脅迫鹽生杜氏藻積累β-胡蘿卜素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脅迫鹽生杜氏藻積累β-胡蘿卜素的方法，屬水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。傳統(tǒng)上鹽生杜氏藻采用開放型跑道式大池且使用Hutner培養(yǎng)液培養(yǎng)，光照強(qiáng)度和溫度完全依賴大自然，生長慢，產(chǎn)量低，易污染，成本高，β-胡蘿卜素含量低。為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明采用室內(nèi)控光控溫培養(yǎng)，根據(jù)鹽生杜氏藻不同生長階段的特定需要調(diào)整光照強(qiáng)度和溫度，特別是在培養(yǎng)的后期，提高光照強(qiáng)度和溫度并補(bǔ)充了氯化銨，人尿，磷酸鈣，鹽酸硫胺素等且改變了傳統(tǒng)一次性培養(yǎng)的做法，在培養(yǎng)的后期更換培養(yǎng)液，去除了培養(yǎng)液中的氮鹽和磷鹽并提高鹽度，大大提高了鹽生杜氏藻生長速度，β-胡蘿卜素含量提高70％。
【專利說明】脅迫鹽生杜氏藻積累β-胡蘿卜素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種脅迫鹽生杜氏藻積累β -胡蘿卜素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鹽生杜氏藻Dunaliella salina是一種雙鞭毛單細(xì)胞綠藻，可耐高鹽度(20-300%。)。鹽生杜氏藻在脅迫條件下可大量積累β -胡蘿卜素，最高可達(dá)干重的14%，為自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大規(guī)模培養(yǎng)鹽生杜氏藻生產(chǎn)β_胡蘿卜素；另外鹽生杜氏藻含有的甘油可達(dá)干重的40%，具有生產(chǎn)甘油的潛在前途；鹽生杜氏藻還是一種良好的水產(chǎn)動物飼料。我國具有漫長的海岸線和眾多的內(nèi)陸鹽湖，具有培養(yǎng)鹽生杜氏藻生產(chǎn)β_胡蘿卜素得天獨厚的自然條件。
[0003]氮、磷鹽種類及其比例、溫度、光照、鹽度、pH值等對鹽生杜氏藻生長都有重要影響。氮在細(xì)胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、葉啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是鹽生杜氏藻生長最重要的營養(yǎng)元素。有研究認(rèn)為硝酸態(tài)氮是鹽生杜氏藻生長的最佳氮源。關(guān)于鹽生杜氏藻生長的最適NaNO3濃度，各學(xué)者研究結(jié)果不一。有的認(rèn)為l.0mmol/L較好(Loeblich, 1982),有的認(rèn)為5.0mmol/L較合適(Amotz et al,1982)。但后來米用較低濃度的氮鹽(0.75mmol/L, Amotz et al, 1989 ;1.0mmol/L, Borowiska, 1997)也獲得了很好的生長效果。我的研究結(jié)果支持這個觀點。我的實驗表明，NaNO3濃度為1.5mm0l/L時，鹽生杜氏藻生長最快；而NaNO3濃度為0.5mmol/L時,鹽生杜氏藻有最高的β -胡蘿卜素含量。而陳晗華、Hejazi等也認(rèn)為鹽生杜氏藻生長的最適條件為N 1.0mmol/L,P 0.3mmol/L。
[0004]研究者早已發(fā)現(xiàn)，鹽生杜氏藻生長的二階段對光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子要求顯著不同。Laws等發(fā)現(xiàn)2.0mmol/L的氮鹽對鹽生杜氏藻生長最好，但氮濃度為O時，單細(xì)胞有最大的胡蘿卜素含量。我的研究表明，較高的NaNO3有利于D.salina的生長，而較低的NaNO3有利于D.salinaβ -胡蘿卜素的積累,這與G1rdano,Hirsch等的研究結(jié)果吻合。β_胡蘿卜素的作用除光保護(hù)外，還有其它尚未搞清楚的功能。我的研究表明，三高一低(高光強(qiáng)、高溫度、高鹽度，低營養(yǎng)鹽特別是低氮和低磷)和培養(yǎng)液的老化有利于
胡蘿卜素的合成。很明顯，鹽生杜氏藻的細(xì)胞生長和胡蘿卜素積累是兩個矛盾的生理過程，適于細(xì)胞生長的氮、磷濃度不適合其胡蘿卜素積累。對此，我們可以合理控制氮鹽濃度，既能獲取較大生物量，又能獲得較大的β_胡蘿卜素產(chǎn)量。據(jù)此，本發(fā)明提出了鹽生杜氏藻生產(chǎn)的二階段養(yǎng)殖法，即先用較低的鹽度和光照及較高的氮鹽條件使藻增殖至較理想的密度，再提高鹽度和光照、溫度脅迫胡蘿卜素的積累。
