抗癌細胞毒性單克隆抗體的制作方法

文檔序號：1144220閱讀：227來源：國知局

專利名稱：抗癌細胞毒性單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分離和生產減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，并且涉及這些CDMAB任選地與一種或多種化療劑聯(lián)合在治療和診斷過程中的應用。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的CDMAB的結合測定方法。
背景技術：
作為癌癥治療的單克隆抗體患有癌癥的每個個體都是獨特的，并且患有與其它癌癥不同的癌癥，正如個人的身份一樣。盡管如此，目前的治療法以相同的方法治療患有同種類型的癌癥、處于相同的階段的所有患者。這些患者中至少有30%將在一線治療中失敗，由此導致以后幾輪的治療和增加治療失敗、轉移、以及最終死亡的可能性。較好的治療方法應該是對于特定的個體量身定制的治療法。目前本身適于量身定制的唯一的治療法是手術?；熀头派渲委煵荒軐颊哌M行量身定做，并且手術本身在大部分情形中不足以產生治愈。
隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，由于每種抗體可以針對單個表位，則開發(fā)量身定制的治療法的方法的可能性變得更加現(xiàn)實。此外，產生針對獨特限定特定個體的腫瘤的表位群的抗體組合也是可能的。
己經認識到在癌癥細胞和正常細胞之間的顯著不同是在于癌癥細胞包含對轉化的細胞特異的抗原，科學團體長期認為單克隆抗體可以設計成通過特異性與這些癌癥抗原結合而特異性靶向轉化的細胞；因此產生這樣的信心單克隆抗體可以作為"魔力子彈(Magic Bullets)"來消除癌細胞。
然而，現(xiàn)在廣泛認識到，沒有任何一種單個的單克隆抗體可以在所有癌癥情形中起作用，并且單克隆抗體可以被配置為一類作為靶向癌癥治療。已經表明按照本文公開的發(fā)明的教導分離的單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過程，例如通過減少腫瘤負荷的方式，并且在本文中應該
不同地稱為減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。
目前，癌癥患者通常具有很少的治療選擇。對癌癥治療法的管理方法
己經在全球生存和發(fā)病率中產生了改善。然而，對于特定的個體，這些改
善的統(tǒng)計學沒有與他們個人情況的改善必然相關。
因此，如果采用能夠使執(zhí)業(yè)者獨立于處于同一團體中的其他患者而治
療每種腫瘤的方法，這將允許產生僅使治療適合該名個體的獨特方法。這
樣的治療療程理想地將增加治愈率，并且產生更好的結果，由此滿足長期
渴望的需要。
歷史上，多克隆抗體已經進行了應用，在治療人類癌癥中具有有限的成功。己經使用人血漿治療淋巴瘤和白血病，但是存在很少延長的好轉或反應。此外，與化療相比，缺少再現(xiàn)性，并且沒有任何其它的益處。實體瘤諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細胞癌也已經使用人血液、黑猩猩血清、人血漿和馬血清進行治療，具有相對不可預知的和無效的結果。
對于實體瘤，己經存在單克隆抗體的許多臨床試驗。在20世紀80年代，對于人乳腺癌存在至少4種臨床試驗，其使用針對特異抗原的抗體或基于組織選擇性，在至少47名患者中僅產生一名響應者。直到1998年才出現(xiàn)使用人源化的抗Her2/neu抗體(Herceptir^)與順鉬組合的成功的臨床試驗。在該試驗中，評估37名患者的響應，其中約四分之一具有部分響應率，另外四分之一具有較小或穩(wěn)定的疾病發(fā)展。在所述響應者中對發(fā)展的中值時間是8.4個月，中值響應持續(xù)5.3個月。
Herceptin⑧在1998年核準與Taxol⑧組合用于一線應用。臨床研究結果顯示，與僅接受Taxo產的組(3.0個月)相比，對于接受抗體治療加Taxol 的那些的疾病發(fā)展的中值時間(6.9個月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；對于Herceptir^加Taxo產治療組相對于單獨的Taxof治療組為 22個月相對于18個月。另外，與單獨的Taxof相比較，在抗體加Taxol 組合組中，在完全(8%相對于2%)和部分響應者(34%相對于15%)的數(shù)量中存在增加。然而，與單獨的Taxof治療相比較，用Herceptir^和Taxol 治療導致更高的心臟中毒的發(fā)生(分別為13%相對于1。/0)。此夕卜，Herceptir^治療法只對過量表達(通過免疫組化(IHC)分析確定)人表皮生長因子受體2 (Her2/neu)的患者，患有轉移乳腺癌的患者的大約25%中有效；所述人表皮生長因子受體2是一種受體，其目前具有未知的功能或生物學重要的配體。因此，對于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未滿足的需求。即使可以受益于Herceptin⑥治療的那些仍然需要化療，并且因此仍然必須處理，至少在某種程度上，處理這種治療的副作用。
研究結腸直腸癌的臨床試驗包括針對糖蛋白和糖脂靶點的抗體?？贵w如17-lA，其對于腺癌具有某種特異性，已經在六十多名患者中進行了 2期臨床試驗，僅有1名患者具有部分響應。在其它試驗中，在使用額外的環(huán)磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中僅產生1例完全響應和2例較小的響應。迄今為止，17-lA的m期臨床試驗尚未表現(xiàn)出作為III期結腸癌的輔助治療的提高的功效。最初核準用于成像的人源化鼠單克隆抗體的應用也沒有產生腫瘤衰減。
僅在最近，使用單克隆抗體的結腸直腸癌臨床研究產生了一些積極的結果。在2004年，ERBITUX②核準用于患有表達EGFR的轉移結腸直腸癌的患者的二線治療，所述患者對基于伊立替康的化療不起反應(refractory)。來自兩組(two-arm) II期臨床研究和單組研究的結果表明，ERBITlIX^與伊立替康組合分別具有23。/。和15%的響應率，疾病發(fā)展的中值時間分別為4.1個月和6.5個月。來自同一兩組II期臨床研究和另一單組研究的結果表明，僅用ERBITU ^治療分別導致11%和9%的響應率，疾病發(fā)展的中值時間分別為1.5個月和4.2個月。
因此，在瑞士和美國，ERBITUX 與伊立替康組合治療，并且在美國，單獨的ERBITII ^治療，已經被核準作為在一線伊立替康治療中失敗的結腸癌患者的二線治療。因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核準治療作為單克隆抗體和化療的組合。另外，在瑞士和美國只核準治療作為二線治療用于患者。此外，在2004年，AVASTIN②被核準與靜脈內基于5-氟尿嘧啶的化療組合用作轉移性結腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結果表現(xiàn)出與僅用5-氟尿嘧啶治療的患者相比，用AVASTIN②加5-氟尿嘧啶治療的患者的中值存活延長(分別為20個月相對于16個月)。然而，同樣如同Hercepti,和ERBITUX ,治療僅被核準作為單克隆抗體和化療的組合。
對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌還繼續(xù)存在極差的結果。對于非小細胞肺癌的最有希望的最近的結果來自II期臨床試驗，其中治療包括與殺細胞藥多柔比星綴合的單克隆抗體(SGN-15; dox-BR96,抗—唾液酸(sialyl)-LeX)，其與化療藥丁^0丁￡11￡@組合。TAXOTERE⑧是唯一一種FDA核準的化療藥，用于肺癌的二線治療。原始數(shù)據(jù)顯示與單獨的丁八乂0丁￡虹@相比提高的整體存活時間。在本研究征募的62名患者中，三分之二接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合，而其余三分之一接受單獨的TAXOTERE 。對于接受SGN-15與丁^0丁￡朋@組合的患者，中值整體存活時間是7.3個月，而與之比較的接受單獨的丁八乂(^^拙@的患者是5.9個月。對于接受SNG-15加TAXOTERE⑧的患者的整體存活時間為1年和18個月的分別為29%和18%，而與之比較的對于接受單獨的TAXOTERE 的患者分別為24%和8%。計劃了進一步的臨床試驗。
臨床前，對于黑素瘤使用單克隆抗體已經存在一些有限的成功。這些抗體中很少已經達到臨床試驗階段，并且迄今為止沒有一種已經被核準或在III期臨床試驗中表現(xiàn)出有利的結果。
治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受到在30,000種已知的基因產物中缺少相關靶點的鑒定的阻礙，所述30,000種已知的基因可能有助于疾病的發(fā)病機理。在腫瘤學研究中，潛在的藥物靶點通常由于它們在腫瘤細胞中過量表達的事實來簡單地選擇。然后篩選這樣鑒定的靶點與多種化合物的相互作用。在潛在的抗體治療的情形中，這些候選化合物通常衍生于根據(jù)Kohler和Milstein所述的基本原理(1975,自然(Nature) ， 256, 495-497, Kohler和Milstein)的單克隆抗體產生的常規(guī)方法。從用抗原(例如，全細胞，細胞級分，純化的抗原)免疫的小鼠收集脾細胞，并且與無限增殖的雜交瘤配偶體融合。篩選所得到的雜交瘤，并且針對最親和性地與所述耙點結合的抗體的分泌進行選擇。針對癌細胞的許多治療和診斷抗體，包括Herceptin 和RITUXIMAB，已經使用這些方法產生，并且基于它們的親和性進行選擇。這種方法中的缺點是雙重的。首先，對治療或診斷抗體結合選擇適當?shù)母锇忘c受到關于組織特異性致癌過程的極少的知識以及用于鑒定這些靶點的所得到的過于單純化的方法的限制，所述過于單純化的方法如通過過量表達進行選擇。第二，與受體以最大的親和力結合的藥物分子通常具有起始或抑制信號的最大可能性的假設可能不總是這種情形。
盡管一些關于乳腺癌和結腸癌的治療的進展，但是作為單一藥劑或共同治療的有效抗體治療的鑒定和開發(fā)對于所有類型的癌癥尚是不充足的。
現(xiàn)有專利
美國專利號5,750,102公開這樣一種方法，其中來自患者腫瘤的細胞用MHC基因轉染，所述MHC基因可克隆自來自該患者的細胞或組織。然后，使用這些轉染的細胞免疫該患者。
美國專利號4,861,581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體對哺乳動物的腫瘤細胞和正常細胞的內部細胞成分是特異性的，但是對外部成分不是特異性的；標記所述單克隆抗體，使所標記的抗體與已經接受治療的哺乳動物組織接觸以殺死腫瘤細胞；并且通過測量所標記的抗體與退化的腫瘤細胞的內部細胞成分的結合而確定治療的功效。在制備針對人細胞內抗原的抗體時，專利權所有人認為惡性細胞代表這樣的抗原的便利的來源。
美國專利號5,171,665提供一種新型抗體以及其生產方法。具體地，該專利教導形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤相關的蛋白質抗原例如結腸和肺的那些強結合而與正常細胞以弱得多的程度結合的能力。
美國專利號5,484,596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌癥患者手術取出腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細胞，輻射所述腫瘤細胞以成為存活的但非腫瘤發(fā)生性的，并且使用這些細胞制備用于患者的疫苗，所述疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復發(fā)而且同時抑制轉移。該專利教導開發(fā)與腫瘤細胞的表面抗原反應的單克隆抗體。如在第4欄45行等描述的，專利權所有人在開發(fā)用于人腫瘤形成的表達單克隆抗體的活性特異性免疫治療中使用自生的腫瘤細胞。
美國專利號5,693,763教導一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并且不依賴于起源的上皮組織。
美國專利號5，783,186涉及在表達Her2的細胞中誘導程序性細胞死亡的抗-Her2抗體，產生所述抗體的雜交瘤細胞系，使用所述抗體治療癌癥的方法和包括所述抗體的藥物組合物。
美國專利號5,849,876描述了用于產生針對黏蛋白抗原的單克隆抗體的新雜交瘤細胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來源純化。
美國專利號5，869,268涉及產生人淋巴細胞的方法，所述人淋巴細胞產生對目的抗原特異性的抗體，產生單克隆抗體的方法，以及由所述方法產生的單克隆抗體。該專利特別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD人單克隆抗體的生產。
