專利名稱：預防、治療和診斷利什曼病的利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶組合物的制作方法
預防、治療和診斷利什曼病的利什曼原蟲固醇24-c-甲基
轉移酶組合物 關于序列表的聲明 與本申請相關的序列表是以代替紙件形式的純文本格式提供的，并通過引用并入 本說明書。含有所述序列表的該文本文件的名稱是480239_404_SEQUENCE_LISTING. txt。 該文本文件的大小為20KB，其創(chuàng)建于2008年7月11日，并經由EFS-Web與提交說明書的同 時提交。 發(fā)明背景 發(fā)明領域 本發(fā)明通常涉及用于預防、治療和檢測患者利什曼病的組合物和方法。更具體地 說，本發(fā)明涉及包含利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶(SMT)多肽、其融合多肽以及編碼此 類多肽和融合物的多核苷酸的組合物。
背景技術：
人類利什曼病是由利什曼原蟲(Leishmania)的原生動物寄生蟲引起的一系列疾 病。根據(jù)臨床表現(xiàn)，利什曼病大致分為皮膚利什曼病(cutaneous leishmaniasis, CL)、粘膜 利什曼病(mucosal leishmaniasis, ML)禾口內臟利什曼病(visceral leishmaniasis, VL) 三種疾病類型。內臟利什曼病通常由杜氏利什曼原蟲(L.donovani)復合種即杜氏利什曼 原蟲和嬰兒(恰氏)利什曼原蟲(L. infantum(chagasi))引起，是最為嚴重的形式，每年報 告約500， 000新發(fā)病例(信息源于世界衛(wèi)生組織www. who. int/leishmaniasis/en/)?；?躍性VL的特征為血液和肝脾異常，如果不進行正確地治療通常是致死的。
利什曼原蟲寄生蟲通過白蛉叮咬傳播，感染性前鞭毛體在哺乳動物宿主的巨噬 細胞中分化并復制為無鞭毛體。與其他的胞內病原體一樣，細胞免疫反應對于防御利什 曼病的保護非常關鍵。Thl免疫反應在介導防御利什曼原蟲的保護中發(fā)揮重要的作用，包 括對CD4+和CD8+T細胞、IFN-y 、 IL_12、 TNF-a以及NO的作用，而對11-10和TGF-P的 抑制性作用已有報道(Engwerda et al. ， (1998) Eur J Immuno 128 :669-680 ;Murphy et al. ， (2001)Eur J Immunol 31 :2848-2856 ;Murrayand Nathan. (1999)J Exp Med 189: 741-746 ;Murray et al. ， (2000) Infectl匪n 68 :6289-6293 ;Squires et al. ， (1989) J Immunol 143 :4244-4249 ;Taylor and Murray, (1997)J Exp Med 185 :1231-1239 ;Kaye and Bancroft. (1992)Infect Immun 60 :4335-4342 ;Stern et al. ， (1988)J Immunol140 : 3971-3977 ;和Wilson et al. ， (1998) J Immunol 161:6148-6155)。動物模型中抗利什 曼病的免疫接種可以通過抗原編碼DNA載體的送遞(Gurunathan et al. ， (1997)J E鄧 Med 186 :1137-1147 ;Piedrafita et al. ， (1999) J Immunol 163 :1467-1472 ;和Mendez et al. ， (2001) J Immuno1166 :5122-5128)或通過給予由Th_l誘導佐劑配制的蛋白來實 現(xiàn)，所述佐劑包括IL-12(Afonso et al. ， (1994) Science 263 :235-237 ;Stobie et al.， (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 :8427—8432 ;和Kenney et al. ， (1999) JImmunol 163 :4481-4488)或諸如CpG寡核苷酸(Rhee et al. ， (2002) J ExpMed 195 :1565-1573 ;Stacey and Blackwell. (1999) Infect I匪n67 :3719-3726 ;禾卩Walker et al. ， (1999)Proc Natl Acad Sci USA96 :6970-6975)和單磷酰脂質A(Coler et al. ， (2002) Infect Immun70 : 4215-4225和Skeiky et al. ， (2002) Vaccine 20:3292-3303)的TLR配體。
盡管存在亞單位疫苗在VL模型中有效的證據(jù)(Basu et al. ， (2005) JImmunol 174 :7160-7171 ;Stager et al. ， (2000)J Immunol 165 :7064-7071 ;Ghosh et al. ， (2001) Vaccine 20 :59-66 ;Wilson et al. ， (1995) Infect I匪n63 :2062-2069 ;Tewaryet al.， (2005) J Infect Dis 191 :2130-2137 ;Aguilar-Be et al. ， (2005) Infect Imm皿73: 812-819 ;和Rafati et al. ， (2006) Vaccine 24 :2169-2175)，但一直缺乏限定體內有效 抗VL的真正候選抗原的進展。利用感染嬰兒利什曼原蟲的倉鼠的血清，經血清學篩選法 已鑒定了幾個嬰兒利什曼原蟲抗原(Goto et al. ， (2006) Infect I匪n74 :3939-3944)。 固醇241-甲基轉移酶(SMT)，已發(fā)現(xiàn)的活性抗原之一，是一種參與麥角固醇生物合成的 酶，所述麥角固醇是殺利什曼原蟲的和殺真菌的二性霉素B(Pourshafie et al. ， (2004) Antimicrob AgentsChemother 48:2409-2414)的耙分子。二性霉素B選擇性地對一些原生 動物寄生蟲和真菌表現(xiàn)出選擇性的殺傷活性，然而并未在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)麥角固醇。 同樣，SMT存在于某些寄生蟲、真菌和植物中，但在哺乳動物中缺失。 使用由全有機體組成的疫苗預防或治療利什曼病的策略在人類中并未奏效。因 此，仍強烈需要能有效預防和/或治療人類或其他哺乳動物(例如犬科動物)利什曼病的 免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明滿足了這些需求并提供了其他的相關優(yōu)勢。
發(fā)明概述 簡而言之，本發(fā)明提供了用于預防、治療和檢測利什曼病的組合物和方法。 一方 面，本發(fā)明的組合物使用包含利什曼原蟲固醇24-『甲基轉移酶(SMT)多肽的至少免疫原 性部分或SMT多肽變體的多肽，其中所述部分或變體保留了所需的全長SMT多肽的免疫原 性特性。在更具體的實施方案中，利什曼原蟲SMT多肽包含杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原 蟲、碩大利什曼原蟲(L. major)或巴西利什曼原蟲(L. braziliensis) SMT多肽的氨基酸序 列。在更具體的實施方案中，SMT多肽包含SEQ ID N0s :1、3、5和11中任一序列所示的氨 基酸序列。 在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼上述多肽的多核苷酸的組合物以及包含這些 多核苷酸序列的重組表達載體和利用此類表達載體轉化或轉染的宿主細胞。在更具體的實 施方案中，多核苷酸包含編碼杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲或巴西利 什曼原蟲SMT多肽的核酸序列。在更具體的實例中，SMT多核苷酸包含SEQ IDN0s :2、4、6 和12中任一序列所示的核酸序列。 在另一方面，本發(fā)明提供了包含利什曼原蟲SMT抗原的至少免疫原性部分且還包 含一個或更多異源融合伴侶的融合多肽。在相關方面，也提供了編碼此類融合蛋白的多核 苷酸。 仍然在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與生理學上可接受的載體組 合的一種或多種本文所述的多肽和/或融合多肽或編碼此類多肽的多核苷酸。
另一方面本發(fā)明提供了疫苗組合物，其包含與免疫剌激劑組合的一種或多種本文 所述的多肽和/或融合多肽或編碼此類多肽的多核苷酸。在更具體的實施方案中，免疫剌
4激劑為誘導占主導的Thl型免疫反應的佐劑。 在其他方面，本發(fā)明提供了剌激患者細胞和/或體液免疫反應的方法，其包括給 予患者上文所述的藥物組合物或疫苗。 另一方面，本發(fā)明提供了誘導患者防御利什曼病的保護性免疫的方法，其包括給 予患者上文所述的藥物組合物或疫苗。 相關方面提供了治療患有利什曼病的患者的方法，其包括給予患者上文所述的藥 物組合物或疫苗。 參考下文詳細的描述和附圖，本發(fā)明這些及其他的方面將會變得明晰。因此將本
文所公開的所有參考文獻通過引用全文并入，如同將每一篇單獨并入一樣。 附圖簡要說明
圖1A-1B表示來自嬰兒利什曼原蟲(SEQ ID NO :1)、杜氏利什曼原蟲(SEQ ID NO : 3)、碩大利什曼原蟲(SEQ ID N0:5)、美洲錐蟲(T. cruzi) (SEQ ID NO :7)和巴西利什曼原 蟲(SEQ ID NO :11)的SMTs的氨基酸序列比對，所述氨基酸序列是由其相應的cDNA序列推 斷的。與嬰兒利什曼原蟲SMT匹配的殘基顯示于框中。 圖2表示未經誘導的E. coli溶胞產物(泳道1)、誘導的E. coli溶胞產物(泳道
2) 和純化的嬰兒利什曼原蟲SMT(泳道3)的考馬斯亮藍染色的SDS/4-20X聚丙烯酰胺梯 度凝膠。大小以kDa顯示于左側。 圖3表示杜氏利什曼原蟲(Ld)、嬰兒利什曼原蟲(Li)和碩大利什曼原蟲(Lm)前 鞭毛體所表達的SMT。 圖4表示VL患者對SMT的抗體反應。(A和B)利用ELISA，檢測來自VL患者(n =21)、美洲錐蟲病患者(Cha :n = 10)、地方病健康對照(EC :n = 10)和非地方病健康供體 (n = 6)的血清對rK39 (A)和rSMT (B)的總IgG反應性，并表示出每一個體的0D值。線條 (bars)代表每組的平均值。(C和D)表示的是VL患者(n = 21)和地方病健康對照(n =
3) 的IgG亞類對rK39(C)和rSMT(D)的反應性，并示出每組的平均值和SEM。 圖5表示免疫小鼠對SMT的抗體反應。利用ELISA，評估接種了鹽水、僅MPI^ -SE、僅rSMT或rSMT加MPL⑧_SE的小鼠抗SMT-IgGl和IgG2a的水平。用0. 1的0D值作 為臨界值，計算終點滴度。每組使用3只小鼠，并示出每組終點滴度的平均值和SEM。
圖6表示免疫小鼠在利什曼原蟲抗原剌激下的細胞因子產生。用僅培養(yǎng)基、伴 刀豆球蛋白A(conA) 、 rSMT或SLA體外剌激來自接種了僅鹽水、僅MPL⑧-SE、僅rSMT或 rSMT加MPL⑧-SE的小鼠的脾細胞。剌激72小時后，收集培養(yǎng)物上清液，并利用夾心 ELISA(sandwichELISA)測量上清液中IFN-y (A)禾P IL-10(B)的水平。插圖表示的用不同 比例的SLA剌激時IFN- y反應。示出了每組3只小鼠的平均值和SEM。
