM 1000iiM左右、優(yōu)選10iiM lOOyM左右的高支 化環(huán)糊精，在室溫下混合1 100分鐘左右、優(yōu)選5 10分鐘左右。如上所述制備的本發(fā) 明的核酸復(fù)合體以分散于溶液中的狀態(tài)存在?？梢詫⒃摲稚Ⅲw直接與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體混合 進(jìn)行使用，或者根據(jù)需要稀釋后或濃縮后與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體混合進(jìn)行使用。(2)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物上述核酸復(fù)合體通過與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體混合，參入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中，該核酸可 以被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。即，本發(fā)明還提供一種含有上述核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的核酸 轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體是指為了將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)(導(dǎo)入)至細(xì)胞內(nèi)而作為核酸載體使用的非 病毒性運(yùn)載體。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物是指為了將該組合物中含有的核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)而與成為 導(dǎo)入對象的細(xì)胞接觸的組合物。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的組成本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中使用的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，只要可以將核酸參入細(xì)胞 內(nèi)即可，沒有特別限定。作為上述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，例如可以使用LipOfectamineTM2000等 公知的載體。從進(jìn)一步提高上述核酸復(fù)合體中所含核酸的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性、以及進(jìn)一步提高細(xì)胞 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率及安全性的觀點(diǎn)考慮，例如優(yōu)選使用含有下述物質(zhì)的載體(A) 二?；字?膽堿、(B)膽固醇及/或其衍生物、及(C)脂肪族伯胺(以下稱作“載體1，，)。載體1中使用的二?；字Ｄ憠A(以下有時(shí)記作“成分(A) ”)，只要藥理學(xué)上允 許即可，沒有特別限定，例如可以舉出酰基部分的碳原子數(shù)為4 23的二?；字Ｄ憠A。 構(gòu)成該二?；字Ｄ憠A的兩個(gè)?；奶荚訑?shù)可以相同或不同。二酰基磷脂酰膽堿的具體例包括二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、肉 豆蔻酰棕櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽堿、二丁 酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二庚酰磷脂酰膽堿、二癸酰磷脂酰膽堿、二苯二甲酰磷 脂酰膽堿、二月桂基磷脂酰膽堿、二花生酰磷脂酰膽堿、二(二十一烷?；?磷脂酰膽堿、 二芥酸酰磷脂酰膽堿、二花生四烯酸酰磷脂酰膽堿、雙(二十三烷二?；?磷脂酰膽堿 (bis (tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。其中，優(yōu)選例包括酰基部分的碳原子數(shù) 為12 18的二?；字Ｄ憠A；更優(yōu)選例包括二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽 堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰棕櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚 酰硬脂酰磷脂酰膽堿等?；糠值奶荚訑?shù)為13 17的二?；字Ｄ憠A；特別優(yōu)選例 包括二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿及二硬脂酰磷脂酰膽堿；最優(yōu)選例包括 二硬脂酰磷脂酰膽堿。上述二酰基磷脂酰膽堿可以單獨(dú)使用或者組合兩種以上進(jìn)行使用。載體1中使用的膽固醇及/或其衍生物(以下有時(shí)記作“成分⑶”)只要藥理學(xué) 上允許即可，沒有特別限定。膽固醇的衍生物為具有膽固醇骨架的陽離子性脂質(zhì)，具體而言 包括33-[N-(N，，N，- 二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)，3 3-[N，，N，， N，-三甲基氨基乙烷]碘化膽固醇(TC-Chol)，(N，，N-雙胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-膽 固醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol) (BGTC)，N-膽甾烯基氧基羰基-3，7-二氮雜 壬烷-1，9-二胺、丙氨酸-二乙醇胺-膽固醇、N4-精胺膽固醇氨基甲酸酯(GL-67)， N[N4-3-氨基丙基亞精胺]膽固醇氨基甲酸酯(GL-78)，N4-精胺膽固醇甲酰胺(GL-gO^N1， N8-雙(精氨酸甲酰胺)-N4-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯出1^-95)、及^況，#，#-三(3-氨 基丙基)亞精胺]膽固醇氨基甲酸酯(GL-96)。成分(B)的優(yōu)選例包括膽固醇。載體1中， 作為成分(B)可以單獨(dú)使用膽固醇及其衍生物、或者也可以組合兩種以上進(jìn)行使用。載體1中使用的脂肪族伯胺(以下有時(shí)也記作“成分(C) ”)只要藥理學(xué)上允許即 可，沒有特別限定，例如可以舉出烷基部分的碳原子數(shù)為10 20的烷基胺。脂肪族伯胺的具體例包括月桂胺、肉豆蔻胺、棕櫚胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二 甲酰胺(phthanoylamine)等。其中，優(yōu)選烷基部分的碳原子數(shù)為12 18的烷基胺；更優(yōu)