美國專利號5,869,045涉及與人癌癥細胞反應的抗體、抗體片段、抗體綴合物和單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機制是兩面性的，原因在于分子與在人癌癥表面上存在的細胞膜抗原反應，并且此外，原因在于所述抗體具有在癌癥細胞內部內在化的能力，隨后結合，使它們特別有效用于形成抗體-藥物和抗體-毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所述抗體還在特定的濃度表現(xiàn)出細胞毒性特征。
美國專利號5,780,033公開自體抗體用于腫瘤治療和預防的應用。然而，這種抗體是來自年老的哺乳動物的抗核自體抗體。在這種情形中，認為該自體抗體是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種自然抗體類型。因為該自體抗體來自"年老的哺乳動物"，不存在所述自體抗體實際來自被治療的患者的要求。另外，該專利公開了來自年老的哺乳動物的天然和單克隆抗核自體抗體，和產生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細胞系。
發(fā)明概述
本申請利用在U.S. 6，180，357專利中教導的生產患者特異性抗癌抗體的方法分離雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系編碼減輕癌性疾病的單克隆抗體。這些抗體可以針對一種腫瘤特異性制備，并且因此使得癌癥治療的量身定制成為可能。在本申請的情形中，具有殺傷細胞(細胞毒性)或抑制細胞生長(抑制細胞)特性的抗癌抗體在下文中稱為細胞毒性的。這些抗體可以用于輔助癌癥的分階段和診斷，并且可以用于治療腫瘤轉移。這些抗體還可以用于通過預防治療的方式用于預防癌癥。與根據(jù)傳統(tǒng)藥物發(fā)
現(xiàn)樣本(paradigm)產生的抗體不同，以這種方式產生的抗體可以靶向這樣的分子和途徑，所述分子和途徑先前沒有顯示出對于惡性組織的生長和/ 或存活是必需的。此外，這些抗體的結合親和力適合起始可能不易受更強的親和性相互作用影響的細胞毒性事件的需要。此外，將標準化療形式如放射性核素與本發(fā)明的CDMAB綴合也在本發(fā)明的范圍內，由此集中在所述化療藥物的應用。所述CDMAB也可以與毒素、細胞毒性部分、酶例如生物素綴合的酶、或造血細胞綴合，由此形成抗體綴合物。
個體化的抗癌治療的前景將在患者的管理方式中引起改變?？赡艿呐R 床方案(scenario)是在出現(xiàn)時獲得腫瘤樣品，并且儲存。從該樣品，腫瘤可以由一組預先存在的減輕癌性疾病的抗體而分類。將患者進行常規(guī)分階段，但是可用的抗體可以用于將患者進一步分階段。患者可以立即用現(xiàn)有的抗體進行治療，并且使用本發(fā)明描述的方法或通過利用噬菌體展示文庫與本發(fā)明公開的篩選方法聯(lián)合，可以產生一組對腫瘤特異性的抗體。由于其它腫瘤可能攜帶一些與被治療的腫瘤相同的表位，故將產生的所有抗體加入到抗癌抗體文庫中。按照該方法產生的抗體可以有效用于治療許多患有與這些抗體結合的癌癥的患者中的癌性疾病。
除了抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的治療作為多形式治療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對非癌癥細胞是相對無毒的事實允許以使用高劑量抗體組合，單獨地，或與常規(guī)治療組合使用。高治療指數(shù)還允許在短時間范圍內再次治療，這應該降低耐受治療的細胞出現(xiàn)的可能性。
如果患者對初始的治療療程沒有反應或發(fā)展了轉移，則可以重復產生針對腫瘤的特異性抗體的方法，進行再次治療。此外，所述抗癌抗體可以與從該患者獲得的紅血細胞綴合，并且重新輸注用于治療轉移。對于轉移癌存在很少有效的治療，并且轉移通常預示著導致死亡的最壞結果。然而，轉移癌通常充分地血管化，通過紅血細胞遞送抗癌抗體可以具有將所述抗體集中在腫瘤部位的作用。甚至在轉移之前，大部分癌癥細胞依賴于宿主的血液供應它們的生存，并且與紅血細胞綴合的抗癌抗體還可以有效針對原位腫瘤。備選地，所述抗體可以與其它造血細胞綴合，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、天然殺傷細胞等。
存在5類抗體，并且每類與由其重鏈賦予的功能相關。通常認為由裸抗體殺傷癌癥細胞通過抗體依賴性細胞毒作用或補體依賴性細胞毒性進
行介導。例如，鼠IgM和IgG2a抗體可以通過結合補體系統(tǒng)的C-l成分而
激活人補體，由此激活可以導致腫瘤消退的補體激活經典途徑。對于人抗
體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgGl。 IgG2a和IgG3同種型的鼠抗體有效募集具有Fc受體的細胞毒性細胞，其將導致由單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細胞進行的細胞殺傷。IgGl和IgG3同種型的人抗體介導ADCC。
抗體介導的癌癥殺傷的另一種可能的機制可以通過使用催化細胞膜中的不同化學鍵的水解的抗體以及其相關的糖蛋白或糖脂，即所謂的催化抗體進行。
存在3種抗體-介導的癌癥細胞殺傷的其它機制。第一種是使用抗體作為疫苗來誘導機體產生針對存在于癌癥細胞上的推定的抗原的免疫反應。第二種是使用這樣的抗體，所述抗體靶向生長受體，并且干擾它們的功能，或下調所述受體，以致有效地喪失其功能。第三種是所述抗體對細胞表面部分的直接連接的作用，所述細胞表面部分的直接連接可能導致直接的細胞死亡，諸如死亡受體如TRAIL Rl或TRAIL R2的連接，或整聯(lián) 蛋白分子如aV (33的連接等。
癌癥藥物的臨床應用基于所述藥物在對患者的可接受的危險模式下的益處。在癌癥治療中，通常是在益處之后最追求生存，然而，除了延長生侖之外，還存在許多其它公認的益處。這些其它的益處，其中治療沒有不利地影響生存，包括癥狀減輕，針對不利事件的保護，復發(fā)時間的延長或沒有疾病的生存，并且延長發(fā)展的時間。這些標準通常被接受，并且管理團體如美國食品及藥品管理局(RD.A.)核準產生這些益處的藥物 (Hirschfeld等.腫瘤學/血液學的重要綜述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了這些標準之外，公認還存在其它的可以預示這些類型的益處的終點(endpoint)。部分地，由美國RD.A. 授予的加速的核準流程承認存在可能預測患者益處的替代品。到2003年年末，在這種流程下已經核準了 16種藥物，并且這些中有4種已經繼續(xù)獲得了完全的核準，即，隨后的研究已經表明由替代品終點預測的直接的患者益處。確定藥物在實體瘤中的作用的一個重要的終點是通過測量針對
治療的響應而評估腫瘤負荷(Therasse等.國家癌癥研究所雜志(Journal of the National Cancer Institute) 92(3):205-216 2000)。關于所述評估的臨床標準(RECIST標準)已由癌癥國際專家組實體瘤工作組的響應評估標準公布。與適當?shù)膶φ战M相比較，對腫瘤負荷具有證明的作用的藥物，如根據(jù) RECIST標準所述的目標響應所示，最終傾向于產生直接的患者益處。在臨床前設定中，腫瘤負荷通常更直接進行評估和記錄。因為臨床前研究可以轉換成臨床設定，在臨床前模型中產生延長的生存的藥物具有最大的預測臨床用途。與產生針對臨床治療的積極響應類似，在臨床前設定中減少腫瘤負荷的藥物還可能對疾病具有顯著的直接影響。盡管延長生存是在癌癥藥物治療的臨床結果后最追求的，但是存在其它的益處，其具有臨床應用，并且清楚地，可能與疾病發(fā)展的延遲、延長的生存或二者相關的腫瘤負荷減少還可以導致直接的益處和具有臨床影響(Eckhardt等.發(fā)展的治療學目標化合物的臨床試驗設計的成功與失敗(Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds) ;ASCO教育書，第39次年會，2003，第209-219頁)。
本發(fā)明描述了 AR104A1289.2.2的開發(fā)和應用，AR104A1289.2.2通過其在細胞毒性測定中和在人癌癥的動物模型中的作用而鑒定。本發(fā)明描述了這樣的試劑，所述試劑與靶分子上的一個或多個表位特異性結合，且作為裸抗體還具有針對惡性腫瘤細胞而不針對正常細胞的體外細胞毒性特性，并且其作為裸抗體還直接介導腫瘤生長的抑制。另一個進步是使用抗癌抗體諸如靶向表達同源抗原標記的腫瘤的抗體來獲得腫瘤生長抑制，以及其它積極的癌癥治療終點。
總之，本發(fā)明教導AR104A1289.2.2抗原作為治療劑耙標的應用，在施用時，其可以在哺乳動物中減少表達所述抗原的癌癥的腫瘤負荷。本發(fā) 明還教導CDMAB(AR104A1289.2.2)、以及它們的衍生物、及其抗原結合片段、和其誘導細胞毒性的配體的應用，其耙向它們的抗原，以減少在哺乳動物中表達所述抗原的癌癥的腫瘤負荷。此外，本發(fā)明還教導在癌性細胞中檢測AR104A1289.2.2抗原的應用，所述應用可以有效用于攜帶表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預測、和預后。
因此，本發(fā)明的一個目的是利用產生針對來源于特定個體的癌性細胞
或一種或多種特定的癌癥細胞系的減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)的方法，
以分離雜交瘤細胞系，和所述雜交瘤細胞系編碼的相對應的分離的單克隆
抗體及其抗原結合片段，所述CDMAB對于癌癥細胞是細胞毒性的，但是同時對于非癌性細胞相對是無毒的。
本發(fā)明的另一個目的是教導減輕癌性疾病的抗體，其配體和抗原結合片段。
本發(fā)明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性通過抗體依賴性細胞毒作用介導。
本發(fā)明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性通過補體依賴性細胞毒作用介導。
本發(fā)明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，其細胞毒性是它們催化細胞的化學鍵水解的能力的功能。
本發(fā)明的另一個目的是產生減輕癌性疾病的抗體，所述抗體有效用于癌癥診斷、預后和監(jiān)測的結合測定。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將通過下述描述變得清楚，其中通過舉例說明和實施例的方式描述本發(fā)明的某些實施方案。
附圖簡述

圖1比較雜交瘤上清針對細胞系Lovo, MDA-MB-231, OVCAR-3,和 CCD-27sk的細胞毒性百分數(shù)和結合水平。
圖2描述AR104A1289.2.2與癌癥和正常細胞系的結合。將數(shù)據(jù)列表以將平均熒光強度表示為高于同種型對照增加的倍數(shù)。
圖3包括針對若干癌癥和非-癌細胞系的AR104A1289.2.2和抗-EGFR 抗體的代表性FACS柱狀圖。
圖4顯示在預防性BxPC-3胰腺癌模型中AR104A1289.2.2對腫瘤生長的作用。垂直的虛線表示施用抗體的時間期間。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
圖5顯示在預防性BxPC-3胰腺癌模型中AR104A1289.2.2對體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
圖6顯示在預防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR104A1289.2.2對腫
瘤生長的影響。垂直虛線表示施用抗體的期間。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
圖7顯示在預防性MDA-MB-231乳腺癌模型中AR104A1289.2.2對體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
圖8顯示在預防性PC-3前列腺癌模型中AR104A1289.2.2對腫瘤生長的影響。垂直虛線表示施用抗體的期間。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
圖9顯示在預防性PC-3前列腺癌模型中AR104A1289.2.2對體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。
發(fā)明詳述
一般地，當用于概述、描述、實施例和權利要求中時，下述詞語或短語具有所示的定義。 '
