專利名稱：藥用化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對包含雌激素受體陽性(ER+)癌細(xì)胞的癌癥的治療，特別是乳腺癌的 治療。本發(fā)明人提供了包含藥用組分和毒素組分的偶聯(lián)物。所述偶聯(lián)物具有靶向和消滅 ER+癌細(xì)胞的優(yōu)異能力。
背景技術(shù)：
在全世界的女性中乳腺癌是最常見的癌癥，也是最常見的癌癥致死原因。據(jù)信乳 腺癌由各種因素導(dǎo)致，這些因素之一是雌激素的血濃度的升高。在雌激素受體族領(lǐng)域及雌 激素受體癌細(xì)胞與正常雌激素受體細(xì)胞之間的差異方面已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。這些研究的 目標(biāo)一直以來都針對著對可以通過抑制體內(nèi)雌激素生成來治療乳腺癌的藥物的發(fā)現(xiàn)。
這種類型的癌癥之一包含攜帶雌激素受體的細(xì)胞(ER+細(xì)胞)。這些細(xì)胞是帶有大 量雌激素受體(通常為約200000 5000000個)的細(xì)胞。正常的非癌性雌激素受體細(xì)胞 通常會有約20000 80000個雌激素受體。由于大量雌激素受體的存在，癌細(xì)胞在雌激素 存在時響應(yīng)于即便是少量的激素而具有增加的分裂速度。 Surgical Oncology 12 (2003) 277-287 (Soo Lo， St印hen R.D.Johnston)中討論
了對乳腺癌的新型系統(tǒng)治療。這些新型系統(tǒng)治療包括諸如純抗雌激素和選擇性雌激素受體 調(diào)節(jié)劑(SERM)等內(nèi)分泌治療、靶向生長因子受體的單克隆抗體、小分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、 疫苗及免疫治療策略以及抗血管生成治療。 已在雌激素受體陽性癌癥的治療中顯示出療效的一種藥物是他莫昔芬。他莫昔芬 是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的一個實例，其通過與細(xì)胞表面上的雌激素受體結(jié)合 和防止雌激素與細(xì)胞結(jié)合并由此抑制細(xì)胞分裂，從而起到雌激素受體陽性癌細(xì)胞的拮抗劑 的作用。雖然他莫昔芬是乳腺組織中的拮抗劑，但其充當(dāng)子宮內(nèi)膜上的部分激動劑，且已發(fā) 現(xiàn)其與某些女性的子宮內(nèi)膜癌有關(guān)聯(lián)。因此，子宮內(nèi)膜的變化(包括癌癥)是他莫昔芬的
副作用之一。 另據(jù)提出，他莫昔芬和卟啉的偶聯(lián)物可能在癌細(xì)胞的光動力治療中有效， 從而所述卟啉在暴露于紅光時顯示出光毒性活性，并且其與未偶聯(lián)的卟啉相比對于 MCF-7乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷。在Bioinorganic & medicinal Chemistry 10 (2002) 3237-3243 (Swamy，James，Mohr， Hanson和Ray)中，還描述了選擇性定位于雌激素 受體陽性乳腺癌細(xì)胞中的用于乳腺癌光動力治療的雌二醇_卟啉偶聯(lián)物。
其治療癌癥的有效性已得到研究的其它偶聯(lián)物包括抗體毒素偶聯(lián)物。British Journal of Haemotology 2000， 110， 351-361 (Bolognesi， Polito等)公開了將諸如皂草 素(s即orin)等核糖體失活蛋白與單克隆抗體連接以用于霍奇金淋巴瘤的治療。然而，迄 今還沒有已經(jīng)成功通過人類試驗成為許可產(chǎn)品的產(chǎn)品問世。 雖然市場上用于治療癌癥、特別是乳腺癌的現(xiàn)有藥物和治療確實能夠減緩這些癌 細(xì)胞的分裂，但是，幾年之后細(xì)胞變異使得這些藥物對于這些細(xì)胞不再有效，藥物變得無 用，而患者對于治療沒有響應(yīng)。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種對于ER+癌癥(特別包括這種乳腺癌)的新型治 療，所述治療通過消滅ER+癌細(xì)胞而不是像其它SERM和治療所做的僅僅降低這些癌細(xì)胞的 細(xì)胞分裂速度從而解決上述問題。 通過下文中概述的本發(fā)明的各個方面和實施方式解決了上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種化合物，所述化合物包含
(a)能與ER+細(xì)胞受體結(jié)合的第一組分；禾口
(b)第二組分； 其中，所述第二組分為核糖體失活毒素并與所述第一組分偶聯(lián)。
第一組分能夠與包含雌激素受體的細(xì)胞(所謂的ER+細(xì)胞)結(jié)合，換言之，能夠與 ER+細(xì)胞受體或雌激素細(xì)胞受體結(jié)合。如上文所提及，在本說明書中，ER+細(xì)胞受體為雌激 素受體陽性細(xì)胞受體(ER+)。這些ER+細(xì)胞受體可以存在于許多細(xì)胞類型上，而本發(fā)明擴(kuò) 展至能夠與所有ER+受體結(jié)合而與細(xì)胞類型無關(guān)的組分。然而，本發(fā)明感興趣的細(xì)胞通常 為一般具有大量的雌激素受體(通常為約200， 000 5， 000， 000個)的癌細(xì)胞。本發(fā)明特 別感興趣的是所有類型的乳腺癌細(xì)胞。相比之下，正常的非癌性雌激素受體細(xì)胞通常有約 20， 000 80， 000個雌激素受體。 第一組分的具體身份不受特別限制，只要其符合上述標(biāo)準(zhǔn)即可。然而，在優(yōu)選實施
方式中，第一組分為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，例如雷洛昔芬化合物。 在本發(fā)明中，核糖體失活毒素通常為蛋白(核糖體抑制蛋白毒素被稱為RIP毒
素)，并且優(yōu)選的是，RIP為I型RIP。通常，這種蛋白通過不可逆地阻斷蛋白合成和導(dǎo)致細(xì)
胞死亡來發(fā)揮作用。毒素的具體身份不受特別限制，只要其符合上述標(biāo)準(zhǔn)即可。在優(yōu)選實