7選硬脂胺、油胺和棕櫚酰胺；特別優(yōu)選硬脂胺。上述脂肪族伯胺可以單獨(dú)使用或者組合兩種 以上進(jìn)行使用。載體1含有上述成分(A) (C)的組合。為了進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效 率、及進(jìn)一步降低毒性，優(yōu)選下述組合(A)?；糠值奶荚訑?shù)為4 23的二?；字?膽堿、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C)碳原子數(shù)為10 20的烷基胺的組合；更優(yōu)選
(A)二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿及/或二硬脂酰磷脂酰膽堿、(B)膽固醇、 以及(C)硬脂胺的組合。載體1中，成分(A) (C)的比率沒有特別限定，例如可以舉出成分(A)成分
(B)成分(C)的摩爾比為5 9 1 5 1，優(yōu)選為6 9 1 4 1，更優(yōu)選為7 8 2 3 1。通過滿足上述比率，可以進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率及進(jìn)一步降 低毒性。相對于載體1的總量，成分(A) (C)的總量例如可以舉出1 100重量％，優(yōu)選 為20 90重量％，更優(yōu)選為30 70重量％。載體1中除成分(A) (C)之外還可以含有其他陽離子性脂質(zhì)。可用的陽離 子性脂質(zhì)的具體例包括角鯊胺(Squalamine),3a,7a,12a-H (3_氨基丙氧基)_5 0 -膽 燒-24-(N，N-雙(3-氨基丙基)胺(3a，7a，12a-Tris(3-aminopropoxy)-53-chol an-24- (N, N-bis (3-aminopropyl) amine) >3a,7a, 12a-三(3- M ^ M ft ■月旦 烷-24- (N- (N- (3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a，7a, 12a_Tris (3-aminopropoxy) -5 b-cholan-24-(N_(N_(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a，7a，12a_ 三(3-疊 氮基丙氧基)-5 0-膽烷-24-(N，N-雙(2-氰基乙基)胺)(3a，7a，12a-Tris(3-azidopr opoxy) -5b-cholan-24- (N, N_bis (2-cyanoethyl) amine))、3a,7a, 12a-三(3~ 疊氮基丙氧 基)-5 3 -膽烷-24-(N-(芐氧基羰基)-N-(羥基丙基)-胺)(3a, 7a, 12a-Tris (3-azidop ropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)_N_(3-hydroxypropyl)-amine))等留 族化合物結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；傘狀精胺復(fù)合體(Umbrella-spermineconjugates)等膽酸 結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；留醇糖苷結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；留類皂苷結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；二 甲基二(十八烷基)溴化銨鹽(DDAB)、1，2-二肉豆蔻?；?3-三甲基銨丙烷、1，2_ 二油 ?；?3-三甲基銨丙烷(D0TAP)、1，2_ 二油?；?3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、1，2- 二棕 櫚?；?3-三甲基銨丙烷、1，2- 二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷、N-(l-(2, 3-雙(油酰基氧 基)丙基)_N，N，N-三甲基銨鹽酸鹽(D0TMA)、二肉豆蔻?；趸谆u基乙基溴化 銨鹽(DMRIE)、二油酰基氧基丙基二甲基羥基乙基溴化銨(D0RIE)、二甲基(二)十二烷基 溴化銨、N- (a-三甲基銨基乙?；?_ ( 二)十二烷基-D-谷氨酰胺鹽酸鹽、N- (a-三甲基銨 基乙?；?_0，0，-雙-(1禮111，211，211-全氟癸基)-1^谷氨酰胺鹽酸鹽、0，0，- 二(十二 烷酰基)-N-(a-三甲基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化 銨、N-{p-(w-三甲基銨基丁基氧基)_苯甲?；鶀 _ 二(十二烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、 9-(w-三甲基銨基丁基)-3，6_雙(十二烷?；?咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)銨鹽 酸鹽、N-w-三甲基銨基十二烷?；?二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N- {p- (w-三甲基 銨基己基氧基)_苯甲?；鶀-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w_三甲基銨基癸基 氧基)_P’ -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-l-0810)、p-{w-(b-羥基乙基)二甲基-銨基-癸 基氧基}-p，-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-0810)、0，0，，0”_三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-銨基癸?；?_三(羥基甲基)氨基甲烷溴化物鹽(TC-1_12)、1，2-二月桂基-甘 油-3-乙基磷酸膽堿、1，2- 二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2- 二棕櫚?；?甘 油-3-乙基磷酸膽堿、1，2_ 二硬脂?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1，2_ 二油?；?甘 油-3-乙基磷酸膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸膽堿等季銨鹽型陽離子性 脂質(zhì)等。