[0005]傳統(tǒng)上鹽生杜氏藻的大量培養(yǎng)采用開放型跑道式大池且使用Hutner培養(yǎng)液培養(yǎng)，光照強(qiáng)度和溫度完全依賴大自然，變化無常且不符合鹽生杜氏藻各階段生長和β -胡蘿卜素積累的要求，無法人為控制，生長慢，產(chǎn)量低，易污染，成本高，基礎(chǔ)投資大，β_胡蘿卜素含量低，產(chǎn)品質(zhì)量差。為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明采用室內(nèi)控溫、控光培養(yǎng)，根據(jù)鹽生杜氏藻不同生長階段的特定需要調(diào)整光照強(qiáng)度和溫度，特別是在培養(yǎng)的后期，加大光照強(qiáng)度和溫度，脅迫鹽生杜氏藻積累β-胡蘿卜素，并對傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行了調(diào)整，補(bǔ)充了氯化鈉，氯化銨，人尿，磷酸鈣，硫酸銨，氯化鐵，鹽酸硫胺素，煙酸，維生素B12且改變了傳統(tǒng)一次性培養(yǎng)的做法，在培養(yǎng)的后期更換培養(yǎng)液，去除了培養(yǎng)液中的氮鹽和磷鹽并提高鹽度，脅迫β-胡蘿卜素的合成，大大提高了鹽生杜氏藻的生長速度和產(chǎn)量，β_胡蘿卜素含量提高70%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種脅迫鹽生杜氏藻積累胡蘿卜素的方法，具體方法如下:
[0007]步驟I培養(yǎng)液的配制I號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉15份，硝酸鈉2份，氯化銨I份，人尿1.5份，磷酸鈣0.04份，硫酸銨0.5份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸0.002份，維生素B120.001份；取此培養(yǎng)液2000毫升裝入一 3000毫升的三角燒瓶，保鮮膜和橡皮筋封口，放在搖床上搖勻15分鐘，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉25份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸0.002份，維生素B120.001份；搖勻后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0008]步驟2接種培養(yǎng)取一 3000毫升潔凈的三角燒瓶，加入步驟I所述的I號培養(yǎng)液1500毫升，取生長旺盛、無污染、指數(shù)生長期的藻種接種，接種密度每毫升3萬個藻細(xì)胞。輕輕搖勻30秒鐘，滅菌的報紙和橡皮筋封口，室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，日光燈管照明，通過控制打開燈管的數(shù)量多少來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。調(diào)節(jié)溫度至25°C，光照強(qiáng)度60001uX，從瓶口插入一直徑4毫米的塑料管，塑料管另一端連接空氣壓縮機(jī)，充氣培養(yǎng)，充入混合氣體，氣體成分=空氣90% +純C0210%，連續(xù)不間斷充氣，氣量不宜太大，以讓藻細(xì)胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D,即提供間歇光，14小時光照，10小時黑暗，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0009]步驟3更換培養(yǎng)液培養(yǎng)至第8天，藻細(xì)胞密度可達(dá)每毫升藻液90萬個細(xì)胞，停止培養(yǎng)，從瓶口拔出充氣管，用離心機(jī)離心采收藻細(xì)胞，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘3600轉(zhuǎn)，離心4分鐘，可得牙膏狀粘稠的藻泥，將此藻泥轉(zhuǎn)入另一 3000毫升的干凈的三角燒瓶中，加入步驟I所述的2號培養(yǎng)液1800毫升，報紙和橡皮筋封口，繼續(xù)充氣培養(yǎng)，充氣方式和氣量大小同步驟2。調(diào)節(jié)溫度至28°C，光照強(qiáng)度90001uX，連續(xù)培養(yǎng)至第10天，從第11天開始，溫度調(diào)至30°C，光照強(qiáng)度調(diào)至120001uX，連續(xù)培養(yǎng)2天，從第13天開始，溫度調(diào)至32°C，光照調(diào)至150001ux ；
[0010]步驟4藻細(xì)胞采收至第15天，藻液呈磚紅色，停止充氣和培養(yǎng)，離心機(jī)采收藻細(xì)胞，將藻液加入離心機(jī)離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘5400轉(zhuǎn)，離心5分鐘，得沉淀物，棄上清液，采收完畢。
[0011]有益結(jié)果
