專利名稱：：杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良中有效的外顯子(44)跳躍方法及相關(guān)手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，涉及人類遺傳學(xué)。本發(fā)明特別涉及人類杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良基因剪接的調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
：肌病是導(dǎo)致肌肉功能障礙的病癥。肌營(yíng)養(yǎng)不良是指以骨骼肌逐漸衰弱和退化為特征的遺傳疾病。杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)和貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良(Beckermusculardystrophy,BMD)是最常見的童年形式的肌營(yíng)養(yǎng)不良。它們?yōu)殡[性遺傳疾病，因?yàn)樨?fù)責(zé)DMD和BMD的基因位于X染色體上，突變主要影響男性，并且發(fā)病率為每3500個(gè)男孩中約一例。DMD和BMD是由編碼肌養(yǎng)蛋白的DMD基因中的基因缺陷引起的，肌養(yǎng)蛋白是細(xì)胞主鏈與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用必需的肌肉蛋白質(zhì)，從而在收縮期間維持肌纖維的穩(wěn)定性。DMD是一種嚴(yán)重的、致死的神經(jīng)肌肉病癥，其導(dǎo)致12歲以前依賴輪椅支持，并且DMD患者常常在30歲以前死于呼吸或心力衰竭。相比之下，BMD患者通常保持能行走，直至生命晚期，并且具有幾乎正常的預(yù)期壽命。肌養(yǎng)蛋白基因DMD突變的特征為移碼插入、缺失或無(wú)義點(diǎn)突變，這導(dǎo)致功能性肌養(yǎng)蛋白的缺乏。BMD突變通常保持可讀框完整，從而允許合成具有部分功能性肌養(yǎng)蛋白。在過(guò)去20年中已經(jīng)研究了一些可能的療法，包括成肌細(xì)胞移植、DNA靶向的基因療法和反義介導(dǎo)的外顯子跳躍(vanDeutekomandvanOmmen,(2003),Nat.Rev.Genet.,4(10):774-83)。反義介導(dǎo)的外顯子跳躍目旨在將存在于DMD患者中的框外(out-of-frame)突變轉(zhuǎn)變成合成至少部分功能性肌養(yǎng)蛋白的框內(nèi)(in-frame)BMD樣突變，從而延長(zhǎng)肌肉的活力(Aartsma-RusandvanOmmen,(2007),RNA,13(10):1609-24)。外顯子跳躍能夠被反義寡核苷酸(AON)誘導(dǎo)，該反義寡核苷酸針對(duì)涉及外顯子連接酶促過(guò)程的剪接點(diǎn)的剪接供體或剪接受體位點(diǎn)，或針對(duì)外顯子內(nèi)部序列。通常，剪接供體和剪接受體位點(diǎn)包含保守序列，靶向這些序列有不可避免的風(fēng)險(xiǎn)，即會(huì)同時(shí)靶向來(lái)自DMD或其他基因轉(zhuǎn)錄本的另外的外顯子的剪接位點(diǎn)。DMD基因的外顯子44由148個(gè)堿基對(duì)組成。外顯子44的治療性跳躍會(huì)恢復(fù)DMD患者的正確可讀框，所述DMD患者具有缺失或者具有外顯子44的重復(fù)，所述缺失包括但不限于外顯子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31_43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，對(duì)于某些DMD患者而言，突變是這樣的，從而除了外顯子44跳躍以外，一個(gè)或多個(gè)外顯子的同時(shí)跳躍是恢復(fù)可讀框必需的。這種突變的非限制性實(shí)例為側(cè)翼外顯子43或45中的無(wú)義點(diǎn)突變，分別要求外顯子43+44跳躍或外顯子44+45跳躍。上述突變總共發(fā)生于約6-8%的全部DMD患者中。大部分所得的肌養(yǎng)蛋白在該蛋白中心桿結(jié)構(gòu)域被截短，這使得重要的N-末端肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、與小肌養(yǎng)蛋白(dystrobrevin)和肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白(syntrophin)結(jié)合的C-末端結(jié)構(gòu)域以及β-營(yíng)養(yǎng)不良聚糖結(jié)合C-末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域完整。發(fā)明描述本發(fā)明鑒定了外顯子44中四個(gè)不同區(qū)域，其特別適合誘導(dǎo)外顯子44的跳躍。