施方式中，毒素為皂草素。 在優(yōu)選實施方式中，該化合物的第一組分與第二組分的化學(xué)計量比為0.5 : l N : l，其中N是第一組分在第二組分中的結(jié)合位點的總數(shù)。結(jié)合位點不受特別限制，但所 述結(jié)合位點應(yīng)該能將第一組分與第二組分結(jié)合。 一般而言(不排除其它情況)，結(jié)合位點 為酪氨酸或賴氨酸。在皂草素中，存在至多14個酪氨酸結(jié)合位點和至多23個賴氨酸結(jié)合 位點，它們各自均能獨立地充當(dāng)?shù)谝唤M分的結(jié)合位點(即，N二 14、N二23或N二37，這取 決于是否僅使用酪氨酸連接點、僅使用賴氨酸連接點或同時使用酪氨酸和賴氨酸連接點)。
由此，其范圍優(yōu)選為o. 5 : 1 37 : i，優(yōu)選為o. 5 : i 23 : i，更優(yōu)選為o. 5 : l
14 : i。然而，根據(jù)哪些附著點被使用，可以采用這些范圍內(nèi)的任何比例。 在更特別優(yōu)選的實施方式中，第一組分與第二組分的化學(xué)計量比為0.5 : l
8 : i(優(yōu)選o.5 : 1 小于8 : i)，更優(yōu)選為o.5 : 1 2.5 : i?；瘜W(xué)計量比還優(yōu)選為 0.5 : i 7 : i、o.5 : i 6 : i、o.5 : i 5 : i、o.5 : i 4 : i、o.5 : i 3 : i 和o. 5 : i 2 : i 。 在這方面，化學(xué)計量比既指平均化學(xué)計量比，也指分子化學(xué)計量比。例如，包含等 比例的分子化學(xué)計量比為i : i的偶聯(lián)物(即，每個第二組分分子與一個第一組分分子偶 聯(lián))和分子化學(xué)計量比為3 : i的偶聯(lián)物(即，每個第二組分分子與三個第一組分分子偶 聯(lián))的混合物具有2 : i的平均化學(xué)計量比。在此方式下可能出現(xiàn)非整數(shù)的化學(xué)計量比。
5
本發(fā)明還提供了含有任何上述化合物的藥用組合物。 在另一個方面，本發(fā)明提供了任何上述的化合物和組合物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個方面提供了將任何上述化合物或組合物用于制造用于治療包含 ER+細(xì)胞的癌癥的藥劑的應(yīng)用。ER+細(xì)胞癌癥的類型不受特別限制，但是特別優(yōu)選的是，該 癌癥為乳腺癌。所述藥劑適合治療任何哺乳動物，特別優(yōu)選人類受試對象。施用方法不受 特別限制，但是優(yōu)選的是，藥劑適于注射或輸注(靜脈內(nèi)或其它方式)到受試對象中或者經(jīng) 口服施用于受試對象。 藥劑的使用劑量不受特別限制，只要提供足以滿足療效和毒性要求的劑量即可。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，藥劑適于注射到受試對象中以使偶聯(lián)物的峰值血藥濃度達(dá)到
相當(dāng)于第一組分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的1% 500%。 在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，藥劑適于注射到受試對象中以達(dá)到第一組
分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的80 % 140 % 。 在這方面，雷洛昔芬的目標(biāo)血藥濃度基于雷洛昔芬在血液中的人類標(biāo)準(zhǔn)治療峰值 濃度(即0. 5ng/ml)。 本發(fā)明還提供了任何上述化合物的制造方法，所述方法通過將第一組分與第二組 分反應(yīng)以將第一組分與第二組分偶聯(lián)來進(jìn)行。 本發(fā)明還提供了包含ER+細(xì)胞的癌癥、特別是乳腺癌的治療方法，所述方法包括
對受試對象施用藥劑，其中，所述藥劑包含任何上述的化合物或組合物。 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的偶聯(lián)化合物和組合物提供了對ER+癌細(xì)胞的有效
治療，其使用導(dǎo)致每日腫瘤體積最初顯著減小，并使腫瘤生長速度的減小得到加快或持續(xù)，
同時沒有顯著影響非癌性ER+細(xì)胞。


下面將參考以下討論及附圖，僅通過實例的方式進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，附圖 中 圖1顯示的是暴露于濃度遞減的不同皂草素雷洛昔芬(S : R)偶聯(lián)物的MCF-7、
HCC-1143和0VCAR-3細(xì)胞單層的存活率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)乳酸脫氫酶(LDH)釋放測試來計算各細(xì)
胞系的細(xì)胞存活率(％ )，其中最小釋放(存活率為0% )對應(yīng)于使用50 ii g/ml的絲裂霉素
C處理的細(xì)胞，最大釋放(100% )存活率對應(yīng)于僅用完全培養(yǎng)基處理的細(xì)胞。 圖2顯示的是暴露于500nM雷洛昔芬皂草素為2 : 1的偶聯(lián)物(S : Rl : 2偶
聯(lián)物)或皂草素(500nM)、雷洛昔芬(1000nM)以及皂草素(500nM)和雷洛昔芬(1000nM)
的共混物(即，未偶聯(lián))的摩爾濃度等價物(molarconcentration equivalent)的MCF-7、
HCC-1143和0VCAR-3細(xì)胞單層的存活率。根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)釋放測試來計算各細(xì)胞
系的細(xì)胞存活率(％ )，其中最小釋放(存活率為0% )對應(yīng)于使用50 ii g/ml的絲裂霉素C
處理的細(xì)胞，最大釋放(100% )存活率對應(yīng)于僅用完全培養(yǎng)基處理的細(xì)胞。 圖3顯示的是在使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 、0. 4ng/ml雷洛昔芬或0. 4nM雷洛昔
芬皂草素為2 : i的偶聯(lián)物(s : r i : 2)治療后雌性裸鼠中已建立的MCF-7腫瘤的生
長圖。接種(challenge)后的第36天和第43天，使動物通過眼球后途徑接受靜脈治療。
圖4顯示的是與對照組和未偶聯(lián)的產(chǎn)品相比，使用偶聯(lián)物治療的腫瘤體積的百分
6比變化。 圖5顯示的是與對照組和未偶聯(lián)的產(chǎn)品相比，使用偶聯(lián)物治療的體重的百分比變 化。
具體實施例方式
