專利名稱：抗癌細(xì)胞毒性單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和生產(chǎn)減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，并且涉及這些CDMAB任 選地與一種或多種化療劑聯(lián)合在治療和診斷過程中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的 CDMAB的結(jié)合測(cè)定方法。

背景技術(shù)：
作為癌癥治療的單克隆抗體患有癌癥的每個(gè)個(gè)體都是獨(dú)特的，并且患有與其它 癌癥不同的癌癥，正如個(gè)人的身份一樣。盡管如此，目前的治療法以相同的方法治療患有 同種類型的癌癥、處于相同的階段的所有患者。這些患者中至少有30%將在一線治療中失 敗，由此導(dǎo)致以后幾輪的治療和增加治療失敗、轉(zhuǎn)移、以及最終死亡的可能性。較好的治療 方法應(yīng)該是對(duì)于特定的個(gè)體量身定制的治療法。目前本身適于量身定制的唯一的治療法是 手術(shù)。化療和放射治療不能對(duì)患者進(jìn)行量身定做，并且手術(shù)本身在大部分情形中不足以產(chǎn) 生治愈。 隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，由于每種抗體可以針對(duì)單個(gè)表位，則開發(fā)量身定制的治 療法的方法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)。此外，產(chǎn)生針對(duì)獨(dú)特限定特定個(gè)體的腫瘤的表位群的 抗體組合也是可能的。 已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著不同是在于癌癥細(xì)胞包含對(duì)轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞特異的抗原，科學(xué)團(tuán)體長(zhǎng)期認(rèn)為單克隆抗體可以設(shè)計(jì)成通過特異性與這些癌癥抗 原結(jié)合而特異性靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；因此產(chǎn)生這樣的信心單克隆抗體可以作為"魔力子彈 (Magic Bullets)"來消除癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在廣泛認(rèn)識(shí)到，沒有任何一種單個(gè)的單克隆抗體 可以在所有癌癥情形中起作用，并且單克隆抗體可以被配置為一類作為靶向癌癥治療。已 經(jīng)表明按照本文公開的發(fā)明的教導(dǎo)分離的單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病 過程，例如通過減少腫瘤負(fù)荷的方式，并且在本文中應(yīng)該不同地稱為減輕癌性疾病的抗體 (CDMAB)或"抗癌"抗體。 目前，癌癥患者通常具有很少的治療選擇。對(duì)癌癥治療法的管理方法已經(jīng)在全球 生存和發(fā)病率中產(chǎn)生了改善。然而，對(duì)于特定的個(gè)體，這些改善的統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有與他們個(gè)人情 況的改善必然相關(guān)。 因此，如果采用能夠使執(zhí)業(yè)者獨(dú)立于處于同一團(tuán)體中的其他患者而治療每種腫瘤 的方法，這將允許產(chǎn)生僅使治療適合該名個(gè)體的獨(dú)特方法。這樣的治療療程理想地將增加 治愈率，并且產(chǎn)生更好的結(jié)果，由此滿足長(zhǎng)期渴望的需要。 歷史上，多克隆抗體已經(jīng)進(jìn)行了應(yīng)用，在治療人類癌癥中具有有限的成功。已經(jīng)使用人血漿治療淋巴瘤和白血病，但是存在很少延長(zhǎng)的好轉(zhuǎn)或反應(yīng)。此外，與化療相比，缺少
再現(xiàn)性，并且沒有任何其它的益處。實(shí)體瘤諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌也已經(jīng)使用人血
液、黑猩猩血清、人血漿和馬血清進(jìn)行治療，具有相對(duì)不可預(yù)知的和無效的結(jié)果。 對(duì)于實(shí)體瘤，已經(jīng)存在單克隆抗體的許多臨床試驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，對(duì)于
人乳腺癌存在至少4種臨床試驗(yàn)，其使用針對(duì)特異抗原的抗體或基于組織選擇性，在至
少47名患者中僅產(chǎn)生一名響應(yīng)者。直到1998年才出現(xiàn)使用人源化的抗Her2/neu抗體
(Herceptir^)與順鉑組合的成功的臨床試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，評(píng)估37名患者的響應(yīng)，其中約
四分之一具有部分響應(yīng)率，另外四分之一具有較小或穩(wěn)定的疾病發(fā)展。在所述響應(yīng)者中對(duì) 發(fā)展的中值時(shí)間是8. 4個(gè)月，中值響應(yīng)持續(xù)5. 3個(gè)月。 Herceptin⑧在1998年核準(zhǔn)與Taxo^組合用于一線應(yīng)用。臨床研究結(jié)果顯示，與 僅接受Taxof的組(3.0個(gè)月)相比，對(duì)于接受抗體治療加Taxol⑧的那些的疾病發(fā)展的中 值時(shí)間(e.9個(gè)月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；對(duì)于Hercepth^加Tajco產(chǎn)治 療組相對(duì)于單獨(dú)的Taxo產(chǎn)治療組為22個(gè)月相對(duì)于18個(gè)月。另外，與單獨(dú)的Taxo產(chǎn)相比較， 在抗體加Taxo產(chǎn)組合組中，在完全(8%相對(duì)于2% )和部分響應(yīng)者(34%相對(duì)于15% )的 數(shù)量中存在增加。然而，與單獨(dú)的Tax。產(chǎn)治療相比較，用Herceptir^和T^。f治療導(dǎo)致更
高的心臟中毒的發(fā)生(分別為13%相對(duì)于1% )。此外，Herceptir^治療法只對(duì)過量表達(dá) (通過免疫組化(IHC)分析確定)人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her2/neu)的患者，患有轉(zhuǎn)移乳腺 癌的患者的大約25%中有效；所述人表皮生長(zhǎng)因子受體2是一種受體，其目前具有未知的 功能或生物學(xué)重要的配體。因此，對(duì)于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未滿足的需求。即 使可以受益于Herceptin⑧治療的那些仍然需要化療，并且因此仍然必須處理，至少在某種
程度上，處理這種治療的副作用。 研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗(yàn)包括針對(duì)糖蛋白和糖脂靶點(diǎn)的抗體。抗體如17-1A，其 對(duì)于腺癌具有某種特異性，已經(jīng)在六十多名患者中進(jìn)行了 2期臨床試驗(yàn)，僅有1名患者具有 部分響應(yīng)。在其它試驗(yàn)中，在使用額外的環(huán)磷酰胺的方案中，使用17-lA在52名患者中僅 產(chǎn)生1例完全響應(yīng)和2例較小的響應(yīng)。迄今為止，17-1A的III期臨床試驗(yàn)尚未表現(xiàn)出作為 III期結(jié)腸癌的輔助治療的提高的功效。最初核準(zhǔn)用于成像的人源化鼠單克隆抗體的應(yīng)用 也沒有產(chǎn)生腫瘤衰減。 僅在最近，使用單克隆抗體的結(jié)腸直腸癌臨床研究產(chǎn)生了一些積極的結(jié)果。在 2004年，ERBITUX^核準(zhǔn)用于患有表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌的患者的二線治療，所述 患者對(duì)基于伊立替康的化療不起反應(yīng)(refractory)。來自兩組(two-arm) II期臨床研究和 單組研究的結(jié)果表明，ERBITUX②與伊立替康組合分別具有23%和15%的響應(yīng)率，疾病 發(fā)展的中值時(shí)間分別為4. 1個(gè)月和6. 5個(gè)月。來自同一兩組II期臨床研究和另一單組研 究的結(jié)果表明，僅用￡1^1111^@治療分別導(dǎo)致11%和9%的響應(yīng)率，疾病發(fā)展的中值時(shí)間 分別為1.5個(gè)月和4.2個(gè)月。 因此，在瑞士和美國(guó)，￡1161丁11 <:@與伊立替康組合治療，并且在美國(guó)，單獨(dú)的 ERBITUX②治療，已經(jīng)被核準(zhǔn)作為在一線伊立替康治療中失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。 因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核準(zhǔn)治療作為單克隆抗體和化療的組合。另外，在瑞士和
6美國(guó)只核準(zhǔn)治療作為二線治療用于患者。此外，在2004年，八￥八8丁^@被核準(zhǔn)與靜脈內(nèi)基
于5-氟尿嘧啶的化療組合用作轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果表現(xiàn)出
與僅用5-氟尿嘧啶治療的患者相比，用AVASTIN⑧加5-氟尿嘧啶治療的患者的中值存活 延長(zhǎng)(分別為20個(gè)月相對(duì)于16個(gè)月)。然而，同樣如同Herceptii^和ERBITO ^，治療
僅被核準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的組合。 對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌還繼續(xù)存在極差的結(jié)果。對(duì)于 非小細(xì)胞肺癌的最有希望的最近的結(jié)果來自II期臨床試驗(yàn)，其中治療包括與殺細(xì)胞藥多 柔比星綴合的單克隆抗體(SGN-15 ;dox-BR96，抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其與化療藥 TAXOTERE⑧組合。TAXOTERE⑧是唯一一種FDA核準(zhǔn)的化療藥，用于肺癌的二線治 療。原始數(shù)據(jù)顯示與單獨(dú)的TAXOTERE^相比提高的整體存活時(shí)間。在本研究征募的 62名患者中，三分之二接受SGN-15與丁八乂0丁￡拙@組合，而其余三分之一接受單獨(dú)的 丁八乂0丁￡虹@。對(duì)于接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合的患者，中值整體存活時(shí)間是7. 3 個(gè)月，而與之比較的接受單獨(dú)的丁八乂0丁￡11￡@的患者是5. 9個(gè)月。對(duì)于接受SNG-15加 TAXOTERE⑧的患者的整體存活時(shí)間為l年和18個(gè)月的分別為29%和18%，而與之比較 的對(duì)于接受單獨(dú)的TAXOTERE⑧的患者分別為24%和8%。計(jì)劃了進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。
臨床前，對(duì)于黑素瘤使用單克隆抗體已經(jīng)存在一些有限的成功。這些抗體中很少 已經(jīng)達(dá)到臨床試驗(yàn)階段，并且迄今為止沒有一種已經(jīng)被核準(zhǔn)或在III期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出 有利的結(jié)果。 治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受到在30， 000種已知的基因產(chǎn)物中缺少相關(guān)靶點(diǎn)的鑒定 的阻礙，所述30， 000種已知的基因可能有助于疾病的發(fā)病機(jī)理。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的 藥物靶點(diǎn)通常由于它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中過量表達(dá)的事實(shí)來簡(jiǎn)單地選擇。然后篩選這樣鑒定的 靶點(diǎn)與多種化合物的相互作用。在潛在的抗體治療的情形中，這些候選化合物通常衍生于 根據(jù)Kohler和Milstein所述的基本原理(1975，自然(Nature) ， 256， 495-497， Kohler和 Milstein)的單克隆抗體產(chǎn)生的常規(guī)方法。從用抗原(例如，全細(xì)胞，細(xì)胞級(jí)分，純化的抗 原)免疫的小鼠收集脾細(xì)胞，并且與無限增殖的雜交瘤配偶體融合。篩選所得到的雜交瘤， 并且針對(duì)最親和性地與所述靶點(diǎn)結(jié)合的抗體的分泌進(jìn)行選擇。針對(duì)癌細(xì)胞的許多治療和診 斷抗體，包括Herceptir^和RITUXIMAB，已經(jīng)使用這些方法產(chǎn)生，并且基于它們的親和性進(jìn) 行選擇。這種方法中的缺點(diǎn)是雙重的。首先，對(duì)治療或診斷抗體結(jié)合選擇適當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)受到 關(guān)于組織特異性致癌過程的極少的知識(shí)以及用于鑒定這些靶點(diǎn)的所得到的過于單純化的 方法的限制，所述過于單純化的方法如通過過量表達(dá)進(jìn)行選擇。第二，與受體以最大的親和 力結(jié)合的藥物分子通常具有起始或抑制信號(hào)的最大可能性的假設(shè)可能不總是這種情形。
盡管一些關(guān)于乳腺癌和結(jié)腸癌的治療的進(jìn)展，但是作為單一藥劑或共同治療的有 效抗體治療的鑒定和開發(fā)對(duì)于所有類型的癌癥尚是不充足的。現(xiàn)有專利
美國(guó)專利號(hào)5， 750， 102公開這樣一種方法，其中來自患者腫瘤的細(xì)胞用MHC基因 轉(zhuǎn)染，所述MHC基因可克隆自來自該患者的細(xì)胞或組織。然后，使用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫該