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞中DMD基因的外顯子44剪接的方法，該方法包括為所述細(xì)胞提供與包含以下序列的核苷酸序列結(jié)合的分子SEQIDNO.1:5’-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQIDNO.2:5’-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQIDNO.3:5’-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQIDNO.45，-CUGUUGAGAAA。當(dāng)DMD前mRNA(pre-mRNA)的外顯子44中存在SEQIDNO:1、2、3或4時(shí)，該分子優(yōu)選地與SEQIDN0:l、2、3或4的任意一個(gè)結(jié)合或互補(bǔ)。在本申請(qǐng)書中，短語(yǔ)“誘導(dǎo)跳躍”與“調(diào)節(jié)剪接”是同義的。據(jù)發(fā)現(xiàn)，與包含SEQIDNO.1:5，-GUGGCUAACAGAAGCU、SEQIDN0.25'-GGGAACAUGCUAAAUAC、SEQIDΝ0·35'-AGACACAAAUUCCUGAGA或SEQIDNO.45’-CUGUUGAGAAA的核苷酸序列結(jié)合的分子在提供了該分子的細(xì)胞中導(dǎo)致外顯子44的高效跳躍。而且，所示序列沒有一個(gè)源自剪接點(diǎn)的保守部分。因此，所述分子不大可能介導(dǎo)DMD前mRNA的其他外顯子或其他基因的外顯子的差異剪接。另外，通過(guò)避免與上文所定義的核苷酸序列結(jié)合的分子中的CpG對(duì)，會(huì)優(yōu)選地避免其他(免疫)毒性。外顯子跳躍指在細(xì)胞中誘導(dǎo)成熟的mRNA，該mRNA不含有通常存在于其中的特定外顯子。外顯子跳躍通過(guò)為表達(dá)所述mRNA的前mRNA的細(xì)胞提供這樣的分子而實(shí)現(xiàn)，該分子能夠干擾諸如允許剪接的酶促過(guò)程所需的剪接供體或剪接受體序列的序列，或者能夠干擾識(shí)別作為外顯子而并入mRNA的一段核苷酸所需的外顯子包含信號(hào)。術(shù)語(yǔ)前mRNA指通過(guò)轉(zhuǎn)錄從細(xì)胞核中的DNA模板合成的未加工或部分加工的前體mRNA。本發(fā)明的某些方法會(huì)緩和具有缺失或具有外顯子44的重復(fù)的DMD患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的一種或多種特征，該缺失包括但不限于外顯子03-43、05-43、06-43、10-43、13-43、14-43、17-43、19-43、28-43、30-43、31-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-54和45-68。此外，移除諸如外顯子43或外顯子45的側(cè)翼外顯子會(huì)由于該側(cè)翼外顯子中的無(wú)義點(diǎn)突變而引起框外轉(zhuǎn)錄。外顯子44的其他跳躍聯(lián)合側(cè)翼外顯子的跳躍會(huì)恢復(fù)DMD患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中DMD基因的可讀框。這些突變的非限制性實(shí)例為側(cè)翼外顯子43或45中的無(wú)義點(diǎn)突變，它們分別要求外顯子43+44跳躍或外顯子44+45跳躍。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可以將強(qiáng)BMD患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的一種或多種特征緩和為輕微BMD患者的特征。DMD或DMD患者的細(xì)胞的特征包括肌細(xì)胞吸收的鈣增加、膠原蛋白合成增加、形態(tài)學(xué)改變、脂類生物合成改變、氧化應(yīng)激和/或破壞的肌膜增加。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案將在后文中進(jìn)行定義。在一實(shí)施方案中，本文所定義的分子可以為與特定的序列結(jié)合和/或互補(bǔ)的化合物分子，或者諸如經(jīng)修飾能夠與RNA分子上指定的核苷酸序列結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白或非天然鋅指蛋白的蛋白。篩查與特定核苷酸序列結(jié)合的化合物分子的方法公開于，例如PCT/NL01/00697和美國(guó)專利6，875，736中，它們通過(guò)引用并入本文。設(shè)計(jì)與特定核苷酸序列結(jié)合的RNA結(jié)合鋅指蛋白的方法公開于FriesenandDarby,NatureStructuralBiology5543-546(1998)中，其通過(guò)引用并入本文。與特定SEQIDNO:1、2、3或4序列之一結(jié)合，優(yōu)4選在DMD的外顯子44的情況下，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選的技術(shù)為EP1619249所述的凝膠遷移率變動(dòng)分析。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一旦在凝膠遷移率變動(dòng)分析中檢測(cè)到所述分子與標(biāo)記的序列SEQIDN0:l、2、3或4的結(jié)合，則認(rèn)為所述分子與特定序列之一結(jié)合?？