本發(fā)明提供包含能與ER+細(xì)胞受體結(jié)合的第一組分以及第二組分的化合物，其 中，第二組分通常為I型RIP類毒素并與第一組分偶聯(lián)。 本發(fā)明的第一組分能與ER+細(xì)胞受體結(jié)合，所述第一組分不受特別限制，只要保 持其功能性即可。然而，如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)任何選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)化合物 都特別有用。SERM的類型不受特別限制，但可以包含任何以下化合物氟維司群、他莫昔 芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬和拉索昔芬。具體而言，雷洛昔芬化合物特別有用。 第二組分是核糖體失活毒素。如已說明的那樣，第二組分優(yōu)選為蛋白(RIP毒素)， 并且進(jìn)一步優(yōu)選I型RIP。特別優(yōu)選的是，所述毒素自身不能進(jìn)入細(xì)胞而僅作用于細(xì)胞的內(nèi) 部運轉(zhuǎn)。 雷洛昔芬是用于防止絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的510Da選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑 (SERM)。近期臨床試驗(Vogel VG ;Costantino JP等；用于"國家手術(shù)佐劑乳腺和腸項 目 (National Surgical Adjuvant Breast and BowelPro ject (NSABP)) ，，。 Effects of Tamoxifen vs Raloxifene on the Risk ofDeveloping Invasive Breast Cancer and Other Disease Outcomes :TheNSABP Study of Tamoxifen and Raloxifene(STAR)P_2 Trial. JAMA. 2006 ;295 :2727-2741)已顯示，雷洛昔芬在降低雌激素受體陽性乳腺癌的發(fā) 生率方面與他莫昔芬同樣有效。但是，與每日服用他莫昔芬的女性相比，每日服用雷洛昔芬 的患者的子宮癌情況要少36%，而凝血情況要少29%。子宮癌、特別是子宮內(nèi)膜癌是他莫 昔芬的嚴(yán)重副作用。 雷洛昔芬化合物可以采取以下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 7</formula>
用于雷洛昔芬的取代基不受特別限制，可以包括任何有機(jī)基團(tuán)和/或一個或多個 來自元素周期表的11IA、IVA、VA、VIA或VIIA族中的任何族的原子，例如，B、Si、N、P、0或 S原子或鹵原子(例如F、Cl、Br或I)。 當(dāng)取代基包含有機(jī)基團(tuán)時，有機(jī)基團(tuán)優(yōu)選包含烴基。烴基可包含直鏈基團(tuán)、支鏈基 團(tuán)或環(huán)狀基團(tuán)。烴基可以獨立地包含脂肪族或芳香族基團(tuán)。此外，烴基還可以獨立地包含 飽和或不飽和基團(tuán)。 當(dāng)烴包含不飽和基團(tuán)時，可以包含一個或多個烯烴官能團(tuán)和/或一個或多個炔烴 官能團(tuán)。當(dāng)烴包含直鏈或支鏈基團(tuán)時，可以包含一個或多個伯、仲和/或叔烷基。當(dāng)烴包含 環(huán)狀基團(tuán)時，可以包含芳香環(huán)、脂肪環(huán)、雜環(huán)基和/或這些基團(tuán)的稠環(huán)衍生物。環(huán)狀基團(tuán)因 此可包含苯、萘、蒽、茚、荷、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、噴哚、咪唑、 噻唑和/或噁唑基，以及上述基團(tuán)的位置異構(gòu)體。 烴基中的碳原子數(shù)不受特別限制，但是烴基優(yōu)選包含1 40個C原子。因此，烴 基可為低級烴(1 6個C原子)或高級烴(7個以上C原子，例如7 40個C原子)。環(huán) 狀基團(tuán)的環(huán)中的原子數(shù)不受特別限制，但是環(huán)狀基團(tuán)的環(huán)優(yōu)選包含3 10個原子，例如3、 4、5、6或7個原子。 上述包含雜原子的基團(tuán)和上述任何其它基團(tuán)可以包含一個或多個雜原子，所述雜 原子來自元素周期表的IIIA、 IVA、VA、VIA或VIIA族中的任何族，例如，B、Si、N、P、0或S 原子或鹵原子(例如F、 Cl、 Br或I)。因此取代基可以包含有機(jī)化學(xué)中的一種或多種任何 常見官能團(tuán)，例如，羥基、羧酸基、酯基、醚基、醛基、酮基、氨基、酰胺基、亞氨基、硫醇基、硫 醚基、硫酸酯基、磺酸基和磷酸酯基等。取代基還可以包含這些基團(tuán)的衍生物，例如羧酸酐 和羧酸鹵化物。 另外，任何取代基都可以包含兩種以上上述取代基和/或官能團(tuán)的組合。
當(dāng)本發(fā)明的第二組分為I型RIP類毒素時，其不受特別限制。它可以是皂草素、 MOM、PAP-S、三角梅核糖體失活蛋白(bouganin)和格拉寧素(gelanin)中的任何一種，其中 特別可將皂草素用作作為本發(fā)明的化合物和藥用組合物的一部分的毒素。
皂草素是由皂草植物(肥皂草)的種子獲得的30kDa的I型核糖體失活蛋白 (RIP)。皂草素的N-糖苷酶活性對核糖體RNA 28S中的特定核苷酸進(jìn)行脫嘌呤，由此不可 逆地阻斷蛋白合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。皂草素也可以通過重組獲得，而不僅僅是來自種子。
皂草素的類型不受特別限制，但是優(yōu)選的皂草素形式是稱作S0-6的形式。該 皂草素形式不尋常的地方在于其對于變性劑、蛋白酶和熱具有高度穩(wěn)定性。此外， 與II型RIP(例如，蓖麻毒素)相反，皂草素自身缺乏細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化機(jī)制，因此在正 常條件下被認(rèn)為是安全的(Stirpe F， Gasper-Campani A， Barbieri L， Falasca A， Abbondanza A， Stevens WA(1983)Ribosome-inactivating proteins from the seeds of Saponaria officinalis L. (soapwort)of Agrostemma githago L. (corncockle)and of Asparagusofficinalis(asparagus)and from the latex of Hura crepitans L (sandbox tree). Biochem J 216 :617-625)。 第一組分和第二組分的偶聯(lián)不受特別限制，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用如雙重氮(鄰聯(lián) 甲苯胺)[BDT]等化學(xué)接頭進(jìn)行共價偶聯(lián)是有效的。接頭的使用和用作接頭的化合物同樣 不受特別限制，但是上述具體實例已據(jù)顯示能夠有效地發(fā)揮作用。