患者o 美國(guó)專利號(hào)4， 861， 581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟獲得單克隆 抗體，所述單克隆抗體對(duì)哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分是特異性的，但是對(duì)外部成分不是特異性的；標(biāo)記所述單克隆抗體，使所標(biāo)記的抗體與已經(jīng)接受治療的哺 乳動(dòng)物組織接觸以殺死腫瘤細(xì)胞；并且通過測(cè)量所標(biāo)記的抗體與退化的腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部細(xì) 胞成分的結(jié)合而確定治療的功效。在制備針對(duì)人細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時(shí)，專利權(quán)所有人認(rèn)為 惡性細(xì)胞代表這樣的抗原的便利的來源。 美國(guó)專利號(hào)5， 171， 665提供一種新型抗體以及其生產(chǎn)方法。具體地，該專利教導(dǎo) 形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)抗原例如結(jié)腸和肺的 那些強(qiáng)結(jié)合而與正常細(xì)胞以弱得多的程度結(jié)合的能力。 美國(guó)專利號(hào)5， 484， 596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌癥患者手術(shù) 取出腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞，輻射所述腫瘤細(xì)胞以成為存活的但非 腫瘤發(fā)生性的，并且使用這些細(xì)胞制備用于患者的疫苗，所述疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā) 而且同時(shí)抑制轉(zhuǎn)移。該專利教導(dǎo)開發(fā)與腫瘤細(xì)胞的表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體。如在第4 欄45行等描述的，專利權(quán)所有人在開發(fā)用于人腫瘤形成的表達(dá)單克隆抗體的活性特異性 免疫治療中使用自生的腫瘤細(xì)胞。 美國(guó)專利號(hào)5，693，763教導(dǎo)一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并且不依賴于 起源的上皮組織。 美國(guó)專利號(hào)5， 783， 186涉及在表達(dá)Her2的細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗-Her2 抗體，產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系，使用所述抗體治療癌癥的方法和包括所述抗體的藥
物組合物。 美國(guó)專利號(hào)5， 849， 876描述了用于產(chǎn)生針對(duì)黏蛋白抗原的單克隆抗體的新雜交 瘤細(xì)胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來源純化。 美國(guó)專利號(hào)5，869，268涉及產(chǎn)生人淋巴細(xì)胞的方法，所述人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)目的 抗原特異性的抗體，產(chǎn)生單克隆抗體的方法，以及由所述方法產(chǎn)生的單克隆抗體。該專利特 別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD人單克隆抗體的生產(chǎn)。 美國(guó)專利號(hào)5， 869， 045涉及與人癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體綴合物和 單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機(jī)制是兩面性的，原因在于分子與在人癌癥表面上存在的 細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，并且此外，原因在于所述抗體具有在癌癥細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)在化的能力，隨后結(jié) 合，使它們特別有效用于形成抗體_藥物和抗體_毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所 述抗體還在特定的濃度表現(xiàn)出細(xì)胞毒性特征。 美國(guó)專利號(hào)5， 780， 033公開自體抗體用于腫瘤治療和預(yù)防的應(yīng)用。然而，這種抗 體是來自年老的哺乳動(dòng)物的抗核自體抗體。在這種情形中，認(rèn)為該自體抗體是在免疫系統(tǒng) 中發(fā)現(xiàn)的一種自然抗體類型。因?yàn)樵撟泽w抗體來自"年老的哺乳動(dòng)物"，不存在所述自體抗 體實(shí)際來自被治療的患者的要求。另外，該專利公開了來自年老的哺乳動(dòng)物的天然和單克 隆抗核自體抗體，和產(chǎn)生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
發(fā)明概述 本申請(qǐng)利用在U. S. 6， 180， 357專利中教導(dǎo)的生產(chǎn)患者特異性抗癌抗體的方法分 離雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系編碼減輕癌性疾病的單克隆抗體。這些抗體可以針對(duì) 一種腫瘤特異性制備，并且因此使得癌癥治療的量身定制成為可能。在本申請(qǐng)的情形中，具 有殺傷細(xì)胞(細(xì)胞毒性)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(抑制細(xì)胞)特性的抗癌抗體在下文中稱為細(xì)胞 毒性的。這些抗體可以用于輔助癌癥的分階段和診斷，并且可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。這些抗體還可以用于通過預(yù)防治療的方式用于預(yù)防癌癥。與根據(jù)傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)樣本(paradigm)產(chǎn)生的抗體不同，以這種方式產(chǎn)生的抗體可以靶向這樣的分子和途徑，所述分子和途徑先前沒有顯示出對(duì)于惡性組織的生長(zhǎng)和/或存活是必需的。此外，這些抗體的結(jié)合親和力適合起始可能不易受更強(qiáng)的親和性相互作用影響的細(xì)胞毒性事件的需要。此外，將標(biāo)準(zhǔn)化療形式如放射性核素與本發(fā)明的CDMAB綴合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，由此集中在所述化療藥物的應(yīng)用。所述CDMAB也可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶例如生物素綴合的酶、或造血細(xì)胞綴合，由此形成抗體綴合物。 個(gè)體化的抗癌治療的前景將在患者的管理方式中引起改變?？赡艿呐R床方案(scenario)是在出現(xiàn)時(shí)獲得腫瘤樣品，并且儲(chǔ)存。從該樣品，腫瘤可以由一組預(yù)先存在的減輕癌性疾病的抗體而分類。將患者進(jìn)行常規(guī)分階段，但是可用的抗體可以用于將患者進(jìn)一步分階段?；颊呖梢粤⒓从矛F(xiàn)有的抗體進(jìn)行治療，并且使用本發(fā)明描述的方法或通過利用噬菌體展示文庫與本發(fā)明公開的篩選方法聯(lián)合，可以產(chǎn)生一組對(duì)腫瘤特異性的抗體。由于其它腫瘤可能攜帶一些與被治療的腫瘤相同的表位，故將產(chǎn)生的所有抗體加入到抗癌抗體文庫中。按照該方法產(chǎn)生的抗體可以有效用于治療許多患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者中的癌性疾病。 除了抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的治療作為多形式治療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對(duì)非癌癥細(xì)胞是相對(duì)無毒的事實(shí)允許以使用高劑量抗體組合，單獨(dú)地，或與常規(guī)治療組合使用。高治療指數(shù)還允許在短時(shí)間范圍內(nèi)再次治療，這應(yīng)該降低耐受治療的細(xì)胞出現(xiàn)的可能性。 如果患者對(duì)初始的治療療程沒有反應(yīng)或發(fā)展了轉(zhuǎn)移，則可以重復(fù)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的
特異性抗體的方法，進(jìn)行再次治療。此外，所述抗癌抗體可以與從該患者獲得的紅血細(xì)胞綴
合，并且重新輸注用于治療轉(zhuǎn)移。對(duì)于轉(zhuǎn)移癌存在很少有效的治療，并且轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)
致死亡的最壞結(jié)果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常充分地血管化，通過紅血細(xì)胞遞送抗癌抗體可以具有
將所述抗體集中在腫瘤部位的作用。甚至在轉(zhuǎn)移之前，大部分癌癥細(xì)胞依賴于宿主的血液
供應(yīng)它們的生存，并且與紅血細(xì)胞綴合的抗癌抗體還可以有效針對(duì)原位腫瘤。備選地，所述
抗體可以與其它造血細(xì)胞綴合，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等。 存在5類抗體，并且每類與由其重鏈賦予的功能相關(guān)。通常認(rèn)為由裸抗體殺傷癌
癥細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性進(jìn)行介導(dǎo)。例如，鼠IgM和IgG2a
抗體可以通過結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的C-l成分而激活人補(bǔ)體，由此激活可以導(dǎo)致腫瘤消退的補(bǔ)體
激活經(jīng)典途徑。對(duì)于人抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgGl。 IgG2a和IgG3同
種型的鼠抗體有效募集具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，其將導(dǎo)致由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒
細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞殺傷。IgGl和IgG3同種型的人抗體介導(dǎo)ADCC。 抗體介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一種可能的機(jī)制可以通過使用催化細(xì)胞膜中的不同化
學(xué)鍵的水解的抗體以及其相關(guān)的糖蛋白或糖脂，即所謂的催化抗體進(jìn)行。 存在3種抗體_介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞殺傷的其它機(jī)制。第一種是使用抗體作為疫苗來
誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)存在于癌癥細(xì)胞上的推定的抗原的免疫反應(yīng)。第二種是使用這樣的抗
體，所述抗體靶向生長(zhǎng)受體，并且干擾它們的功能，或下調(diào)所述受體，以致有效地喪失其功
能。第三種是所述抗體對(duì)細(xì)胞表面部分的直接連接的作用，所述細(xì)胞表面部分的直接連接
可能導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，諸如死亡受體如TRAIL R1或TRAIL R2的連接，或整聯(lián)蛋白分子
9如aV 13 3的連接等。 癌癥藥物的臨床應(yīng)用基于所述藥物在對(duì)患者的可接受的危險(xiǎn)模式下的益處。在癌癥治療中，通常是在益處之后最追求生存，然而，除了延長(zhǎng)生命之外，還存在許多其它公認(rèn)的益處。這些其它的益處，其中治療沒有不利地影響生存，包括癥狀減輕，針對(duì)不利事件的保護(hù)，復(fù)發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)或沒有疾病的生存，并且延長(zhǎng)發(fā)展的時(shí)間。這些標(biāo)準(zhǔn)通常被接受，并且管理團(tuán)體如美國(guó)食品及藥品管理局(F.D.A.)核準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld等.月中瘤學(xué)/血液學(xué)的重要綜述(Critical Reviews inOncology/Hematolgy) 42 :137-1432002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，公認(rèn)還存在其它的可以預(yù)示這些類型的益處的終點(diǎn)(endpoint)。部分地，由美國(guó)F. D. A.授予的加速的核準(zhǔn)流程承認(rèn)存在可能預(yù)測(cè)患者益處的替代品。到2003年年末，在這種流程下已經(jīng)核準(zhǔn)了 16種藥物，并且這些中有4種已經(jīng)繼續(xù)獲得了完全的核準(zhǔn)，即，隨后的研究已經(jīng)表明由替代品終點(diǎn)預(yù)測(cè)的直接的患者益處。確定藥物在實(shí)體瘤中的作用的一個(gè)重要的終點(diǎn)是通過測(cè)量針對(duì)治療的響應(yīng)而評(píng)估腫瘤負(fù)荷(Therasse等.國(guó)家癌癥研究所雜志(Journal of the National Cancer Institute) 92 (3):205-2162000)。關(guān)于所述評(píng)估的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已由癌癥國(guó)際專家組實(shí)體瘤工作組的響應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)公布。與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比較，對(duì)腫瘤負(fù)荷具有證明的作用的藥物，如根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)所述的目標(biāo)響應(yīng)所示，最終傾向于產(chǎn)生直接的患者益處。在臨床前設(shè)定中，腫瘤負(fù)荷通常更直接進(jìn)行評(píng)估和記錄。因?yàn)榕R床前研究可以轉(zhuǎn)換成臨床設(shè)定，在臨床前模型中產(chǎn)生延長(zhǎng)的生存的藥物具有最大的預(yù)測(cè)臨床用途。與產(chǎn)生針對(duì)臨床治療的積極響應(yīng)類似，在臨床前設(shè)定中減少腫瘤負(fù)荷的藥物還可能對(duì)疾病具有顯著的直接影響。盡管延長(zhǎng)生存是在癌癥藥物治療的臨床結(jié)果后最追求的，但是存在其它的益處，其具有臨床應(yīng)用，并且清楚地，可能與疾病發(fā)展的延遲、延長(zhǎng)的生存或二者相關(guān)的腫瘤負(fù)荷減少還可以導(dǎo)致直接的益處和具有臨床影響(Eckhardt等.發(fā)展的治療學(xué)目標(biāo)化合物的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功與失敗(DevelopmentalTherapeutics -Successes and Failures of Clinical TrialDesigns of TargetedCompounds) ;ASC0教育書，第39次年會(huì)，2003，第209-219頁)。