術語"抗體"以最寬泛的意義使用，并且特別涵蓋，例如，單一的單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、和中和抗體、去免疫的(de-immunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，免疫綴合物和抗體片段(見下文)。
當用于本發(fā)明時，術語"單克隆抗體"是指從一群基本上均一的抗體獲得的抗體，即，除了可能以較少量存在的可能天然存在的突變之外，構成(comprising)所述群體的個體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原性位點。此外，多克隆抗體制劑包括針對不同決定簇 (表位)的不同抗體，與所述多克隆抗體制劑相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性，因為單克隆抗體可以不被其它抗體污染地合成，所以單克隆抗體是有利的。修飾詞"單克隆"表示該抗體的特征是從基本上均一的抗體群體獲得，并且不被解釋為抗體的生產需要通過任何特定的方法。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由 Kohler等^然rTNtow^入Z56:邦5 (1975)首先描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備，或可以通過重組DNA方法(參見，例如，美國專利號4,816,567) 制備。"單克隆抗體"還可以從噬菌體抗體文庫分離，例如，使用Clackson等，^然(7VafM^J 352:624-628 (1991)和Marks等，為、7主激學^^志a Mo/. 所o/J ， 222:581-597 (1991)中所述的技術。
"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原-結合或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括小于全長的抗體，F(xiàn)ab, Fab，， F(ab')2,和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結構域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。
"完整的"抗體是一種包括抗原-結合可變區(qū)以及輕鏈恒定結構域(co
和重鏈恒定結構域CHl、 Ch2和Ch3的抗體。恒定結構域可以是天然序列恒定結構域(例如，人天然序列恒定結構域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應子功能。
取決于它們的重鏈恒定結構域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同的"種類"。存在5種主要類別的完整抗體IgA, IgD， IgE， IgG和IgM，并且它們中的一些可以進一步分成"亞類"(同種型)，例如，IgGl,IgG2， IgG3， IgG4， IgA,和IgA2。與不同種類的抗體相對應的重鏈恒定結構域分別叫作cc， S， s， y，和p。不同種類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是公知的。
抗體"效應子功能"是指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學活性?？贵w效應子功能的實例包括Clq 結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)的下調，等。
"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"和"ADCC"是指細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK) 細胞，嗜中性粒細胞，和巨噬細胞)識別在靶細胞上的結合的抗體，并且隨后引起該靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞，即NK細胞，僅表達 FcyRffl，而單核細胞表達FcYRI, FcyRII和FcyRIII。 FcR在造血細胞上的表達總結在Ravetch禾n Kinet，免疫學年度綜述(j朋w. i ev. /wwwm /j 9:457-92 (1991)的第464頁表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，諸如在美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。對于所述測定有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC:)和天然殺傷(NK)細胞。備選地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在體
內進行評估，例如，在動物模型中，諸如在Clynes等.尸WAS (USA) 95:652-656 (1998)中公開的動物模型中。
"效應細胞"是表達一種或多種FcRs并且執(zhí)行效應子功能的白細胞。優(yōu)選地，該細胞至少表達FcyRIII并且執(zhí)行ADCC效應子功能。介導ADCC 的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)，天然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；其中PBMCs和NK細胞是優(yōu)選的。效應細胞可以從其天然來源分離，例如，從血液或PBMCs分離，如本發(fā)明所述。
術語"Fc受體"或"FcR"用來描述結合抗體的Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的 FcR是天然人FcR序列。此外，優(yōu)選的FcR是一種結合IgG抗體的FcR
(y受體)，并且包括FcyRI, FcyRH，禾q FcYRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的可變剪接形式。FcYRn受體包括FcYRIIA("激活受體") 和FcYRIIB ("抑制受體")，它們具有主要在它們的細胞質結構域不同的相似的氨基酸序列。激活受體FcYRIIA在其細胞質結構域包含免疫受體基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質結構域包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見在M. Dagron,免疫學年度綜述
(T ev. /mm,o/. ) 15:203-234 (1997)中的綜述)。FcRs在Ravetch和 Kinet,免疫學年度綜述(Annu. Rev. Immunol) 9:457-92 (1991); Capel等, ^資學;^"茲(7/wm#7ome//zoA J 4:25-34 (1994);禾卩de Haas等,^^教皇游康 J丄W. C7z'". MecU 126:330-41 (1995)中綜述。其它FcRs，包括將在將來鑒定的那些，包含在本發(fā)明的術語"FcR"中。該術語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負責將母親的IgGs轉運到胎兒(Guyer等，身資學泰吉
〃 /wm柳o/.力17:587 (1976)和Kim等，^///^i^^^^^gCEur. / /wmw"o/, J 24:2429(1994》。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"是指在存在補體的條件下分子裂解靶點的能力。補體激活途徑通過補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)同與同源抗原復合的分子(例如，抗體)的結合而起始。為了評估補體激活，可以進行 CDC觀lJ定，例如，如在Gazzano-Santoro等，,資,^"茲^^吉(7./mm，o/. MeAo&J 202: 163 (1996)中所述。術語"可變"是指這樣的事實，即，可變結構域的某些部分在序列上在抗體之間大量不同，并且用在每種特定的抗體對于其特定的抗原的結合和特異性中。然而，在抗體的整個可變結構域中可變性不是均勻分布的。它集中在輕鏈和重鏈可變結構域內稱為高變區(qū)的三個片段中?？勺兘Y構域
的更高度保守的部分稱為構架區(qū)(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域分別包括4個FRs，其主要采取(3-折疊構型，通過三個高變區(qū)連接，其形成環(huán) 連接，并且在某些情形中形成(3-折疊結構的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FRs緊密相鄰保持在一起，并且與另一條鏈的高變區(qū)一起有助于形成抗體的抗原-結合位點(見Kabat等,身^^學>^#/^歪^>^^^/ "e，^c^ 7Vo/e/ra o/Twmwwo/og/ca//wtems/9 ,第5 y^.公共衛(wèi)生月艮務(Public Health Service),全國衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health) ， Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991))。恒定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現(xiàn)出多種效應子功能，諸如在抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)中的抗體參與。
當用于本發(fā)明時，術語"高變區(qū)"是指抗體負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來自"互補性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，在輕鏈可變結構域中的殘基24-34 (LI), 50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重鏈可變結構域中的31-35 (HI), 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等，身i^學！遂游歪A游y^^/ (^e《we"ces1 o//附mwwo/og/ca/ /"femsf人第5 L 公共衛(wèi)生服務(Public Health Service),全國衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health) , Bethesda, Md. pp 15-17; 48-53 (1991))和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基(例如，在輕鏈可變結構域中的殘基26-32 (LI), 50-52 (L2)和91-96 (L3)和在重鏈可變結構域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)禾口 96-101 (H3); Chothia和Lesk，分子生物學雜志( / Mo/.歷o/J 196:901-917 (1987》。"構架區(qū)"或"FR"殘基是除了如本文所定義的所述高變區(qū)殘基之外的那些可變結構域殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩種相同的抗原-結合片段，其稱為 "Fab"片段，每個具有單個抗原-結合位點，和剩余的"Fc"片段，它的名稱反應了它容易結晶的能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')2片段，其具有兩個抗原-結合位點，并且仍然能夠交聯(lián)抗原。
"Fv"是包含完整的抗原-識別和抗原-結合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價締合的一個重鏈和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。正是在這種構型中每個可變結構域的三個高變區(qū)相互作用，以限定在 Vh-Vl^二聚體表面上的抗原-結合位點?；\統(tǒng)地，6個高變區(qū)賦予抗體的抗原-結合特異性。然而，甚至單個可變結構域(或僅包括對抗原特異的3 個高變區(qū)的FV的一半)具有識別和結合抗原的能力，盡管是以比完整的