在本發(fā)明的化合物中的第一組分與第二組分的化學(xué)計量比不受特別限制，其可在
0.5 : i n : i范圍內(nèi)，其中n是第一組分在第二組分中的結(jié)合位點的總數(shù)。在第一組 分與第二組分的化學(xué)計量比在o.5 : i i4 : i范圍內(nèi)而不受特別限制的偶聯(lián)物中，在 o. 5 : i 8 : l范圍內(nèi)、優(yōu)選在o. 5 : i 2.5 : i范圍內(nèi)的偶聯(lián)物可能在治療ER+癌細(xì) 胞方面是有效的。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，雷洛昔芬皂草素的比例為約2 : i時將獲得治 療乳腺癌細(xì)胞最有效的偶聯(lián)物，其使用導(dǎo)致每日腫瘤體積最初顯著減小，并使腫瘤生長速 度的減小得到加快或持續(xù)。不過，任何在o.5 : 1 小于8 : i范圍內(nèi)的本發(fā)明的偶聯(lián)物 都可以同樣有效。 包含本發(fā)明的任何化合物而不受特別限制的藥用組合物也可以包含藥用可接受 的載體、賦形劑和/或佐劑。 本發(fā)明的化合物和組合物雖然在應(yīng)用上不受特別限制，但通常用于制造用于治療
包含ER+細(xì)胞的癌癥的藥齊U，并且在治療乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌或其它ER+癌中特別有用。 本發(fā)明的化合物和組合物的應(yīng)用適于所有哺乳動物，特別是人類。 應(yīng)用還可以是以下情況其中的藥劑適于注射或輸注并且不受任何特別限制，特
別可以通過靜脈內(nèi)、皮下或通過包括口服在內(nèi)的其它任何方式應(yīng)用。 應(yīng)用還適于注射至受試對象中，以使峰值血藥濃度達(dá)到第一組分以未偶聯(lián)形式使 用時的臨床峰值血藥濃度的1% 500%中的任一值。特別是，應(yīng)用可能進(jìn)而適用于注射以 達(dá)到臨床峰值血藥濃度的1% 400%，或者進(jìn)而為1% 300%，或者更特別是達(dá)到1% 200%，并且優(yōu)選為80% 140%。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用雷洛昔芬皂草素為2 : 1 的偶聯(lián)物而達(dá)到80% 140%的治療可使每日腫瘤體積與對照結(jié)果相比最初顯著減小，并 使腫瘤生長速度的減小得到加快或持續(xù)，而不會對非癌性ER+細(xì)胞造成明顯影響。
不同于充當(dāng)雌激素的拮抗競爭劑(即，它們降低細(xì)胞分裂速度)的當(dāng)前癌癥藥物， 本發(fā)明的化合物、藥用組合物和治療對于攜帶大量ER受體的細(xì)胞(即，癌細(xì)胞)具有致死 作用，但對于其它ER+細(xì)胞不具致死作用。在長期暴露于拮抗競爭劑下的癌細(xì)胞中通常可 以觀察到，短期治療引起的癌細(xì)胞破壞會減小表型變化的范圍，從而導(dǎo)致靶標(biāo)細(xì)胞失去對 競爭劑的敏感性。如果癌細(xì)胞由ER+突變?yōu)镋R-，則情況不利于本產(chǎn)品。本產(chǎn)品與赫賽汀 (Herc印tin)(作用于HER2/neu受體的人源化單克隆抗體，用于乳腺癌治療)相比具有兩個 優(yōu)點首先，無論Her2/neu是否為陽性本產(chǎn)品均靶向ER+癌細(xì)胞，而赫賽汀主要靶向Her2/ neu陽性癌細(xì)胞；其次，本產(chǎn)品消滅癌細(xì)胞而不是僅減緩其復(fù)制。本發(fā)明的產(chǎn)品沒有與光動 力治療相關(guān)的缺點，因為即使無法將光源聚焦在所討論的癌細(xì)胞上該產(chǎn)品仍能夠靶向所述 癌細(xì)胞。此外，本產(chǎn)品優(yōu)于免疫毒素(即，與毒素連接的單克隆抗體)之處在于，其應(yīng)該具 有更低的因免疫復(fù)合物的形成而引起的血管滲漏綜合征和腎毒性的風(fēng)險。
另外，偶聯(lián)物進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞后，無論SERM(載體)與I型RIP(毒素)是否通過胞 內(nèi)蛋白酶對接頭的作用而分離，由于產(chǎn)品的療效不依賴于SERM與其受體的結(jié)合或由這種 結(jié)合激活的任何細(xì)胞機(jī)理因而保持不變。即，一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，I型RIP對于核糖體具有 直接的不可逆負(fù)效應(yīng)，并因此對于所有mRNA的翻譯具有直接的不可逆負(fù)效應(yīng)，所述mRNA或 由管家基因產(chǎn)生、或作為任何其它細(xì)胞受體的結(jié)合和激活所產(chǎn)生的剌激信號(例如，如載 體SERM與細(xì)胞受體的結(jié)合所產(chǎn)生的信號)的結(jié)果而誘導(dǎo)、或者是因任何其它環(huán)境機(jī)理或內(nèi) 部機(jī)理和/或剌激而產(chǎn)生。
9
實施例 實施例1-雷洛昔芬與皂草素的偶聯(lián) 使用雙重氮(鄰聯(lián)甲苯胺)[BDT]作為接頭(此接頭用于經(jīng)酪氨酸進(jìn)行連接)將 雷洛昔芬(Sigma)與皂草素(Sigma)偶聯(lián)。該接頭在酸溶液中相當(dāng)穩(wěn)定，但是當(dāng)pH升至7 時其會極其迅速地與酪氨酸和其它芳香酚反應(yīng)?；诖嗽?，很難對該反應(yīng)進(jìn)行控制。如果 不能受到適當(dāng)?shù)乜刂?，接頭將使皂草素通過其序列中的14個酪氨酸交聯(lián)并破壞其完整性。 因此所用的條件非常關(guān)鍵。
以雷洛昔芬與皂草素之比為14 : 1、8(近似)l和2 : i來制備偶聯(lián)物。