載體1含有除成分(A) (C)之外的其他陽離子性脂質(zhì)時(shí)，該陽離子性脂質(zhì)的比 例只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，例如可以舉出下述比例，即相對于100重 量份上述成分㈧ (C)的總量，該陽離子性脂質(zhì)為1 10重量份，優(yōu)選為2 8重量份， 更優(yōu)選為4 6重量份。根據(jù)需要，載體1也可以含有油性基劑。配合油性基劑，利用其特性，由此能控制 載體1的核酸導(dǎo)入效率。例如通過配合油性基劑調(diào)節(jié)載體1的比重，可以控制細(xì)胞與載體 1的接觸性，改善體外的導(dǎo)入效率。另外，例如通過配合具有溫度感受性功能的基劑作為油 性基劑，能夠在規(guī)定的溫度條件下使核酸載體組合物的芯破碎，從而誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng)， 提高核酸的導(dǎo)入效率。進(jìn)而，例如通過配合具有外部刺激破碎性的基劑作為油性基劑，可以 通過外部刺激使載體1的芯破碎，從而誘發(fā)細(xì)胞表面的波動(dòng)，提高核酸的導(dǎo)入效率?？梢栽谳d體1中配合的油性基劑的例子包括全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛 烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氫化大豆油、大豆油非皂化物、角鯊烯、 蓖麻油、丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松節(jié)油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、棕櫚油、菜子 油、雜醇油、橄欖油、亞麻仁油、芝麻油、葉綠素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉 樹油、玉米油、熏衣草油、香馬郁蘭油、檸檬油、棉籽油、椰子油、蛋黃油、玫瑰花油、松油、杏 仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黃菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、羅馬春黃菊 油、蛇油、留蘭香油、向日葵油、可可脂、小麥胚芽油、氧化鋅油、氫化油、氫化植物油、輕質(zhì)液 體石蠟、液體石蠟、中鏈脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖 麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化蓖麻油20、聚氧乙 烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯氫化蓖麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油 60、蓖麻油聚烴氧酯35、操作油等。在上述油性基劑中，全氟戊烷具有溫度感受性、具有在 29. 5°C下通過沸騰氣化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷及全氟三丁基胺具有下述特 性，即具有外部刺激破碎性，在由超聲波照射產(chǎn)生的刺激等來自外部的刺激作用下，使載體 1的芯產(chǎn)生空腔，使其破碎。當(dāng)含有油性基劑時(shí)，該油性基劑的比例只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒有特別 限定，例如可以為下述比例，即相對于100重量份上述成分(A) (C)的總量，該油性基劑 為0. 1 50重量份、優(yōu)選為1 30重量份、更優(yōu)選為5 20重量份。根據(jù)需要載體1也可以含有膜融合性脂質(zhì)(輔助脂質(zhì))。通過含有上述膜融合性 脂質(zhì)，載體1可以進(jìn)一步提高核酸向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。上述膜融合性脂質(zhì)的例子包括二 油?；字Ｒ掖及贰⒍王；字Ｄ憠A、反式磷脂?；字；掖及贰?，2_雙(10， 12-二十三烷二酰基)_磷酸乙醇胺、1，2_二反油?；姿嵋掖及?、1，2_二(十六烷基)磷酸 乙醇胺、1，2_ 二己?；姿嵋掖及贰?，2_ 二月桂?；姿嵋掖及?、1，2_ 二亞油酰基磷酸乙 醇胺、1，2-二肉豆蔻?；姿嵋掖及贰?，2-二油?；姿嵋掖及贰?，2-二棕櫚油酰基磷酸 乙醇胺、1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?、1，2- 二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2- 二硬脂?；姿嵋?br> 9醇胺、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕櫚?；?2- (10，12- 二十三烷二?；?磷酸 乙醇胺、1，2- 二油?；姿嵋掖及?N-己酰胺、1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及?N-己酰胺、N， N- 二甲基-1，2- 二油?；姿嵋掖及贰，N- 二甲基-1，2- 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、N-十二 烷?；?1，2- 二棕櫚?；姿嵋掖及贰-十二烷?；?1，2- 二油?；姿嵋掖及?、1，2- 二 油?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1，2_ 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2_ 二 油?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1，2_ 二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2_ 二油?；?酸乙醇胺-N-乳糖、1，2_ 二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸 鹽、二棕櫚酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽、1，2_ 二棕櫚?；?磷酸乙醇胺-N-[4(p-馬來酰亞胺苯基)丁酰胺、1，2_ 二油?；姿嵋掖及?N-[4(p-馬來 酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-甲基-1，2-二油?；姿嵋掖及?、N-甲基-二棕櫚?；姿嵋?醇胺、1，2_ 二油?；姿嵋掖及?N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、1，2_ 二棕櫚?；姿嵋掖?胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸鹽、N-(琥珀酰)-1，2_ 二油?；姿嵋掖及?、N-(琥珀酰)-1， 2_ 二棕櫚?；姿嵋掖及返?。其中，在載體1中優(yōu)選使用二油?