結合位點低的親和力結合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域(CHI)。 Fab'片段不同于Fab片段，其通過在重鏈CH1結構域的羧基端添加幾個殘基而不同，所述添加的殘基包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發(fā)明中是Fab'的名稱，其中恒定結構域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離的巰基(thiol)基團。F(ab')2抗體片段最初作為一對Fab，片段產生，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的。
基于它們的恒定結構域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體的"輕鏈"可以被指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同的類型稱為kappa (k)禾卩l(xiāng)ambda (人)。
"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包括抗體的Vh和VL結構域，其中這些結構域存在于單一的多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包括在VH和Vl結枸域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于抗原結合的理想結構。對于scFv的綜述，參見Pltickthun，在單克隆抗體的藥理學(7Tze 尸/za環(huán)aco/。gv o/Mowoc/owa/ Jw/^ocZ/asO* 巻113, Rosenburg禾口 Moore編, Springer-Verlag,紐約，第269-315頁(1994)。
術語"雙抗體"是指具有兩個抗原-結合位點的小抗體片段，所述片段包括與在同一多肽鏈(VH-VO中的可變輕鏈結構域(VL)連接的可變重鏈結構域(VH)。通過使用太短而不允許在同一條鏈中的兩個結構域之間成對的連接體，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域成對，并且產生兩個抗原-結合位點。例如，在EP404,097;WO 93/11161;和Hollinger等，夷房房^^￥學綜學叛fiVoc. 7VW/. ^cad 5W. "SyO , 90:6444-6448 (1993)中更充分地描述了雙抗體。
"分離的"抗體是一種已經被鑒定并且與其天然環(huán)境的成分分離和/ 或從中回收的抗體。它的天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應用的物質，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶質。因為將不存在抗體天然環(huán)境的至少一種成分，分離的抗體包括在重組細胞內原位的抗體。然而，一般地，分離的抗體應該通過至少一個純化步驟制備。
與目的抗原"結合"的抗體是一種能夠以充足的親和力結合所述抗原的抗體，以便所述抗體通過靶向表達所述抗原的細胞而有效用作治療或診斷劑。在所述抗體是一種結合抗原性部分的抗體的情形中，與其它受體相反，它通常優(yōu)先結合所述抗原性部分，并且不包括偶然發(fā)生的結合，如非特異性Fc接觸，或不包括與其它抗原所常見的翻譯后修飾結合，并且可以是一種不與其它蛋白顯著交叉反應的抗體。用于檢測與目的抗原結合的抗體的方法在本領域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、
細胞ELISA和蛋白質印跡的測定。
當用于本發(fā)明時，表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可以互換地使用，并且所有這樣的名稱包括后代。還應該理解，由于故意的或偶然的突變，所有的后代在DNA內容物上可能不是精確相同的。包括在初始轉化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的突變的后代。這將通過使用不同名稱的上下文變得清楚。
"治療或處理"是指治療性治療和預防或預防性措施，其中目的是預防或減緩(減輕)目的病理癥狀或病癥。需要治療的那些包括已經患有病癥的那些，以及傾向于患有病癥的那些，或要預防病癥的那些。因此，在本發(fā)明中待治療的哺乳動物可以己經診斷患有病癥或可以是傾向于或易受病癥影響的。
術語"癌癥"和"癌性的"是指或描述哺乳動物中的生理狀況，所述生理狀況的典型特征在于失控的細胞生長或死亡。癌癥的實例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚細胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴惡性病。所述癌癥的更具體的實例包括鱗狀細胞癌(例如，上皮鱗狀細胞癌)，肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(gastric or stomach cancer),包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌癥，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。"化療劑"是有效用于治療癌癥的化學化合物?；焺┑膶嵗ㄍ?基化試劑，如塞替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM);垸基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶類如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌，美妥-替呢 (meturedopa )，禾口烏瑞替呢 (uredopa ) ; ethylenimines 禾口 methylamelamines，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷酰胺，塞替哌
(triethylenethiophosphoramide )禾口三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥 (nitrogen mustards ) 如苯丁酸氮芥,萘氮芥 (chlornaphazine ), cholophosphamide，肚隹莫司汀，異環(huán)磷酉先月安，氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥，美法侖，新氮芥，苯芥膽甾醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司 ?。粊喯趸?nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀, 尼莫司汀，雷莫司?。豢股厝绨⒖死顾?adacinomysins),放線菌素, authramycin,偶氮絲氨酸，博來霉素，方文線菌素C, calicheamicin, carabicin， carnomycin,嗜癌霉素，色霉氣放線菌素D,柔紅霉素，地托比星，6-重氮 -5-氧代丄-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達比星，馬塞羅霉氣絲裂霉素，麥考酚酸，諾拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin, 嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉素，鏈佐星，殺結核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物如denopterin,甲氨喋呤，喋羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine,硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷， 6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-FU;雄激素諸如卡普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內酯；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補償物如frolinic acid;醋葡醛內酯；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ; 5-氨基酮戊酸;安吖啶；bestrabucil;比生群；依達曲沙
(edatraxate) ; defofamine;秋水仙胺；地吖醌；elformithine;依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；尼曲吖啶；噴司他丁；異丙嗪(phenamet);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼;PSK⑧；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2,2，,2"-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan);長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴垸；gacytosine;阿拉伯糖苷("Am-C");環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉垸類，例如，紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新澤西)和多西他賽(TAXOTERE⑧，Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑; 長春堿；鉬；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11;拓撲異構酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；esperamicins;卡培他濱；以及任何上述物質的藥用鹽、酸或衍生物。下列物質也包含在本定義中，它們是作用調控或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素藥，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬， keoxifene， LY117018,奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素藥諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物質的藥用鹽、酸或者衍生物。
用于治療目的的"哺乳動物"是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和農場動物，以及動物園、運動或寵物動物，諸如綿羊、狗、馬、貓、牛、等等。在本發(fā)明中優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
"寡核苷酸"是長度短的、單鏈或雙鏈的多脫氧核苷酸，其通過已知方法化學合成(如磷酸三酯、亞磷酸酯、或亞磷酰胺化學，使用固相技術，如在1988年5月4日公布的EP 266,032中所述的，或通過脫氧核苷H-磷酸酯中間物，如Froehler等，孩^^^秀(7W/c/. A /A入14:5399-5407, 1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化它們。
按照本發(fā)明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和/或"嵌合的"形式是指這樣的抗體，所述抗體包含特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv, Fab, Fab', F(ab')2或抗體的其它抗原-結合亞序列)，與原始抗體相比較，其導致人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA) 或人抗-人抗體(HAHA)反應的減少，并且所述抗體包含來源于所述非人免疫球蛋白的、對再現(xiàn)所需要的作用是必需的必需部分(例如，一個或多個 CDR(s)、抗原結合區(qū)、可變結構域等)，同時保留與所述非人免疫球蛋白相當?shù)慕Y合特征。對于大部分，人源化的抗體是這樣的人免疫球蛋白(受