下面提供了用于2 : 1 (雷洛昔芬皂草素)偶聯(lián)的方案 為進(jìn)行偶聯(lián)，使用相對于(皂草素中的)酪氨酸摩爾數(shù)過量10倍的BDT，并讓反 應(yīng)在-2(TC進(jìn)行30秒 超過50秒。通過加入適當(dāng)體積的摩爾氫氧化鈉水溶液(M.NaOHaq) 而將pH值由2升至5之后，通過加入摩爾鹽酸(M.HC1)停止反應(yīng)。紫外光譜分析揭示，在 反應(yīng)時間為30秒時，這導(dǎo)致每個皂草素分子平均與兩個BDT分子反應(yīng)。增加溫育時間會使 每個皂草素分子平均與8和14個BDT分子反應(yīng)。過量的BDT被用于增大每個BDT分子僅 會與一個酪氨酸反應(yīng)的可能性。這意味著，這兩個BDT分子的每一個中的第二重氮基團(tuán)尚 未反應(yīng)，因此還可以與結(jié)構(gòu)中具有3個酚基的雷洛昔芬反應(yīng)。 將混合物在M. HC1中凝膠過濾以除去過量的BDT之后，通過將pH升高至7而使
BDT-皂草素偶聯(lián)物與大大過量的雷洛昔芬在50X的甲醇中反應(yīng)。立即使溶液再次酸化，這 是因為雷洛昔芬在酸溶液中穩(wěn)定，但在堿溶液中不穩(wěn)定。使用大大過量的雷洛昔芬可確保 其將僅通過其一個酚基，經(jīng)由BDT連接于皂草素上，由此僅在可能的最小程度上進(jìn)行化學(xué) 修飾，從而盡可能保持其完整性。 與雷洛昔芬的反應(yīng)生成棕色溶液，通過使用氯仿萃取該溶液可除去該顏色。在 4(TC真空下將灰稻草色的水層蒸發(fā)至少量，并在13000RPM離心以去除固體物質(zhì)。通過在 M. HC1中的凝膠過濾純化所獲得的灰黃色溶液，以獲得雷洛昔芬-BDT-皂草素偶聯(lián)物的無 色溶液。 實施例2-細(xì)胞系 從一位69歲女性的乳腺癌中分離MCF-7細(xì)胞系(ECACC，目錄號86012803)，該 細(xì)胞系表達(dá)雌激素受體。將該細(xì)胞系保持在補充有2mML-Gln(Sigma) 、1%非必需氨基酸 (Sigma) 、100IU青霉素、100 ii g/ml鏈霉素(Sigma)和作為完全培養(yǎng)基的10%胎牛血清 (PCS) (Sigma)的最低必需培養(yǎng)基(Sigma)中。 從一位52歲女性的原發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌中分離HCC-1143細(xì)胞系(ATTC，目錄號 CRL-2321)，該細(xì)胞系不表達(dá)雌激素受體。將該細(xì)胞系保持在補充有2mM L-Gln (Sigma)、 10mM HEPES (Sigma) 、lmM Na-Pyr (Sigma) 、 100IU青霉素、100 ii g/ml鏈霉素(Sigma)和作為 完全培養(yǎng)基的腦FCS (Sigma)的RPMI-1640 (Sigma)中。 最后，從一位60歲女性的卵巢腺癌中分離NIH:0VCAR-3細(xì)胞(ATTC，目錄號 HTB-161)，該細(xì)胞表達(dá)雌激素受體。將該細(xì)胞系保持在補充有2mM L-Gln(Sigma) 、 10mM HEPES (Sigma) 、 lmM Na-Pyr (Sigma) 、0. Olmg/ml牛胰島素、100IU青霉素、100 ii g/ml鏈霉素 (Sigma)和作為完全培養(yǎng)基的20% FCS (Sigma)的RPMI-1640 (Sigma)中。
實施例3-克隆生成試驗
通過胰蛋白酶化在約80%匯合時收集MCF-7、 HCC-1143和0VCAR-3的培養(yǎng)物，并 在無血清培養(yǎng)基中洗滌一次后，將其用于接種平底96孔板(Nunc)，使每個孔在200 iU完全 培養(yǎng)基中有5X103個細(xì)胞。 在37t:培養(yǎng)48小時后，除去培養(yǎng)基，并代以100 y 1/孔的一式四份的測試物質(zhì) (雷洛昔芬皂草素偶聯(lián)物的PBS溶液)或?qū)φ瘴镔|(zhì)(皂草素、雷洛昔芬、PBS(Sigma)和最 后作為陽性對照組的Mitomycin C(Sigma))在完全培養(yǎng)基中的多份稀釋液。
在37t:培養(yǎng)18小時之后，除去測試化合物，并向各孔中加入200 y 1/孔的完全培養(yǎng)基。 在37 °C培養(yǎng)96小時后，除去培養(yǎng)基，并向所有孔中加入100 iU/孔的室溫下 0. 9%的Triton X-100 (Sigma)的PBS溶液。在37"C培養(yǎng)2小時后，將50 ii 1 PBS-Triton 溶液從所有孔中轉(zhuǎn)移至一個新的平底96孔板中。 按照制造商的指示準(zhǔn)備來自CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒 (Promega)的檢測試齊U，并向所有孔中加入50 y1/孔的檢測試齊U。在室溫于黑暗中培養(yǎng)30 分鐘后，通過向所有孔中加入50iU/孔的終止溶液(Stopsolution)來停止反應(yīng)，并確定在 490nm處各孔的吸光度。
實施例4-體內(nèi)抗腫瘤活性 對于三十(30)只6 8周齡的雌性裸鼠(皿/皿)，通過皮下接種與 Matrigel (Becton Dickinson)組合輸送的2X 1(f個MCF-7細(xì)胞(總量為200ii 1)。每日監(jiān)控 體重?fù)p失和腫瘤生長(通過進(jìn)行兩個垂直測量并使用公式[n X ((最小測量)/2)2乂 (最 大測量)]來計算)，直至研究結(jié)束。 當(dāng)已建立的腫瘤體積達(dá)到0.3cn^時(接種后第36日)，將動物分為三(3)組，并 以以下物質(zhì)對各組通過靜脈內(nèi)(經(jīng)由眼球后途徑)給藥 > ioo iU的雷洛昔芬皂草素為2 : i的偶聯(lián)物(s : r i : 2)的pbs溶液，以
獲得0.4nM、0. 2nM和0. lnM的峰值R : S 2 : 1偶聯(lián)物血藥濃度，它們分別相當(dāng)于0. 4ng/ m1、0. 2ng/ml和0. lng/ml的雷洛昔芬(即，三組分別是A、B和C)>再次100 ii 1的雷洛昔芬的PBS溶液，以獲得0. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml雷 洛昔芬的峰值偶聯(lián)物血藥濃度(即，三組分別是D、E和F)
> 100ii 1的PBS(即，一組G) 雷洛昔芬的目標(biāo)血藥濃度基于血液中雷洛昔芬的人類標(biāo)準(zhǔn)治療峰值濃度(即，
0. 5ng/ml)。通過將各小鼠的個體體重(g)乘以0. 08(即，以ml計的小鼠的血液體積平均