本發(fā)明描述了 AR92A271. 7的開發(fā)和應(yīng)用，AR92A271. 7通過其在細(xì)胞毒性測(cè)定中和在人癌癥的動(dòng)物模型中的作用而鑒定。本發(fā)明描述了這樣的試劑，所述試劑與靶分子上的一個(gè)或多個(gè)表位特異性結(jié)合，且作為裸抗體還具有針對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞而不針對(duì)正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性特性，并且其作為裸抗體還直接介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。另一個(gè)進(jìn)步是使用抗癌抗體諸如靶向表達(dá)同源抗原標(biāo)記的腫瘤的抗體來獲得腫瘤生長(zhǎng)抑制，以及其它積極的癌癥治療終點(diǎn)。 總之，本發(fā)明教導(dǎo)AR92A271. 7抗原作為治療劑耙標(biāo)的應(yīng)用，在施用時(shí)，其可以在哺乳動(dòng)物中減少表達(dá)所述抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷。本發(fā)明還教導(dǎo)CDMAB(AR92A271. 7)、以及它們的衍生物、及其抗原結(jié)合片段、和其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的配體的應(yīng)用，其靶向它們的抗原，以減少在哺乳動(dòng)物中表達(dá)所述抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)在癌性細(xì)胞中檢測(cè)AR92A271.7抗原的應(yīng)用，所述應(yīng)用可以有效用于攜帶表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物
的診斷、治療預(yù)測(cè)、和預(yù)后。 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是利用產(chǎn)生針對(duì)來源于特定個(gè)體的癌性細(xì)胞或一種或多種特定的癌癥細(xì)胞系的減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)的方法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，和所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的相對(duì)應(yīng)的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，所述CDMAB對(duì)于癌癥細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，但是同時(shí)對(duì)于非癌性細(xì)胞相對(duì)是無毒的。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是教導(dǎo)減輕癌性疾病的抗體，其配體和抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性是它們催化細(xì)胞的化學(xué)鍵水解的能力的功能。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，所述抗體有效用于癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的結(jié)合測(cè)定。 本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將通過下述描述變得清楚，其中通過舉例說明和實(shí)施例
的方式描述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。 附圖簡(jiǎn)述

圖1比較雜交瘤上清針對(duì)細(xì)胞系A(chǔ)549，NCI-H23，NCI-H460，MDA-MB-231和Hs888.Lu的細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)和結(jié)合水平。 圖2描述AR92A271. 7與癌癥和正常細(xì)胞系的結(jié)合。將數(shù)據(jù)列表以將平均熒光強(qiáng)度表示為高于同種型對(duì)照增加的倍數(shù)。 圖3包括針對(duì)若干癌癥和非_癌細(xì)胞系的AR92A271. 7和抗-EGFR抗體的代表性FACS柱狀圖。 圖4顯示在預(yù)防性A549肺癌模型中AR92A271. 7對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。垂直的虛線表示施用抗體的時(shí)間期間。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值+/_SEM。 圖5顯示在預(yù)防性A549肺癌模型中AR92A271. 7對(duì)體重的影響。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均
值+/_SEM。 發(fā)明詳述 —般地，當(dāng)用于概述、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求中時(shí)，下述詞語或短語具有所示的定義。 術(shù)語"抗體"以最寬泛的意義使用，并且特別涵蓋，例如，單一的單克隆抗體(包括激動(dòng)劑、拮抗劑、和中和抗體、去免疫的(de-immunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，免疫綴合物和抗體片段(見下文)。
當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語"單克隆抗體"是指從一群基本上均一的抗體獲得的抗體，即，除了可能以較少量存在的可能天然存在的突變之外，構(gòu)成(comprising)所述群體的個(gè)體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一的抗原性位點(diǎn)。此外，多克隆抗體制劑包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體，與所述多克隆抗體制劑相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性，因?yàn)閱慰寺】贵w可以不被其它抗體污染地合成，所以單克隆抗體是有利的。修飾詞"單克隆"表示該抗體的特征是從基本上均一的抗體群體獲得，并且不被解釋為抗體的生產(chǎn)需要通過任何特定的方法。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler等，自然(Nature) ，256 :495(1975)首先描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備，或可以通過重組DNA方法(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4，816， 567)制備。"單克隆抗體"還可以從噬菌體抗體文庫分離，例如，使用Clackson等，自然(Nature) ， 352 :624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) ， 222 :581-597 (1991)中所述的技術(shù)。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原一結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括小于全長(zhǎng)的抗體，F(xiàn)ab， Fab' ， F(ab' )2，和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整的"抗體是一種包括抗原一結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CJ和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl、CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。
取決于它們的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同的"種類"。存在5種主要類別的完整抗體IgA， IgD， IgE， IgG，和IgM，并且它們中的一些可以進(jìn)一步分成"亞類"(同種型)，例如，IgGl， IgG2， IgG3， IgG4， IgA，和IgA2。與不同種類的抗體相對(duì)應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別叫作a ， S ， e ， y，和ii 。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。 抗體"效應(yīng)子功能"是指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)，等。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcRs)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別在靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體，并且隨后引起該靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，即NK細(xì)胞，僅表達(dá)FcYRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI， FcyRII和FcyRIII。 FcR在造血細(xì)胞上的表達(dá)總結(jié)在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年度綜述(Annu. Rev. Immunol) 9 :457-92(1991)的第464頁表3中。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定，諸如在美國(guó)專利號(hào)5， 500， 362或5， 821， 337中所述的測(cè)定。對(duì)于所述測(cè)定有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估，例如，在動(dòng)物模型中，諸如在Clynes等.PNAS(USA)95 :652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中。"效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcRs并且執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞至少表達(dá)Fc y RIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)，天然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；其中PBMCs和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如，從血液或PBMCs分離，如本發(fā)明所述。 術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用來描述結(jié)合抗體的Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然人FcR序列。此外，優(yōu)選的FcR是一種結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體)，并且包括Fc y RI，F(xiàn)c y RII，和Fc y RIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的可變剪接形式。Fc y RII受體包括Fc yRIIA("激活受體")和Fc yRIIB("抑制受體")，它們具有主要在它們的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的相似的氨基酸序列。激活受體FcYRIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見在M. Da e ron，免疫學(xué)年度綜述(Annu. Rev. Immunol.) 15 : 203-234 (1997)中的綜述)。FcRs在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年度綜述(Annu. Rev. Immunol)9 :457-92(1991) ;C即el等，免疫學(xué)方法(Immunomethods)4 :25-34(1994);和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志(J. Lab. Clin. Med.) 126 :330-41(1995)中綜述。其它FcRs，包 括將在將來鑒定的那些，包含在本發(fā)明的術(shù)語"FcR"中。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn， 其負(fù)責(zé)將母親的IgGs轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 117 :587(1976)和 Kim等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur. J. Immunol.) 24 :2429 (1994))。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"是指在存在補(bǔ)體的條件下分子裂解靶點(diǎn)的能力。 補(bǔ)體激活途徑通過補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)同與同源抗原復(fù)合的分子(例如，抗體)的 結(jié)合而起始。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測(cè)定，例如，如在Gazzano-Santoro等，免疫 學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 202 :163(1996)中所述。 術(shù)語"可變"是指這樣的事實(shí)，S卩，可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在序列上在抗體之間大 量不同，并且用在每種特定的抗體對(duì)于其特定的抗原的結(jié)合和特異性中。然而，在抗體的整 個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中可變性不是均勻分布的。它集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)稱為高變區(qū)的 三個(gè)片段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié) 構(gòu)域分別包括4個(gè)FRs，其主要采取P-折疊構(gòu)型，通過三個(gè)高變區(qū)連接，其形成環(huán)連接，并 且在某些情形中形成P-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FRs緊密相鄰保持在 一起，并且與另一條鏈的高變區(qū)一起有助于形成抗體的抗原_結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等，免疫 學(xué)興趣的蛋白的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5片反.公共 衛(wèi)生服務(wù)(Public HealthService)，全國(guó)衛(wèi)生研究所(National Institutes ofHealth)， Bethesda， Md.卯15_17 ;48-53 (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表 現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，諸如在抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)中的抗體參與。