體抗體)，其中來自該受體抗體互補性決定區(qū)(CDRs)的殘基被來自非人物
種(供體抗體)CDRS的、具有需要的特異性、親和性和能力的殘基取代，
所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv構架區(qū)(FR)殘基被相對應的非人FR殘基取代。此外，所述人源化的抗體可以包括在受體抗體和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的殘基。進行這些修飾以進一步限定和最優(yōu)化抗體性能。通常，所述人源化的抗體應該包括基本上不少于至少一個、和典型地兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對應，并且所有或基本上所有的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體優(yōu)化地還應該包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
"去免疫的(De-immunized)"抗體是對于給定的物種是無免疫原性的或較少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通過抗體的結構改變實現(xiàn)?？?以使用本領域技術人員已知的任何去免疫技術。例如，用于使抗體去免疫性的一種適宜的技術記述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。
誘導"程序性細胞死亡"的抗體是一種通過任何方式誘導程序性細胞死亡的抗體，所述方式示例而不限于，膜聯(lián)蛋白V的結合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，細胞收縮，內質網膨脹，細胞片段化和/或膜囊泡的形成(稱為凋亡小體)。
當用于本文時，"抗體誘導的細胞毒性"應該理解為意指來源于由雜交瘤產生的雜交瘤上清或抗體的細胞毒性作用，所述作用不必與結合程度相關，所述雜交瘤以保藏號190607-04保藏在IDAC。
在整個說明書中，備選地，雜交瘤細胞系以及由其產生的分離的單克隆抗體由它們的內部命名AR104A1289.2.2或保藏命名IDAC 190607-04指示。
當用于本文時，"抗體-配體"包括這樣的部分，所述部分表現(xiàn)出針對靶抗原的至少一個表位的結合特異性，并且其可以是完整的抗體分子、抗體片段、以及至少具有它的抗原-結合區(qū)或部分(即，抗體分子的可變部分) 的任何分子，例如，F(xiàn)v分子,Fab分子,Fab，分子，F(xiàn)(ab，)2分子，雙特異性抗體，融合蛋白，或特異性識別和結合由分離的單克隆抗體結合的抗原的至少一個表位的任何遺傳工程分子，所述分離的單克隆抗體由命名為idac
190607-04 (IDAC 190607-04抗原)的雜交瘤細胞系產生。
當用于本文時，"減輕癌性疾病的抗體"(CDMAB)是指這樣的單克隆抗體及其抗體-配體，所述單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過程，例如，通過減少腫瘤負荷或延長腫瘤攜帶個體的生存的方式。當用于本文時，"抗原-結合區(qū)"意指分子識別靶抗原的部分。當用于本文時，"競爭性抑制"意指使用常規(guī)的交互(reciprocal)抗體競爭測定(Belanger L.， Sylvestre C.和Dufour D. (1973),通過競爭性和夾心方法X寸a月臺蛋白的酶耳關免疫領!j定(Enzyme linked immunoassay for alphafetoprotein by competitive and sandwich procedures). Clinica Chimica Acta 48:15)能夠識別和結合這樣的決定簇位點，所述決定簇位點是由命名為IDAC190607-04的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體(IDAC 190607-04抗體)所針對的。
當用于本文時，"靶抗原"是IDAC 190607-04抗原或其部分。當用于本文時，"免疫綴合物"意指任何分子或CDMAB，如與細胞毒素、放射性試劑、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑化學或生物學連接的抗體。所述抗體或CDMAB可以在分子的任何位置處與所述細胞毒素、放射性試劑、腫瘤藥或治療藥物連接，只要它能夠結合其耙點。免疫綴合物的實例包括抗體毒素化學綴合物和抗體-毒素融合蛋白。
當用于本文時，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原結合區(qū)與生物活性分子如毒素、酶、或蛋白藥物連接。
為了更充分地理解本文所述的本發(fā)明，進行了下述描述。本發(fā)明提供特異性識別和結合IDAC 190607-04抗原的CDMAB (即，IDAC 190607-04 CDMAB)。
通過以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤產生的分離的單克隆抗體的cdmab可以以任何形式存在，只要它具有這樣的抗原-結合區(qū)，所述抗原-結合區(qū)競爭性抑制由雜交瘤IDAC 1卯607-04產生的分離的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異性結合。因此，具有與idac 190607-04抗
體相同的結合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗體與明的范圍
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述CDMAB是IDAC 190607-04抗體。在其它實施方案中，所述CDMAB是抗原結合片段，其可以是Fv分子(如單鏈Fv分子)、Fab分子、Fab，分子、F(ab，)2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體或具有IDAC 190607-04抗體的抗原-結合區(qū)的任何重組分子。本發(fā)明的CDMAB針對所述ID AC 190607-04單克隆抗體針對的
表位c
本發(fā)明的CDMAB可以在分子內進行修飾，g卩，通過氨基酸修飾，以產生衍生物分子?；瘜W修飾也可以是可能的。
衍生物分子將保留所述多肽的功能特性，即，具有這樣的取代的分子仍然允許所述多肽與所述IDAC 190607-04抗原或其部分結合。
這些氨基酸取代包括，但不必要限于，本領域內已知為"保守的"氨基酸取代。
例如，充分確定的蛋白質化學原理認為，通?？梢栽诘鞍踪|內進行稱為"保守氨基酸取代"的特定的(certain)氨基酸取代，而不改變該蛋白質的構象或功能。
這樣的變化包括用異亮氨酸(I),纈氨酸(V),和亮氨酸(L)中的任一種取代這些疏水性氨基酸中的任意其它一種；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被認為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白質的三維結構中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常?？梢曰Q，同樣丙氨酸和纈氨酸(V)也可以互換。相對疏水性的甲硫氨酸(M)常?？梢耘c亮氨酸和異亮氨酸互換，并且有時可以與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)常常在這樣的情形中互換，在所述情形中，氨基酸殘基的重要特征是其電荷，并且這兩種氨基酸殘基的不同的pK's并不顯著。在特定的情形中，還有其它的變化可以被認為是"保守的"。
實施例1雜交瘤生產--雜交瘤細胞系AR104A1289.2.2
依據(jù)布達佩斯條約，雜交瘤細胞系AR104A1289.2.2于2007年6月19日保藏在加拿大國際保藏機構(the International Depository Authority ofCanada, IDAC)，加拿大衛(wèi)生部微生物局(Bureau of Microbiology, HealthCanada)(加拿大，馬尼托巴省，溫尼伯，Arlington街1015 ， R3E3R2)，保藏號為190607-04。依據(jù)37 CFR 1.808，保藏者保證在授予專利時，施加在所保藏的材料的公眾可獲得性上的所有約束均不能撤銷。如果保藏機構不能發(fā)放存活的樣品，替換保藏品。
為了產生生產抗癌抗體AR104A1289.2.2的雜交瘤，在PBS中制備與由冷凍的人腹膜液(通過告知許可獲得的患者捐獻)分離的轉移性卵巢癌相一致的惡性腫瘤細胞。通過輕輕混合制備IMMUNEASY (Qiagen,Venlo,荷蘭)佐劑用于使用。通過皮下注射在50微升的抗原佐劑中的1000萬個細胞而免疫5-7周齡的BALB/c小鼠。在初次免疫后2和5周，用新鮮制備的抗原佐劑對免疫的小鼠進行腹膜內加強，濃度為1000萬個細胞/50微升。在最后一次免疫后3天，使用脾臟進行融合。通過將分離的脾細胞與NSO-l骨髓瘤配偶體融合而制備雜交瘤。對雜交瘤亞克隆，檢測來自融合物的上清。
為了確定該雜交瘤細胞分泌的抗體是IgG還是IgM同種型，使用ELISA測定。在4°C在ELISA平板中加入100微升/孔的山羊抗-小鼠IgG十lgM(H+L)過夜，所述山羊抗-小鼠IgG + IgM(H+L)在包被緩沖液(0.1 M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.2-9.6)中，濃度2.4微克/mL。將平板用洗滌緩沖液(PBS + 0.05。/。吐溫)洗滌3次。向平板加入100微升/孔的封閉緩沖液(在洗滌緩沖液中5%牛奶)，在室溫下1小時，然后在洗滌緩沖液中洗滌3次。加入100微升/孔的雜交瘤上清，并且將平板在室溫下溫育1小時。平板用洗滌緩沖液洗滌3次，并且加入山羊抗-小鼠IgG或IgM辣根過氧化物酶綴合物的1/100,000稀釋液(稀釋在含有5M牛奶的PBS中)，100微升/孔。在將平板在室溫下溫育1小時后，將平板用洗滌緩沖液洗滌3次。將100微升/孔的TMB溶液在室溫下溫育1-3分鐘。加入50微升/孔2M H2S04終止顏色反應，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板讀數(shù)儀在450 nm下對平板讀數(shù)。如在圖1中所示，AR104A1289.22雜交瘤主要分泌IgG同種型的抗體。
為了確定由所述雜交瘤細胞分泌的抗體的亞類，使用小鼠單克隆抗體
同種型試劑盒(HyCult生物技術(HyCult Biotechnology) , Frontstraat,荷蘭)進行同種型分型實驗。將500微升緩沖液加入到包含大鼠抗-小鼠亞類特異性抗體的檢測試驗條(teststrip)。將500微升雜交瘤上清液加入到檢測管，并通過輕輕攪動浸沒。通過與膠體粒子偶聯(lián)的第二大鼠單克隆抗體直接檢測捕獲的小鼠免疫球蛋白。這兩種蛋白質的組合產生用于分析同種型的視覺信號?？?癌抗體AR104A1289.2.2是IgG2a、 K同種型的。
在一輪限制性稀釋后，在細胞ELISA測定中檢測雜交瘤上清的與耙細胞結合的抗體。檢測了一種人結腸癌細胞系、一種人乳腺癌細胞系、一種人卵巢細胞系和一種人非-癌皮膚細胞系分別為Lovo, MDA-MB-231,OVCAR-3和CCD-27sk。所有細胞系均從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)獲得。在使用前將接種的細胞固定。在室溫下，用含有MgCl2和CaCl2的PBS洗滌平板三次。向每個孔中加入100微升稀釋在PBS中的2%低聚甲醛，在室溫下10分鐘，然后倒掉。將平板再在室溫下用含有MgCl2和CaCl2的PBS洗滌三次。在室溫下用100微升/孔在洗滌緩沖液
(PBS + 0.05。/。吐溫)中的5%牛奶封閉1小時。將平板用洗滌緩沖液洗滌三次，并且以75微升/孔加入雜交瘤上清，在室溫下l小時。將平板用洗滌緩沖液洗滌3次，并且加入100微升/孔與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗-小鼠IgG或IgM抗體的1/25,000稀釋液(稀釋在含有5%牛奶的PBS .中)。在室溫下溫育1小時后，將平板用洗滌緩沖液洗滌3次，并且將100微升/孔的TMB底物在室溫下溫育1-3分鐘。用50微升/孔2MH2S04終止反應，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板讀數(shù)儀在450 nm下對平板讀數(shù)。列在圖1中的結果表示為與內部(in-house) IgG同種型對照相比高出背景的倍數(shù)，所述內部IgG同種型對照先前已經表明不與所檢測的細胞系結合。來自雜交瘤AR104A1289.2.2的抗體顯示出與Lovo結腸癌，MDA-MB-231乳腺癌和CCD-27sk非癌皮膚細胞系的可檢測的結合。