蛇x擇地，或者與前述實(shí)施方案結(jié)合，如后文所定義的，分子為與SEQIDNO:1、2、3或4或其部分互補(bǔ)或者基本上互補(bǔ)的寡核苷酸。該語(yǔ)境中所用的術(shù)語(yǔ)“基本上”互補(bǔ)表示，可以允許1個(gè)或2個(gè)或者更多個(gè)錯(cuò)配，只要具有功能性，即外顯子44的誘導(dǎo)跳躍仍然是可接受的。本發(fā)明提供了設(shè)計(jì)能夠誘導(dǎo)DMD基因的外顯子44跳躍的分子的方法，該分子優(yōu)選為寡核苷酸。首先，如前文所定義的，選擇與SEQIDN0:l、2、3或4之一或其部分結(jié)合的所述寡核苷酸。隨后，在優(yōu)選的方法中，設(shè)計(jì)必須考慮至少以下方面之一以進(jìn)一步改進(jìn)所述分子-所述分子不含有CpG，-所述分子不含有G-四聯(lián)體基序，-所述分子具有可接受的RNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)屬性。寡核苷酸中CpG的存在通常與所述寡核苷酸免疫原性增加有關(guān)(DornandKippenberger,CurrOpinMolTher200810⑴10-20)。這種增加的免疫原性是不期望的，因?yàn)槠淇赡苷T導(dǎo)肌纖維的破壞。動(dòng)物模型中的免疫原性可以通過(guò)評(píng)價(jià)所述動(dòng)物的肌肉活檢中的CD4+和/或CD8+細(xì)胞的存在和/或炎癥單核細(xì)胞侵潤(rùn)來(lái)評(píng)價(jià)。免疫原性還可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定，在用本發(fā)明的寡核苷酸進(jìn)行處理的動(dòng)物或人的血液中，通過(guò)檢測(cè)中和抗體和/或識(shí)別所述寡核苷酸的抗體的存在來(lái)評(píng)價(jià)。免疫原性的增加可以通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定，檢測(cè)中和抗體和/或識(shí)別所述寡核苷酸的抗體的存在或增加量來(lái)評(píng)價(jià)。包含G-四聯(lián)體基序的寡核苷酸具有形成四聯(lián)體(quadruplex)的趨勢(shì)，該四聯(lián)體是通過(guò)4條單鏈寡核苷酸的Hoogsteen堿基配對(duì)形成的多聚體或集合物(aggregate)(ChengandVanDyke,Gene.1997Sep15；197(1-2):253-60)，這當(dāng)然是不期望的因?yàn)轭A(yù)期寡核苷酸的效率會(huì)降低。多聚化或聚集優(yōu)選地通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，小于總量的20%或15^^10%]^5%或更低的本發(fā)明的寡核苷酸具有利用上文所述的測(cè)定評(píng)價(jià)的多聚化或聚集能力。本發(fā)明允許設(shè)計(jì)具有可接受的RNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)屬性的寡核苷酸。RNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)性質(zhì)至少部分地通過(guò)寡核苷酸的解鏈溫度來(lái)測(cè)定(Tm；用寡核苷酸屬性計(jì)算器來(lái)計(jì)算(www,unc.edu/cail/biotool/oligo/index.html)，對(duì)于單鏈RNA，利用基本Tm和最近的鄰近模型來(lái)計(jì)算)，和/或通過(guò)AON-靶外顯子復(fù)合體的自由能來(lái)測(cè)定(利用RNA結(jié)構(gòu)4.。如果Tm過(guò)高，則預(yù)期寡核苷酸具有較低的特異性?？山邮艿腡m和自由能取決于寡核苷酸的序列。因此，對(duì)于這些參數(shù)中的每一個(gè)，難以給出優(yōu)選的范圍?？山邮艿腡m的變動(dòng)范圍可以為35°C至65°C，而可接受的自由能的變動(dòng)范圍可以為Mkcal/mol至45kcal/mol。因此，技術(shù)人員可以首先選擇寡核苷酸作為潛在治療化合物，如本文所定義的，所述寡核苷酸與外顯子44的SEQIDN0:l、2、3或4或其部分結(jié)合和/或互補(bǔ)。技術(shù)人員可以檢查所述寡核苷酸如前文所定義地與所述序列結(jié)合。任選地，在第二步中，技術(shù)人員可以利用本發(fā)明，通過(guò)檢查CpG的不存在、G-四聯(lián)體基序的不存在，和/或通過(guò)優(yōu)化其Tm和/或AON-靶復(fù)合物的自由能來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化所述寡核苷酸。技術(shù)人員可以試圖設(shè)計(jì)這樣的寡核苷酸，其中不存在CpG和/或不在G-四聯(lián)體基序，和/或通過(guò)選擇與所述寡核苷酸互補(bǔ)的外顯子44(例如SEQID^):1、2、3或4)的不同序列來(lái)獲得更可接受的1^和/或自由能。