當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語"高變區(qū)"是指抗體負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變 區(qū)通常包括來自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 中的殘基24-34 (LI) ， 50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35 (HI)， 50-65(H2)和95-102(H3) ;Kabat等，免疫學(xué)興趣的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版 公共衛(wèi)生服務(wù)(Public Health Service)，全國(guó)衛(wèi) 生研究所(National Institutesof Health), Bethesda, Md. pp 15-17 ;48-53(1991))和 /或來自"高變環(huán)"的那些殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32 (LI) ，50-52 (L2) 和91-96(L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32 (HI) ，53-55 (H2)和96-101(H3) ;Chothia和 Lesk，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 196 :901-917 (1987))。"構(gòu)架區(qū)"或"FR"殘基是除
了如本文所定義的所述高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生 兩種相同的抗原-結(jié)合片段，其稱為"Fab"片段，每個(gè)具有單個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)，和剩余的 "Fc"片段，它的名稱反應(yīng)了它容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab' )2片段，其具有 兩個(gè)抗原_結(jié)合位點(diǎn)，并且仍然能夠交聯(lián)抗原。 "Fv"是包含完整的抗原_識(shí)別和抗原_結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊 密、非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)型中每個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用，以限定在Vf、二聚體表面上的抗原-結(jié)合位點(diǎn)?；\統(tǒng) 地，6個(gè)高變區(qū)賦予抗體的抗原-結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括對(duì)抗
13原特異的3個(gè)高變區(qū)的Fv的一半)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管是以比完整的結(jié)合位 點(diǎn)低的親和力結(jié)合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH 1)。 Fab'片段不同于Fab片段，其通過在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端添加幾個(gè)殘基而不同，所述添 加的殘基包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH在本發(fā)明中是Fab'的名 稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離的巰基(thiol)基團(tuán)。F(ab' )2抗 體片段最初作為一對(duì)Fab'片段產(chǎn)生，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化 學(xué)偶聯(lián)也是已知的。 基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的"輕鏈" 可以被指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同的類型稱為k即pa(K )和 lambda(入)。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包括抗體的VH和、結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于 單一的多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包括在VH和、結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，其使得scFv 能夠形成用于抗原結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv的綜述，參見Plilckthun，在單克隆抗體的藥 理學(xué)(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)中，巻113， Rosenburg禾口 Moore編， Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994)。 術(shù)語"雙抗體"是指具有兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包括與在 同一多肽鏈(VH_VJ中的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VJ連接的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太 短而不允許在同一條鏈中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間成對(duì)的連接體，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的 互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域成對(duì)，并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)。例如，在EP 404，097;W0 93/11161 ;和 Hollinger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ，90 :6444-6448 (1993)中 更充分地描述了雙抗體。"分離的"抗體是一種已經(jīng)被鑒定并且與其天然環(huán)境的成分分離和/或從中回收的 抗體。它的天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，并且可以包括酶、激 素、和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。因?yàn)閷⒉淮嬖诳贵w天然環(huán)境的至少一種成分，分離的抗體包 括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體。然而，一般地，分離的抗體應(yīng)該通過至少一個(gè)純化步驟制備。
與目的抗原"結(jié)合"的抗體是一種能夠以充足的親和力結(jié)合所述抗原的抗體，以便 所述抗體通過靶向表達(dá)所述抗原的細(xì)胞而有效用作治療或診斷劑。在所述抗體是一種結(jié)合 抗原性部分的抗體的情形中，與其它受體相反，它通常優(yōu)先結(jié)合所述抗原性部分，并且不包 括偶然發(fā)生的結(jié)合，如非特異性Fc接觸，或不包括與其它抗原所常見的翻譯后修飾結(jié)合， 并且可以是一種不與其它蛋白顯著交叉反應(yīng)的抗體。用于檢測(cè)與目的抗原結(jié)合的抗體的方 法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、細(xì)胞ELISA和蛋白質(zhì)印跡的測(cè) 定。 當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，表述"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可以互換地使用，并且 所有這樣的名稱包括后代。還應(yīng)該理解，由于故意的或偶然的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容 物上可能不是精確相同的。包括在初始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的 突變的后代。這將通過使用不同名稱的上下文變得清楚。"治療或處理"是指治療性治療和預(yù)防或預(yù)防性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減 輕)目的病理癥狀或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那些，以及傾向于患有病 癥的那些，或要預(yù)防病癥的那些。因此，在本發(fā)明中待治療的哺乳動(dòng)物可以已經(jīng)診斷患有病癥或可以是傾向于或易受病癥影響的。 術(shù)語"癌癥"和"癌性的"是指或描述哺乳動(dòng)物中的生理狀況，所述生理狀況的典 型特征在于失控的細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡。癌癥的實(shí)例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚細(xì)胞瘤，肉 瘤，和白血病或淋巴惡性病。所述癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì) 胞癌)，肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌， 胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌， 肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液 腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌癥，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
"化療劑"是有效用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷基化試劑， 如塞替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN );烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶 類如苯佐替派(benzodopa)，卡波醌，美妥替哌(meturedopa)，和烏瑞替哌(uredopa); ethylenimines和methylamelamines，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷酰胺，塞替 哌(triethylenethiophosphoramide)禾口三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥 (nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlornaphazine) ， cholophosphamide，雌 莫司汀，異環(huán)磷酰胺，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥，美法侖，新氮芥，苯芥膽甾 醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司?。粊喯趸?nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素， 福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司??；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放 線菌素，authramycin，偶氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C， calicheamicin， carabicin， carnomycin，嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正 亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達(dá)比星，馬塞羅霉素，絲裂霉素，麥考酚酸，諾 拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin，嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉 素，鏈佐星，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨喋呤和5-氟尿 嘧啶(5-FU);葉酸類似物如denopterin，甲氨喋呤，喋羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟 達(dá)拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷，6-氮尿 苷，卡莫氟，阿糖胞昔，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-FU ;雄激素諸如卡 普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如 氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補(bǔ)償物如frolinic acid ;醋葡醛內(nèi)酯；羥醛磷酰胺配 糖(aldophosphamideglycoside) ;5-氨基酮戊酸；安吖啶;bestrabucil ;比生群；依達(dá) 曲沙(edatraxate) ;defofamine ;秋水仙胺；地吖醌；elformithine ;依利醋銨；依托格 魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴 司他??；異丙嗪(phenamet);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙 卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三 乙胺；烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇； 哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如， 紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新澤西)和多西他 賽(TAXOTERE , Aventis， Rhone-Poulenc Rorer， Antony,法國(guó))；苯丁酸氮芥；吉 西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉬類似物如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊 苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C ;米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾消靈
(novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-ll ;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑
15制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMF0);視黃酸；esperamicins ;卡培他濱；以及任何上述
物質(zhì)的藥用鹽、酸或衍生物。下列物質(zhì)也包含在本定義中，它們是作用調(diào)控或抑制激素
對(duì)腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素藥，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶
的4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene， LY117018，奧那司酮，和托瑞米芬 (Fareston);和抗雄激素藥諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及 任何上述物質(zhì)的藥用鹽、酸或者衍生物。 用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"是指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人，小鼠， SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如綿羊、狗、 馬、貓、牛、等等。在本發(fā)明中優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。"寡核苷酸"是長(zhǎng)度短的、單鏈或雙鏈的多脫氧核苷酸，其通過已知方法化學(xué)合成 (如磷酸三酯、亞磷酸酯、或亞磷酰胺化學(xué)，使用固相技術(shù)，如在1988年5月4日公布的EP 266,032中所述的，或通過脫氧核苷H-磷酸酯中間物，如Froehler等，核酸研究(Nucl. Acids Res.) ， 14 :5399-5407， 1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化它們。
按照本發(fā)明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和/或"嵌合的"形式是 指這樣的抗體，所述抗體包含特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab， Fab' ，F(xiàn)(ab')2或抗體的其它抗原-結(jié)合亞序列)，與原始抗體相比較，其導(dǎo)致人抗_小鼠抗 體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)或人抗_人抗體(HAHA)反應(yīng)的減少，并且所述抗體包 含來源于所述非人免疫球蛋白的、對(duì)再現(xiàn)所需要的作用是必需的必需部分(例如，一個(gè)或 多個(gè)CDR(s)、抗原結(jié)合區(qū)、可變結(jié)構(gòu)域等)，同時(shí)保留與所述非人免疫球蛋白相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特 征。對(duì)于大部分，人源化的抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該受體抗體 互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的殘基被來自非人物種(供體抗體)CDRs的、具有需要的特異性、親 和性和能力的殘基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的 Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相對(duì)應(yīng)的非人FR殘基取代。此外，所述人源化的抗體可以包括在受 體抗體和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步限定和最 優(yōu)化抗體性能。通常，所述人源化的抗體應(yīng)該包括基本上不少于至少一個(gè)、和典型地兩個(gè)可 變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對(duì)應(yīng)，并且所有或 基本上所有的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體優(yōu)化地還應(yīng)該包 括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
"去免疫的(De-immunized)"抗體是對(duì)于給定的物種是無免疫原性的或較少免疫 原性的免疫球蛋白。去免疫可以通過抗體的結(jié)構(gòu)改變實(shí)現(xiàn)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知 的任何去免疫技術(shù)。例如，用于使抗體去免疫性的一種適宜的技術(shù)記述在于2000年6月15 日公布的WO 00/34317中。 誘導(dǎo)"程序性細(xì)胞死亡"的抗體是一種通過任何方式誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體， 所述方式示例而不限于，膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，細(xì)胞收縮，內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞片段化和/或膜囊泡的形成(稱為凋亡小體)。 當(dāng)用于本文時(shí)，"抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性"應(yīng)該理解為意指來源于由雜交瘤產(chǎn)生的 雜交瘤上清或抗體的細(xì)胞毒性作用，所述作用不必與結(jié)合程度相關(guān)，所述雜交瘤以保藏號(hào) 290507-04保藏在IDAC。 在整個(gè)說明書中，備選地，雜交瘤細(xì)胞系以及由其產(chǎn)生的分離的單克隆抗體由它們的內(nèi)部命名AR92A271. 7或保藏命名IDAC 290507-04指示。 當(dāng)用于本文時(shí)，"抗體-配體"包括這樣的部分，所述部分表現(xiàn)出針對(duì)耙抗原的至 少一個(gè)表位的結(jié)合特異性，并且其可以是完整的抗體分子、抗體片段、以及至少具有它的 抗原-結(jié)合區(qū)或部分(即，抗體分子的可變部分)的任何分子，例如，F(xiàn)v分子，F(xiàn)ab分子， Fab'分子，F(xiàn)(ab' )2分子，雙特異性抗體，融合蛋白，或特異性識(shí)別和結(jié)合由分離的單克隆 抗體結(jié)合的抗原的至少一個(gè)表位的任何遺傳工程分子，所述分離的單克隆抗體由命名為 IDAC290507-04(IDAC 290507-04抗原)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。 當(dāng)用于本文時(shí)，"減輕癌性疾病的抗體"(CDMAB)是指這樣的單克隆抗體及其抗 體_配體，所述單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過程，例如，通過減少腫瘤負(fù) 荷或延長(zhǎng)腫瘤攜帶個(gè)體的生存的方式。 當(dāng)用于本文時(shí)，"抗原_結(jié)合區(qū)"意指分子識(shí)別靶抗原的部分。
當(dāng)用于本文時(shí)，"競(jìng)爭(zhēng)性抑制"意指使用常規(guī)的交互(reciprocal)抗體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定 (Belanger L. ， Sylvestre C.和Dufour D. (1973)，通過競(jìng)爭(zhēng)性和夾心方法對(duì)a胎蛋白的 酶聯(lián)免飽則定(Enzyme linked immunoassay for alphafetoprotein by competitive and sandwich procedures) Clinica Chimica Acta 48， 15)能夠識(shí)別和結(jié)合這樣的決定簇位 點(diǎn)，所述決定簇位點(diǎn)是由命名為IDAC290507-04的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(IDAC 290507-04抗體)所針對(duì)的。 當(dāng)用于本文時(shí)，"靶抗原"是IDAC 290507-04抗原或其部分。 當(dāng)用于本文時(shí)，"免疫綴合物"意指任何分子或CDMAB，如與細(xì)胞毒素、放射性試劑、
酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑化學(xué)或生物學(xué)連接的抗體。所述抗體或CDMAB可以在分子
的任何位置處與所述細(xì)胞毒素、放射性試劑、腫瘤藥或治療藥物連接，只要它能夠結(jié)合其靶
點(diǎn)。免疫綴合物的實(shí)例包括抗體毒素化學(xué)綴合物和抗體_毒素融合蛋白。 當(dāng)用于本文時(shí)，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原結(jié)合區(qū)與生物活性分子
如毒素、酶、或蛋白藥物連接。 為了更充分地理解本文所述的本發(fā)明，進(jìn)行了下述描述。 本發(fā)明提供特異性識(shí)別和結(jié)合IDAC 290507-04抗原的CDMAB (即，IDAC 290507-04CDMAB)。 通過以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的CDMAB 可以以任何形式存在，只要它具有這樣的抗原_結(jié)合區(qū)，所述抗原_結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)性抑制由雜 交瘤IDAC 290507-04產(chǎn)生的分離的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異性結(jié)合。因此，具有 與IDAC 290507-04抗體相同的結(jié)合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗 體與第二蛋白如淋巴因子或腫瘤抑制性生長(zhǎng)因子結(jié)合)均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDMAB是IDAC 290507-04抗體。
在其它實(shí)施方案中，所述CDMAB是抗原結(jié)合片段，其可以是Fv分子(如單鏈Fv 分子)、Fab分子、Fab'分子、F(ab' )2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體或具有 IDAC 290507-04抗體的抗原_結(jié)合區(qū)的任何重組分子。本發(fā)明的CDMAB針對(duì)所述IDAC 290507-04單克隆抗體針對(duì)的表位。 本發(fā)明的CDMAB可以在分子內(nèi)進(jìn)行修飾，即，通過氨基酸修飾，以產(chǎn)生衍生物分 子。化學(xué)修飾也可以是可能的。
衍生物分子將保留所述多肽的功能特性，S卩，具有這樣的取代的分子仍然允許所 述多肽與所述IDAC 290507-04抗原或其部分結(jié)合。 這些氨基酸取代包括，但不必要限于，本領(lǐng)域內(nèi)已知為"保守的"氨基酸取代。
例如，充分確定的蛋白質(zhì)化學(xué)原理認(rèn)為，通?？梢栽诘鞍踪|(zhì)內(nèi)進(jìn)行稱為"保守氨基 酸取代"的特定的(certain)氨基酸取代，而不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的構(gòu)象或功能。
這樣的變化包括用異亮氨酸(I)，纈氨酸(V)，和亮氨酸(L)中的任一種取代這些 疏水性氨基酸中的任意其它一種；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨 酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，并且反之亦 然。其它取代也可以被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白質(zhì)的三維結(jié) 構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常?？梢曰Q，同樣丙氨酸和纈氨酸(V)也可 以互換。相對(duì)疏水性的甲硫氨酸(M)常?？梢耘c亮氨酸和異亮氨酸互換，并且有時(shí)可以與 纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)常常在這樣的情形中互換，在所述情形中，氨基酸殘 基的重要特征是其電荷，并且這兩種氨基酸殘基的不同的pK' s并不顯著。在特定的情形
中，還有其它的變化可以被認(rèn)為是"保守的"。
實(shí)施例1 雜交瘤生產(chǎn)——雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R92A271. 7 依據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R92A271.7于2007年5月29日保藏在加拿 大國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(the International D印ository Authority ofCanada， IDAC)，力口拿大衛(wèi) 生部微生物局(Bureau of Microbiology, HealthCanada)(加拿大，馬尼托巴省，溫尼伯， Arlington街1015， R3E 3R2)，保藏號(hào)為290507-04。依據(jù)37CFR 1. 808，保藏者保證在授予 專利時(shí)，施加在所保藏的材料的公眾可獲得性上的所有約束均不能撤銷。如果保藏機(jī)構(gòu)不 能發(fā)放存活的樣品，替換保藏品。 為了產(chǎn)生生產(chǎn)抗癌抗體AR92A271.7的雜交瘤，在PBS中制備冷凍的人肺腺癌腫 瘤組織(Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的單細(xì)胞混懸液。通過輕輕混合制備 I匪UNEASYTM(Qiagen， Venlo，荷蘭)佐劑用于使用。通過皮下注射在50微升的抗原佐劑中 的200萬個(gè)細(xì)胞而免疫5-7周齡的BALB/c小鼠。在初次免疫后2和5周，用新鮮制備的抗 原佐劑對(duì)免疫的小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)加強(qiáng)，濃度為200萬個(gè)細(xì)胞/50微升。在最后一次免疫后 3天，使用脾臟進(jìn)行融合。通過將分離的脾細(xì)胞與NS0-1骨髓瘤配偶體融合而制備雜交瘤。 對(duì)雜交瘤亞克隆，檢測(cè)來自融合物的上清。 為了確定該雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是IgG還是IgM同種型，使用ELISA測(cè)定。在 4°C在ELISA平板中加入100微升/孔的山羊抗-小鼠IgG+IgM (H+L)過夜，所述山羊抗-小 鼠IgG+IgM(H+L)在包被緩沖液(0. 1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH 9. 2-9. 6)中，濃度2. 4 微克/mL。將平板用洗滌緩沖液(PBS+0. 05%吐溫)洗滌3次。向平板加入100微升/孔 的封閉緩沖液(在洗滌緩沖液中5%牛奶)，在室溫下1小時(shí)，然后在洗滌緩沖液中洗滌3 次。加入100微升/孔的雜交瘤上清，并且將平板在室溫下溫育1小時(shí)。平板用洗滌緩沖 液洗滌3次，并且加入山羊抗-小鼠IgG或IgM辣根過氧化物酶綴合物的1/100， 000稀釋 液(稀釋在含有5%牛奶的PBS中)，100微升/孔。在將平板在室溫下溫育1小時(shí)后，將平 板用洗滌緩沖液洗滌3次。將100微升/孔的TMB溶液在室溫下溫育1-3分鐘。加入50 微升/孔2M H2S04終止顏色反應(yīng)，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板讀數(shù)儀在450nm下對(duì)平板讀數(shù)。如在圖1中所示，AR92A271. 7雜交瘤主要分泌IgG同種型的抗體。 為了確定由所述雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體的亞類，使用小鼠單克隆抗體同種型試劑