；字Ｒ掖及贰．?dāng)含有該膜融合性脂質(zhì)時(shí)，該膜融合性脂質(zhì)的比例只要不妨礙本發(fā)明的效果即 可，沒有特別限定，可以舉出下述比例，即相對于100重量份上述成分(A) (C)的總量，該 膜融合性脂質(zhì)為1 500重量份、優(yōu)選為10 250重量份、更優(yōu)選為25 100重量份。根據(jù)使用形態(tài)，載體1可以含有等滲劑、賦形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、 保存劑等各種添加劑；及/或精制水、糖水溶液、緩沖液、生理鹽水、高分子水溶液、不含 RNase的水等水性載體。上述添加劑和水性載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的使用 形態(tài)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的形態(tài)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的形態(tài)沒有特別限定，只要能夠封入轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的核酸即可， 但優(yōu)選為脂質(zhì)體形態(tài)。例如將載體1制成脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，上述成分(A) (C)及根據(jù)需要 選擇使用的其他脂質(zhì)形成脂質(zhì)體膜。將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體制成脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，可以為小單層脂質(zhì)體(smallimilamellar. vesicles :SUV)、大單層脂質(zhì)體(large unilamellar vesicles :LUV)、及多層脂質(zhì)體 (multilamellar vesicles :MLV)中的任一種。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的粒徑可以根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)對象的 細(xì)胞種類適當(dāng)設(shè)定，例如可以舉出為SUV時(shí)粒徑為20 lOOnm左右、為LUV時(shí)粒徑為200 lOOOnm左右、為MLV時(shí)粒徑為400 3500nm左右。脂質(zhì)體的粒徑是根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射法而測 定得到的。脂質(zhì)體的制備及其粒徑的調(diào)節(jié)按照本領(lǐng)域公知的方法實(shí)施。例如為載體1時(shí)，可 以使用含有上述成分(A) (C)的油相和水相(水性載體)，通過薄膜法、逆向蒸發(fā)法、醚注 入法、表面活性劑法、加熱法等形成脂質(zhì)體。另外，可以通過擠壓法、French press法、均質(zhì) 化法等調(diào)節(jié)粒徑。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的形態(tài)、組成、使用方法核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為脂質(zhì)體形態(tài)時(shí)，在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，核酸復(fù)合體 可以以被封入在脂質(zhì)體內(nèi)水相中的狀態(tài)存在，或也可以以通過離子鍵或疏水鍵鍵合在脂質(zhì) 體膜的內(nèi)側(cè)或外側(cè)的狀態(tài)存在。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為脂質(zhì)體以外的形態(tài)時(shí)，在本發(fā)明的核酸 轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，只要核酸復(fù)合體與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的成分通過離子鍵或疏水鍵形成復(fù)合
10體即可。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物通過混合核酸復(fù)合體與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體制成所期望 的形態(tài)，或以任意順序混合核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的配合成分制成所期望的形態(tài)而 進(jìn)行制備。在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物中，核酸復(fù)合體與核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的比率根據(jù)核酸 復(fù)合體的種類、核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的種類、成為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)對象的細(xì)胞的種類等而不同。可以舉 出下述比率，即相對于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的總量100重量份，核酸復(fù)合體為1 100重量份、 優(yōu)選為10 100重量份、更優(yōu)選為20 100重量份。更具體而言，使用載體1作為核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用載體時(shí)，例如可以舉出下述比率，即相對于載體1中的成分㈧ (C)的總量100重量 份，核酸復(fù)合體為1 100重量份、優(yōu)選為10 100重量份、更優(yōu)選為20 100重量份。進(jìn)而，使用載體1作為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體時(shí)，載體1中含有的成分(A) (C)的總量 相對于核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的總量，例如可以舉出10 90重量％、優(yōu)選為30 80重量％、 更優(yōu)選為40 60重量％。根據(jù)其使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以含有等滲劑、賦形劑、稀釋劑、 增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑；及/或精制水、葡萄糖水溶液、緩沖液、生理 鹽水等水性載體。