圖7顯示了SMT特異性T細胞流式細胞術分析的結果。(A)代表流式細胞術數(shù) 據(jù)。(B)CD4+和CD8+T細胞響應SMT產生的TNF-a 、IL-2和IFN-y 。將來自給予了鹽水、僅 MPL-SE、僅rSMT和rSMT加MPL-SE的小鼠的脾細胞與僅培養(yǎng)基或在rSMT存在的情況下培 養(yǎng)，通過流式細胞術分析細胞因子的產生。(C)對產生多種Thl型細胞因子的CD4+(左側) 和CD8+(右側)T細胞的單細胞分析。 圖8表示通過SMT免疫防御嬰兒利什曼原蟲感染。用嬰兒利什曼原蟲激發(fā)接種了 鹽水、MPl^-SE或rSMT+MPl^-SE的小鼠，并在感染后4周測量脾臟(A)和肝臟(B)中寄生蟲的數(shù)量。示出每組5只小鼠的平均值和SEM。對比鹽水和MPI^-SE兩組，未配對 t檢驗(unpairedt-test)的*P < 0. 05且**P < 0. 01 。這代表具有類似結果的三個獨立實 驗。 圖9表示通過SMT免疫防御碩大利什曼原蟲感染。用碩大利什曼原蟲在耳部激發(fā) 接種了鹽水或rSMT+MP]^^-SE的小鼠。(A)監(jiān)控感染部位的病變發(fā)展，8周。示出每組5 只小鼠的平均值和SEM。 (B)感染后8周，利用有限稀釋測定，評估感染的耳部中寄生蟲的 數(shù)量。線條表示單個組的平均值。這一實驗代表具有類似結果的三個獨立實驗。
序列標識符的描述 SEQ ID N0 :1為嬰兒利什曼原蟲固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO :2為編碼SEQ ID NO :1多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :3為杜氏利什曼原蟲固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :4為編碼SEQ ID NO :3多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :5為碩大利什曼原蟲固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :6為編碼SEQ ID NO :5多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :7為美洲錐蟲固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :8為白色念珠菌(C. albicans)固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的 氨基酸序列。 SEQ ID NO :9_10為用于擴增嬰兒利什曼原蟲SMT可讀框的引物 SEQ ID NO :11為巴西利什曼原蟲固醇24_c_甲基轉移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO :12為編碼SEQ ID NO :11多肽的核酸序列。
發(fā)明的詳細描述 如上文所述，本發(fā)明通常涉及預防、治療和檢測利什曼病的組合物和方法。本發(fā)明 的組合物包括，例如，多肽，其包含利什曼原蟲固醇241-甲基轉移酶(SMT)多肽的至少免 疫原性部分或此類SMT多肽的變體，其中該部分或變體基本上保留了與全長SMT多肽相同 或類似的免疫原性特性。如本文所進一步證明的，使用本發(fā)明組合物的免疫策略為防御嬰 兒利什曼原蟲提供了顯著的體內保護，所述利什曼原蟲是人類及犬科動物的VL致病因子。 此外，利用本發(fā)明組合物所實現(xiàn)的預防效果相對于以前報導的疫苗策略，表現(xiàn)出實質性進 步和優(yōu)勢。 如本文所用，"多肽"包含任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白，其中氨基酸殘基通 過共價鍵連接。包含SMT多肽免疫原性部分的多肽可由免疫原性部分單獨組成，可含有兩 個或多個免疫原性部分和/或可含有另外的序列。另外的序列可衍生于天然利什曼原蟲 SMT多肽或可以是異源的，而且上述異源序列可以(但非必須)是免疫原性的。
利什曼原蟲SMT多肽的免疫原性部分是能在以下情況中誘發(fā)免疫反應(例如細胞 和/或體液免疫)的部分在感染利什曼原蟲不久或曾感染利什曼原蟲的患者(諸如人或 犬)中和/或在分離自感染利什曼原蟲不久或曾感染利什曼原蟲的個體的淋巴結細胞或外 周血單核細胞(PBMC)的培養(yǎng)物中。誘發(fā)反應的細胞可包含各型細胞的混合物或可包含分 離的組成細胞(component cells,包括但不限于，T細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞和/ 或B細胞)。在具體實施方案中，免疫原性部分能誘導T細胞增殖和/或占主導的Thl型細胞因子反應(例如T細胞和/或NK細胞產生的IL-2、 IFN- Y和/或TNF- a ;和/或單核 細胞、巨噬細胞和/或B細胞產生的IL-12)。通?？衫帽绢I域技術人員所知的技術，包括 本文所提供的代表性方法在內，鑒定本文所述的抗原免疫原性部分。 SMT多肽的免疫原性部分基本上可為任何長度，只要它們保留了一個或多個負責 和/或有助于全長SMT多肽所提供的本文所述的防御利什曼病的體內保護作用的SMT免疫 原性部分。在一實施方案中，與天然蛋白相比，免疫原性部分與抗原特異性抗血清反應的能 力可增強或不變，或者與天然蛋白相比，免疫原性部分對抗原特異性抗血清反應的能力可 以有小于50%優(yōu)選小于20%的降低。示例性部分的長度通常為至少10U5、25、50或100 個氨基酸，或者更多，直至并包括全長SMT多肽。在具體實施方案中，SMT多肽的免疫原性 部分為能例如在本文所述的體內測定中，提供防御杜氏利什曼原蟲復合種中利什曼原蟲種 類(Leishmania species)的保護作用的部分，所述杜氏利什曼原蟲復合種即杜氏利什曼原 蟲和/或嬰兒利什曼原蟲，其被認為是人類和犬科動物內臟利什曼病致病因子。
本發(fā)明的組合物和方法也包含上述多肽的變體。本文所用的多肽"變體"是在一 個或多個取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然蛋白的多肽，因此與天然SMT多肽相 比，所需要的變體多肽的免疫原性并沒有實質性降低。在一實施方案中，與天然蛋白相比， 變體與抗原特異性抗血清反應的能力可增強或不變，或者與天然蛋白相比，變體與抗原特 異性抗血清反應的能力可以有小于50%和優(yōu)選小于20%的降低。在具體實施方案中，SMT 多肽變體能例如在本文所述的體內測定中，提供防御杜氏利什曼原蟲復合種即杜氏利什曼 原蟲和/或嬰兒利什曼原蟲中利什曼原蟲種類的保護作用。 變體通?？梢酝ㄟ^修飾上述多肽序列的一種、評估修飾多肽與抗原特異性抗體或 抗血清的本文所述的反應性或進行本文所述的體內保護測定來鑒定。 多肽變體通常包括那些展示了與本文所公開的SMT多肽具有至少約70% 、75%、 80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一'性(例 如，如下文所述所測定的)的多肽。 在某些實施方案中，變體含有保守取代。"保守取代"為用一氨基酸取代另一具有 類似特性的氨基酸的取代，從而肽化學領域的技術人員將預料多肽的二級結構和水性不會 發(fā)生實質性改變。氨基酸取代通常基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兼 性性質的相似性進行。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基 酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的帶有不帶電荷的極性頭部基團的氨基酸包括 亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及絲氨酸、蘇氨酸、 苯丙氨酸和酪氨酸。其他可代表保守改變的氨基酸基團包括(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、 Gln、 Asn、 Ser、 Thr ; (2) Cys、 Ser、 Tyr、 Thr ;(3)Val、 Ile、 Leu、 Met、 Ala、 Phe ;(4)Lys、Arg、 His;和(5)Phe、Tyr、Trp、His。變體也可以或可擇地含有非保守改變。在具體實施方案中， 變體多肽通過5個或更少氨基酸的取代、缺失或添加而不同于天然序列。變體也可以(或 可選地)通過例如氨基酸的缺失或添加進行修飾，所述氨基酸的缺失或添加對多肽的免疫 原性、二級結構和水性的影響最小。 多核苷酸可以包含天然序列(即編碼蛋白或其部分的內源性序列)或可以包含此 類序列的變體或生物學或抗原功能性等同物。如下文進一步所述，多核苷酸變體可以含有 一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選，與天然腫瘤蛋白相比，編碼的多肽的免疫原
7性沒有實質性降低。對編碼的多肽免疫原性的影響可按本文所述進行評估。
當比較多核苷酸或多肽序列時，兩條序列中的核苷酸或氨基酸序列在如下文所述 進行最大相似性比對時如果相同，則這兩條序列被稱為"相同的"。兩條序列的比較通常通 過在比較窗(comparison window)內比較序列以確定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文 所用"比較窗"指至少約20個、通常30個-約75個、40個-約50個連續(xù)位置的節(jié)段，其中 在將兩條序列進行最佳比對后，可將序列可與相同數(shù)量連續(xù)位置的參照序列進行比較。
利用生物信息學軟件(DNASTAR， Inc. ， Madison， WI)Lasergene組中的Megalign
程序，其使用默認參數(shù)，可進行用于比較的序列比對。這一程序所包含的幾個比對方 案描述以下參考文獻中Dayhoff， M. 0. Q978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships,其位于Dayhoff， M. 0.(編 輯)Atlas of ProteinSequence and Structure (蛋白序列禾口結構的圖譜)，National BiomedicalResearch Foundation, Washington DC Vol. 5， S卯pl. 3， pp. 345-358 ; Hein(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol. 183， Academic Press, Inc. ， San Diego， CA ;Higgins and Sharp(1989) CABI0S 5 :151-153 ;Myers， E. W. and Muller W. (1988)CABI0S 4 :11_17 ;Robi固n， E. D. (1971)Comb. Theor 11 :105 ;Santou， N. Nes， M. (1987)Mol. Biol. Evol. 4 :406—425 ; Sneath and Sokal(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of NumericalTaxonomy，F(xiàn)reeman Press,San Francisco, CA ;Wilbur and Lipman(1983)Proc. Natl. Acad. ， Sci. USA 80 :726-730. 可選地，用于比較的序列比對可通過Smith and Waterman(1981)Add. APL Math 2 :482的局部同一性算法、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443的同一性 比對算法、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444的相似性方法 搜索、計算機執(zhí)行這些算法(威斯康辛遺傳學軟件包中的GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA和 TFASTA， Genetics Computer Group (GCG) ， 575 Science Dr. ， Madison， WI)或檢查來進行。