或者，如果與外顯子44的SEQIDNO:1、2、3或4中給定的一段序列互補(bǔ)的寡核苷酸包含CpG、G-四聯(lián)體基序和/或不具有可接受的Tm和/或自由能，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)降低該寡核苷酸的長(zhǎng)度和/或通過(guò)選擇與該寡核苷酸互補(bǔ)的任何SEQIDN0:l、2、3或4中不同的一段序列和/或通過(guò)改變?cè)摴押塑账岬幕瘜W(xué)來(lái)改進(jìn)任何這些參數(shù)。作為實(shí)例，如果選擇SEQIDNO:1，則設(shè)計(jì)據(jù)發(fā)現(xiàn)與該序列結(jié)合的幾種寡核苷酸SEQIDN0:5、49和M。據(jù)發(fā)現(xiàn)包含SEQIDNO:5的寡核苷酸具有最優(yōu)的RNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)性質(zhì)，例如最優(yōu)的Tm。當(dāng)我們測(cè)試這些寡核苷酸誘導(dǎo)外顯子44跳躍的功能性時(shí)，證實(shí)包含SEQIDNO:5的寡核苷酸在這四種寡核苷酸中是最有效的。這些寡核苷酸的每一個(gè)在本發(fā)明中都是有功能的。然而，包含SEQIDNO:5的寡核苷酸是最優(yōu)選的鑒定為與SEQIDNO1結(jié)合和/或互補(bǔ)的寡核苷酸。在該方法的任何步驟中，本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選為仍然能夠表現(xiàn)出可接受水平的功能活性的寡核苷酸。所述寡核苷酸的功能活性優(yōu)選為將DMD基因的外顯子44的跳躍誘導(dǎo)至某種程度，以為個(gè)體提供功能性肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA，和/或至少部分地降低異常肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生。每種這些特征在后文中定義。這些功能活性可以在個(gè)體的肌肉組織或肌細(xì)胞中，或者在體外的細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)量?？梢栽趍RNA水平，優(yōu)選利用RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)功能性?？梢栽诘鞍姿剑瑑?yōu)選利用蛋白印跡分析或橫切片的免疫熒光分析來(lái)評(píng)價(jià)功能性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在DMD患者的肌細(xì)胞中通過(guò)RT-PCR進(jìn)行測(cè)試時(shí)，寡核苷酸被認(rèn)為誘導(dǎo)DMD基因的外顯子44的跳躍，外顯子44跳躍百分比為至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%、或至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或100%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的寡核苷酸優(yōu)選為藥物。更優(yōu)選地，所述藥物用于預(yù)防或治療個(gè)體或患者的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良。如本文所定義的，DMD前mRNA優(yōu)選地表示DMD或BMD患者的DMD基因的前mRNA。優(yōu)選地，患者旨在表示患有DMD或BMD的患者，或者由于他或她的遺傳背景而容易發(fā)展DMD或BMD的患者。對(duì)于DMD患者，所用的寡核苷酸優(yōu)選地修正至少一個(gè)存在于所述患者的DMD基因中的DMD突變，因此會(huì)優(yōu)選地產(chǎn)生看起來(lái)像BMD肌養(yǎng)蛋白的肌養(yǎng)蛋白所述肌養(yǎng)蛋白優(yōu)選地為如后文所定義的功能性肌養(yǎng)蛋白。對(duì)于BMD患者，所用的寡核苷酸優(yōu)選地修正至少一個(gè)存在于所述患者的DMD基因中的BMD突變，因此會(huì)優(yōu)先產(chǎn)生或產(chǎn)生更多的比原始存在于所述BMD患者中的肌養(yǎng)蛋白更具功能性的肌養(yǎng)蛋白。甚至更優(yōu)選地，所述藥物增加個(gè)體的功能性或更具功能性的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生，和/或至少部分地降低個(gè)體的異?；蚬δ苄暂^低的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法通過(guò)誘導(dǎo)和/或促進(jìn)患者的一種或多種細(xì)胞中，優(yōu)選肌細(xì)胞中如本文所定義的至少DMD前mRNA的外顯子44的跳躍來(lái)增加該患者的更具功能性的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生，和/或降低該個(gè)體的異?；蚬δ苄暂^低的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生。