上述添加劑和水性載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的使用形態(tài) 而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物可以單獨(dú)用作基因治療藥物等藥物組合物。使用本發(fā) 明的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物作為藥物組合物時(shí)，選擇藥理學(xué)上允許的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體、基質(zhì)、運(yùn) 載體等。本發(fā)明的藥物組合物可以制成各種藥物形態(tài)。本發(fā)明的藥物組合物的形態(tài)的例子 包括液體制劑，如溶液劑(包括糖漿劑等)、滴劑、注射劑等；固體制劑，如片劑、丸劑、散劑、 顆粒劑、膠囊劑(包括軟膠囊劑)等。本發(fā)明的藥物組合物為液體制劑時(shí)，其可以通過冷凍 或凍干等方法除去水分進(jìn)行保存。凍干制劑、干糖漿劑等可以在使用時(shí)再次溶解于注射用 蒸餾水、滅菌水等中。本發(fā)明的藥物組合物為固體制劑時(shí)，可以在使用時(shí)再次溶解于注射用 蒸餾水、滅菌水等中。在本發(fā)明中，成為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)對象的細(xì)胞、即應(yīng)用本發(fā)明的藥物組合物的細(xì)胞，沒有 特別限定，可以為培養(yǎng)細(xì)胞、從生物體中分離的細(xì)胞(包括株化的細(xì)胞)、體內(nèi)細(xì)胞等，可以 來自于人或非人的動(dòng)物。本發(fā)明的藥物組合物可以用于體外或體內(nèi)。在本發(fā)明中，可以通過使本發(fā)明的藥物組合物與細(xì)胞接觸的步驟將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì) 胞內(nèi)。使藥物組合物與細(xì)胞接觸的方法沒有特別限定，只要使適當(dāng)量的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物 與成為核酸導(dǎo)入對象的細(xì)胞接觸即可。例如，該方法可以與基因治療中迄今為止公知的方 法相同，與細(xì)胞接觸的量也同樣適用，可以適當(dāng)選擇方法及量。將本發(fā)明的藥物組合物用于 細(xì)胞可以使核酸的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)變得容易，持續(xù)且穩(wěn)定地將被轉(zhuǎn)運(yùn)的核酸保持在細(xì)胞內(nèi)。例如，為了使本發(fā)明的藥物組合物在體外與細(xì)胞接觸，可以在適當(dāng)量的藥物組合 物存在下培養(yǎng)細(xì)胞。為了使本發(fā)明的藥物組合物在體外與培養(yǎng)的細(xì)胞或從生物體分離得到 的細(xì)胞接觸，可以在血清存在下進(jìn)行上述接觸。使本發(fā)明的藥物組合物在體內(nèi)與細(xì)胞接觸 時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物可以通過下述方法與細(xì)胞接觸，例如向組織內(nèi)直接注入；向靜脈、 皮下、肌肉、腹腔、眼內(nèi)、消化器官內(nèi)、牙內(nèi)等注射；從鼻腔、口腔、肺等吸入給與；口服給與； 經(jīng)皮膚給與；通過口腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經(jīng)粘膜給與等。
根據(jù)需要，本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步含有藥理學(xué)上允許的載體或基質(zhì)。載 體及基質(zhì)只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，根據(jù)使用形態(tài)適當(dāng)選擇。例子如上 所述。在上述情況下，藥物組合物、載體及基質(zhì)的配合比例只要不妨礙本發(fā)明的效果即可， 沒有限定，根據(jù)使用形態(tài)適當(dāng)選擇。使用本發(fā)明的藥物組合物時(shí)，使用其有效量。例如藥物組合物的使用量如下，即相 對于每一個(gè)細(xì)胞，含有的核酸復(fù)合體的量為0. 001 10pM、優(yōu)選為0. 001 lpM、更優(yōu)選為 0. 01 0. lpM。本發(fā)明的藥物組合物可以將特定的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。即，本發(fā)明的藥物組合物 通過使藥物組合物與細(xì)胞接觸，可以有效地將存在于藥物組合物中的、及形成核酸復(fù)合體 的特定核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還提供一種將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法。根據(jù)本發(fā)明，將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞 內(nèi)的方法包括使上述核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸的步驟。核酸復(fù)合體或核 酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞之間的接觸，只要將適當(dāng)量的核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與成 為核酸導(dǎo)入對象的細(xì)胞接觸即可，沒有特別限定。例如，接觸方法、與細(xì)胞接觸的量可以與 迄今為止在基因治療中公知的方法、與細(xì)胞接觸的量相同，可以適當(dāng)選擇方法及量通過按照上述方法使核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸，可以將核酸持 續(xù)且穩(wěn)定地保持在細(xì)胞內(nèi)。為了與細(xì)胞接觸，核酸復(fù)合體可以直接使用，或者與上述載體或 基質(zhì)組合進(jìn)行使用。核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物也可以直接使用，或者與上述載體或基質(zhì)組合進(jìn)行 使用。為了更有效地進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，優(yōu)選使核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸。本發(fā)明中，如上所述，成為核酸轉(zhuǎn)運(yùn)對象的細(xì)胞沒有限定，可以為培養(yǎng)細(xì)胞、從生 物體中分離的細(xì)胞(包括株化的細(xì)胞)、體內(nèi)細(xì)胞等，可以來自于人或非人的動(dòng)物。上述接 觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。例如，為了使核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞在體外接觸，可以在適當(dāng)量 的核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。為了使核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用 組合物與培養(yǎng)的細(xì)胞或從生物體中分離的細(xì)胞在體外接觸，可以在血清存在下進(jìn)行上述接 觸。使核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物與細(xì)胞在體內(nèi)接觸時(shí)，核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組 合物可以通過下述方法與細(xì)胞接觸，例如向組織內(nèi)直接注入；向靜脈、皮下、肌肉、腹腔、眼 內(nèi)、消化器官內(nèi)、牙內(nèi)等注射；從鼻腔、口腔、肺等吸入給與；口服給與；經(jīng)皮膚給與；通過口 腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經(jīng)粘膜給與等。根據(jù)本發(fā)明，將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法中，使有效量的核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn) 用組合物與細(xì)胞接觸，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。例如可以選擇核酸復(fù)合體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物 的給與量，使向每個(gè)細(xì)胞給與0. 001 10pM，優(yōu)選0. 001 lpM，更優(yōu)選0. 01 0. lpM的核
酸復(fù)合體。本發(fā)明的將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法可以通過使藥物組合物與細(xì)胞接觸來進(jìn)行。 使用藥物組合物時(shí)，本發(fā)明的方法可以采用與上述同樣的方法。實(shí)施例以下基于實(shí)施例等詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。在以下實(shí)施例及 試驗(yàn)例中，使用GL3-siRNA(相對于螢火蟲熒光素酶的siRNA ；Dharmacon公司(Boulder， CO), USA ；有意5，-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT，反義5，-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作為siRNA。使用Cluster dextrin(Ezaki Glico株式會(huì)社制)作為高支化環(huán)糊精。實(shí)施例1含有siRNA與高支化環(huán)糊精的復(fù)合體的制備使用Tris-EDTA(TE)緩沖液(Fluka公司制)，制備以2 y M的濃度含有siRNA的溶 液(siRNA溶液)。另外，使用Tris-EDTA(TE)緩沖液(Fluka公司制)制備以25 y M的濃 度含有高支化環(huán)糊精的溶液(高支化環(huán)糊精溶液)。將等量的上述溶液混合1分鐘，形成 siRNA復(fù)合體。得到的siRNA復(fù)合體的物性示于表1。表 1
粒徑(nm)Zeta 電位( mV)復(fù)合體 31.1-42.9# 粒徑表示使用 ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT)(利用激光衍射法測定體積平均粒徑)測定得到的平均粒徑(nm)。Zeta 電位利用 ZETASIZER 3000HSA (MALVERN INSTRUMENT)測定。實(shí)施例2含有siRNA復(fù)合體的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的制備稱量二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇及硬脂胺使其摩爾比為二硬脂酰磷脂 酰膽堿膽固醇硬脂胺=7:3: 1，用茄型瓶(回收瓶)使之溶解于氯仿。用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀使溶液減壓干燥，形成脂質(zhì)薄膜。將實(shí)施例1中得到的含有0.028mg/ml siRNA復(fù)合 體的溶液添加到所得脂質(zhì)薄膜中，使溶液的DSPC的濃度為30mg/mL，然后將其混合。用 擠出機(jī)通過孔徑為800nm及200nm的膜來調(diào)節(jié)溶液的粒徑，制備陽離子性脂質(zhì)體形態(tài) 的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。得到的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的粒徑約為200nm，為粒度均勻的 粒子的脂質(zhì)體形態(tài)。上述組合物的Zeta電位約為50mV。粒徑表示為使用ZETASIZER 3000HSA (MALVERNINSTRUMENT)(利用激光衍射法測定體積平均粒徑)測定得到的平均粒徑 (nm)。Zeta 電位為利用 ZETASIZER 3000HSA(MALVERNINSTRUMENT)測定得到的。實(shí)施例3含有siRNA復(fù)合體的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的制備除DSPC 膽固醇硬脂胺=7:3: 2之外，與實(shí)施例2同樣地制備陽離子性脂 質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。與實(shí)施例2同樣地，得到的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的粒徑約 為200nm，為粒度均勻的粒子的脂質(zhì)體形態(tài)。上述組合物的Zeta電位約為50mV。試驗(yàn)例1siRNA 的封入率(inclusion efficiency)的評(píng)價(jià)使用預(yù)先用FITC標(biāo)記的siRNA，與上述實(shí)施例1同樣地制備FITC標(biāo)記的siRNA復(fù) 合體。