適用于測定百分比序列同 一 性和序列相似性的算法的 一 個實例，是BLAST和 BLAST 2. O算法，其分別描述于Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402和 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中。BLAST和BLAST 2. O可與本文所述的 參數(shù)一起使用，以測定本發(fā)明多核苷酸核和多肽的百分比序列同一性。進行BLAST分析的 軟件可通過國立生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information) 公開獲得。在一示例性的實施方案中，對核苷酸序列，利參數(shù)M(—對匹配殘基的獎勵分；總 是> 0)和參數(shù)N(不匹配殘基的罰分；總是< O)，可計算累積分。對氨基酸序列而言，得分 矩陣可用來計算累積分。每一方向字串搜索(word hits)的延伸在以下情況下終止累積 比對分自其所獲得最大值下降了 X ;由于一個或更多負得分殘基比對的累積而導致的累積 分到達0或0以下；或到達任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定比對的靈敏度 和速度。BLASTN程序(對于核酸序列而言)使用的缺省值為字長(W)ll，期望值(E)10，以 及BL0SUM62得分矩陣(參見Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915)比對，(B) 50，期望值(E) 10， M = 5， N = -4和兩鏈比較。 優(yōu)選地，"序列同一性百分比"通過在至少20個位置的比較窗中比較兩條最佳 比對的序列來測定，其中，對比窗中多核苷酸或多肽序列的部分與用于兩條序列最佳比對的參照序列(其不包含添加或缺失)對相比，可包含20%或更少，通常為5%-15%，或 10% -12%的添加或缺失(即缺口 )。百分比的計算如下測定兩個序列中存在相同核苷酸 堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以產生匹配位置的數(shù)量，匹配位置的數(shù)量除以參照序列中 位置的總數(shù)(即窗口大小)，并將結果乘以ioo產生序列同一性百分比。
因此，本發(fā)明包含與本文所公開的序列具有實質同一性的多核苷酸和多肽，例如 利用本文所述方法(例如，如下文所述采用標準參數(shù)的BLAST分析)，與本發(fā)明的多核苷酸 或多肽序列相比，包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或 更高序列同一性的多核苷酸和多肽。本領域技術人員應當理解，這些值可通過考慮密碼子 簡并性、氨基酸相似性、閱讀框(reading frame)定位等進行適當?shù)恼{整，以測定兩條核苷 酸序列所編碼的蛋白的相應同一性。 在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸和多肽，其包含各種長度的 與本文所公開的一個或多個序列相同或互補的一段連續(xù)序列。例如，本發(fā)明所提供的多 核苷酸包含本文所公開的一個或更多個序列的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、 300、400、500或1000或多個連續(xù)核苷酸，以及其所有中間長度。很容易理解的是，本文中的 "中間長度"表示任何介于引用值之間的長度，諸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、 32等；50、51、52、53等；100、 101、 102、 103等；150、 151、 152、 153等；包括所有貫穿200-500、 5000-1000等的整數(shù)。 本發(fā)明的多核苷酸或其片段，不管編碼序列自身的長度，可與其他的DNA序列結 合，諸如啟動子、多腺苷酸化信號、其他限制酶位點、多克隆位點、其他編碼節(jié)段等，它們的 全長從而可能有顯著差異。因此預計幾乎可使用任何長度的核酸片段，總的長度優(yōu)選以便 于在既定重組DNA試驗方案中制備和使用為限。例如，預計全長長度約10000、約5000、約 3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個等(包括所有中間長度)堿基對的示 例性DNA節(jié)段可用于本發(fā)明的許多實施方案中。 在另一實例中，本發(fā)明涉及能在適度嚴格條件下與本文所提供的多核苷酸序列或 其片段或其互補序列雜交的多核苷酸。雜交技術在分子生物學領域中是熟知的。出于說 明的目的，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的適度嚴格條件包括5X SSC、 0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)溶液中的預洗滌；5(TC _65"下5XSSC雜交過夜；隨后用 每一含有0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65t:下洗滌兩次持續(xù)20分鐘。
而且，本領域普通技術人員應當理解，由于遺傳密碼的簡并性，存在許多編碼本文 所述多肽的核酸序列。這些多核苷酸中的一些產生極小的與任何天然基因的核苷酸序列的 同源性。盡管如此，由于密碼子使用不同而導致差異的多核苷酸是本發(fā)明特別考慮的。此 外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因位于本發(fā)明范圍內。等位基因是由 于一個或多個諸如核苷酸的缺失、添加和/或取代等的突變而改變的內源基因。由此得到 的mRNA和蛋白可以，但不是必須的，具有改變的結構或功能。可應用標準技術(諸如雜交、 擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)鑒定等位基因。 本發(fā)明的另一方面提供了融合多肽以及編碼此類融合多肽的多核苷酸，所述融合 多肽包含SMT多肽的至少免疫原性部分且還包含異源融合伴侶。例如，在一實施方案中，融 合多肽包含SMT多肽的一個或多個免疫原性部分和一個或多個其他的免疫原性利什曼原 蟲序列，所述序列經肽鍵連接成氨基酸單鏈。在另一實施方案中，融合多肽可包含多個利什曼原蟲抗原表位，其中表位中至少一個來源于SMT多肽。如本文所用的"表位"，是與來自利 什曼原蟲感染個體的血液樣本發(fā)生反應的抗原的一部分(即與此類血液樣本中的一種或 多種抗體和/或T細胞特異性結合的表位)。 在另一實施方案中，異源融合伴侶包含輔助提供T輔助細胞表位(免疫融合伴 侶)、優(yōu)選人識別的T輔助細胞表位，或輔助表達比天然重組蛋白產量更高的蛋白(表 達增強子)的序列。某些優(yōu)選的融合伴侶包括免疫融合伴侶和表達增強融合伴侶兩 者?？蛇x擇其他融合伴侶來增加蛋白的溶解度，或使蛋白靶向于所期望的細胞內區(qū)室 (compartments)。更多的融合伴侶包括促進蛋白純化的親和標簽。 在一具體實施方案中，免疫融合伴侶包含衍生于D蛋白的序列，D蛋白是衍生于革 蘭氏陰性菌B型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza B) (W091/18926)的表面蛋白。例 如，D蛋白衍生物包含該蛋白的前三分之一 (例如N末端的前100-110個氨基酸)，D蛋白 衍生物可進行脂質修飾。在某些實施方案中，N末端上包括D脂蛋白融合伴侶的前109個 殘基，以提供具有其他外源性T細胞表位的多肽和增強在E. coli中的表達水平(從而發(fā)揮 表達增強子的功能)。脂質尾部確保抗原對抗原呈遞細胞的最佳呈遞。其他示例性融合伴 侶包括源于流感病毒的非結構性蛋白即NS1 (血凝素)。盡管也可以使用包括T輔助細胞表 位的不同片段，但通常使用N末端的81個氨基酸。 在另一具體實施方案中，免疫融合伴侶包含衍生于稱為LYTA蛋白或其一部分(優(yōu) 選C末端部分)的氨基酸序列。LYTA衍生于肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)，其 合成稱為LYTA酰胺酶的N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gene (1986) 43 : 265-292)。 LYTA是特異性降解肽聚糖主鏈中某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C末端結構域 負責對膽堿或一些諸如DEAE的膽堿類似物的親和性。這一特性已用于研發(fā)可用來表達融 合蛋白的E.coli C-LYTA表達質粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的雜合蛋白的純化已有 描述(見Biotechnology (1992) 10 :795-798)。在具體實施方案中，LYTA的重復部分可并 入融合蛋白中。在始于殘基178處的C末端區(qū)發(fā)現(xiàn)重復部分。更具體的重復部分合并殘基 188-305。 融合序列可直接連接(即無插入氨基酸)或可經由不顯著減少組成多肽的免疫原 性特性的連接體序列連接(例如，Gly-Cys-Gly)。形成融合蛋白的多肽通常連接C末端到 N末端，盡管它們也可以連接C末端到C末端、N末端到N末端或N末端到C末端。融合蛋 白的多肽可以任何順序排列。融合多肽或融合蛋白也可包括保守修飾變體、多態(tài)性變體、等 位基因、突變體、子序列、種間同系物和構成融合蛋白的抗原的免疫原性片段。
通?？蓱冒ㄖ亟M技術、化學連接等標準技術制備融合多肽。例如，編碼融合物 多肽組分的DNA序列可單獨組裝然后連接到合適的表達載體上。將編碼一多肽組分的DNA 序列的3'末端，經或不經肽連接體，連接于編碼另一多肽組分的DNA序列的5'末端，因此 序列的閱讀框在框架中。這可允許翻譯為保留組分多肽生物學活性的單一融合多肽。