與檢測抗體結合聯(lián)合，在下述細胞系中檢測雜交瘤上清的細胞毒性作用(抗體誘導的細胞毒性)Lovo,MDA-MB-231, OVCAR-3和CCD-27sk。鈣熒光素AM從分子探針(Molecular Probes) (Eugene, OR)獲得，并且按照下文所述進行測定。在測定前將細胞以預先確定的適當?shù)拿芏冉臃N。2 天后，將來自雜交瘤微量滴定板的75微升上清轉移到細胞平板中，并且
在5% C02培養(yǎng)箱中溫育5天。抽空作為陽性對照的孔，加入100微升溶解在培養(yǎng)基中的疊氮鈉(NaN3， .01%，西格瑪(Sigma) , Oakville, ON)，或放線菌酮(CHX, 0.5微摩爾，西格瑪(Sigma) ， Oakville, ON)。在處理5天后，然后通過倒置將平板倒空，并且吸干。從多通道擠壓瓶向每個孔中分配含有MgCl2禾B CaCl2的室溫DPBS (Dulbecco，s磷酸鹽緩沖液)，輕敲3 次，通過倒置倒空然后吸干。向每個孔中加入50微升稀釋在含有MgCl2 和CaCl2的DPBS中的熒光鈣熒光素染料，并且在37°C在5% C02培養(yǎng)箱中溫育30分鐘。在Perkin-ElmerHTS7000熒光平板讀數(shù)儀中對平板讀數(shù)，并且在Microsoft Excel中分析數(shù)據(jù)。結果列在圖1中。來自AR104A1289.2.2 雜交瘤的上清對Lovo細胞產生15%的特異性細胞毒性。這是用陽性對照疊氮化鈉和放線菌酮分別對Lovo獲得的細胞毒性的500%和31%。對非-癌皮膚細胞系CCD-27sk不存在可檢測的細胞毒性。己知的非-特異性細胞毒素試劑放線菌酮和NaN3如所料通常產生細胞毒性。
來自圖1的結果證明AR104A1289.2.2對不同細胞系的細胞毒性作用與結合水平不相關。盡管與MDA-MB-231細胞系具有最高水平的結合，但是最高細胞毒性水平針對Lovo細胞系。AR104A1289.2.2雖然的確結合 CCD-27sk非癌皮膚細胞系，但是不在其中產生細胞毒性?？贵w因此表現(xiàn) 出功能特異性，其不必然與結合程度有關。
實施例2 體外結合
通過在CL-1000燒瓶(BD生物科學(BD Biosciences), Oakville， ON) 中培養(yǎng)雜交瘤而生產AR104A1289.2.2單克隆抗體，收集和再接種以兩次/ 周進行。接著使用蛋白質G瓊脂糖4 Fast Flow (Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(安瑪西亞生物科學(Amersham Biosciences), Baie d，Urf6， QC)進行標準的抗體純化步驟。使用人源化的、去免疫的、嵌合的或鼠單克隆抗體在本發(fā)明范圍之內。
通過流式細胞計數(shù)(FACS)評估AR104A1289.2.2與卵巢(ES-2,OV2008, OVCAR畫3禾tl SK-OV陽3),乳腺(MDA-MB-231和SK-BR-3),肺 (A549),胰腺(BxPC-3),結腸(Lovo)和前列腺(PC-3)癌細胞系和來自皮膚的非癌細胞系(CCD-27sk)的結合。除兩種卵巢癌細胞系外，全部細胞系獲
自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Tissue Collection) (ATCC， Manassas, VA)。 OV2008和ES-2卵巢癌細胞系獲自渥太華地區(qū)癌癥中心
(Ottawa Regional Cancer Center)(渥太華，安大略)。
通過最初用DPBS (無Ca"和Mg++)清洗細胞單層，為FACS準備細胞。然后使用細胞解離緩沖液(Invitrogen, Burlington, ON)在37。C將細胞從它們的細胞培養(yǎng)板中移出。離心和收集后，將細胞在4°C重新混懸在包含 MgCl2，CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS中(染色培養(yǎng)基)并計數(shù)，等分為適當?shù)募毎芏龋x心沉淀細胞并在存在檢測抗體(AR104A1289.2.2)或對照抗體(同種型對照，抗-EGFR(c225，IgGl,K,Cedarlane, Hornby ON))的條件下，在4。C，重新混懸在染色培養(yǎng)基中。在冰上，以20微克/mL評估同種型對照和檢測抗體，而以5微克/mL評估抗-EGFR30分鐘。加入Alexa Fluor546-綴合的二次抗體前，用染色培養(yǎng)基清洗細胞一次。然后，在4°C，添加染色培養(yǎng)基中的Alexa Fluor 546-綴合抗體30分鐘。再最后清洗細胞一次并重新混懸在固定培養(yǎng)基(包含1.5%低聚甲醛的染色培養(yǎng)基)中。通過利用FACSarray 系統(tǒng)軟件在FACSarray 上運行樣品評估細胞的流式細胞計數(shù)采樣(BD生物科學(BD Biosciences), Oakville， ON)。通過調節(jié) FSC和SSC檢測器上的電壓和振幅增加設置細胞正向(FSC)和側向擴散 (SSC)。通過運行未染色的細胞調節(jié)用于熒光(Alexa-546)通道的檢測器，從而使細胞具有約l-5單位中等熒光強度的一致的峰。對于每份樣品，獲得約10,000門控事件(染色的固定細胞)以進行分析，并將結果顯示在圖2 中。
圖2顯示超過同種型對照的平均熒光強度倍數(shù)增加。圖3編輯 AR104A1289.2.2抗體的代表性柱狀圖。AR104A1289.2.2證明了與除卵巢癌細胞系OVCAR-3和結腸癌細胞系Lovo以外的測試細胞系的結合。存在與卵巢ES-2 (2.9-倍)，OV2008 (2.6-倍)和SK-OV-3 (1.9-倍);乳腺 MDA-MB-231 (4.4-倍)和SK-BR-3 (1.8-倍)；肺A549 (5.2-倍)；胰腺BxPC-3 (7.3-倍)和前列腺PC-3 (9.5-倍)癌細胞系和非癌皮膚細胞系CCD-27sk (2.0-倍)的結合。這些數(shù)據(jù)證明AR104A1289.2.2結合于具有不同抗原表達水平的若干不同細胞系。
實施例3
使用BxPC-3細胞進行體內腫瘤實驗
實施例1證明AR104A1289.2.2具有針對人癌細胞系的抗癌特性。為了證明針對人癌細胞系的體內功效，在BxPC-3胰腺癌異種移植模型中測試AR104A1289.2.2。參考圖4和5，對6-8周齡雌性SCID小鼠通過在右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬人胰腺癌細胞 (BxPC-3)。將小鼠隨機分成2個處理組，每組8只。在植入后那天，在用含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內施用300微升體積的20 mg/kg 的AR104A1289.2.2檢測抗體或緩沖液對照。然后，在研究持續(xù)時間內，每周一次施用所述抗體和對照樣品。約每隔7天用測徑器測量腫瘤生長。在8劑量抗體注射后，結束本研究。在研究持續(xù)時間內，每周一次記錄動物的體重。在研究結束時，按照CCAC指導將所有動物處死。
AR104A1289.2.2在人胰腺癌BxPC-3體內預防模型中減少腫瘤生長。如在第56天，即最后給藥抗體后6天時確定地，與緩沖液-處理的組相比，用Arius抗體AR104A1289.2.2處理以53.3% (p=0. 0010, t-檢驗)減少 BxPC-3腫瘤生長(圖4)。
在整個研究過程中，不存在臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體
重是健康和不能健壯生長(thrive)的替代品(surrogate)(圖5)。在處理
期結束時各組間不存在平均體重的顯著差異。從研究開始到結束各組內不存在平均體重的顯著差異。
總之，在這種人胰腺癌異種移植模型中，AR104A1289.2.2是很好耐受的，并且減少腫瘤負荷。
實施例4
使用MDA-MB-231細胞的體內腫瘤實驗
實施例1和3證明AR104A1289.2.2具有針對結腸和胰腺人癌癥指征的抗癌特性。為了證明在乳腺癌模型內的功效，在MDA-MB-231乳腺癌異種移植模型中測試AR104A1289.2.2。參考圖6和7，對6-8周齡雌性SCID 小鼠通過在右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)。將小鼠隨機分成2個處理組，每組8只。在植入后那天，在用含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內施用300微升體積的20mg/kg的AR104A1289.2.2檢測抗體或緩沖液對照。然后，在研究持續(xù)時間內，每周一次施用所述抗體和對照樣品。約每隔7天用測徑器測量腫瘤生長。在8劑量抗體注射后，結束本研究。在研究持續(xù)時間內，每周一次記錄動物的體重。在研究結束時，按照CCAC指導將所有動物處死。
AR104A1289.2.2在人乳腺癌MDA-MB-231體內預防模型中減少腫瘤生長。如在第76天，即最后給藥抗體后26天時確定地，與緩沖液-處理的組相比，用Arius抗體AR104A1289.2.2處理以94.2% (p=0.0003, t-檢驗) 減少MDA-MB-231腫瘤生長(圖6)。
在整個研究過程中，不存在臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體重是健康和不能健壯生長(thrive)的替代品(surrogate)(圖7)。在處理期結束時各組間不存在平均體重的顯著差異。從研究開始到結束各組內也不存在平均體重的減少。
總之，在這種人乳腺癌異種移植模型中，AR104A1289.2.2是很好耐受的，并且顯著減少腫瘤負荷。
使用PC-3細胞的體內腫瘤實驗
實施例1 、 3和4證明AR104A1289.2.2具有針對結腸、胰腺和乳腺人癌癥指征的抗癌特性。為了證明在前列腺癌模型內的功效，在PC-3前列腺癌異種移植模型中測試AR104A1289.2.2。參考圖8和9，對6-8周齡雌性SCID小鼠通過在右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的 IOO萬人前列腺癌細胞(PC-3)。將小鼠隨機分成2個處理組，每組8只。在植入后那天，在用含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內施用300微升體積的20mg/kg的AR104A1289.2.2檢測抗體或緩沖液對照。然后，在
研究持續(xù)時間內，每周一次施用所述抗體和對照樣品。約每隔7天用測徑器測量腫瘤生長。在8劑量抗體注射后，結束本研究。在研究持續(xù)時間內，每周一次記錄動物的體重。在研究結束時，按照CCAC指導將所有動物處死。
AR104A1289.2.2在人前列腺癌PC-3體內預防模型中減少腫瘤生長。如在第33天，即最后第5次給藥抗體后4天時確定地，與緩沖液-處理的組相比，用Arius抗體AR104A1289.2.2處理以76.5% (p=0.0003, t-檢驗) 減少PC-3腫瘤生長(圖8)。所有小鼠在第33天仍然存活。研究持續(xù)直到第53天，即最后給藥后3天。在第53天時，由于大腫瘤體積和腫瘤病灶，除去對照組中的三只小鼠和抗體處理組中的一只小鼠，這是研究的終點。然而，在第53天，AR104A1289.2.2仍然以61.3% (p=0.0483, t-檢驗)顯著減少PC-3腫瘤生長。
在整個研究過程中，不存在臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體重是健康和不能健壯生長(thrive)的替代品(surrogate)(圖9)。緩沖液處理組中的平均體重從研究開始到結束顯著減小(pi.0001,t-檢驗)。然而， AR104A1289.2.2處理小鼠的平均體重從研究開始到結束不存在顯著差別。
總之，在這種人前列腺癌異種移植模型中，AR104A1289.2.2是很好耐受的，并且顯著減少腫瘤負荷。AR104A1289.2.2被證明了針對四種不同人癌癥指征的功效結腸、胰腺、乳腺和前列腺。在若干公認的人癌癥疾病模型中觀察到治療益處，這提示該抗體對于其他哺乳動物，包括人的治療的藥理學和藥物益處?？傊摂?shù)據(jù)證明AR104A1289.2.2抗原是癌性相關抗原且在人癌細胞上表達，并且是病理學相關癌癥耙標。
實施例6
競爭性結合劑的分離
給定抗體，本領域普通技術人員可以產生競爭性抑制CDMAB，例如競爭性抗體，其是一種識別相同表位的抗體(BelangerL箏C7z'm'ca C7H'm/ca Jcto":75-7S(1973))。一種方法需要(entails)用這樣的免疫原進行免疫，所述免疫原表達被所述抗體識別的抗原。樣品可以包括，但不限于，組織、分離的蛋白或細胞系。得到的雜交瘤可以使用競爭測定進行篩選，所述競