通常在DMD患者中增加患者的更具功能性的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生，和/或降低患者的異常肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生。通常在BMD患者中增加更具功能性的或功能性肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生。因此，優(yōu)選方法是這樣的方法，其中在患者中，或者在所述患者的一種或多種細(xì)胞中，增加更具功能性的或功能性肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生，和/或降低所述患者的異常肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的產(chǎn)生，其中所述異常肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA或者所述更具功能性的肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的水平通過(guò)與所述方法起作用時(shí)所述患者的所述肌養(yǎng)蛋白和/或mRNA的水平進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)。如本文所定義的，功能性肌養(yǎng)蛋白優(yōu)選地為對(duì)應(yīng)于具有SEQIDN0:55所定義的氨基酸序列的蛋白的野生型肌養(yǎng)蛋白。功能性肌養(yǎng)蛋白優(yōu)選地為這樣的肌養(yǎng)蛋白，其在其N末端部分具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(N末端的前240個(gè)氨基酸)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361至3685)以及C末端結(jié)構(gòu)與(C末端的后325個(gè)氨基酸)，并且這些結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)都存在于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的野生型肌養(yǎng)蛋白中。本文所示的氨基酸對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:55所示的野生型肌養(yǎng)蛋白的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，功能性肌養(yǎng)蛋白為表現(xiàn)出至少某種程度的野生型肌養(yǎng)蛋白活性。優(yōu)選地，“至少某種程度”表示野生型功能性肌養(yǎng)蛋白相應(yīng)活性的至少30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^；100%。在該語(yǔ)境中，優(yōu)選地，野生型肌養(yǎng)蛋白的活性為與肌動(dòng)蛋白結(jié)合以及與肌養(yǎng)蛋白相關(guān)的糖蛋白復(fù)合物(DGC)結(jié)合(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進(jìn)入leiden杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)確定讀框規(guī)則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。如技術(shù)人員已知的，肌養(yǎng)蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合以及與DGC復(fù)合物的結(jié)合可以通過(guò)利用總蛋白提取物的共免疫沉淀或疑似為營(yíng)養(yǎng)不良的肌肉活檢橫切片的免疫熒光分析，進(jìn)行觀察?；加卸排d肌營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體通常在編碼肌養(yǎng)蛋白的基因中具有突變，該突變防止合成完整的蛋白，即過(guò)早終止防止合成該蛋白的C末端。在貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良中，肌養(yǎng)蛋白基因與野生型相比也包含突變，但是該突變通常不包含過(guò)早終止并且通常合成該蛋白的C末端。因此，合成了具有與野生型蛋白在活性類型至少相同的功能性肌養(yǎng)蛋白，盡管不一定是相同量的活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能性肌養(yǎng)蛋白表示框內(nèi)肌養(yǎng)蛋白基因。BMD個(gè)體的基因組通常編碼包含N末端部分(N末端的前240個(gè)氨基酸)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(氨基酸3361至3685)和C末端結(jié)構(gòu)域(C末端的后325個(gè)氨基酸)的肌養(yǎng)蛋白，但是其中心桿狀結(jié)構(gòu)域可以短于野生型肌養(yǎng)蛋白的中心桿狀結(jié)構(gòu)域(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進(jìn)入leiden杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)確定讀框規(guī)則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve，34:135-144.)