肽連接體序列可用于以足以確保每一多肽折疊成其所需要的二級和/或三級結 構的距離，分隔融合組分。利用領域所熟知的標準技術，可將此類肽連接體序列合并入融合 多肽中。合適的肽連接體序列可基于以下一個或多個因素進行選擇(l)它們采用彈性延 伸構象的能力；(2)它們不能采用能與第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二級結構 的能力；和(3)可與多肽功能表位相互作用的疏水或帶電荷殘基的缺乏。某些優(yōu)選的肽連接體序列包含Gly、 Asn和Ser殘基。其他近中性氨基酸，諸如Thr和Ala也可用于連接體 序列中?？捎行в米鬟B接體使用的氨基酸序列包括下述文獻中所公開的那些氨基酸序列 Maratea et al. ， (1985)Gene 40 :39-46 ;Murphy et al. ， (1986)Proc. Natl. Acad. Sci USA 83 :8258-8262 ;美國專利第4， 935， 233號和美國專利第4， 751， 180號。連接體序列的長度 通常為1個_約50個氨基酸。當?shù)谝换虻诙嚯木哂锌捎糜诜指艄δ芙Y構域和防止空間 干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)域時，連接體是不需要的。 將連接的DNA序列可操作地連接于合適的轉錄或翻譯調節(jié)元件。負責DNA表達的 調節(jié)元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'端。同樣，終止翻譯所需的終止密碼子和轉 錄終止信號只存在于編碼第二個多肽的DNA序列的3'端。 通常，分離多肽和融合多肽(及編碼它們的多核苷酸)。"分離的"多肽或多核苷 酸為自其初始環(huán)境中移除的多肽或多核苷酸。例如，如果從一些或所有的自然系統(tǒng)中共存 的物質中分離天然存在的蛋白質，那么這種天然蛋白為分離的。優(yōu)選地，此類多肽的純度為 至少約90% ，更優(yōu)選至少約95% ，和最優(yōu)選至少約99% 。如果，例如將多核苷酸克隆到一個 不是其自然環(huán)境的一部分的載體中，則認為這種多核苷酸是分離的。 本發(fā)明的利什曼原蟲SMT多肽和多核苷酸可利用多種方法中的任何方法或利什 曼原蟲種類中的任何種類制備或分離，所述利什曼原蟲種包括但不只限于，杜氏利什曼原 蟲、恰氏利什曼原蟲(L. chagasi)、嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、亞馬遜利什曼原蟲 (L. amazonensis)、巴西利什曼原蟲、巴拿馬利什曼原蟲(L. panamensis)、墨西哥利什曼原 蟲(L. mexicana)、熱帶利什曼原蟲(L. tropica)和圭亞那利什曼原蟲(L. guyanensis)。此 類種類可從例如美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC) (Rockville，MD)獲得。
不管采用何種制備方法，本文所述的SMT多肽優(yōu)選是免疫原性的。換言之，多肽 (和其免疫原性部分)能在分離于感染利什曼原蟲不久或或曾經感染利什曼原蟲的個體的 淋巴結細胞和/或外周血單核細胞(PBNC)的培養(yǎng)物中誘發(fā)免疫反應。更準確地說，抗原和 其免疫原性部分具有在分離于感染利什曼原蟲不久或曾經感染利什曼原蟲的個體的細胞 中誘導T細胞增殖和/或誘發(fā)占主導地位的Thl型細胞因子應答(例如，T細胞和/或NK細 胞產生IL-2、IFN-Y和/或TNF-a ;和/或單核細胞、巨噬細胞和/或B細胞產生IL-12)。 利什曼原蟲感染的個體可以患有利什曼病型癥狀(諸如亞臨床的、皮膚的、粘膜的或活躍 的內臟的)或可能無癥狀的。此類個體可利用技術領域普通技術人員所知的方法鑒定。基 于與下述至少之一相關的臨床發(fā)現(xiàn)，鑒定個體患有利什曼病寄生蟲病變處的分離，利什曼 原蟲溶胞產物的陽性皮膚測試或陽性血清學測試。無癥狀的個體是沒有疾病體征或癥狀的 感染個體。此類個體可以基于陽性血清學測試和/或利什曼原蟲溶胞產物皮膚測試進行鑒 定。 術語"PBMC"指主要由存在于外周血中的淋巴細胞和單核細胞組成的有核細胞的 制劑，即包含細胞混合物又包含一種或多種純化細胞類型制劑。PBMC可通過本領域中已知 的方法分離。例如，PBMC可經密度離心法通過例如Ficoll (Winthrop Laboratories,New York)分離。淋巴結培養(yǎng)物通?？赏ㄟ^用在弗氏完全佐劑中乳化的利什曼原蟲前鞭毛體免 疫BALB/c小鼠(例如在足墊后部)來制備。免疫后可切除引流淋巴結。T細胞可在抗小 鼠Ig柱中純化來移除B細胞，隨后穿過交聯(lián)葡聚糖凝膠G10(S印hadex G10)柱移除巨噬細 胞。同樣，進行淋巴結活檢或者手術衣櫥后，淋巴結細胞可從人體分離。
例如，將細胞與SMT多肽接觸然后測量合適的反應，可評估利什曼原蟲SMT多肽，或其部分、變體或融合物誘發(fā)外周血單核細胞(PBMC)或淋巴結細胞培養(yǎng)物反應的能力。通常，足夠用于評估約2乂105個細胞的多肽數(shù)量范圍為約10ng-約lOOiig，且優(yōu)選約l-10yg。多肽與細胞的孵育通常在37t:進行，持續(xù)約l-3天。與多肽一起孵育后，測定細胞的適當反應。如果該反應是增殖反應，則可以使用本領域普通技術人員所熟知的多種技術中的任何技術。例如，可將細胞暴露于放射性胸苷的脈沖下，并測量摻入細胞DNA中的標記物。通常，可導致增殖增加超過背景(即在未用多肽培養(yǎng)的細胞中所觀察到的增殖)至少3倍的多肽，被認為能誘導增殖。 可選地，待測量的反應可以是一種或多種細胞因子(如干擾素-y (IFN-y)、白細胞介素_4 (IL-4)、白細胞介素-12 (p70和/或p40)、白細胞介素_2 (IL-2)和/或腫瘤壞死因子-a (TNF- a ))的分泌或編碼一種或多種特異性細胞因子的mRNA水平的變化。例如，干擾素_ y 、白細胞介素_2、腫瘤壞死因子_ a和/或白細胞介素-12的分泌預示著Thl反應，Thl反應負責防御利什曼原蟲的保護作用。通常可利用本領域普通技術人員已知的方法，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，對任何上述細胞因子進行測定。此類測定中所使用的合適的抗體可從多種來源獲得，如Chemicon、Temucula，CA和PharMingen San Diego CA獲得，且通常按照制造商的說明書使用。編碼一種或多種特異性細胞因子的mRNA水平，可通過例如聚合酶鏈式反應(PCR)擴增來評價。通常，在約1-3乂105個細胞制劑中，能誘導產生30pg/mL的IL-12、 IL_4、 IFN- y 、 TNF- a或IL-12p40，或10pg/mL的IL-12p70的多肽，被認為能剌激細胞因子的產生。 利用熟知的技術，如Paul, Fundamental Immunology (基礎免疫學)，3rd ed.(第三版)，243-247 (Raven Press, 1993)中總結的技術和其引用的參考文獻中的技術，可制備和評價利什曼原蟲SMT多肽的免疫原性部分。此類技術包括利用例如本文所述的代表性技術篩選衍生于天然抗原的多肽的免疫原性特性。 除了重組多肽表達外，SMT多肽、部分和變體可通過合成或重組方法產生?？衫帽绢I域普通技術人員所熟知的技術產生具有少于約100個氨基酸，通常少于約50個氨基酸的合成多肽。例如，可利用任何商業(yè)上可獲取的諸如Merrifield固相合成方法的固相技術合成此類多肽，其中將氨基酸依次添加到逐漸增長的氨基酸鏈上(參見Merrifield，(1963)J Am. Chem. Soc. 85 :2149-2146)。自動合成多肽的設備可自諸如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division,Foster City， CA等供應商處商購獲得，并可按照制造商的用法說明操作。 含有天然SMT多肽的部分和/或變體的重組多肽，可利用熟知和確定的技術自編碼抗原的DNA序列中很容易地制備。例如，來自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的合適的宿主/載體系統(tǒng)的上清液，可首先利用商購獲得的過濾器濃縮。濃縮后，可將濃縮物應用于諸如親和性基質或離子交換樹脂等合適的純化基質中。 通常，可使用本領域普通技術人員所知的多種表達載體中的任何表達載體來表達本發(fā)明的重組多肽?？稍谟冒幋a重組多肽的多核苷酸的表達載體轉化或轉染的任何合適的宿主細胞中實現(xiàn)表達。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞和高等真核細胞。優(yōu)選，所用的宿主細胞為E. coli、酵母或諸如COS或CHO的哺乳動物細胞系。以這種方式表達的DNA序列可編碼天然存在的抗原、天然存在的抗原的一部分，或其其他變體。例如，天然
12抗原的變體通?？衫弥T如寡核苷酸定點特異性誘變的標準誘變技術制備，而且可移除部分DNA序列以允許制備截短的多肽。 在某些方面，將本文所述的多肽、多核苷酸、部分、變體、融合多肽等并入藥物組合物或疫苗中。藥物組合物通常包含與生理學可接受載體組合的本文所述的一種或多種多肽、多核苷酸、部分、變體、融合蛋白等。疫苗，也稱為免疫原性組合物，通常包含與諸如佐劑免疫剌激劑組合的、本文所述的一種或多種多肽、多核苷酸、部分、變種、融合蛋白等。
免疫剌激劑可以是提高或強化針對外源性抗原的免疫反應(抗體和/或細胞介導的)的任何物質。免疫剌激劑的實例包括佐劑、生物可降解的小球體(例如聚乳酸乳液(polytactic galactide))和脂質體(將化合物并于其中，參見例如Fullerton的美國專利第4， 235， 877號)。疫苗制劑通常描述于例如Powell & Newman ， eds. ， Vaccine Design(thesub皿itend adj證nt即proach)(疫苗設計(亞單位禾口佐劑方法))(1995)。
多種免疫剌激劑中的任何免疫剌激劑都可用于本發(fā)明的疫苗中。例如佐劑可以包括其中。許多佐劑包含有適于保護抗原避免遭快速代謝的諸如氫氧化鋁或礦物油的物質，和諸如脂質A(天然的或合成的)、百日咳桿菌(Bortadella pertussis)或分支桿菌(Mycobacterium)種類或分支桿菌來源的蛋白的免疫反應剌激劑。合適的佐劑是可商購獲得，例如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, Mich.) ;Merck佐劑65(Merck and Company, Inc. ，Rahway，N. J) ;AS-2禾口其衍生物(GlaxoSmithKline Beecham，Philadelphia, Pa.) ;CWS、 TDM、白細胞干擾素，諸如氫氧化鋁凝膠(明砜)或磷酸鋁的鋁鹽；鈣、鐵或鋅的鹽；酰化酪氨酸的不可溶性懸浮液；?；牵魂栯x子型或陰離子型多糖衍生物；磷腈；生物可降解的小球體；單磷酰脂質A和皂苷A。也可使用諸如GM_CSF或白細胞介素_2、7或12的細胞因子，作為佐劑。 可用于本發(fā)明的其他示例性佐劑包括，諸如TLR7激動劑、TLR7/8激動劑等Toll樣受體激動劑。其他示例性佐劑還包括咪喹莫德(imiquimod)、 gardiquimod、瑞喹莫德(resiquimod)禾口相關4t合物。 某些優(yōu)選的疫苗使用適于誘導Thl型占主導的免疫反應的佐劑系統(tǒng)。高水平的Thl型細胞因子(例如IFN-y 、 TNF-a . 、 IL_2和IL-12)傾向于加強誘導針對所給予的抗原的細胞介導的免疫反應。與此相反，高水平的Th2型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于加強誘導體液免疫反應。應用本文所提供的疫苗后，患者將維持包括Thl型和Th2型反應在內的免疫反應。在Thl型反應為主導的優(yōu)選實施方案中，Thl型細胞因子的水平提高到高于Th2型細胞因子水平的程度?？蓱脴藴蕼y定方便地評估這些細胞因子的水平。有關細胞因子家族的綜述，參見Mossman和Coffman， (1989) Ann. Rev. Immunol. 7 :145-173。 可用于誘發(fā)占主導的Thl型反應的某些佐劑包括，例如單磷酰脂質A優(yōu)選3-脫氧?；瘑瘟柞Ｖ|A(3D-MP1")與鋁鹽(美國專利第4，436，727號、第4，877，611號、第4， 866， 034號和第4， 912， 094號)的組合。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導占主導的Thl反應。此類寡核苷酸是所熟知的，并描述于WO 96/02555、W099/33488和美國專利第6， 008， 200號和第5， 856， 462號中。免疫剌激性DNA序列也有描述，例如由Sato et al. ， (1996) Science 273 :352描述。另一示例性的佐劑包含諸如皂苷A的皂苷或其衍生物，包括QS21禾口 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc. ，F(xiàn)ramingham，Mass.);七葉皂苷(escin);洋地黃皂苷(digitonin);或絲石竹(Gypsophila)或昆諾藜(Chenopodiumquinoa)皂苷。其他示例性的制劑包括本發(fā)明佐劑組合中的一種以上皂苷，所述佐劑組合例如QS21、 QS7、皂苷A、 13 -七葉皂苷或洋地黃皂苷中至少兩種的組合。 在具體實施方案中，佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質A和皂角苷衍生物的組合，諸如在WO 94/00153所述的QS21和3D-MPL 佐劑的組合，或如W0 96/33739所述的不良反應小的組合物，其中QS21被膽固醇所淬火。其他制劑包含水包油乳劑和維生素E。 W0 95/17210中描述了另一種使用QS21、3D-MP1"佐劑和水包油乳劑中的維生素E的佐劑制劑。