盒(HyCult生物技術(shù)(HyCult Biotechnology) ，F(xiàn)rontstraat，荷蘭)進(jìn)行同種型分型實(shí)驗(yàn)。
將500微升緩沖液加入到包含大鼠抗-小鼠亞類特異性抗體的檢測(cè)試驗(yàn)條(test strip)。
將500微升雜交瘤上清液加入到檢測(cè)管，并通過輕輕攪動(dòng)浸沒。通過與膠體粒子偶聯(lián)的第
二大鼠單克隆抗體直接檢測(cè)捕獲的小鼠免疫球蛋白。這兩種蛋白質(zhì)的組合產(chǎn)生用于分析同
種型的視覺信號(hào)?？筥癌抗體AR92A271. 7是IgG2a、 k同種型的。 在一輪限制性稀釋后，在細(xì)胞ELISA測(cè)定中檢測(cè)雜交瘤上清的與靶細(xì)胞結(jié)合的 抗體。檢測(cè)了三種人肺癌細(xì)胞系、一種人乳腺癌細(xì)胞系和一種人非-癌肺細(xì)胞系分別為 A549， NCI-H23， NCI-H460， MDA-MB-231和Hs888. Lu。所有細(xì)胞系均從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心(ATCC，Manassas，VA)獲得。在使用前將接種的細(xì)胞固定。在室溫下，用含有MgCl2和 CaCl2的PBS洗滌平板三次。向每個(gè)孔中加入100微升稀釋在PBS中的2%低聚甲醛，在室 溫下10分鐘，然后倒掉。將平板再在室溫下用含有MgCl2和CaCl2的PBS洗滌三次。在室 溫下用100微升/孔在洗滌緩沖液(PBS+0. 05%吐溫)中的5%牛奶封閉1小時(shí)。將平板用 洗滌緩沖液洗滌三次，并且以75微升/孔加入雜交瘤上清，在室溫下1小時(shí)。將平板用洗滌 緩沖液洗滌3次，并且加入100微升/孔與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗_小鼠IgG或IgM 抗體的1/25， 000稀釋液(稀釋在含有5%牛奶的PBS中)。在室溫下溫育1小時(shí)后，將平 板用洗滌緩沖液洗滌3次，并且將100微升/孔的TMB底物在室溫下溫育1-3分鐘。用50 微升/孔2M H2S04終止反應(yīng)，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板讀數(shù)儀在450nm下對(duì)平板 讀數(shù)。列在圖1中的結(jié)果表示為與內(nèi)部(in-house)IgG同種型對(duì)照相比高出背景的倍數(shù)， 所述內(nèi)部IgG同種型對(duì)照先前已經(jīng)表明不與所檢測(cè)的細(xì)胞系結(jié)合。來自雜交瘤AR92A271. 7 的抗體顯示出與測(cè)試細(xì)胞系的可檢測(cè)的結(jié)合，其具有與A549肺癌細(xì)胞系的最高可檢測(cè)結(jié) 合和與Hs888. Lu肺細(xì)胞系的最低可檢測(cè)結(jié)合。 與檢測(cè)抗體結(jié)合聯(lián)合，在下述細(xì)胞系中檢測(cè)雜交瘤上清的細(xì)胞毒性作用(抗體誘 導(dǎo)的細(xì)胞毒性)A549， NCI-H23， NCI-H460， MDA-MB-231和Hs888. Lu。鈣熒光素AM從分子 探針(Molecular Probes) (Eugene, OR)獲得，并且按照下文所述進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定前將細(xì) 胞以預(yù)先確定的適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N。2天后，將來自雜交瘤微量滴定板的75微升上清轉(zhuǎn)移到 細(xì)胞平板中，并且在5% (A培養(yǎng)箱中溫育5天。抽空作為陽性對(duì)照的孔，加入100微升溶 解在培養(yǎng)基中的疊氮鈉(NaN3，.01X，西格瑪(Sigma) ，0akville，ON)，或放線菌酮(CHX，O. 5 微摩爾，西格瑪(Sigma) ， 0akville， ON)。在處理5天后，然后通過倒置將平板倒空，并且 吸干。從多通道擠壓瓶向每個(gè)孔中分配含有MgCl2和CaCl2的室溫DPBS(Dulbecco' s磷酸 鹽緩沖液)，輕敲3次，通過倒置倒空然后吸干。向每個(gè)孔中加入50微升稀釋在含有MgCl2 和CaCl2的DPBS中的熒光鈣熒光素染料，并且在37t:在5% C02培養(yǎng)箱中溫育30分鐘。在 Perkin-Elmer HTS7000熒光平板讀數(shù)儀中對(duì)平板讀數(shù)，并且在Microsoft Excel中分析數(shù) 據(jù)。結(jié)果列在圖1中。來自AR92A271. 7雜交瘤的上清對(duì)NCI-H23細(xì)胞產(chǎn)生41%的特異性 細(xì)胞毒性。這是用陽性對(duì)照疊氮化鈉和放線菌酮分別對(duì)NCI-H23獲得的細(xì)胞毒性的47%和 132%。對(duì)非-癌肺細(xì)胞系Hs888.Lu不存在可觀察到的細(xì)胞毒性。已知的非-特異性細(xì)胞 毒素試劑放線菌酮和NaN3如所料通常產(chǎn)生細(xì)胞毒性。來自圖1的結(jié)果證明AR92A271.7的細(xì)胞毒性作用不與癌細(xì)胞類型上的結(jié)合水平成比例。在四種測(cè)試的癌細(xì)胞系上存在可檢測(cè)的結(jié)合，且細(xì)胞毒性僅與NCI-H23相關(guān)。如 在表1中列表，AR92A271. 7在Hs888. Lu非癌人肺細(xì)胞系中不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
實(shí)施例2
體外結(jié)合 通過在CL-1000燒瓶(BD生物科學(xué)(BD Biosciences), 0akville， ON)中培養(yǎng)雜 交瘤而生產(chǎn)AR92A271. 7單克隆抗體，收集和再接種以兩次/周進(jìn)行。接著使用蛋白質(zhì)G 瓊月旨糖4 Fast Flow (Protein G S印harose 4 Fast Flow)(安瑪西亞生物科學(xué)(Amersham Biosciences), Baie d' Urf6， QC)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的抗體純化步驟。使用人源化的、去免疫的、嵌 合的或鼠單克隆抗體在本發(fā)明范圍之內(nèi)。 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(FACS)評(píng)估AR92A271. 7與肺(A549， NCI-H23， NCI-H322M， NCI-H460和NCI-H520)，結(jié)腸(Lovo)，乳腺(MDA-MB-231)，胰腺(BxPC-3)，前列腺(PC-3) 和卵巢(0VCAR-3)癌細(xì)胞系，和來自皮膚(CCD-27sk)和肺(Hs888. Lu)的非-癌細(xì)胞系的 結(jié)合。全部細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Tissue Collection) (ATCC， Manassas, VA)。 通過最初用0 85(無&++和1%++)清洗細(xì)胞單層，為FACS準(zhǔn)備細(xì)胞。然后使用細(xì) 胞解離緩沖液(Invitrogen， Burlington, ON)在37"C將細(xì)胞從它們的細(xì)胞培養(yǎng)板中移出。 離心和收集后，將細(xì)胞在4t:重新混懸在包含MgCl2，CaCl2和2X胎牛血清的DPBS中(染色 培養(yǎng)基)并計(jì)數(shù)，等分為適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，離心沉淀細(xì)胞并在存在檢測(cè)抗體(AR92A271.7) 或?qū)φ湛贵w(同種型對(duì)照，抗-EGFR(c225， IgGl， k ， Cedarlane， Homby 0N))的條件下，在 4°C ，重新混懸在染色培養(yǎng)基中。在冰上，以20微克/mL評(píng)估同種型對(duì)照和檢測(cè)抗體，而以 5微克/mL評(píng)估抗-EGFR 30分鐘。加入Alexa Fluor 546-綴合的二次抗體前，用染色培 養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次。然后，在4t:，添加染色培養(yǎng)基中的Alexa Fluor 546-綴合抗體30分 鐘。再最后清洗細(xì)胞一次并重新混懸在固定培養(yǎng)基(包含1.5%低聚甲醛的染色培養(yǎng)基) 中。通過利用FACSarray 系統(tǒng)軟件在FACSarray 上運(yùn)行樣品評(píng)估細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)采 樣(BD生物科學(xué)(BD Biosciences) ，Oakville， ON)。通過調(diào)節(jié)FSC和SSC檢測(cè)器上的電壓 和振幅增加設(shè)置細(xì)胞正向(FSC)和側(cè)向擴(kuò)散(SSC)。通過運(yùn)行未染色的細(xì)胞調(diào)節(jié)用于熒光 (Alexa-546)通道的檢測(cè)器，從而使細(xì)胞具有約1_5單位中等熒光強(qiáng)度的一致的峰。對(duì)于每 份樣品，獲得約10， 000門控事件(染色的固定細(xì)胞)以進(jìn)行分析，并將結(jié)果顯示在圖2中。
圖2顯示超過同種型對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度倍數(shù)增加。圖3編輯AR92A271.7 抗體的代表性柱狀圖。AR92A271.7被證明了與測(cè)試細(xì)胞系的結(jié)合。存在與肺 NCI-H23 (26. 2-倍)，NCI-H322M(30. 5-倍)和NCI-H460 (28. 1_倍)癌細(xì)胞系的強(qiáng)結(jié) 合。還存在與肺A549 (19. 3-倍)和NCI-H520 (14. 5-倍)，結(jié)腸Lovo (18. 3_倍);乳 腺M(fèi)DA-MB-231 (18. 0-倍)；胰腺BxPC-3 (9. 5-倍)；前列腺PC-3 (6. 5-倍)和卵巢 0VCAR-3(16. 3-倍)癌細(xì)胞系和非_癌皮膚CCD-27sk(7. 0-倍)和肺Hs888. Lu(5. 5-倍) 細(xì)胞系的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)證明AR92A271. 7與具有不同抗原表達(dá)水平的若干不同細(xì)胞系具 有最強(qiáng)的結(jié)合。非癌皮膚和肺細(xì)胞系上存在可檢測(cè)但較低的抗原表達(dá)，其與實(shí)施例1中的 結(jié)合相一致。
實(shí)施例3 使用A549細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例1證明AR92A271. 7具有針對(duì)人肺癌細(xì)胞系的抗癌特性。為了證明針對(duì)人 肺癌細(xì)胞系的體內(nèi)功效，在A549肺癌異種移植模型中測(cè)試AR92A271. 7。參考圖4和5，對(duì) 6-8周齡雌性SCID小鼠通過在右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的100萬人肺 癌細(xì)胞(A549)。將小鼠隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每組10只。在植入后那天，在用含有2.7mM KCl，lmM KH2P04，137mM NaCl和20mM Na2HP04的稀釋劑從儲(chǔ)備的濃縮液稀釋后，對(duì)每組腹膜 內(nèi)施用300微升體積的20mg/kg的AR92A271. 7檢測(cè)抗體或緩沖液對(duì)照。然后，在研究持續(xù) 時(shí)間內(nèi)，每周一次施用所述抗體和對(duì)照樣品。約每隔7天用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。在8劑量 抗體注射后，結(jié)束本研究。在研究持續(xù)時(shí)間內(nèi)，每周一次記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)， 按照CCAC指導(dǎo)將所有動(dòng)物處死。 AR92A271.7在人肺癌A549體內(nèi)預(yù)防模型中減少腫瘤生長(zhǎng)。如在第49天，即處 理期間的最后一天時(shí)確定地，與緩沖液_處理的組相比，用Arius抗體AR92A271. 7處理以 48. 6% (p = 0. 0387， t-檢驗(yàn))減少A549腫瘤生長(zhǎng)(圖4)。 在整個(gè)研究過程中，不存在臨床毒性跡象。以每周時(shí)間間隔測(cè)量的體重是健康和
不能健壯生長(zhǎng)(thrive)的替代品(surrogate)(圖5)。在處理期結(jié)束時(shí)各組間不存在平均
體重的顯著差異。從研究開始到結(jié)束各組內(nèi)不存在平均體重的顯著差異。 總之，在這種人肺癌異種移植模型中，AR92A271. 7是很好耐受的，并且減少腫瘤負(fù)荷。 實(shí)施例4 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑的分離 給定抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制CDMAB，例如競(jìng)爭(zhēng)性抗體，其 是一種識(shí)別相同表位的抗體(Belanger L等.Clinica ChimicaActa 48:15-18(1973))。 一種方法需要(entails)用這樣的免疫原進(jìn)行免疫，所述免疫原表達(dá)被所述抗體識(shí)別的抗 原。樣品可以包括，但不限于，組織、分離的蛋白或細(xì)胞系。得到的雜交瘤可以使用競(jìng)爭(zhēng) 測(cè)定進(jìn)行篩選，所述競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定是一種鑒定抑制測(cè)試抗體的結(jié)合的抗體的測(cè)定，諸如ELISA， FACS或蛋白質(zhì)印跡。另一種方法可以使用噬菌體展示抗體文庫，和淘選(panning)識(shí)別所 述抗原的至少一個(gè)表位的抗體(Rubinstein幾等.年度生物化學(xué)(Anal Biochem)314: 294-300(2003))。在每種情形中，基于抗體置換初始標(biāo)記抗體與其靶抗原的至少一個(gè)表位 的結(jié)合的能力，選擇抗體。因此，這樣的抗體將如初始抗體一樣具有識(shí)別抗原的至少一個(gè)表 位的特征。