。本文所示的氨基酸對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:55所示的野生型肌養(yǎng)蛋白的氨基酸。用于治療DMD的外顯子跳躍優(yōu)選地，但非專門地涉及通過(guò)使桿狀結(jié)構(gòu)域中的外顯子跳躍來(lái)克服前mRNA的過(guò)早終止以修正可讀框并允許合成包含C末端在內(nèi)的肌養(yǎng)蛋白的剩余部分，盡管該蛋白由于較小的桿狀結(jié)構(gòu)域而稍微變小。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以為患有DMD并用本文所定義的寡核苷酸治療的個(gè)體提供表現(xiàn)出至少某種程度的野生型肌養(yǎng)蛋白活性的肌養(yǎng)蛋白。更優(yōu)選地，如果所述個(gè)體為杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良患者或者疑似為杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良患者，則功能性肌養(yǎng)蛋白為在功能性上與患有BMD的個(gè)體的肌養(yǎng)蛋白相當(dāng)?shù)募○B(yǎng)蛋白優(yōu)選地，所述肌養(yǎng)蛋白能夠與肌動(dòng)蛋白和DGC相互作用，但是其中心桿狀結(jié)構(gòu)域可以短于野生型肌養(yǎng)蛋白的中心桿狀結(jié)構(gòu)域(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(入leiden杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)確定讀框規(guī)則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。野生型肌養(yǎng)蛋白的中心桿狀結(jié)構(gòu)域包含M個(gè)血影蛋白樣重復(fù)(Aartsma-RusAetal,(2006)，EntriesintheleidenDuchenneMuscularDystrophymutationdatabase:anoverviewofmutationtypesandparadoxicalcasesthatconfirmthereading-framerule(進(jìn)入leiden杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良突變數(shù)據(jù)庫(kù)確定讀框規(guī)則的突變類型和矛盾事例的綜述)，MuscleNerve,34:135-144.)。例如，本文所提供的肌養(yǎng)蛋白的中心桿狀結(jié)構(gòu)域可以包含5-23、10-22或12-18個(gè)血影蛋白樣重復(fù)，只要其能夠與肌動(dòng)蛋白和與DGC結(jié)合。降低所述患者或所述患者細(xì)胞中的異常肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生可以在mRNA水平評(píng)價(jià)，并且優(yōu)選地表示99%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或更低的原始量的異常肌養(yǎng)蛋白mRNA仍然可以通過(guò)RTPCR檢測(cè)。異常肌養(yǎng)蛋白mRNA或蛋白在本文中也稱為非功能性或功能性較低至非功能性或半功能性的肌養(yǎng)蛋白mRNA或蛋白。非功能性前mRNA肌養(yǎng)蛋白優(yōu)選地導(dǎo)致框外肌養(yǎng)蛋白，這表示沒有產(chǎn)生和/或檢測(cè)到肌養(yǎng)蛋白。非功能性肌養(yǎng)蛋白優(yōu)選地為不能與肌動(dòng)蛋白和/或DGC蛋白復(fù)合物的成員結(jié)合的肌養(yǎng)蛋白。非功能性肌養(yǎng)蛋白或肌養(yǎng)蛋白mRNA通常不具有或不編碼具有完整的蛋白C末端的肌養(yǎng)蛋白。增加患者或所述患者細(xì)胞中功能性肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生可以在mRNA水平評(píng)價(jià)(通過(guò)RT-PCR分析)，并且優(yōu)選地表示可檢測(cè)量的功能性或框內(nèi)肌養(yǎng)蛋白可以通過(guò)RTPCR檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的可檢測(cè)肌養(yǎng)蛋白mRNA是功能性或框內(nèi)肌養(yǎng)蛋白mRNA。增加患者或所述患者細(xì)胞中功能性肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生可以在蛋白水平評(píng)價(jià)(通過(guò)免疫熒光和蛋白印跡分析)，并且優(yōu)選地表示可檢測(cè)量的功能性肌養(yǎng)蛋白可以通過(guò)免疫熒光或蛋白印跡分析檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的可檢測(cè)肌養(yǎng)蛋白是功能性肌養(yǎng)蛋白。