另一種加強型佐劑系統(tǒng)包括WO 00/09159所述的含CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的組合。 在某些優(yōu)選的具體實例中，本發(fā)明所用的佐劑為未決的美國專利申請公開第20080131466號所述的吡喃葡糖脂質A(GLA)佐劑，在此通過引用將其所公開的內容全部并入。 其他示例性的佐劑包括Montanide ISA 720 (S印pic， France) 、 SAF (Chiron，Calif ， United States) 、 ISC0MS(CSL) 、 MF-59 (Chiron) 、 SBAS佐劑系列(SBAS_2、 AS2 '、AS2 〃 、 SBAS-4或SBAS6，可自SmithKlineBeecham， Rixensart， Belgium獲得)、Detox、RC-529 (Corixa， Hamilton, Mont)，和未決的美國專利申請序列第08/853,826號和第09/074， 720號所述的其他氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸鹽(AGPs)(在此通過引用將兩者所公開的內容全部并入)，以及W099/52549A1所述的聚氧乙烯乙醚佐劑。 本發(fā)明的組合物也可以或可選地包含對利什曼原蟲SMT抗原具特異性的T細胞。通?？稍隗w內或體外利用標準方法制備此類細胞。例如，T細胞可從患者的骨髓、外周血或部分骨髓或外周血中分離?？蛇x地，T細胞可衍生于相關的或不相關的人類、非人類哺乳動物、細胞系或培養(yǎng)物。 可用本發(fā)明的多肽、編碼此類多肽的多核苷酸和/或表達此類多肽的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell, APC)剌激T細胞。此類剌激在一定條件下進行，持續(xù)的時間足以允許對多肽具有特異性的T細胞傳代。優(yōu)選地，多肽或多核苷酸存在于諸如小球體的運輸載體中，以易于特異性T細胞的傳代。 如果T細胞特異性增殖、分泌細胞因子或殺傷包被有多肽或編碼該多肽的表達基因的靶細胞，則認為T細胞對本發(fā)明的多肽具特異性。可利用標準技術中的任何技術評估T細胞的特異性。例如，在鉻釋放測定或擴展測定中，與陰性對照相比，剌激指數(shù)在溶解和/或增殖中增加兩倍以上，預示T細胞特異性。例如可按Chen et al. ， (1994)CancerRes. 54 :1065-1070)中所述，進行此類測定?？蛇x地，可利用多種已知技術實現(xiàn)T細胞增殖檢測。例如，可通過測量DNA合成的增加來檢測T細胞增殖(例如，通過用含氚的胸腺嘧啶脈沖標記T細胞培養(yǎng)物，并測量摻入DNA中的含氚的胸腺嘧啶的量)。與本發(fā)明的多肽(100ng/ml-100 ii g/ml，優(yōu)選200ng/ml-25 y g/ml)接觸3_7天，應該會導致T細胞增殖增加至少兩倍。如上所述的接觸2-3小時，應該會導致T細胞激活，這是利用標準細胞因子測定來測量的，其中細胞因子(例如TNF或IFN-y)釋放水平增加2倍預示著T細胞激活(參見Coliganet al. ， (1998)Current Protocols in Immunology,vol. 1)。 口向應多肽、多核苷酸或表達多肽的APC而激活的T細胞，可以是CD4+和/或CD8+。蛋白特異性T細胞可利用標準技術擴增。在優(yōu)選的實施方案中，T細胞來源于患者、相關供體或無關供體，并在剌激和擴增后，給予所述患者。 在本發(fā)明的組合物中，藥學可接受的賦形劑和載體溶液的配制，對本領域技術人
員而言是熟知的，如同在多種治療方案中，包括例如口月艮，胃腸夕卜，靜脈內，鼻內和肌肉內給
藥和制劑在內，為使用本文所述的具體組合物探索合適的劑量給藥和治療方案。 在某些應用中，本文所公開的組合物可經口服給藥送遞至個體。就此而論，這些組
合物可以用惰性稀釋劑或用可吸收的可食用載體配制，或它們可包于硬殼或軟殼明膠膠囊
中，或它們可壓縮成片劑，或它們可以直接摻入到膳食食品中。 在某些情況下，希望本文所公開的組合物送遞方式為胃腸外、靜脈內、粘膜內，或甚至腹膜內，例如如美國專利第5， 543， 158號、美國專利第5， 641， 515號和美國專利第5， 399， 363號所述(在此特別通過引用將每個專利全文并入)。作為游離堿或藥學可接受的鹽的活性成分的溶液，可在與諸如羥基丙基纖維素的表面活性劑適當混合的水中制備。分散劑也可在甘油、液態(tài)聚乙二醇和其混合物中以及在油中制備。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑含有防止微生物生長的防腐劑。 適于注射使用的藥物劑型(pharmaceutical form)包括無菌水溶液或分散劑和用于臨時制備無菌注射液或分散劑的無菌粉末(美國專利第5， 466， 468號，在此將其通過引用全文并入)。任何情況下，劑型必須為無菌的且流動性達到易于注射的程度。在制造和儲存情況下，它必須是穩(wěn)定的，且必須預防諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油的分散介質。例如，通過使用諸如卵磷脂的包被，在分散劑的情況下通過維持所需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑，可維持適當?shù)牧鲃有?。通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳滎(thimerosal)等，可促進對微生物作用的防御。許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。在組合物中使用延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠，可以使可注射組合物的吸收延長。
為實現(xiàn)胃腸外水溶液給藥，例如，如果需要，應適當?shù)鼐彌_溶液，并且首先用足夠鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些具體的水溶液尤其適用于靜脈內的、粘膜內的、皮下和腹膜內給藥。因此，按照本發(fā)明的公開內容，能使用的無菌水性介質對本領域技術人員而言是已知的。例如，一次劑量可溶解于lml的等滲NaCl溶液中，或也可添加到1000ml皮下輸液或注射到推薦的輸注部位(例如見Remington' sPharmaceutical Sciences(雷明頓藥物學)，15th Edition,卯.1035-1038和1570-1580)。依照所治療個體的情況，必然存在劑量上的某些差異。負責給藥的人員在任何情況下都確定單個個體的合適劑量。而且，對于對人給藥，制劑應當滿足無菌、熱原性和FDA生物制品標準辦公室(FDA Office ofBiologies standards)所要求的一般安全性和純度標準。 無菌注射溶液的制備如下通過將所需數(shù)量的活性化合物與上文所列舉的其他組分一起并入到適當?shù)娜軇┲校绻枰?，隨后過濾滅菌。通常，通過將各種已滅菌的活性組分并入到包含基礎分散介質和上文所列舉的所需要的其他組分的無菌媒介(sterilevehicle)中，制備分散劑。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，這可產生活性組分與其早前無菌過濾的溶液中的任何其他所需組分的粉末。 本文公開的組合物可配制成中性的或鹽的形式。藥學可接受的鹽包括酸式加成鹽
15(由蛋白的游離氨基基團形成的)和由例如如同鹽酸、磷酸的無機酸或如同乙酸、草酸、酒 石酸、苦杏仁酸等有機酸形成。游離的羧基基團形成的鹽也可以衍生于諸如氫氧化鈉、氫氧 化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等無機堿和如同異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等 有機堿。配制后，溶液將以與制劑劑量相配伍的方式并以治療有效量給藥。制劑易于采用 多種劑型給藥，諸如可注射的溶液、藥物釋放膠囊等劑型。 本文所用的"載體"包括，任何和所有的溶劑、分散劑、介質、媒介、包被、稀釋劑、抗 菌和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑、緩沖液、載體溶液、懸浮液、膠體等。此類介質和試劑 在藥物活性物質中的用途，在本領域內是熟知的。除了任何常規(guī)介質或試劑與活性組分不 相容外，其在治療組合物中的應用是經過考慮的。輔助活性組分也可以并入組合物中。
短語"藥學可接受的"指當給予人時不會產生變態(tài)反應或類似的不良反應的分子 實體和組合物。包含作為活性成分的蛋白的水性組合物的制備，在本領域內業(yè)已充分理解。 通常將此類組合物制成可注射的液態(tài)溶液或懸浮液；也可以制備注射前適于液體溶液或懸 浮液的固體形式。也可以乳化制劑。 在某些實施方案中，組合物可經鼻內噴霧、吸入和/或其他氣霧劑送遞媒介送遞。 將基因、多核苷酸和肽組合物經鼻內氣霧劑噴霧直接送遞至肺部的方法，已描述于例如美 國專利第5， 756， 353號和美國專利第5， 804， 212號(在此特地將每一專利通過引用全文并 入)中。同樣，利用鼻內微粒體樹脂送遞藥物(Takenaga et al. ， 1998)和溶血磷脂丙三 醇化合物(美國專利第5， 725， 871號，在此特地將其通過引用全文并入)，在藥學領域內也 是所熟知的。同樣，采用聚四氟乙烯支持基質的形式的跨粘膜藥物送遞描述于美國專利第 5， 780， 045號(在此特地將其通過引用全文并入)中。 在某些實施方案中，送遞可利用脂質體、納米膠囊、微粒、小球體、脂質顆粒、小囊 泡等發(fā)生，以便將本發(fā)明的組合物引入到合適的宿主細胞。尤其是，可配制本發(fā)明的組合 物，用于封入脂質顆粒、脂質體、小囊泡、納米球、納米顆粒等送遞。應用已知的和常規(guī)技術 可此類送遞媒介的配制和應用。 藥物或免疫原性組合物可以可選地含有免疫剌激劑和編碼一個或多個上文所述 的多肽或融合蛋白的DNA分子，以便原位產生所需要的多肽。在此類組合物中，DNA可存在 于本領域普通技術人員所知的多種送遞系統(tǒng)中的任何送遞系統(tǒng)中，包括核酸表達系統(tǒng)、細 菌和病毒表達系統(tǒng)。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)含有在患者中表達必需的DNA序列(諸如合適 的啟動子和終止信號)。