為其體重的8%)再乘以期望的雷洛昔芬血藥濃度(即，O. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml)，
計算可達(dá)到該雷洛昔芬血藥濃度的作為偶聯(lián)物或純產(chǎn)品輸送的個體小鼠劑量。 第一次給藥后七日(接種后第43日)，動物接受偶聯(lián)物、純雷洛昔芬或PBS的第二
次給藥，以獲得相同的最終雷洛昔芬血藥濃度(即，O. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml)。 統(tǒng)計分析 利用非參數(shù)化Ma皿-Whitney檢驗來計算統(tǒng)計差異，并認(rèn)為當(dāng)p < 0. 05時統(tǒng)計差
異顯著。
結(jié)果 本研究的目的在于確定皂草素和雷洛昔芬的偶聯(lián)物是否可以選擇性地殺死雌激素受體(ER)陽性乳腺細(xì)胞而不殺死女性(雌性)生殖道ER陽性細(xì)胞或其它非ER陽性細(xì)
胞?；诖四康?，以i4 : i、8 : l和2 : i的摩爾比(R : s)將皂草素與雷洛昔芬偶聯(lián)，
并測試遞增劑量的這些偶聯(lián)物對于MCF-7 (ER陽性乳腺癌細(xì)胞系)、HCC-1143 (ER陰性乳腺 癌細(xì)胞系)和0VCAR-3(ER陽性卵巢癌細(xì)胞系)的細(xì)胞單層的效果。
如圖i所示，雷洛昔芬皂草素為14 : i的偶聯(lián)物(s : r i : 14)對于任何細(xì)
胞系都具有有限效果，當(dāng)然，其對于MCF-7細(xì)胞相比于HCC-1143或OVCAR-3沒有選擇性致
死作用。相反，已證實雷洛昔芬皂草素為8 : i的偶聯(lián)物(s : r i : 8)在濃度為500nM
以上時對于所有細(xì)胞系都是致死的。只有在濃度為250nM時，才能觀察到對于MCF-7細(xì)胞 的選擇性致死效果略有提高(MCF-7的存活率為33. 6±2%，相比之下，HCC-1143的存活率 為70. 8±5%、 OVCAR-3的存活率為61. 2±5. 6% )。 與8 : i的雷洛昔芬皂草素偶聯(lián)物(s : r i : 8)相似，無論er為何種狀態(tài)， 2 : i的雷洛昔芬皂草素偶聯(lián)物(s : r i : 2)在所測試的最高偶聯(lián)物濃度下都?xì)⑺懒?所有細(xì)胞。然而，在較低劑量下，在所有三組受測偶聯(lián)物中雷洛昔芬皂草素為2 : i的偶
聯(lián)物具有最顯著的選擇性效果。在偶聯(lián)物濃度為500nM時，雷洛昔芬皂草素為2 : i的 偶聯(lián)物殺死了絕大多數(shù)MCF-7細(xì)胞(存活率為4. 9±4. 3% )，同時對于HCC_1143(存活率 為62. 8±10. 7% )和OVCAR-3 (存活率為65. 2±3. 5% )僅具有有限效果。
鑒于這些結(jié)果，選擇雷洛昔芬皂草素偶聯(lián)物2 : l用于更加詳細(xì)的體內(nèi)分析。為 此，使用500nM的雷洛昔芬皂草素2 : l并且使用皂草素(500nM)、雷洛昔芬(1000nM)以 及皂草素(500nM)和雷洛昔芬(1000nM)的共混物(S卩，未偶聯(lián))的摩爾濃度等價物來處理 MCF-7、 HCC-1143和0VCAR-3細(xì)胞單層。 圖2代表兩次獨立實驗的平均，如圖2所示，雷洛昔芬對于ER陽性乳腺癌MCF-7 細(xì)胞系具有顯著(P < 0. 05)的選擇性效果，但對于ER陰性HCC-1143細(xì)胞系或卵巢ER陽 性0VCAR-3細(xì)胞系則不然。類似地，皂草素和雷洛昔芬共混物對于MCF-7細(xì)胞具有選擇性 效果，而由于不能將顯著的(p>0.05)致死效果歸因于皂草素本身，故這一點最可能要追 溯至雷洛昔芬的活性。與雷洛昔芬與皂草素的簡單共混物相比，雷洛昔芬與皂草素的摩爾 比為2 : 1的偶聯(lián)可導(dǎo)致所述化合物對于MCF-7的致死效果(MCF-7存活率為51. 6 ±3. 2% (簡單共混物)與16.0±6.3% (偶聯(lián)物))的顯著提高(p，O. 05)，但對于HCC-1143細(xì)胞 (HCC-1143的存活率為84. 3±8. 5%與72. 4±5. 7% )和0VCAR-3細(xì)胞(0VCAR-3的存活率 為104. 4±2. 5%與77. 7±4. 9% )的致死效果則僅有有限的提高。
為檢測雷洛昔芬皂草素為2 : i的偶聯(lián)物(s : r i : 2)控制體內(nèi)腫瘤生長的
功效，對雌性裸鼠(皿/皿)在皮下接種MCF-7細(xì)胞。 一旦腫瘤已建立(第36日)，使用經(jīng)
由眼球后途徑的靜脈推注的雷洛昔芬皂草素2 : i(s : r i : 2)治療小鼠，以使雷洛昔
芬皂草素2 : l(S : R 1 : 2)的峰值血藥濃度達(dá)到O. 4nM、0. 2nM和O. lnM。這些濃度相 當(dāng)于使雷洛昔芬峰值血藥濃度達(dá)到0. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml所需的濃度，它們分別 構(gòu)成了人體中雷洛昔芬的目標(biāo)峰值臨床血藥濃度的80%、40%和20%。對照動物經(jīng)由相同
途徑接受pbs或等劑量的雷洛昔芬。在第43日，動物接受雷洛昔芬皂草素2 : i(s : r
1 : 2)、PBS或雷洛昔芬的二次給藥。 由于MCF-7細(xì)胞對于雌激素生成的天然易感性，所用裸鼠模型中的每日腫瘤體積 變化在約4/5日的時段內(nèi)遵循正弦模式(見圖3)。此時段的持續(xù)時間與小鼠的發(fā)情周期(即，4/5日)相關(guān)。結(jié)果，為便于實驗分析，圖3將各實驗組的腫瘤體積變化表現(xiàn)為每日變 化和重疊5日(即，每點重疊4日)的時段的移動平均(即趨勢線)。 PBS治療組遵循上述腫瘤生長的正弦模式。該模式的特征在于，各周期中獲得的最 大腫瘤體積的自然增加趨勢最終將導(dǎo)致致命的腫瘤尺寸。與PBS對照組相比，使用0. 2ng/ ml和O. lng/ml的雷洛昔芬的治療沒有導(dǎo)致任何變化。只有O. 4ng/ml雷洛昔芬組顯示了隨 時間推移保持或略微減小腫瘤尺寸的自然趨勢，這是其作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑在臨 床中的作用模式的特征。 與PBS對照組相比，使用0.2nM和0. lnM峰值血藥濃度的雷洛昔芬皂草素 2 : l(S : R 1 : 2)治療也不能引起腫瘤生長的任何變化。