實(shí)施例5 克隆AR92A271. 7單克隆抗體的可變區(qū) 可以確定由AR92A271. 7雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(、) 的可變區(qū)的序列。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括使用異硫氰酸胍進(jìn)行的細(xì)胞溶解(Chirgwin等.生 物化學(xué)(Biochem). 18 :5294-5299 (1979))，可以從受試雜交瘤提取編碼免疫球蛋白重鏈 和輕鏈的RNA。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的PCR方法(Sambrook等，編，分子克隆(Molecular Cloning)，第14章，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor laboratories Press)，紐 約.(1989))，可以使用mRNA制備cDNA，隨后分離VH和、基因?？梢酝ㄟ^自動(dòng)Edman測(cè)序 獨(dú)立地確定重鏈和輕鏈的N端氨基酸序列。還可以通過VH和、片段的氨基酸測(cè)序而確定 CDRs和側(cè)翼FRs的其他片段。然后，設(shè)計(jì)合成的引物，用于從AR92A271. 7單克隆抗體分離VH和、基因，并且可以將分離的基因連接到適當(dāng)?shù)妮d體中進(jìn)行測(cè)序。為了產(chǎn)生嵌合的和人
源化的IgG，可以將可變輕鏈和可變重鏈結(jié)構(gòu)域亞克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中進(jìn)行表達(dá)。
(i)單克隆抗體 使用常規(guī)方法容易地分離并測(cè)序編碼單克隆抗體(如在實(shí)施例1中所述)的 DNA(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼所述單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸 探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這樣的DNA的優(yōu)選來源。當(dāng)分離時(shí)，所述DNA可以置于表達(dá)載體 內(nèi)，然后將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，所述細(xì)胞不另外產(chǎn)生免疫球蛋白，以在重組宿主細(xì)胞中獲得 單克隆抗體的合成。也可以修飾所述DNA，例如，通過取代人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域編碼序 列替換同源鼠序列。也可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括含有交聯(lián)劑的那些方 法，體外制備嵌合抗體或雜交抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵構(gòu) 建免疫毒素。用于這一目的的適當(dāng)試劑的實(shí)例包括亞氨基硫羥酸鹽(iminothiolate)和甲 基+巰基butyrimickte。
(ii)人源化的抗體 人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人 氨基酸殘基通常稱為"引入"的殘基，其典型地來自"引入的"可變結(jié)構(gòu)域。可以通過 Winter及合作者的方法用嚙齒類CDRs或CDR序列取代相對(duì)應(yīng)的人抗體序列(Jones等， 自然(Nature)321 :522-525(1986) ;Riechmann等，自然(Nature)332 :323-327(1988); Verhoeyen等，科學(xué)(Science) 239 :1534-1536(1988);在Clark，今日免疫學(xué)(Immunol. Today) 21 :397-402(2000)中的綜述)進(jìn)行人源化。 可以通過使用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和不同概念人源化產(chǎn) 物的方法而制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的和熟悉 的。圖解和展示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可獲得 的。這些展示的觀察允許分析殘基在所述候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分 析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和引入序列 中選擇FR殘基且組合FR殘基，以便獲得需要的抗體特征，如對(duì)靶抗原增加的親和性。通常， CDR殘基直接且最顯著地(most substantially)參與影響抗原結(jié)合。
(iii)抗體片段 已經(jīng)開發(fā)了生產(chǎn)抗體片段的各種技術(shù)。這些片段可以通過重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生 (參考Hudson,現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)(Curr.Opin. Immunol. ) 11 :548-557(1999) ;Little等，今 日免疫學(xué)(Immunol. Today) 21 :364-370(2000))。例如，F(xiàn)ab' _SH片段可以直接從大腸桿 菌回收，并且化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段(Carter等，生物技術(shù)(Biotechnology) 10 : 163-167(1992))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab')2分子的組裝而 形成F(ab' )2。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離Fv，F(xiàn)ab或F(ab' )2 片段。 實(shí)施例6 包括本發(fā)明的抗體的組合物 本發(fā)明抗體可以用作預(yù)防/治療癌癥的組合物。所述包括本發(fā)明抗體的用于預(yù)防 /治療癌癥的組合物是低毒性的，并且它們可以采用液體制劑的形式施用，或作為適用于人
22或哺乳動(dòng)物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、犬、猿猴、等等)的制劑的藥物組合物口服或 腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、等等)施用。本發(fā)明抗體可以以本身施用，或可以作 為適當(dāng)?shù)慕M合物施用。用于所述施用的組合物可以包含藥用載體，和本發(fā)明抗體或其鹽，稀 釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用的藥物制劑的形式提供。
用于腸胃外施用的組合物的實(shí)例是可注射制劑、栓劑等?？勺⑸渲苿┛梢园ㄟ@ 樣的劑型，諸如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射，滴注，關(guān)節(jié)內(nèi)注射等等。這些可注射制劑可 以通過公知方法制備。例如，可注射制劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽溶解、混懸或乳化在 常規(guī)用于注射的無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中而制備。對(duì)于水性注射介質(zhì)，存在如生理鹽水， 含有葡萄糖和其他輔助試劑的等滲溶液等，其可以與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇)、多元 醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80， HC0-50(氫化蓖 麻油的聚氧乙烯(50mols)加合物))等組合使用。對(duì)于油性介質(zhì)，使用例如芝麻油、大豆油 等，其可以與增溶劑如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。這樣制備的注射劑通常裝在適當(dāng)?shù)?安瓿中。用于直腸施用的栓劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽與常規(guī)用于栓劑的基質(zhì)混合而 制備。用于口服施用的組合物包括固體或液體制劑，具體為片劑(包括糖衣和薄膜包衣片 劑)，丸劑、粒劑、粉末制劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳液、混懸液等。這樣的組合物通過 公知方法制備，并且可以包含常規(guī)用在藥物制劑領(lǐng)域中的載體(vehicle)、稀釋劑或賦形劑 (excipient)。用于片劑的載體(vehicle)或賦形劑(excipient)的實(shí)例包括乳糖、淀粉、 蔗糖、硬脂酸鎂等。 有利地，將上述用于口服或腸胃外應(yīng)用的組合物制備成適于符合活性成分劑量的 單位劑量的藥物制劑。所述單位劑量制劑包括，例如，片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓 劑、等等。所包含的前述化合物的量通常為5-500mg/劑量單位形式；優(yōu)選地特別是在注射 液形式中含有約5-約100mg的上述抗體，并且對(duì)于其他形式含有10-250mg的上述抗體。
前述包括本發(fā)明抗體的預(yù)防性/治療性藥劑或調(diào)節(jié)劑的劑量可以取決于下列各 項(xiàng)而不同被施用的受試者，目的疾病，病癥，施用途徑等等。例如，當(dāng)用于治療/預(yù)防目的 時(shí)，例如，治療/預(yù)防成年人中的乳腺癌時(shí)，有利地以約0. 01-約20mg/kg體重、優(yōu)選地約 0. 1-約10mg/kg體重且更優(yōu)選地約0. 1-約5mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體， 約1-5次/天，優(yōu)選約1-3次/天。在其他腸胃外和口服施用中，所述藥劑可以以與上述劑 量相對(duì)應(yīng)的劑量施用。當(dāng)病癥特別嚴(yán)重時(shí)，可以依據(jù)病癥增加劑量。 本發(fā)明抗體可以以其自身或以適當(dāng)組合物的形式施用。用于施用的組合物可以包 含藥用載體與前述抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用 (例如，血管內(nèi)注射、皮下注射等)的藥物制劑的形式提供。上述每種組合物還可以包含其 他活性成分。此外，本發(fā)明抗體可以與其他藥劑聯(lián)合使用，所述其他藥劑例如烷基化試劑 (例如，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，等)，代謝拮抗劑(例如，甲氨喋呤，5-氟尿嘧啶，等)，抗腫 瘤抗生素(例如，絲裂霉素，阿霉素，等)，植物來源的抗腫瘤藥(例如，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛， 泰素，等)，順鉑，卡鉑，依托泊苷，伊立替康，等。本發(fā)明抗體和上述藥物可以同時(shí)或以交錯(cuò) 的次數(shù)施用給患者。 大量的事實(shí)表明AR92A271. 7通過與癌癥細(xì)胞系上存在的表位連接而介導(dǎo)抗癌作 用。此外，可以表明，AR92A271.7抗體可以用于檢測(cè)表達(dá)與所述抗體特異性結(jié)合的表位的 細(xì)胞；這使用所例舉的但不限于FACS、細(xì)胞ELISA或IHC的技術(shù)。
23
本說明書中提及的所有專利和出版物象征本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有 的專利和出版物通過引用結(jié)合于此，以如同每篇單獨(dú)的出版物通過引用特別且獨(dú)立地指明 結(jié)合的相同程度結(jié)合。 應(yīng)該理解，盡管示例了本發(fā)明的某些形式，但是不限于本文所述和所示的部分的 特定形式或安排。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的范圍的條件下可以進(jìn)行各 種變化，并且本發(fā)明不應(yīng)該被視為限于在本說明書中所示和所述的內(nèi)容，這是顯而易見的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易地理解本發(fā)明充分適合實(shí)施所述目標(biāo)并且獲得所提及 的目的和益處以及其中固有的那些。本發(fā)明所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)的化 合物、方法、步驟和技術(shù)代表目前的優(yōu)選實(shí)施方案，意欲是示例性的，并且不意欲作為對(duì)范 圍的限制。其中的變化和其他應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是可以發(fā)生的，所述變化和其 他應(yīng)用包括在本發(fā)明的精神內(nèi)，并且由后附的權(quán)利要求的范圍限定。盡管已經(jīng)聯(lián)合特定優(yōu) 選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解所要求的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵抻谒?特定實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種改進(jìn) 意欲被包括在后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
加拿大國(guó)際保藏機(jī)構(gòu) 國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室，加拿大公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu) 1015Arlington Street 電話(204) 789-6030Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2傳真(204) 789-2018 國(guó)際表格IDAC/BP/4 原始保藏情形中的收據(jù)(按照布達(dá)佩斯條約細(xì)則Rule 7. 1發(fā)布) 附加原始保藏文本和存活證明復(fù)印件 本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受以下指定的微生物的保藏，其接收日期為2007年5月29日
為(保藏者名稱)-Valerie Harris,阿瑞斯研究公司
地址55 York Street, Suite 1600，多倫多，0N M5J 1R7
保藏鑒定 保藏者指定的參考AR92A271. 7
本IDA指定的保藏號(hào):290507-04
以上證明的保藏物伴隨 科學(xué)描述(詳列)_ 提議的分類命名(詳列)_ 授權(quán)代表IDAC的人員簽名
_ 日期2007年5月29日
加拿大國(guó)際保藏機(jī)構(gòu) 國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室，加拿大公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)