使用FITC標(biāo)記的siRNA復(fù)合體，在與實(shí)施例2及3同樣的條件下制備陽離子性脂質(zhì) 體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。將剛制備好的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物通過離心(75，000rpm、l 小時(shí))使之沉淀，測定存在于上清中的FITC標(biāo)記的siRNA的熒光強(qiáng)度，算出siRNA的封入 率(相對于全部的siRNA，被封入脂質(zhì)體內(nèi)的siRNA的比例(％ ))。結(jié)果，在與實(shí)施例2、實(shí)施例3同樣的條件下制備時(shí)，siRNA的封入率顯示出高水 平，分別為97. 2%、99. 8%。這表明本發(fā)明的核酸復(fù)合體具有有效地以脂質(zhì)體形態(tài)導(dǎo)入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體的特性。雖然限定性解釋并不理想，但推測這是由于高支化環(huán)糊精與siRNA形 成緊密的復(fù)合體。試驗(yàn)例2細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)利用MTS試驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)。MTS試驗(yàn)利用Promega公司制的“CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay” 進(jìn)行。具體而言，在 96 孔板上將 A594 細(xì) 胞(ATCC，USA)以3. 16X104細(xì)胞/孔接種在200iiL含有10容量％胎牛血清(FBS)的 Dulbecco's Modification ofEagle，s 培養(yǎng)基(DMEM)中，在 37°C下培養(yǎng) 24 小時(shí)。用 Hank，s 緩沖鹽溶液(HBSS)洗滌3次后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM。向每1孔中分別加入 20uL上述每種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。然后，將孔中的培 養(yǎng)上清液更換為含有10容量％ FBS的DMEM，進(jìn)一步在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)20小時(shí)。 向各孔中加入20 ii L MTS(四唑鐺鹽)試劑及100 ii L含有10容量％ FBS的DMEM培養(yǎng)基， 培養(yǎng)2小時(shí)。測定在492nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率(cellviability)。細(xì)胞存活率是 以不添加核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物在上述條件下培養(yǎng)時(shí)測定的492nm處的吸光度為100%計(jì)算得 到的。結(jié)果示于圖2。圖2表明實(shí)施例2及3的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物均顯示出低細(xì)胞毒性、 高安全性。特別是確認(rèn)了實(shí)施例2及3的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物顯示出明顯高的安全性。試驗(yàn)例3siRNA向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率的評(píng)價(jià)試驗(yàn)通過使用流式細(xì)胞儀測定FITC標(biāo)記的siRNA的熒光強(qiáng)度來評(píng)價(jià)siRNA的細(xì)胞內(nèi) 導(dǎo)入效率。在本試驗(yàn)中，使用的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物是利用預(yù)先在siRNA上進(jìn)行FITC標(biāo)記的 siRNA制備得到的。具體而言，在24孔板上將A594細(xì)胞(ATCC，USA)以5X105細(xì)胞/孔接 種至500ii L含有10容量％ FBS的DMEM中，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)。用HBSS 洗滌3次后，向其中加入0. 95ml不含F(xiàn)BS的DMEM。再向各孔中分別加入0. 05ml實(shí)施例1 及2的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)4小時(shí)。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液 更換為含有10容量％ FBS的DMEM，進(jìn)一步在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)20小時(shí)。將各孔用 HBSS洗滌 1 次后，加入 0. 2mL CellScrubBuffer (Gene TherapySystems, Inc.制)，在 37°C、 5% C02條件下培養(yǎng)15分鐘。再用HBSS洗滌2次后，使用胰蛋白酶剝?nèi)「街诳椎撞康募?xì) 胞，通過離心分離回收細(xì)胞，使所得細(xì)胞懸浮于HBSS中。使上述懸浮液通過41 iim孔徑的 膜。用流式細(xì)胞儀測定加入核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物2小時(shí)后、12小時(shí)后及24小時(shí)后的細(xì)胞的 熒光強(qiáng)度。作為對照，使用下述對照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，與上述相同地測定細(xì)胞的熒光強(qiáng) 度，所述對照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物如下制備以容量比1 1混合用OptiMEM培養(yǎng)基將市售 的常用作基因運(yùn)載體的Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司制)稀釋至0. lmg/mL的溶 液、和用TE緩沖液以2 u M的濃度稀釋siRNA的siRNA溶液。結(jié)果示于圖3。由上述結(jié)果確認(rèn)，為實(shí)施例1及2的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的任一種情 況下，siRNA均持續(xù)地保持在細(xì)胞內(nèi)且其濃度保持恒定。相對于此，對照用核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合 物不僅初期的向細(xì)胞內(nèi)的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)率低，而且細(xì)胞內(nèi)的siRNA還經(jīng)時(shí)減少，加入12小時(shí) 后及24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)的siRNA量不充分。