細菌送遞系統(tǒng)包括給予在其細胞表面表達多肽的免疫原性部分的 細菌(如卡介苗)。在具體實施方案中，DNA可利用病毒表達系統(tǒng)(例如牛痘或其他牛病 毒、逆轉錄病毒或腺病毒)引入，這包括非致病的(缺陷的)、具有復制能力的病毒。將DNA 并人此類表達系統(tǒng)的技術，對本領域普通技術人員而言是熟知的。DNA也可以是"裸的"， 例如如Ulmer et al. ， (1993) Science259 :1745-1749所述和Cohen， (1993) Science 259: 1691-1692所評述的。通過將DNA包被到生物可降解的有效轉運到細胞的珠上，可增加裸 DNA的吸收。 本發(fā)明的藥物組合物和疫苗也可用于，例如誘導諸如人或犬的患者防御利什曼原 蟲的保護性免疫，以預防利什曼病或減小其嚴重性。組合物和疫苗也可用于剌激患者的細 胞和/或體液的免疫反應以治療已感染的個體。在一實施方案中，對利什曼原蟲感染患者 而言，所產生的免疫反應包括優(yōu)先的Thl免疫反應(即以產生細胞因子白細胞介素1、白細反應)。在另一實施方案中，對未感染的患者而言，免疫反應包括產生白細胞介素12和/或白細胞介素2，或剌激Y S-T細胞。在任一類型的患者中，所剌激的反應可包括產生IL-12。此類反應也可來自自利什曼原蟲感染或未感染個體的PBMC或其組分的生物樣本中誘導。如以上所述，通常可利用本領域普通技術人員所知的諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的方法對以上任何細胞因子及其他已知的細胞因子進行測定。 技術人員利用本領域中可獲得的知識和/或常規(guī)技術，可容易地確定用于這些目的的合適的給藥劑量和給藥方法。用于本發(fā)明以上方面的給藥途徑和頻率及劑量因人而異，而且可以與在抗其他感染的免疫中正用的并行，所述其他感染如包括原生動物、病毒和細菌感染。例如，在一實施方案中，在l年周期內給予1-12劑量。此后根據(jù)需要或期望，定期進行加強接種。當然對個體患者而言替換方案是適當?shù)?。在具體實施方案中，合適的劑量為當如以上所述給藥時，能誘發(fā)免疫的患者產生足以保護患者免遭利什曼病至少1-2年的免疫反應的多肽或DNA的量。通常，劑量中存在的多肽的量(或由劑量中的DNA原位產生)范圍為宿主每kg約lOOng-約lmg，通常約10 y g-約100 y g。合理的劑量大小因患者體量不同而各異，但通常在約0. lml-大約5ml內變動。 SMT組合物、融合多肽和多核苷酸也用作檢測和/或監(jiān)控患者利什曼原蟲感染的診斷試劑。例如，本發(fā)明的組合物、融合多肽和多核苷酸可用于檢測抗利什曼原蟲的體液抗體或細胞介導的免疫的體外和體內測定中，用來診斷感染、監(jiān)控疾病進展或評估治愈訪視(test-of-cure)。 診斷方法和試劑盒優(yōu)選使用SMT多肽、部分、變體等，選擇性地與一種或多種其他利什曼原蟲抗原組合。在某些實施方案中，在本發(fā)明的診斷方法中優(yōu)選使用本文所述的多種抗原，例如3種或更多，4種或更多，5種或更多，6種或更多等。基本上抗原可用于所期望的任何測定形式，例如分別測定的單個抗原，同時測定的多種抗原，固定在諸如陣列等固體支持體上的抗原。 在一實施方案中，提供了用于檢測生物樣本中利什曼原蟲感染的診斷試劑盒，其包含(a)包含本文所述SMT多肽的至少一個免疫原性部分的多肽，和(b)檢測試劑。
在另一實施方案中，提供了用于檢測生物樣本中利什曼原蟲感染的診斷試劑盒，其包含(a)對多肽具有特異性的抗體或其抗原結合片段，所述多肽包含本文所述SMT多肽的至少一個免疫原性部分，和(b)檢測試劑。 在另一實施方案中，提供了用于檢測生物樣本中利什曼原蟲感染存在的方法，其包含(a)將生物樣本與結合本文所述SMT多肽的單克隆抗體接觸；和(b)檢測生物樣本中結合該單克隆抗體的利什曼原蟲蛋白的存在。 存在本領域普通技術人員所知的多種測定形式，用來利用純化的抗原或融合多肽檢測樣本中的抗體。參見例如Harlow and Lane， Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Cold SpringHarbor Laboratory, 1988。在一實施方案中，測定包括用固定于固體支持體上的多肽結合并移除樣本中的抗體。然后利用結合抗體/多肽復合體和含有可檢測的報道基團的檢測試劑，檢測結合的抗體。合適的檢測試劑包括結合抗體/多肽復合體的抗體和標記有報道基團的游離多肽(即在半競爭性測定中)。可選地，可應用競爭性測定，其中用報道基團標記與多肽結合的抗體，并在該抗原與樣本一起孵育后，允許其與固定的抗原結合。樣本組分抑制標記的抗體與多肽結合的程度，預示樣本與固定的多肽的反應性。 固體支持體可為本領域普通技術人員所知的，可附著抗原的任何固體材料。例如，固體支持體可為微量滴定板或硝基纖維或其他合適的薄膜中的檢測孔(test well)。可選地，支持體可以是諸如玻璃、玻璃纖維、膠乳的珠或盤，或諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料材料。支持體也可以是磁性顆?；蚶w維光學傳感器，諸如例如美國專利第5， 359， 681號中所公開的。 利用本領域已知且可獲得的多種技術中的任何技術，可將多肽結合于固體支持載體上。術語"結合"既指諸如吸附的非共價連接和共價鍵合(其可以為抗原與支持體上的功能基團的直接鍵合，或可以為借助交聯(lián)劑的鍵合)。優(yōu)選經吸附結合于微量滴定板或薄膜中的？L。在這種情況下，通過在合適的緩沖液中將多肽與固相載體接觸適當?shù)臅r間，實現(xiàn)吸附。 在某些實施方案中，所用的診斷測定為酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。這一測定可通過以下步驟進行首先將已固定于固體支持體上的多肽抗原與樣本接觸，固相載體通常為微量滴定板的孔，如此以來，允許樣本中多肽的抗體與固定的多肽結合。然后自固定的多肽中移除未結合的樣本，并添加能與固定的抗體-多肽復合體結合的檢測試劑。然后利用合適的用于特異性檢測試劑的方法，測定仍然與固體支持體結合的檢測試劑的量。
—旦多肽固定于支持體上，通常就阻斷了支持體上剩余的蛋白結合位點。本領域普通技術人員所知的任何合適的封閉劑，諸如牛血清白蛋白或吐溫2(T(Sigma ChemicalCo. ，St. Louis，M0)。然后將固定的多肽與樣本一起孵育，允許抗體(如果樣本中存在的話)與抗原結合。在孵育前，樣本可用合適的諸如磷酸鹽緩沖液(PBS)等稀釋劑稀釋。通常，合適的接觸時間(即孵育時間)為足以在感染的樣本中檢測針抗利什曼原蟲的抗體存在的時間段。優(yōu)選地，接觸時間為足以實現(xiàn)結合抗體與未結合抗體間平衡時所實現(xiàn)的結合水平的至少95%的時間段。本領域普通技術人員應當理解，實現(xiàn)平衡所需要的時間可易于通過測定一定時間內發(fā)生的結合水平來測定。室溫下，約30分鐘的孵育時間通常是足夠的。
通過用諸如含有O. 1X吐溫20TM的PBS的合適緩沖液洗滌固相載體，可移除未結合的樣本。隨后可將檢測試劑添加到固體支持體中。合適的檢測試劑為可與固定的抗體-多肽復合體結合，并可利用本領域技術人員所知的多種方法檢測中的任何方法檢測的任何化合物。檢測試劑通常含有與報道基團結合的結合劑(諸如，例如，蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、植物凝集素或游離抗原)。示例性的報道基團包括酶(諸如辣根過氧化物酶)、基質、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團、熒光基團和生物素。結合劑與報道基團的結合可利用本領域普通技術人員所知的標準方法來實現(xiàn)。 然后將檢測試劑與固定的抗體-多肽復合體一起孵育，持續(xù)足以檢測結合的抗體的時間量。合適的時間量通常根據(jù)制造商的用法說明或經測定一段時間內發(fā)生的結合水平來測定。然后移去未結合的檢測試劑，并利用報道基團檢測結合的檢測試劑。檢測報道基團所使用的方法取決于報道基團的性質。對于放射性基團而言，閃爍計數(shù)或放射自顯影方法通常是合適的。光譜方法可用來檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團。利用耦合于不同報道基團(通常為放射性基團或熒光基團或酶)的抗生物素蛋白，可檢測生物素。通常通過添加基質(通常持續(xù)特定的一段時間)，隨后進行反應產物的光譜分析或其他分析，來檢測酶報道基團。 為了測定樣本中是否存在利什曼原蟲抗體，通常將從仍然與固體支持體結合的報道基團中所檢測的信號，與對應于預測定的臨界值(cut-off value)的信號比較。臨界值優(yōu)選地為當固定的抗原與未感染患者來源的樣本一起孵育時所獲得的信號的平均值。通常，樣本產生的信號高于平均值三個標準偏差以上，即可認為該樣本是利什曼原蟲抗體和利什曼原蟲感染陽性的。在另一實施方案中，按照Sackett et al. ，Clinical Epidemiology :ABasic Science for Clinical Medicine,p. 106-7(Xittle Brown and Co. ， 1985)的方法，利用受試者工作特征曲線(Receiver Operator Curve)，測定臨界值。簡而言之，在本實施方案中，臨界值可由真性陽性率(例如靈敏度)和假性陽性率(100%特異性)配對曲線確定，所述曲線對應于用于診斷檢測結果的每個可能的臨界值。曲線上最靠近左上角的臨界值(即圍繞著最大區(qū)域的值)為最準確的臨界值，樣本產生的信號高于這一方法所測定的界限值，即可認為該樣本為陽性的?？蛇x地，可將臨界值沿曲線移到左側，以使假性陽性率最小，或移到右側，以使假性陰性率最小。通常，樣本產生的信號高于這一方法所測定的界限值，即可認為該樣本利什曼原蟲感染陽性的。 在另一實施方案中，診斷測定可以以流通檢測模式(flow-throughtest format)或帶狀檢測模式(strip test format)進行，其中將抗原或融合多肽固化在諸如硝基化纖維的薄膜上。在流通檢測中，當樣本穿過薄膜時，樣本中的抗體與固定的多肽結合。然后當含有檢測試劑的溶液流過薄膜時，檢測試劑(例如蛋白A-膠體金)與抗體-多肽復合體結合。然后如上所述，檢測結合的檢測試劑。在帶狀檢測模式中，將薄膜與多肽結合的一端浸入到含有樣本的溶液中。樣本沿薄膜移動穿過含有檢測試劑的部位，到達固定的多肽區(qū)。在多肽上的檢測試劑濃度，預示樣本中存在利什曼原蟲抗體。通常上述檢測可用非常少量(例如1滴)的患者血清或血液進行。 仍然在另一實施方案中，提供了利用對本發(fā)明的一種或多種抗原、融合多肽和/或免疫原性部分具特異性的抗體(其可為多克隆的或單克隆的)和/或T細胞，檢測生物樣本中利什曼原蟲的方法。 本說明書所引用的所有出版物和專利申請在此通過引用并入，如同每篇單個細胞外或專利申請?zhí)貏e指出通過引用并入一樣。 盡管為了理解清晰，已借助例證和實例相當詳細地描述了上述發(fā)明，但顯然，根據(jù)本發(fā)明的教導，對本領域普通技術人員而言，在沒有背離所附加的權利要求的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明做某些改變和修飾。僅以說明而非限制的方式，提供下述實施例。本領域技術人員應當很容易地認識到，可以改變或修飾以產生基本類似結果的各種非關鍵性參數(shù)。
實施例 實施例1 利用在佐劑中配制的利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶防御內臟利什曼病的保護性免疫 A.材料和方法
1.動物和寄生蟲
19