增加或降低優(yōu)選地在個(gè)體或患者的肌肉組織或肌細(xì)胞中通過(guò)與在用本發(fā)明的所述分子或組合物進(jìn)行治療之前存在于所述個(gè)體或患者中的量進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)?；蛘?，比較可以用所述個(gè)體或患者的肌肉組織或細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，如果治療是局部的，所述個(gè)體或患者尚未用所述寡核苷酸或組合物進(jìn)行治療。在另一方面，提供了用于緩和個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良的一種或多種癥狀，或者緩和所述個(gè)體的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的一種或多種特征的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體如本文所定義的寡核苷酸或組合物。還提供了用于增強(qiáng)、誘導(dǎo)或促進(jìn)患有杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良個(gè)體的表達(dá)肌養(yǎng)蛋白前mRNA的細(xì)胞中所述肌養(yǎng)蛋白前mRNA的外顯子跳躍的方法，所述方法包括給8予所述個(gè)體如本文所定義的寡核苷酸或組合物。還提供了用于增加細(xì)胞中功能性肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生和/或降低細(xì)胞中異常肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生的方法，所述細(xì)胞包含編碼異常肌養(yǎng)蛋白的肌養(yǎng)蛋白基因的前mRNA，所述方法包括為所述細(xì)胞提供本發(fā)明的寡核苷酸或組合物并允許由所述前mRNA剪接產(chǎn)生的mRNA翻譯。在一實(shí)施方案中，所述方法在體內(nèi)進(jìn)行，例如利用細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述方法為所述個(gè)體體內(nèi)的。在本上下文中，已經(jīng)了定義了增加功能性肌養(yǎng)蛋白的產(chǎn)生。利用本發(fā)明的分子或組合物緩和個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良的一種或多種癥狀可以通過(guò)任何以下測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)至喪失行走的時(shí)間延長(zhǎng)、肌肉強(qiáng)度改善、舉起重物的能力改善、從地板起來(lái)的時(shí)間改善、9米行走時(shí)間改善、4階爬行所耗時(shí)間改善、腿功能等級(jí)改善、肺功能改善、心臟功能改善、生活質(zhì)量改善。這些測(cè)定中的每個(gè)測(cè)定對(duì)技術(shù)人員是已知的。作為實(shí)例，出版物Manzureta1(ManzurAYetal,(2008),GlucocorticoidcorticosteroidsforDuchennemusculardystrophy(用于杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)類固醇)(綜述)，Wileypublishers,TheCochranecollaboration.)給出了這些測(cè)定中的每個(gè)測(cè)定的大量解釋。對(duì)于這些測(cè)定中的每個(gè)測(cè)定，只要在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)所測(cè)量參數(shù)的可檢測(cè)的改善或延長(zhǎng)，這優(yōu)選地表示利用本發(fā)明的分子或組合物緩和了個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良的一種或多種癥狀?？蓹z測(cè)的改善或延長(zhǎng)優(yōu)選地為如Hodgettsetal(HodgettsS.，etal,(2006),NeuromuscularDisorders,16:591-602)所述的統(tǒng)計(jì)上顯著的改善或延長(zhǎng)?；蛘?，杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良的一種或多種癥狀的緩和可以通過(guò)測(cè)量與肌纖維的功能、完整性和/或存活相關(guān)的肌纖維特征的改善來(lái)評(píng)價(jià)，所述特征在患者自身進(jìn)行評(píng)價(jià)。這樣的特征可以在給定患者的細(xì)胞、組織水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。