[0012]我的研究表明，鹽生杜氏藻的細(xì)胞生長和胡蘿卜素積累是兩個矛盾的生理過程，適于細(xì)胞生長的氮、磷濃度不適合其胡蘿卜素積累。三高一低(高光強(qiáng)、高溫度、高鹽度，低營養(yǎng)鹽特別是低氮和低磷)及培養(yǎng)液的老化有利于β_胡蘿卜素的合成。對此，我們可以合理控制氮鹽濃度，既能獲取較大生物量，又能獲得較大的β_胡蘿卜素產(chǎn)量。據(jù)此，本發(fā)明提出了鹽生杜氏藻生產(chǎn)的二階段養(yǎng)殖法，即先用較低的鹽度和光照、溫度及較高的氮鹽條件使藻增殖至較理想的密度，再提高鹽度和光照、溫度脅迫胡蘿卜素的積累。傳統(tǒng)上鹽生杜氏藻的大量培養(yǎng)采用開放跑道式大池且使用Hutner培養(yǎng)液培養(yǎng)，光照強(qiáng)度和溫度完全依賴大自然，變化無常且不符合鹽生杜氏藻各階段生長和胡蘿卜素積累的要求，無法人為控制，生長慢，產(chǎn)量低，易污染，成本高，基礎(chǔ)投資大，β-胡蘿卜素含量低，產(chǎn)品質(zhì)量差。為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明采用室內(nèi)控溫、控光培養(yǎng)，根據(jù)鹽生杜氏藻不同生長階段的特定需要調(diào)整光照強(qiáng)度和溫度，特別是在培養(yǎng)的后期，加大光照強(qiáng)度和溫度，脅迫鹽生杜氏藻積累胡蘿卜素，并對傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行了調(diào)整，補(bǔ)充了氯化鈉，氯化銨，人尿，磷酸鈣，硫酸銨，氯化鐵，鹽酸硫胺素，煙酸，維生素B12且改變了傳統(tǒng)一次性培養(yǎng)的做法，在培養(yǎng)的后期更換培養(yǎng)液，去除了培養(yǎng)液中的氮鹽和磷鹽并提高鹽度，脅迫胡蘿卜素的合成，大大提高了鹽生杜氏藻的生長速度和產(chǎn)量，β_胡蘿卜素含量提高70%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為鹽生杜氏藻的生長情況圖；
[0014]其中橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間(天)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞密度，單位是萬個細(xì)胞/每毫升藻液。

【具體實施方式】
[0015]①步驟I培養(yǎng)液的配制I號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉15份，硝酸鈉2份，氯化銨I份，人尿1.5份，磷酸鈣0.04份，硫酸銨0.5份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸0.002份，維生素B120.001份；取此培養(yǎng)液2000毫升裝入一 3000毫升的三角燒瓶，保鮮膜和橡皮筋封口，放在搖床上搖勻15分鐘，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉25份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸0.002份，維生素B120.001份；搖勻后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0016]②步驟2接種培養(yǎng)取一 3000毫升潔凈的三角燒瓶，加入步驟I所述的I號培養(yǎng)液1500毫升，取生長旺盛、無污染、指數(shù)生長期的藻種接種，接種密度每毫升3萬個藻細(xì)胞。輕輕搖勻30秒鐘，滅菌的報紙和橡皮筋封口，室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，日光燈管照明，通過控制打開燈管的數(shù)量多少來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。調(diào)節(jié)溫度至25°C，光照強(qiáng)度60001uX，從瓶口插入一直徑4毫米的塑料管，塑料管另一端連接空氣壓縮機(jī)，充氣培養(yǎng)，充入混合氣體，氣體成分=空氣90% +純C0210%，連續(xù)不間斷充氣，氣量不宜太大，以讓藻細(xì)胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D,即提供間歇光，14小時光照，10小時黑暗，連續(xù)培養(yǎng)7天。
[0017]③步驟3更換培養(yǎng)液培養(yǎng)至第8天，藻細(xì)胞密度可達(dá)每毫升90萬，停止培養(yǎng)，從瓶口拔出充氣管，用離心機(jī)離心采收藻細(xì)胞，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘3600轉(zhuǎn)，離心4分鐘，可得牙膏狀粘稠的藻泥，將此藻泥轉(zhuǎn)入另一 3000毫升的干凈的三角燒瓶中，加入步驟I所述的2號培養(yǎng)液1800毫升，報紙和橡皮筋封口，繼續(xù)充氣培養(yǎng)，充氣方式和氣量大小同步驟2。調(diào)節(jié)溫度至28°C，光照強(qiáng)度90001uX，連續(xù)培養(yǎng)至第10天，從第11天開始，溫度調(diào)至30°C，光照強(qiáng)度調(diào)至12000Iux，連續(xù)培養(yǎng)2天，從第13天開始，溫度調(diào)至32°C，光照調(diào)至150001ux ；