雌性C57BL/6小鼠購買于Charles River實驗室(Wilmington, MA)，并保持在無特異性病原體的條件下。實驗開始使用8-12周齡的小鼠。嬰兒利什曼原蟲(MH0M/BR/82/BA-2)的前鞭毛體培養(yǎng)于MEM(基本必需培養(yǎng)基)(Invitrogen， Carlsbad, CA)中，MEM添加了O. 5XMEM必需氨基酸溶液(Invitrogen) ，0. ImM MEM非必需氨基酸(Invitrogen) ， lmM丙酮酸鈉，25mM HEPES(羥乙基哌嗪乙磺酸)，8. 3mM葡萄糖，26mM碳酸氫鈉，1 y g/ml對氨基苯甲酸，50 g/ml慶大霉素，10%熱滅活的胎牛血清和6 g/ml氯高鐵血紅素。杜氏利什曼原蟲和碩大利什曼原蟲(MH0M/IL/80/Friedlin)是由國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesof Health)的David Sacks博士惠贈的，并培養(yǎng)于之前所述的199培養(yǎng)基(Medium 199，Belkaid et al. ， (2002) J Immunol 168 :3992-4000)中。對數(shù)期或靜止期晚期的前鞭毛體用于感染或抗原制備。 2.嬰兒利什曼原蟲SMT的克隆和重組蛋白的產生 利用嬰兒利什曼原蟲基因組DNA，用5' CAA TTA CAT ATG TCCGCC GGT GGC CGTG(SEQ ID NO :9) 、3' CAA TTA AAG CTT CTAAGC CTG CTT GGA CGG(SEQ ID NO :10)引物對，經PCR，擴增嬰兒利什曼原蟲SMT的可讀框。將擴增的PCR產物用6X組氨酸標記框內插入pET-28a載體(EMD Biosciences, San Diego， CA)中，且對插入物進行測序。通過Clustal方法利用MegAlign軟件包(DNASTAR Inc. ，Madison，WI)，將嬰兒利什曼原蟲SMT的推斷的氨基酸序列，與自NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov)獲得的杜氏利什曼原蟲(登錄號AAR92098)、碩大利什曼原蟲(CAJ09196)、美洲錐蟲(EAN81270)和白色念珠菌(AAC26626)的SMT氨基酸序列進行對比。 將用于嬰兒利什曼原蟲SMT克隆的pET-28a載體轉化到E. coliRosetta中。并與1M異丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG) —起孵育誘導重組蛋白的表達。然后用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen Inc. ， Valencia, CA)，將rSMT純化為6X組氨酸標記的蛋白。利用BCA蛋白測定(PierceBiotechnology Inc. ，Rockford， IL)，測量純化蛋白的濃度。利用考馬斯亮藍染色，隨后SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)，評估蛋白的純度。利用鱟阿米巴狀細胞溶解物檢測(CambrexCorporation， East Rutherford, NJ)，測量蛋白的內毒素水平，并顯示低于10EU/mg蛋白。
3.免疫小鼠 以lOiig rSMT力口 20ii gMPL -SE(GlaxoSmithKline Biologicals， Rixensant，Belgium)共0. 1ml體積免疫小鼠。另一組小鼠用僅10 y grSMT給藥。對照組僅接受鹽水或MPL _SE。在小鼠的足墊右后部或尾根部，每隔3周，共進行3次皮下免疫。
4.蛋白質印跡法 將前鞭毛體懸浮于SDS樣本緩沖液中，隨后煮沸5分鐘，制備用于免疫印跡的樣本。含有5X10S個前鞭毛體的樣本經SDS-PAGE分離并印跡于聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene difluoride membrane)上。自rSMT力口 MPL-SE免疫的小鼠獲得的多克隆抗體用于蛋白質印跡法。利用來自天然小鼠的同樣稀釋度的血清作為對照。然后用HRP-結合的羊抗鼠IgG(Rockland Immunochemicals, Inc. ， Gilbertsville， PA)探測薄膜。利用化學發(fā)光的超靈敏HRP基質試劑盒(Chemiluminescent Supersensitive HRP SubstrateKit，BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)進行顯景》。
5.人抗SMT IgG的ELISA
在ELISA包被緩沖液中稀釋rSMT，96-孔板按200ng/孔抗原進行包被，隨后用含 有0.05X吐溫-20(Tween-20)和1 %牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉。接下來，將平板 與巴西內臟利什曼病患者(n = 21)血清，及來自美洲錐蟲病患者(n = 10)、地方病健康供 體(n = 10)和非地方病健康供體(n = 6)以1 : 200稀釋的血清一起孵育。對于所有的 IgG而言，HRP-結合的抗-人IgG (Rockland Immunochemicals)用作二Ab。對于IgG亞類 測定而言，使用HRP-結合的抗-人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 (Invitrogen)。利用四甲聯(lián)苯 胺過氧化物酶基質(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)進行平板顯景》， 禾口通過酶標儀(microplate reader)在450nm處讀取(570nm參考值)。
6.鼠抗SMT IgG的ELISA ELISA實驗設計類似于上述方案，但是使用不同的一抗和二抗。在最后一次免疫 l周后，抽取每組3只小鼠的血液，用于Ab ELISA。在5倍連續(xù)稀釋液中，將小鼠血清樣本 稀釋到1 : 100，并應用于平板。然后將平板與HRP-結合的羊抗鼠IgGl或IgG2 (Southern Biotech,Birmingham, AL) —起孵育。平板用基質顯影并用酶標儀在450nm波長處讀取。借 助Gr即hPad Prism軟件，利用0. 10D值作為臨界值，計算終點滴度。
7.使用脾細胞的細胞因子測定 在最后一次免疫2周后，由每組3只小鼠采集脾臟。將每孔完全RPMI培養(yǎng)基(添 加了 10X熱滅活胎牛血清、100U/ml青霉素和lOOii g/ml鏈霉素的PRMI)中的2乂105脾細 胞，平板接種于96孔板，然后用僅3ii g/ml伴刀豆球蛋白A、100ii g/ml嬰兒利什曼原蟲可 溶性溶解產物抗原(LiSLA) 、 10 g/ml rSMT或培養(yǎng)基剌激。培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)物上 清液并通過夾心ELISA檢測IFN- y和IL-10的水平。
8.細胞內染色和流式細胞術 在最后一次免疫2周后，由每組3只小鼠采集脾臟。將每孔100 1完全PRMI中 的1 X 106脾細胞，平板接種于圓底96孔板，然后用僅PMA/伊吾諾霉素、10 g/ml rSMT 或培養(yǎng)基剌激。在剌激期間，將共同剌激抗體抗CD28(eBioscience， San Diego， CA)和 抗CD49d(eBioscience)添加到培養(yǎng)基中，以使孔中最終濃度為1 P g/ml。 37(TC下孵育2 小時后，將布雷菲德菌素A(GolgiPlug :BD Biosciences, San Jose， CA)添加到孔中，并 在37t:下繼續(xù)孵育另外12小時。用50iU 1 : 50的抗CD16/32(eBioscience)封閉細 胞，然后用Alexa Fluor 700-抗-CD3 (eBioscience) 、 PerCP-抗-CD4 (BD Biosciences)、 PE-抗-CD8(BD Biosciences)染色。隨后利用Cytof ix/Cytoperm試劑盒(BD Biosciences) 固定細胞。用抗-CD16/32再次封閉細胞，然后用FITC-抗-TNF- a (eBioscience)、 PacificBlue-抗-IL-2 (eBioscience)禾口 PE_Cy7_抗_IFN_ y / (BD Biosciences)進行細胞 內染色。利用LSRII FACS儀(BD Biosciences)和DIVA軟件分析細胞。
9.嬰兒利什曼原蟲激發(fā)小鼠 在最后一次免疫3周后，用嬰兒利什曼原蟲激發(fā)每組7只小鼠。將5X 106嬰兒利 什曼原蟲懸浮于漢克(氏)平衡鹽溶液(hypodermoclysisfluid)中，并靜脈注射到小鼠尾 靜脈中。激發(fā)后4周，處死小鼠，采集脾臟和肝臟，以便利用有限稀釋測定，測定這些組織中 的寄生蟲數(shù)量。用玻璃研磨器將這些組織勻漿化，在含有NNN血瓊脂的96孔微量培養(yǎng)板中 用完全HOMEM將懸浮液連續(xù)地稀釋兩倍。平板接種IO天后，檢查每個孔中寄生蟲的存在， 并基于最后陽性孔的稀釋劑，估算最初組織中的寄生蟲數(shù)量。
B.結果 1.利什曼原蟲種類表達SMT 利用特異引物，借助PCR擴增，自嬰兒利什曼原蟲總DNA中克隆SMT可讀框。大 小為1062bp，而且序列與數(shù)據(jù)庫(LinJ36. 4930 ; 1， 062bp， 353個氨基酸，39. 8kDa，獲得自 GeneDB :www. genedb. org)中的100%匹配。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(麗w. ncbi. nlm. nih. gov)進 行的序列分析顯示，嬰兒利什曼原蟲SMT與杜氏利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、巴西利什曼 原蟲和美洲錐蟲的SMTs分別有99. 6%、96. 6%、81%和66. 0%的同一性(圖1A-1B)。
在E. coli中表達rSMT并純化(圖2)。預測蛋白的表觀分子量(42kDa)。所產生 的抗rSMT的小鼠多克隆抗體用于通過蛋白質印跡分析檢測利什曼原蟲種類中的天然SMT。 在所有測驗的利什曼原蟲種類即杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲和碩大利什曼原蟲中， 抗SMTAb檢測到表觀分子量大小為38KD的帶，這與預測的大小在同一范圍，然而帶的強度 不同(圖3)。當來源于天然小鼠的血清作為一抗時，檢測不到那些帶。