圖1表示高支化環(huán)糊精的例子。圖2表示試驗(yàn)例2的試驗(yàn)結(jié)果，即核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物的細(xì)胞內(nèi)安全性的評(píng)價(jià)結(jié)果。圖3表示試驗(yàn)例3中由各核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物介導(dǎo)的將siRNA導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的評(píng)價(jià) 結(jié)果。圖3中的縱坐標(biāo)表示每一個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。
權(quán)利要求
一種核酸復(fù)合體，其特征在于，含有核酸及高支化環(huán)糊精。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸復(fù)合體，其中，相對于1重量份核酸，高支化環(huán)糊精的量為 1 4000重量份。
3.如權(quán)利要求1或2所述的核酸復(fù)合體，其中，核酸為siRNA。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體，其中，高支化環(huán)糊精是具有內(nèi)支環(huán)結(jié) 構(gòu)部分和外支化結(jié)構(gòu)部分的、聚合度為50 5000的葡聚糖，所述內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分由α -1， 4-糖苷鍵及至少一個(gè)α-1，6-糖苷鍵形成，所述外支化結(jié)構(gòu)部分與所述內(nèi)支環(huán)結(jié)構(gòu)部分連 接。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體，所述核酸復(fù)合體是通過將核酸與高 支化環(huán)糊精在水溶液中混合而得到的聚集體。
6.一種核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，含有權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的核酸復(fù)合體及核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用載體。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體為含有下述物質(zhì)的 組合物(A)二?；字Ｄ憠A；(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種；及(C)脂肪族伯胺。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(A)為?；?部分的碳原子數(shù)為4 23的二酰基磷脂酰膽堿。
9.如權(quán)利要求7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(B)為膽固醇。
10.如權(quán)利要求7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體中的成分(C)為碳 原子數(shù)為10 20的烷基胺。
11.如權(quán)利要求7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，成分(A)成分(B)成分(C)的 摩爾比為5 9 1 5 1。
12.如權(quán)利要求7所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物，其中，所述核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體是由成分 (A) (C)形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。
13.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。
14.權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物在制備用于將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞 內(nèi)的藥物中的應(yīng)用。
15.一種將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的方法，包括使權(quán)利要求6 12中任一項(xiàng)所述的核酸轉(zhuǎn) 運(yùn)用組合物與細(xì)胞接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種低毒性且高安全性的、可以將siRNA等核酸持續(xù)地保持在細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)合體；以及能夠有效地將核酸復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用組合物。通過使用導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的核酸與高支化環(huán)糊精形成復(fù)合體，可以得到低毒性且高安全性的、可以將核酸持續(xù)地保持在細(xì)胞內(nèi)的核酸復(fù)合體。進(jìn)而，通過使用含有下述物質(zhì)的載體作為用于將該核酸復(fù)合體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運(yùn)用載體，可以進(jìn)一步提高安全性、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的有效性、及細(xì)胞內(nèi)核酸的持續(xù)性，所述物質(zhì)包括(A)二?；字Ｄ憠A、(B)膽固醇及/或其衍生物、及(C)脂肪族伯胺。
文檔編號(hào)A61K47/40GK101854918SQ20088011516
公開日2010年10月6日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者豐福秀一, 平安幸, 戶塚裕一, 竹內(nèi)洋文 申請人:大塚制藥株式會(huì)社;竹內(nèi)洋文