[0018]④步驟4藻細(xì)胞采收至第15天，藻液呈磚紅色，停止充氣和培養(yǎng)，離心機(jī)采收藻細(xì)胞，將藻液加入離心機(jī)離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘5400轉(zhuǎn)，離心5分鐘，得沉淀物，棄上清液，米收完畢。
[0019]⑤步驟2中接種用的鹽生杜氏藻預(yù)先進(jìn)行提純(本領(lǐng)域常規(guī)方法，只要可實現(xiàn)提純即可，例如高氏提取法)，以確保接種時藻種為純種且處于生長旺盛的指數(shù)生長期；
[0020]⑥步驟I中各種營養(yǎng)鹽要按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；
[0021]⑦步驟I中各種無機(jī)營養(yǎng)鹽和維生素可預(yù)先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存?zhèn)溆?，放置時間不要超過30天；
[0022]⑧步驟I和2中所用三角燒瓶等玻璃儀器均需洗刷干凈放在70°C烘箱中烘干后使用；
[0023]⑨步驟2所述接種過程需在無菌操作臺上進(jìn)行；
[0024]⑩步驟I中所用化學(xué)藥品純度均需化學(xué)純級別。
[0025]最后應(yīng)說明的是:以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種脅迫鹽生杜氏藻積累β-胡蘿卜素的方法，其特征在于具體步驟如下: 步驟I)培養(yǎng)液的配制； I號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉15份，硝酸鈉2份，氯化銨I份，人尿1.5份，磷酸鈣0.04份，硫酸銨0.5份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸.0.002份，維生素B120.001份；取此培養(yǎng)液2000毫升裝入-3000毫升的三角燒瓶，保鮮膜和橡皮筋封口，放在搖床上搖勻15分鐘，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?號培養(yǎng)液成分:煮沸冷卻后的海水1000份，氯化鈉25份，氯化鐵0.002份，鹽酸硫胺素0.001份，煙酸0.002份，維生素B120.001份；搖勻后，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 步驟2)接種培養(yǎng) 取一 3000毫升潔凈的三角燒瓶，加入步驟I所述的I號培養(yǎng)液1500毫升，取生長旺盛、無污染、指數(shù)生長期的藻種接種，接種密度每毫升3萬個藻細(xì)胞；輕輕搖勻30秒鐘，滅菌的報紙和橡皮筋封口，室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，日光燈管照明，通過控制打開燈管的數(shù)量多少來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度；調(diào)節(jié)溫度至25°C，光照強(qiáng)度60001uX，從瓶口插入一直徑4毫米的塑料管，塑料管另一端連接空氣壓縮機(jī)，充氣培養(yǎng)，充入混合氣體，氣體成分=空氣90% +純C0210%，連續(xù)不間斷充氣，氣量不宜太大，以讓藻細(xì)胞浮起不下沉即可，光暗周期=14h/L+10h/D，即提供間歇光，14小時光照，10小時黑暗；連續(xù)培養(yǎng)7天； 步驟3)更換培養(yǎng)液培養(yǎng)至第8天，藻細(xì)胞密度可達(dá)每毫升90萬，停止培養(yǎng)，從瓶口拔出充氣管，用離心機(jī)離心采收藻細(xì)胞，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘3600轉(zhuǎn)，離心4分鐘，可得牙膏狀粘稠的藻泥，將此藻泥轉(zhuǎn)入另一 3000毫升的干凈的三角燒瓶中，加入步驟I所述的2號培養(yǎng)液1800毫升，報紙和橡皮筋封口，繼續(xù)充氣培養(yǎng)，充氣方式和氣量大小同步驟2 ;調(diào)節(jié)溫度至28°C，光照強(qiáng)度90001uX，連續(xù)培養(yǎng)至第10天，從第11天開始，溫度調(diào)至30°C，光照強(qiáng)度調(diào)至12000lux，連續(xù)培養(yǎng)2天，從第13天開始，溫度調(diào)至32°C，光照調(diào)至15000Iux ； 步驟4)藻細(xì)胞采收 至第15天，藻液呈磚紅色，停止充氣和培養(yǎng)，離心機(jī)采收藻細(xì)胞，離心機(jī)轉(zhuǎn)速每分鐘5400轉(zhuǎn)，離心5分鐘，得沉淀物，棄上清液，采收完畢。
【文檔編號】C12P23/00GK104450849SQ201410680311
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】王培磊 申請人:臨沂大學(xué)