爭測定是一種鑒定抑制測試抗體的結合的抗體的測定，諸如ELISA, FACS
或蛋白質印跡。另一種方法可以使用噬菌體展示抗體文庫，和淘選
(panning)識別所述抗原的至少一個表位的抗體(Rubinstein JL等.年度生物化學""a/腸c/z簡)314:294-300(2003))。在每種情形中，基于抗體置換初始標記抗體與其靶抗原的至少一個表位的結合的能力，選擇抗體。因此，這樣的抗體將如初始抗體一樣具有識別抗原的至少一個表位的特征。
實施例7
克隆AR104A1289.2.2單克隆抗體的可變區(qū)
可以確定由AR104A1289.2.2雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體的重鏈 (vh)和輕鏈(VO的可變區(qū)的序列。使用標準方法，包括使用異硫氰酸胍進行的細胞溶解(Chirgwin等.生物化學(Biochem) . 18:5294-5299(1979))，可以從受試雜交瘤提取編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的RNA。通過本領域內已知的PCR方法(Sambrook禁編，分子克隆(Molecular Cloning),第 14章，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor laboratories Press),紐約. (1989))，可以使用mRNA制備cDNA，隨后分離Vh和Vl基因?？梢酝?過自動Edman測序獨立地確定重鏈和輕鏈的N端氨基酸序列。還可以通過Vh和Vt片段的氨基酸測序而確定CDRs和側翼FRs的其他片段。然后，設計合成的引物，用于從AR104A1289.2.2單克隆抗體分離Vh和V^基因，并且可以將分離的基因連接到適當?shù)妮d體中進行測序。為了產生嵌合的和人源化的IgG，可以將可變輕鏈和可變重鏈結構域亞克隆到適當?shù)妮d體中進行表達。
(i)單克隆抗體
使用常規(guī)方法容易地分離并測序編碼單克隆抗體(如在實施例1中所述)的DNA (例如，通過使用能夠特異性結合編碼所述單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞作為這樣的DNA的優(yōu)選來源。當分離時，所述DNA可以置于表達載體內，然后將其轉染到宿主細胞中，如大腸桿菌(E.coli)細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞中，所述細胞不另外產生免疫球蛋白，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。也可以修飾所述DNA，例如，通過取代人重鏈和輕鏈恒定結構域編碼序列替換同源鼠序列。也可以使用合成蛋白質化學中的已知方法，包括含有交聯(lián)劑的那些方法，體外制備嵌合抗體或雜交抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵構建免疫
毒素。用于這一目的的適當試劑的實例包括亞氨基硫羥酸鹽(iminothiolate) 禾口甲基-4-5充基butyrimidate。
(ii) 人源化的抗體人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些
非人氨基酸殘基通常稱為"引入"的殘基，其典型地來自"引入的"可變結構域?？梢酝ㄟ^Winter及合作者的方法用嚙齒類CDRs或CDR序列取代相對應的人抗體序列(Jones等，自然(Nature) 321:522-525 (1986); Riechmann等，自然(Nature) 332:323-327 (1988); Verhoeyen等，科學 (Science) 239:1534-1536 (1988);在Clark，今日免疫學(Immunol. Today) 21:397-402 (2000)中的綜述)進行人源化。
可以通過使用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和不同概念人源化產物的方法而制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是本領域技術人員可獲得的和熟悉的。圖解和展示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序是可獲得的。這些展示的觀察允許分析殘基在所述候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和引入序列中選擇FR殘基且組合FR殘基，以便獲得需要的抗體特征，如對耙抗原增加的親和性。通常，CDR殘基直接且最顯著地(most substantially) 參與影響抗原結合。
(iii) 抗體片段
已經開發(fā)了生產抗體片段的各種技術。這些片段可以通過重組宿主細胞產生(參考Hudson,現(xiàn)代免疫學觀點(Curr.Opin. Immunol,) 11:548-557 (1999); Little等，今日免疫學(Immunol. Today) 21:364-370 (2000))。例如，F(xiàn)ab，-SH片段可以直接從大腸桿菌回收，并且化學偶聯(lián)以形成F(ab，)2片段 (Carter等,生物技術(Biotechnology) 10:163-167 (1992))。在另一個實施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進F(ab')2分子的組裝而形成F(ab')2。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離Fv, Fab或F(ab')2片段。
實施例8
包括本發(fā)明的抗體的組合物
本發(fā)明抗體可以用作預防/治療癌癥的組合物。所述包括本發(fā)明抗體的用于預防/治療癌癥的組合物是低毒性的，并且它們可以采用液體制劑的形式施用，或作為適用于人或哺乳動物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、犬、猿猴、等等)的制劑的藥物組合物口服或腸胃外(例如，靜脈內、腹膜內、皮下、等等)施用。本發(fā)明抗體可以以本身施用，或可以作為適當?shù)慕M合物施用。用于所述施用的組合物可以包含藥用載體，和本發(fā)明抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用的藥物制劑的形式提供。
用于腸胃外施用的組合物的實例是可注射制劑、栓劑等?？勺⑸渲苿?可以包括這樣的劑型，諸如靜脈內、皮下、皮內和肌內注射，滴注，關節(jié) 內注射等等。這些可注射制劑可以通過公知方法制備。例如，可注射制劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽溶解、混懸或乳化在常規(guī)用于注射的無菌水性介質或油性介質中而制備。對于水性注射介質，存在如生理鹽水，含有葡萄糖和其他輔助試劑的等滲溶液等，其可以與適當?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80， HCO-50 (氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50 mols)加合物))等組合使用。對于油性介質，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以與增溶劑如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。這樣制備的注射劑通常裝在適當?shù)陌碴持小?用于直腸施用的栓劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽與常規(guī)用于栓劑的基質混合而制備。用于口服施用的組合物包括固體或液體制劑，具體為片劑 (包括糖衣和薄膜包衣片劑)，丸劑、粒劑、粉末制劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳液、混懸液等。這樣的組合物通過公知方法制備，并且可以包含常規(guī)用在藥物制劑領域中的載體(vehicle)、稀釋劑或賦形劑 (excipient)。用于片劑的載體(vehicle)或賦形劑(excipient)的實例包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
有利地，將上述用于口服或腸胃外應用的組合物制備成適于符合活性成分劑量的單位劑量的藥物制劑。所述單位劑量制劑包括，例如，片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑、等等。所包含的前述化合物的量通常為5 - 500 mg/劑量單位形式；優(yōu)選地特別是在注射液形式中含有約5-約 100 mg的上述抗體，并且對于其他形式含有10-250 mg的上述抗體。
前述包括本發(fā)明抗體的預防性/治療性藥劑或調節(jié)劑的劑量可以取決于下列各項而不同被施用的受試者，目的疾病，病癥，施用途徑等等。例如，當用于治療/預防目的時，例如，治療/預防成年人中的乳腺癌時，有利地以約0.01 -約20 mg/kg體重、優(yōu)選地約0.1 -約10 mg/kg體重且更優(yōu)選地約0.1 -約5 mg/kg體重的劑量靜脈內施用本發(fā)明的抗體，約1 -5次沃，優(yōu)選約1 - 3次沃。在其他腸胃外和口服施用中，所述藥劑可以以與上述劑量相對應的劑量施用。當病癥特別嚴重時，可以依據(jù)病癥增加劑量。
本發(fā)明抗體可以以其自身或以適當組合物的形式施用。用于施用的組合物可以包含藥用載體與前述抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用(例如，血管內注射、皮下注射等)的藥物制劑的形式提供。上述每種組合物還可以包含其他活性成分。此外，本發(fā)明抗體可以與其他藥劑聯(lián)合使用，所述其他藥劑例如垸基化試劑(例如，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，等)，代謝拮抗劑(例如，甲氨喋呤,5-氟尿嘧啶，等)，抗腫瘤抗生素(例如，絲裂霉素，阿霉素，等)，植物來源的抗腫瘤藥(例如，長春新堿，長春地辛，泰素，等)，順鉑，卡鉑，依托泊苷，伊立替康，等。本發(fā) 明抗體和上述藥物可以同時或以交錯的次數(shù)施用給患者。
大量的事實表明AR104A1289.2.2通過與癌癥細胞系上存在的表位連接而介導抗癌作用。此外，可以表明，AR104A1289.2.2抗體可以用于檢測表達與所述抗體特異性結合的表位的細胞；這使用所例舉的但不限于 FACS、細胞ELISA或IHC的技術。
本說明書中提及的所有專利和出版物象征本發(fā)明所屬領域技術人員的水平。所有的專利和出版物通過引用結合于此，以如同每篇單獨的出版物通過引用特別且獨立地指明結合的相同程度結合。
應該理解，盡管示例了本發(fā)明的某些形式，但是不限于本文所述和所示的部分的特定形式或安排。對于本領域技術人員來說，在不背離本發(fā)明的范圍的條件下可以進行各種變化，并且本發(fā)明不應該被視為限于在本說明書中所示和所述的內容，這是顯而易見的。
本領域技術人員應該容易地理解本發(fā)明充分適合實施所述目標并且獲得所提及的目的和益處以及其中固有的那些。本發(fā)明所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相關的化合物、方法、步驟和技術代表目前的優(yōu)選實施方案，意欲是示例性的，并且不意欲作為對范圍的限制。其中的變化和其他應用對于本領域技術人員而言是可以發(fā)生的，所述變化和其他應用包括在本發(fā)明的精神內，并且由后附的權利要求的范圍限定。盡管己經聯(lián)合特定優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，但是應該理解所要求的本發(fā)明不應該不適當?shù)叵抻谒鎏囟▽嵤┓桨?。實際上，對于本領域技術人員是明顯的實施本發(fā)明的所述模式的各種改進意欲被包括在后附權利要求的范圍內。加拿大國際保藏機構
國家微生物實驗室，加拿大公共衛(wèi)生機構 1015 Arlington Street Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2
國際表格IDAC/BP/4
原始保藏情形中的收據(jù)
(按照布達佩斯條約細則Rule 7.1發(fā)布)
附加原始保藏文本和存活證明復印件
本國際保藏機構接受以下指定的微生物的保藏，其接收日期為2007
年6月19日_
為(保藏者名稱)Valerie Harris,阿瑞斯硏究公司_
地址55 York Street， Suite 1600 ，多倫多，ON M5J 1R7_
保藏鑒定
保藏者指定的參考AR104A1289.2.2_
本IDA指定的保藏號190607-04_