2. VL患者血清識別rSMT 為測定利什曼原蟲SMT在人類中抗原性，通過ELISA，應用來自21例巴西VL患者 的血清，檢查內臟VL患者中針對rSMT和rK39的抗體的普遍性(prevalence) 。 rK39是血 清診斷性抗原，而且針對該抗原的抗體的存在，預示活躍的VL(Burns et al. ， (1993)Proc Natl Acad SciUSA 90:775779)。 21例中的19例顯示了針對rK39的強烈的Ab反應，而且 這些反應在VL患者中是特異性的(圖4A)。這些血清顯示了針對rSMT的中度到強烈的反 應性，而且看起來這些Ab反應在VL患者中是特異性的，然而1例非地方病健康供體顯示了 中度反應(圖4B)。感染杜氏利什曼原蟲的蘇丹VL患者識別rSMT(數(shù)據(jù)沒有顯示)，表明 SMT在杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲感染患者中都是抗原性的。 進一步檢查血清，以確定它們的IgG亞類。在VL患者血清中檢測IgGl、 IgG2和 IgG3針對rK39的反應，且IgGl是主要的亞類(圖4C)。針對rSMT的IgGl反應也是主要 的，盡管滴度比低于針對rK39的那些(圖4D)。在VL患者血清中觀察到一些針對rSMT的 IgG2反應，但是其不是VL特異性的，因為健康供體顯示了針對這一抗原的IgG2反應。幾乎 沒有檢測到IgG4針對rK39或rSMT的反應。 3. rSMT加MPL⑧_SE誘導具有Thl特征的免疫反應因為rSMT加MPL⑧_SE疫苗 誘導小鼠防御VL的保護作用，我們因而評估疫苗所誘導的免疫反應。用rSMT加MPI^-SE 免疫的小鼠顯示強烈的針對rSMT的，以高水平的抗原特異性IgGl和IgG2a為特征的體液 免疫(圖5)。相比之下，僅用rSMT的免疫導致IgGl為主的抗體反應。僅注射鹽水或佐劑 的小鼠不顯示針對rSMT的抗體反應。 為調查免疫所產生的細胞介導的反應，測量rSMT或LiSLA剌激下脾細胞所產生 的細胞因子。來自用rSMT加MPL -SE免疫的小鼠的脾細胞，響應rSMT ，產生高水平的 IFN- y (圖6A)。這些小鼠也對LiSLA剌激作出反應，盡管所產生的IFN- y數(shù)量遠低于rSMT 剌激所觀察到的IFN-y數(shù)量。相比之下，來自僅用rSMT免疫的小鼠的脾細胞，響應rSMT， 僅產生低水平的IFN- y 。與僅rSMT給藥相比，當MPL⑧-SE與抗原聯(lián)合注射時，IFN- y / IL-10比率得以顯著提高(圖6B) 。 rSMT或LiSLA剌激下，僅鹽水或佐劑組中未發(fā)現(xiàn)可檢測 到的細胞因子產生。4. rSMT力口MPL⑧-SE誘導CD4+和CD8+T細胞表達多種Thl型細胞因子
為進一步調查rSMT加MP:l^^-SE接種所誘導的細胞反應，對CD4+和CD8+T細胞所 產生的Thl型細胞因子進行流式細胞術分析。將體外與SMT或不與SMT —起培養(yǎng)后收獲的 脾細胞首先在前射光和測射光的基礎上設門，然后CD3表達(圖7A)。 CD4+和CD8+細胞進 一步自CD3+群體設門。分析這些群體中產生TNF- a 、 IL-2或IFN- y的細胞的頻率。
FACS數(shù)據(jù)顯示，抗原特異的CD4+和CD8+細胞受rSMT加MPL⑧_SE接種誘導(圖 7B)。在rSMT剌激下產生TNF- a 、 IL-2或IFN- y的CD4+細胞，僅發(fā)現(xiàn)于該組小鼠中?？?原特異CD8+細胞也發(fā)現(xiàn)于rSMT加MPL⑧-SE給藥的小鼠中，而且產生TNF-a或IFN-y的 那些細胞的頻率很高。 當在基于單細胞水平上的TNF-a 、IL-2或IFN-y表達模式，進一步將CD4+和CD8+ 細胞分為7個不同的群體時，表明許多產生多種細胞因子的抗原特異性T細胞被rSMT加 MPL -SE誘導(圖7C) 。 rSMT剌激下，存在僅產生TNF- a的CD4+和CD8+細胞兩者，而僅 表達IFN- y的細胞幾乎沒有。大多數(shù)產生IFN- y的抗原特異性CD4+T細胞共表達TNF- a 或TNF- a和IL-2兩者。而且許多抗原特異性CD8+T細胞同時產生TNF- a和IFN- y 。
5. rSMT-免疫接種的小鼠抵抗嬰兒利什曼原蟲感染 為評估rSMT力口MPL⑧_SE接種防御VL的保護效果，利用靜脈內注射5X 106個嬰 兒利什曼原蟲前鞭毛體激發(fā)免疫的小鼠。嬰兒利什曼原蟲感染期間，C57BL/6小鼠在感染 4周左右顯示出肝臟內寄生蟲負荷高峰(數(shù)據(jù)沒有顯示)。因此，我們選擇4周作為一個時 間點來測定激發(fā)小鼠的脾臟和肝臟中寄生蟲的數(shù)量。與僅用鹽水或佐劑激發(fā)的小鼠相比， 在用rSMT加MPL⑧_SE免疫的小鼠中觀察到寄生蟲顯著減少(圖8)。與僅用鹽水和佐劑 的組相比，免疫的小鼠顯示，脾臟中寄生蟲數(shù)量減少43倍和55倍，肝臟中寄生蟲數(shù)量分別 減少111倍和117倍。在僅用鹽水和佐劑的組中不存在顯著差異。在SMT免疫的小鼠中重 復地觀察到類似強度的保護作用。
C.討論 用嬰兒利什曼病原蟲SMT免疫顯著地保護了小鼠免遭嬰兒利什曼原蟲感染，其為 人類和犬科動物VL的致病因子，而且這種預防效果大大地強于任何先前所報導的候選疫 苗的效果。已存在數(shù)量有限的已證明在動物模型中誘導防VL的候選疫苗(Basu et al.， (2005) JImmunol 174 :7160-7171 ;Ghosh et al. ， (2001) Vaccine 20 :59-66 ;和Rafatiet al. ， (2006) Vaccine 24:2169-2175)。對大多數(shù)候選者而言，所觀察到的保護水平是極微 弱的，寄生蟲負荷通常僅減少2倍。在小鼠中，感染后4周左右肝臟中寄生蟲數(shù)量顯示出高 峰，隨后減少。相比之下，在脾臟中觀察到寄生蟲持續(xù)性感染。與先前報導的抗原相比，本 發(fā)明的SMT免疫獲得更高程度的保護作用，而且這種保護作用可同時在脾臟和肝臟中觀察 到。 此外，兩種VL致病因子即嬰兒利什曼原蟲和杜氏利什曼原蟲，以及CL致病因子 即碩大利什曼原蟲和CL及彌散性利什曼病(DL)致病因子即巴西利什曼原蟲，都表達SMT。 這種SMT表達模式表明，該抗原也可用于其他形式的利什曼病中。而且，在用SMT免疫接 種時，與哺乳動物蛋白同源性的缺乏預計提供安全性優(yōu)勢。SMT也發(fā)現(xiàn)于其他病原體中，包 括寄生蟲和真菌，諸如錐蟲(Trypanosoma spp.) (Zhou etal. ， (2006) J Biol Chem 281: 6290-6296)、白色念珠菌(Jensen-Pergakes etal. ， (1998) Antimicrob Agents Chemother 42:1160-1167)禾口卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii) (Kaneshiro et al. ， (2001) JEukaryot MicrobiolSuppl :144S-146S)。因而，SMT也代表用于治療除VL外的狀況的候選 疫苗。 實施例2 用rSMT免疫的小鼠受到免遭碩大利什曼原蟲感染的保護 將BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)保持在無特異性病原體的條件 下。實驗開始時，小鼠8-12周齡。將碩大利什曼原蟲(MH0M/IL/80/Friedlin)的前鞭毛體 培養(yǎng)于25°CT 199培養(yǎng)基(Mediuml99)中，該培養(yǎng)基添加了 20%熱滅活的胎牛血清、每ml 100U的青霉素、每ml lOOii g鏈霉素、2mM左旋谷氨酰胺、0. lmM腺嘌呤、40mM HEPES、每ml 0.25mg氯高鐵血紅素和每ml 0. 31mg 6-生物素。對數(shù)期或靜止期晚期的前鞭毛體用于感 染或抗原制備。 免疫5只小鼠組。第一組用鹽水免疫，作為陰性對照。第二組用10 ii g rSMT加 20 ii g MPL -SE (GlaxoSmithKl ine Biologicals， Rixensant， Belgium)總體禾只為0. lml 免疫。作為激發(fā)劑，將2， 000個碩大利什曼原蟲前鞭毛體懸浮于10 P 1磷酸鹽緩沖液并皮 內注射到左耳和右耳。免疫實驗方案完成后3周，感染小鼠。 通過利用公制游標卡尺測量耳部病變區(qū)硬結直徑，每周監(jiān)測感染進展，持續(xù)8周 (圖9A)。 在激發(fā)后8周，收集耳部組織，以便利用有限稀釋測定來測定寄生蟲的數(shù)量。用研 磨器將該組織勻漿化，在含有NNN血瓊脂的96孔微量培養(yǎng)板中用完全199培養(yǎng)基將懸浮液
連續(xù)稀釋兩倍。平板接種io天后，檢查每個孔中寄生蟲的存在，而且基于最后陽性孔的稀
釋劑，估算最初組織中寄生蟲的數(shù)量(圖9B)。 實驗結果證明，用rSMT免疫的小鼠顯著保護防御為皮膚利什曼病致病因子的碩 大利什曼原蟲。這些結果表明，用rSMT免疫能有效保護防御為內臟、皮膚、粘膜和彌散性利 什曼病致病因子的利什曼原蟲病原體。 可以組合上文所述的各種實施方案，以便提供其他的實施方案。通過引用，全文并
入本說明書所涉及和/或申請資料頁所列舉的所有美國專利、美國專利申請公布、美國專
利申請、國外的專利、國外的專利申請和非專利出版物。如有必要，可更改實施方案的各種
方面，以便應用各種專利、申請和出版物的概念再提供其他的實施方案。 根據(jù)上文的詳述，可對實施方案做出這些或其他改變?？傊谒降臋嗬?br>
中，所用的術語不應當解釋為，限制說明書和權利要求中所公開的具體實施方案，而應當解
釋為包括所有可能的實施方案，以及授予權利的此類權利要求的等同物的全部范圍。因此，
權利要求并不限于公開的內容。
權利要求
組合物，包含與免疫刺激劑組合的利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶(SMT)多肽或其免疫原性部分或變體。
2. 如權利要求1所述的組合物，其中所述SMT多肽具有嬰兒利什曼原蟲(L. infantum) SMT多肽、杜氏利什曼原蟲(L. donovani)SMT多肽和碩大利什曼原蟲(L. major) SMT多肽或 巴西利什曼原蟲(L.braziliensis)SMT多肽的氨基酸序列。
3. 如權利要求1所述的組合物，其中所述SMT多肽具有選自SEQID N0s :1、3、5或11中 任一序列所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NOs :1、3、5或11中任一序列具有至少90%同源 性的序列。
4. 如權利要求1所述的組合物，其中所述利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶(SMT)多 肽能在體內測定中提供防御嬰兒利什曼原蟲(L. infantum)的保護作用。
5. 如權利要求1所述的組合物，其中所述其免疫原性部分能在體內測定中提供防御嬰 兒利什曼原蟲(L. infantum)的保護作用。
6. 如權利要求1所述的組合物，其中所述其變體能在體內測定中提供防御嬰兒利什曼 原蟲(L. infantum)的保護作用。
7. 組合物，包含與免疫剌激劑組合的融合多肽，所述融合多肽包含權利要求1所述的 至少一種多肽和至少一種異源融合伴侶。
8. 組合物，包含與免疫剌激劑組合的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼權利 要求1所述的多肽。
9. 組合物，包含與免疫剌激劑組合的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼權利 要求7所述的融合多肽。
10. 如權利要求1、7、8或9中任一項所述的組合物，其中所述免疫剌激劑選自含CpG的 寡核苷酸、合成的脂質A、 MPLTM、3D-MP1"、皂苷、皂苷類似物、AGPs、 Toll樣受體激動劑或其 組合。
11. 如權利要求1、7、8或9中任一項所述的組合物，其中所述免疫剌激劑為穩(wěn)定的乳劑 中的MP1"。
12. 剌激哺乳動物免疫反應的方法，包括給予權利要求1、7、8或9中任一項所述的組合物。
13. 誘導哺乳動物防御利什曼病的保護性免疫的方法，包括給予權利要求1、7、8或9中 任一項所述的組合物。
全文摘要
公開了用于預防、治療和檢測利什曼病的組合物和方法。該組合物通常包含利什曼原蟲固醇24-c-甲基轉移酶(SMT)多肽、部分、變體和/或融合物以及編碼SMT多肽、部分、變體和/或融合物的多核苷酸。
文檔編號A61K38/45GK101743016SQ200880024553
公開日2010年6月16日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權日2007年7月13日
發(fā)明者史蒂文·里德, 后藤康之 申請人:傳染性疾病研究院