然而，與O. 4ng/ml雷洛昔芬組 和PBS組相比，使用0.4nM雷洛昔芬皂草素2 : 1 (S : R 1 : 2)的治療造成每日腫瘤體 積的顯著初始減小(見圖3，第37日和第38日的每日腫瘤體積變化)，且與O. 4ng/ml雷洛 昔芬組相比，所述治療加快或維持了腫瘤生長速度的減小(見圖3，用于研究的移動平均趨 勢線)。 實施例5-偶聯(lián)物的體外活性 本研究的目的在于評價偶聯(lián)物對于移植在裸鼠中的皮下ZR-75-l ( —種雌激素受 體陽性人類乳腺癌細(xì)胞系)的生長動力學(xué)的效果。 為進(jìn)行此研究，并且由于ZR-75-l生長依賴于雌激素，因此在腫瘤細(xì)胞接種之前的 第3日開始，對不少于40只4 6周齡的正常雌性無胸腺裸鼠(皿/皿)每日注射5mg/kg的 雌二醇。在雌二醇處理之后，使用21G針頭和注射器將處于Matrigel (Becton-Dickinson) 中的25X 106個ZR-75-l細(xì)胞(獲自ATCC)對所有動物進(jìn)行皮下接種。
在第一次施用測試物之后，每48小時 72小時監(jiān)控體重和腫瘤體積，持續(xù)36日。 腫瘤體積利用下式確定腫瘤體積=(a2Xb/2)，其中"a"為最小直徑，"b"為最大直徑。
—旦已建立的腫瘤達(dá)到約75mm3 150mm3 (個體腫瘤量可為100mg 250mg)，可 將小鼠分為3個治療組(每組n = 12)，以使七個組的平均腫瘤量在對照組的平均腫瘤重量 的10%以內(nèi)。在同一日(第l日)，對動物靜脈注射O. lml的(a)皂草素-雷洛昔芬偶聯(lián) 物、(b)未偶聯(lián)的皂草素和雷洛昔芬的混合物或者(c)僅雷洛昔芬。每72小時重復(fù)一次該 治療，總共進(jìn)行五次(第1、3、6、9和12日)。 在所有三個組中，每個動物所注射的凈雷洛昔芬量都相同，并且被設(shè)計為在血液 中提供處于臨床中的雷洛昔芬血藥濃度范圍之內(nèi)的0.7ng/ml的峰值雷洛昔芬濃度。那些 還注射有皂草素(其或者未與雷洛昔芬偶聯(lián)，或者已與雷洛昔芬偶聯(lián))的動物接受了以皂 草素雷洛昔芬摩爾比為l:2計算的相同量的皂草素。 在植入之后的15日繼續(xù)進(jìn)行雌二醇給藥，以培養(yǎng)皮下腫瘤的正常生長。 若發(fā)現(xiàn)動物瀕臨死亡或者體重降至低于14g，則對其實施安樂死(通過(A窒息)。
若個體腫瘤體積達(dá)到3， OOOmm3或腫瘤發(fā)生潰爛，則也執(zhí)行安樂死。在研究過程中，不得不
將B組(未偶聯(lián)的皂草素和雷洛昔芬)中的一只動物排除于研究之外。 本研究的結(jié)果表明，與單獨施用雷洛昔芬或施用未偶聯(lián)的雷洛昔芬和皂草
素相比，施用皂草素-雷洛昔芬偶聯(lián)物獲得了峰值腫瘤體積的顯著減小(p <0.05，
Mann-Whitney)(第5日)。 此外，與其它兩個實驗組相比，在治療(12日)結(jié)束時和直至第36日，以皂草素-雷洛昔芬偶聯(lián)物給藥的動物通常顯示出持續(xù)降低的腫瘤體積(見圖4)。 可以通過在研究過程中觀察動物的體重而獲得動物的一般健康狀況指標(biāo)。因此，
在整個研究期間，每隔48 72小時對各組的小鼠稱重。結(jié)果清楚地顯示，與僅以雷洛昔芬
給藥或以未偶聯(lián)的雷洛昔芬和皂草素給藥的動物相比，以皂草素_雷洛昔芬偶聯(lián)物給藥的
動物具有明顯更好的增重情況(參見圖5)。 實施例6-雷洛昔芬與皂草素的進(jìn)一步偶聯(lián) 實驗A 使用雙重氮(鄰聯(lián)甲苯胺)[BDT]作為接頭將雷洛昔芬(Sigma)與皂草素(Sigma) 偶聯(lián)。該接頭在酸溶液中相當(dāng)穩(wěn)定，但是當(dāng)pH升至7時其會極其迅速地與酪氨酸和其它芳 香酚反應(yīng)?；诖嗽?，很難對該反應(yīng)進(jìn)行控制。如果不能充分控制，所述接頭將通過皂草 素序列中的14個酪氨酸而與皂草素交聯(lián)并破壞其完整性。因此所用的條件非常重要。
以雷洛昔芬與皂草素為2 : l的比例制備偶聯(lián)物。
以下提供用于2 : l(雷洛昔芬皂草素)偶聯(lián)的方案輕度超聲
為進(jìn)行偶聯(lián)，將1. 2mg凍干的皂草素(Sigma)溶解在0. 6ml水中。向該溶液中加 入0. 4ml DMS0 (Sigma)和0. 01ml的1M HC1并進(jìn)行混合。對所得蛋白溶液進(jìn)行輕度超聲之 后，向該溶液中加入0.4mg lmg雷洛昔芬，然后加入相對每摩爾(皂草素中的)酪氨酸過 量1摩爾的BDT。通過加入適當(dāng)體積的摩爾氫氧化鈉水溶液(M. NaOHaq)將所得溶液的pH 升高至6. 5，并使反應(yīng)在室溫進(jìn)行22分鐘 34分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，向該溶液中加入磷酸直 至最終濃度約為9并進(jìn)行混合。使用30. 4%匿SO和9. 1%磷酸的水溶液作為洗脫液，通過 經(jīng)Biogel P2柱(BioRad)洗脫而從粗偶聯(lián)物溶液中除去過量的BDT。通過紫外分光光度法
確定含有皂草素和雷洛昔芬的組分，并在使用前在水中透析。
實驗B 以質(zhì)量比2 : l(雷洛昔芬DSC)將雷洛昔芬-HCl和DSC(二 (N-琥珀酰亞氨基) 碳酸酯——該接頭可用于經(jīng)賴氨酸的結(jié)合)溶解在0.2ml DMF(二甲基甲酰胺)中。將三 乙胺(O.Olml)加入吡啶(0. 13ml)中，并在15分鐘期間將該制劑的等分試樣(0. Olml)依 次加入雷洛昔芬/DSC混合物中。在2rC并于恒速攪拌下進(jìn)行該過程。在40% DMF于15mM pH7. 4的磷酸鈉緩沖液中的混合物中制備皂草素(0. 6mg/ml)溶液，并加入0. Olml雷洛昔 芬/DSC溶液。首先通過渦旋混合所得制劑，隨后進(jìn)行聲波處理直至獲得膠體外觀，然后在 2rC進(jìn)行30分鐘的偶聯(lián)反應(yīng)。以13000rpm離心所得產(chǎn)物3分鐘，直接使用澄清的上清液， 或者使其通過0. 1HC1中的S印hadexGlO柱、冷凍干燥并在PBS中重懸然后使用。
實驗C 將皂草素溶解在含有2mg/ml葡萄糖的p朋.0的10mM磷酸鹽緩沖液中，并在恒速 攪拌下向所得溶液中加入0. lml摩爾HC1從而將pH降低至3. 7。在2rC于恒速攪拌下，向 該制劑中加入lml雷洛昔芬-HC1的DMSO溶液(3mg/ml)，然后加入0. 005ml BDT試劑。向 連續(xù)攪拌的皂草素_雷洛昔芬-BDT制劑中依次加入少量等分試樣的0. 1M NaOH(O. Olml) 從而將PH升至6. 8，在該pH值使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行60分鐘。將所得產(chǎn)物首先在水中透析過夜， 然后在含有2mg/ml葡萄糖的PBS中透析。收集該過程中產(chǎn)生的棕色沉淀，并通過超聲和劇 烈渦旋將其重溶于水中。通過離心而澄清后，將上清液等分以供使用。