以上證明的保藏物伴隨科學描述(詳列)_提議的分類命名(詳列):
授權代表IDAC的人員簽名
日期2007年6月21日
原始保藏情形中的收據(jù)/l
電話(204)789-6030 傳真(204)789-2018
文件105 (07)加拿大國際保藏機構
國家微生物實驗室，加拿大公共衛(wèi)生機構
1015Arlington Street 電話(204)789-6030
Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2 傳真(204)789-2018
國際表格IDAC/BP/9
存活證明
(按照布達佩斯條約細則Rule 10.2發(fā)布)
發(fā)給存活證明的團體
名稱 Ferris Lander_
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida 33410_
保藏者
名稱Valerie Harris, 阿瑞斯研究公司_
地址55 York Street, Suite 1600，多倫多，ON M5J 1R7_
保藏鑒定
國際保藏機構給出的保藏號190607-04_
原始保藏日期(或最近的相關日期) 2007年6月19日_
存活測試
在(最近的測試日期)測試的以上鑒定的保藏物的存活性
在以上指定的日期，該培養(yǎng)物是存活 [] 不再存活
進行存活測試的條件(如果需要該信息并且測試的結果是陰性的，則填
寫)^_
授權代表IDAC的人員簽名
日期2007年6月29日
存活證明1/1 文件號105 (07)
權利要求
1.由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體。
2. 由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的人源化抗體，或由所述人源化抗體產生的抗原結合片段。
3. 由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，或由所述嵌合抗體產生的抗原結合片段。
4. 以保藏號190607-04保藏在IDAC的分離的雜交瘤細胞系。
5. 在選自人腫瘤的組織樣品中起始抗體誘導的癌細胞細胞毒性的方法，所述方法包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供由以保藏號1卯607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體，由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力；禾口使所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其 CDMAB與所述組織樣品接觸；其中所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其 CDMAB與所述組織樣品的結合誘導細胞毒性。
6. 權利要求1的分離的單克隆抗體的CDMAB。
7. 權利要求2的人源化抗體的CDMAB。
8. 權利要求3的嵌合抗體的CDMAB。
9. 權利要求1、 2、 3、 6、 7或8中任一項的分離的抗體或其CDMAB，所述分離的抗體或其CDMAB與選自由下列各項組成的組中的成員綴合細胞毒性部分、酶、放射性化合物、和造血細胞。
10. 在哺乳動物中治療易受抗體誘導的細胞毒性影響的人腫瘤的方法，其中所述人腫瘤表達抗原的至少一個表位，其特異性結合由以保藏號 190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述方法包括對所述哺乳動物以有效導致所述哺乳動物腫瘤負荷減小的量施用所述單克隆抗體或所述其CDMAB。
11. 權利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細胞毒性部分綴合。
12. 權利要求ll的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
13. 權利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
14. 權利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒作用。
15. 權利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
16. 權利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
17. —種單克隆抗體，其能夠特異性結合與由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體結合的表位相同的一個或多個表位。
18. 在哺乳動物中治療人腫瘤的方法，其中所述人腫瘤表達抗原的至少一個表位，其特異性結合由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述方法包括對所述哺乳動物以有效導致所述哺乳動物腫瘤負荷減小的量施用所述單克隆抗體或其CDMAB。
19. 權利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細胞毒性部分綴合。
20. 權利要求19的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
21. 權利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
22. 權利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒作用。
23. 權利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
24. 權利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
25. 在哺乳動物中治療人腫瘤的方法，其中所述人腫瘤表達抗原的至少一個表位，其特異性結合由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述方法包括對所述哺乳動物以有效導致所述哺乳動物腫瘤負荷減小的量施用與至少一種化療劑聯(lián)合的所述單克隆抗體或其CDMAB。
26. 權利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細胞毒性部分綴合。
27. 權利要求26的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
28. 權利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
29. 權利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒作用。
30. 權利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
31. 權利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
32. 確定在選自人腫瘤的組織樣品中的癌細胞存在的結合測定方法，所述癌細胞特異性結合由具有IDAC保藏號190607-04的雜交瘤細胞系 AR104A1289.2.2生產的分離的單克隆抗體、由以保藏號190607-04保藏在 IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的人源化抗體、或由以保藏號 190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，所述結合測定方法包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供至少一種所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其CDMAB，其識別與由具有IDAC保藏號190607-04的雜交瘤細胞系AR104A1289.2.2生產的分離的單克隆抗體所識別的那些表位相同的一個或多個表位；使至少一種所述提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品接觸；和確定所述至少一種所提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品的結合.由此指示所述癌細胞在所述組織樣品中的存在。
33. 單克隆抗體用于減小人腫瘤負荷的應用，其中所述人腫瘤表達抗原的至少一個表位，其特異性結合由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述應用包括對所述哺乳動物以有效導致所述哺乳動物人腫瘤負荷減小的量施用所述單克隆抗體或其CDMAB。
34. 權利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細胞毒性部分綴合。
35. 權利要求34的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
36. 權利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
37. 權利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒作用。
38. 權利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
39. 權利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
40. 單克隆抗體用于減小人腫瘤負荷的應用，其中所述人腫瘤表達抗原的至少一個表位，其特異性結合由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤生產的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競爭性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結合的能力，所述應用包括對所述哺乳動物以有效導致所述哺乳動物人腫瘤負荷減小的量與至少一種化療劑聯(lián)合施用所述單克隆抗體或其CDMAB。
41. 權利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細胞毒性部分綴合。
42. 權利要求41的方法，其中所述細胞毒性部分是放射性同位素。
43. 權利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。
44. 權利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導抗體依賴性細胞毒作用。
45. 權利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
46. 權利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
47.有效用于治療人癌性腫瘤的組合物，所述組合物以組合方式包括:權利要求1，2，3，6,7,8,或17中任一項的抗體或CDMAB; 所述抗體或其抗原結合片段的綴合物，所述抗體或其抗原結合片段與選自由下列各項組成的組的成員綴合細胞毒性部分、酶、放射性化合物、和造血細胞；禾口需要量的藥用載體；其中所述組合物有效用于治療所述人癌性腫瘤。
全文摘要
抗體介導的癌細胞殺死是治療癌癥的有效方法。當用卵巢癌細胞免疫時，篩選小鼠中產生的抗體，以獲得作為終點的針對多種癌細胞系的細胞毒性。分離由以保藏號190607-04保藏在IDAC的雜交瘤AR104A1289.2.2產生的抗癌細胞毒性單克隆抗體，其對結腸癌細胞系具有細胞毒性，且在人胰腺、乳腺和前列腺癌的動物模型中減少腫瘤負荷。所述單克隆抗體還結合若干癌細胞系。單克隆抗體不對非癌細胞系引起細胞毒性，盡管其結合該細胞系。該單克隆抗可以用于輔助對癌癥進行分段和診斷，并且可以用來治療原發(fā)瘤和腫瘤轉移。所述細胞毒性單克隆抗體還可以用于將毒素、酶、放射性化合物、以及造血細胞遞送到癌細胞，從而進一步輔助減少腫瘤負荷。
文檔編號A61P37/04GK101687931SQ200880024555
公開日2010年3月31日申請日期2008年7月14日優(yōu)先權日2007年7月16日
發(fā)明者戴維·S·F·揚, 海倫·P·芬德利, 蘇珊·E·哈恩, 莉薩·M·切凱托申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司

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