1015Arlington Street
Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2
國(guó)際表格IDAC/BP/9
電話:(204) 789-6030 傳真(204)789-2018:0172] 存活證明
:0173](按照布達(dá)佩斯條約細(xì)則Rule 10.2發(fā)布)
:0174] 發(fā)給存活證明的團(tuán)體
:0175] 名稱Ferris bander
:0176] 地址:2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida 33410
:0177] 保藏者
:0178] 名稱:Valerie Harris,阿瑞斯研究公司
:0179] 地址:55 York Street, Suite 1600,多倫多，0N M5.T 1R7
:0180] 保藏鑒定
:0181 ] 國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給出的保藏號(hào):290507-04
:0182] 原始保藏日期(或最近的相關(guān)日期):2007年5月29日
:0183] 存活測(cè)試
:0184] 在(最近的測(cè)試日期)測(cè)試的以上鑒定的保藏物的存活性
:0185] 在以上指定的日期，該培養(yǎng)物是
:0186] [X]存活
:0187] 不再存活
:0188] 進(jìn)行存活測(cè)試的條件(如果需要該信息并且測(cè)試的結(jié)果是陰性的，則填寫)
:0189] 授權(quán)代表IDAC的人員簽名
:0190] _
:0191 ] 曰期:2007年6月18日
權(quán)利要求
由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體。
2. 由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的人源化抗 體，或由所述人源化抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。
3. 由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的嵌合抗體， 或由所述嵌合抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。
4. 以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的分離的雜交瘤細(xì)胞系。
5. 在選自人腫瘤的組織樣品中起始抗體誘導(dǎo)的癌細(xì)胞細(xì)胞毒性的方法，所述方法包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體，由以保 藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號(hào) 290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，或其CDMAB，所述 CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力；禾口使所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其CDMAB與所述組織樣 品接觸；其中所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其CDMAB與所述組織 樣品的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。
6. 權(quán)利要求1的分離的單克隆抗體的CDMAB。
7. 權(quán)利要求2的人源化抗體的CDMAB。
8. 權(quán)利要求3的嵌合抗體的CDMAB。
9. 權(quán)利要求1、2、3、6、7或8中任一項(xiàng)的分離的抗體或其CDMAB，所述分離的抗體或其 CDMAB與選自由下列各項(xiàng)組成的組中的成員綴合細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、和造 血細(xì)胞。
10. 在哺乳動(dòng)物中治療易受抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性影響的人腫瘤的方法，其中所述人腫 瘤表達(dá)抗原的至少一個(gè)表位，其特異性結(jié)合由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生 產(chǎn)的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗 體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物以有效導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù) 荷減小的量施用所述單克隆抗體或所述其CDMAB。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
13. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補(bǔ)體。
14. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞 毒作用。
15. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
16. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
17. —種單克隆抗體，其能夠特異性結(jié)合與由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交 瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體結(jié)合的表位相同的一個(gè)或多個(gè)表位。
18. 在哺乳動(dòng)物中治療人腫瘤的方法，其中所述人腫瘤表達(dá)抗原的至少一個(gè)表位，其 特異性結(jié)合由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所 述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物以有效導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減小的量施用所述單克隆 抗體或其CDMAB。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補(bǔ)體。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞 毒作用。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
24. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
25. 在哺乳動(dòng)物中治療人腫瘤的方法，其中所述人腫瘤表達(dá)抗原的至少一個(gè)表位，其 特異性結(jié)合由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體或其 CDMAB，所述CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所 述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物以有效導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)荷減小的量施用與至少一種 化療劑聯(lián)合的所述單克隆抗體或其CDMAB。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
28. 權(quán)利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補(bǔ)體。
29. 權(quán)利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞 毒作用。
30. 權(quán)利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
31. 權(quán)利要求25的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
32. 確定在選自人腫瘤的組織樣品中的癌細(xì)胞存在的結(jié)合測(cè)定方法，所述癌細(xì)胞特異 性結(jié)合由具有IDAC保藏號(hào)290507-04的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R92A271. 7生產(chǎn)的分離的單克隆抗 體、由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的人源化抗體、 或由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，所述 結(jié)合測(cè)定方法包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供至少一種所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其CDMAB，其 識(shí)別與由具有IDAC保藏號(hào)290507-04的雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)R92A271. 7生產(chǎn)的分離的單克隆抗 體所識(shí)別的那些表位相同的一個(gè)或多個(gè)表位；使至少一種所述提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品接觸；禾口確定所述至少一種所提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品的結(jié)合；由此指示所述癌細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。
33. 單克隆抗體用于減小人腫瘤負(fù)荷的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)抗原的至少一個(gè)表 位，其特異性結(jié)合由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體或 其CDMAB，所述CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力， 所述應(yīng)用包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物以有效導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物人腫瘤負(fù)荷減小的量施用所述單 克隆抗體或其CDMAB。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
36. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補(bǔ)體。
37. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞 毒作用。
38. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
39. 權(quán)利要求33的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
40. 單克隆抗體用于減小人腫瘤負(fù)荷的應(yīng)用，其中所述人腫瘤表達(dá)抗原的至少一個(gè)表 位，其特異性結(jié)合由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤生產(chǎn)的分離的單克隆抗體或 其CDMAB，所述CDMAB特征在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力， 所述應(yīng)用包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物以有效導(dǎo)致所述哺乳動(dòng)物人腫瘤負(fù)荷減小的量與至少一種 化療劑聯(lián)合施用所述單克隆抗體或其CDMAB。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。
43. 權(quán)利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補(bǔ)體。
44. 權(quán)利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞 毒作用。
45. 權(quán)利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體是人源化的。
46. 權(quán)利要求40的方法，其中所述分離的單克隆抗體是嵌合的。
47. 有效用于治療人癌性腫瘤的組合物，所述組合物以組合方式包括 權(quán)利要求1， 2， 3， 6， 7， 8，或17中任一項(xiàng)的抗體或CDMAB ;所述抗體或其抗原結(jié)合片段的綴合物，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自由下列各項(xiàng) 組成的組的成員綴合細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、和造血細(xì)胞；禾口 需要量的藥用載體；其中所述組合物有效用于治療所述人癌性腫瘤。
全文摘要
抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺死是治療癌癥的有效方法。當(dāng)用肺腺癌細(xì)胞免疫時(shí)，篩選小鼠中產(chǎn)生的抗體，以獲得作為終點(diǎn)的針對(duì)多種癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。分離由以保藏號(hào)290507-04保藏在IDAC的雜交瘤AR92A271.7產(chǎn)生的抗癌細(xì)胞毒性單克隆抗體，其對(duì)肺癌細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性，且在人肺癌的動(dòng)物模型中減少腫瘤負(fù)荷。所述單克隆抗體還結(jié)合若干癌細(xì)胞系。存在單克隆抗體與非癌細(xì)胞系的低但可檢測(cè)的結(jié)合，然而，在該非癌細(xì)胞系中不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。該單克隆抗體可以用于輔助對(duì)癌癥進(jìn)行分段和診斷，并且可以用來治療原發(fā)瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移。所述細(xì)胞毒性單克隆抗體還可以用于將毒素、酶、放射性化合物、以及造血細(xì)胞遞送到癌細(xì)胞，從而進(jìn)一步輔助減少腫瘤負(fù)荷。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101743255SQ200880024518
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日
發(fā)明者戴維·S·F·揚(yáng), 海倫·P·芬德利, 蘇珊·E·哈恩 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司