1權(quán)利要求
一種化合物，所述化合物包含(a)能與ER+細(xì)胞受體結(jié)合的第一組分；和(b)第二組分；其中，所述第二組分為核糖體失活毒素并與所述第一組分偶聯(lián)。
2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述毒素為皂草素、MOM、PAP-S、三角梅核糖體失 活蛋白和格拉寧素中的任意一種。
3. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中，所述毒素為皂草素。
4. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中，所述第一組分為雷洛昔芬化合物。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中，所述第一組分與所述第二組分共價 偶聯(lián)。
6. 如權(quán)利要求5所述的化合物，其中，用化學(xué)接頭將所述第一組分與所述第二組分偶聯(lián)。
7. 如權(quán)利要求6所述的化合物，其中，所述接頭為雙重氮(鄰聯(lián)甲苯胺)[BDT]。
8. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物，其中，所述第一組分與所述第二組分的化 學(xué)計量比為0.5 : 1 N : l，其中N是所述第一組分在所述第二組分中的可能連接點的總 數(shù)。
9. 如權(quán)利要求8所述的化合物，其中，所述第一組分與所述第二組分的化學(xué)計量比為o. 5 : i 2.5 : i。
10. —種藥用組合物，所述藥用組合物包含如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物和 藥用可接受的載體、賦形劑和/或佐劑。
11. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的化合物或組合物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
12. 如權(quán)利要求1 10中任一項所述的化合物或組合物用于制造用于治療包含ER+癌 細(xì)胞的癌癥的藥劑的應(yīng)用。
13. 如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌或其它￡尺+癌。
14. 如權(quán)利要求12 13中任一項所述的應(yīng)用，其中，所述藥劑適用于治療哺乳動物。
15. 如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動物為人類。
16. 如權(quán)利要求12 15中任一項所述的應(yīng)用，其中，所述藥劑適用于注射或輸注(靜 脈內(nèi)或其它方式)到受試對象中或者經(jīng)口服施用于受試對象。
17. 如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述藥劑適于注射到受試對象中而使所述偶聯(lián) 物的峰值血藥濃度達(dá)到相當(dāng)于所述第一組分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的 1% 500%。
18. 如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述藥劑適于注射到受試對象中而使所述偶聯(lián) 物的峰值血藥濃度達(dá)到相當(dāng)于所述第一組分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的 80% 140%。
19. 如權(quán)利要求1 9中任一項所述的化合物的制造方法，其中，所述方法包括將所述 第一組分與所述第二組分反應(yīng)以將所述第一組分與所述第二組分偶聯(lián)。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，所述方法包括在偶聯(lián)過程中控制所述第一組分和所述 第二組分的pH值。
21. —種包含ER+細(xì)胞的癌癥的治療方法，所述方法包括對受試對象施用藥劑，其中，所述藥劑包含權(quán)利要求1 10中任一項所述的化合物或組合物。
22. 如權(quán)利要求21所述的治療方法，其中，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌或其它ER+癌。
23. 如權(quán)利要求21 22中任一項所述的治療方法，其中，所述受試對象是哺乳動物。
24. 如權(quán)利要求23所述的治療方法，其中所述哺乳動物是人類。
25. 如權(quán)利要求21 24中任一項所述的治療方法，其中，將所述藥劑通過靜脈內(nèi)或其它方式注射或輸注到受試對象中，或者經(jīng)口服施用于受試對象。
26. 如權(quán)利要求25所述的治療方法，其中，將所述藥劑注射或輸注到受試對象中以使所述偶聯(lián)物的峰值血藥濃度達(dá)到相當(dāng)于所述第一組分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的1% 500%。
27. 如權(quán)利要求26所述的治療方法，其中，將所述藥劑注射或輸注到受試對象中以使所述偶聯(lián)物的峰值血藥濃度達(dá)到相當(dāng)于所述第一組分以未偶聯(lián)形式使用時的臨床峰值血藥濃度的80% 140%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種化合物，所述化合物包含(a)能與ER+細(xì)胞受體結(jié)合的第一組分；和(b)第二組分；其中，所述第二組分為核糖體失活毒素并與所述第一組分偶聯(lián)。
文檔編號A61P35/00GK101795712SQ200880105602
公開日2010年8月4日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者威爾遜·羅梅羅·卡帕羅斯-萬德雷, 格雷戈里·艾倫·斯特洛夫 申請人:派特塞爾有限公司