一種或多種特征的緩和可以通過(guò)患者的生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞的任何以下測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)肌細(xì)胞鈣吸收減少、膠原蛋白合成降低、形態(tài)學(xué)改變、脂類生物合成改變、氧化應(yīng)激降低和/或肌纖維功能、完整性和/或存活改善。這些參數(shù)通常利用肌肉活檢橫切片的免疫熒光和/或組織化學(xué)分析來(lái)評(píng)價(jià)。本文所用的寡核苷酸優(yōu)選地包括反義寡核苷酸或反義寡核糖核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用了外顯子跳躍技術(shù)。外顯子跳躍干擾發(fā)生于真核細(xì)胞中的天然剪接過(guò)程。在高等真核生物中，細(xì)胞DNA中的蛋白質(zhì)遺傳信息編碼于外顯子中，該外顯子被內(nèi)含子序列互相隔離。這些內(nèi)含子在某些情況下非常長(zhǎng)。真核生物的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(transcriptionmachinery)產(chǎn)生含有外顯子和內(nèi)含子的前mRNA，而已經(jīng)在產(chǎn)生前mRNA期間的剪接系統(tǒng)通過(guò)存在于前mRNA中的外顯子剪接在一起產(chǎn)生蛋白的實(shí)際編碼區(qū)。外顯子跳躍導(dǎo)致缺乏至少一個(gè)跳躍的外顯子的成熟mRNA。因此，當(dāng)所述外顯子編碼氨基酸時(shí)，外顯子跳躍導(dǎo)致表達(dá)改變的產(chǎn)物。外顯子跳躍技術(shù)目前涉及使用反義寡核苷酸(AON)。許多這項(xiàng)工作在杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良的mdx小鼠模型中完成。Mdx小鼠攜帶外顯子23中的無(wú)義突變。除了妨礙合成功能性肌養(yǎng)蛋白的mdx突變以外，已經(jīng)在mdx肌肉組織中觀察到稀有的天然存在的肌養(yǎng)蛋白陽(yáng)性纖維。這些肌養(yǎng)蛋白陽(yáng)性纖維被認(rèn)為來(lái)自由于體細(xì)胞突變或通過(guò)替代剪接而導(dǎo)致的明顯天然存在的外顯子跳躍機(jī)制。分別涉及肌養(yǎng)蛋白前mRNA中的內(nèi)含子22和23的3’和/或5’剪接位點(diǎn)的AON被證實(shí)干擾通常參與除去內(nèi)含子23的因子，從而外顯子23也從mRNA中被除去(AlterJ，etal.Systemicdeliveryofmorpholinooligonucleotiderestoresdystrophinexpressionbodywideandimprovesdystrophicpathology(嗎啉代寡核苷酸的全身遞送恢復(fù)身體范圍的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)并改善營(yíng)養(yǎng)不良病理學(xué)).NatMed2006；12(2):175-7,LuQL,etal.FunctionalamountsofdystrophinproducedbyskippingthemutatedexoninthemdxdystrophicmouseOiidx營(yíng)養(yǎng)不良小鼠中突變的外顯子所產(chǎn)生的功能量的肌養(yǎng)蛋白).NatMed2003；66,LuQL,etal.Systemicdeliveryofantisenseoligoribonucleotiderestoresdystrophinexpressioninbody-wideskeletalmuscles(反義寡核糖核苷酸的全身遞送恢復(fù)身體范圍骨骼肌中的肌養(yǎng)蛋白表達(dá))NatlAcadSciUSA2005；102(1)198-203,MannCJ,etal,Improvedantisenseoligonucleotideinducedexonskippinginthemdxmousemodelofmusculardystrophy(改進(jìn)的反義寡核糖核苷酸誘導(dǎo)肌肉萎縮癥的mdx小鼠模型中的外顯子跳躍).JGeneMed2002；4(6):644-54orGrahamIR,etal,Towardsatherapeuticinhibitionofdystrophinexon23splicinginmdxmousemuscleinducedbyantisenseoligoribonucleotides(spIicomers)targetsequenceoptimisationusingoligonucleotidearrays(針對(duì)mdx小鼠肌肉中由反義寡核糖核苷酸(剪接體)誘導(dǎo)的肌養(yǎng)蛋白外顯子23剪接的治療抑制利用寡核苷酸陣列優(yōu)化靶序列).JGeneMed2004；6(10):1149-58)。通過(guò)特定外顯子的靶向跳躍，將DMD表型轉(zhuǎn)變?yōu)檩^輕微的BMD表型。外顯子跳躍優(yōu)選地由靶向外顯子內(nèi)部序列的AON的結(jié)合誘導(dǎo)。針對(duì)外顯子內(nèi)部序列的寡核苷酸通常不表現(xiàn)出與非外顯子序列的重疊。其優(yōu)選地不與剪接位點(diǎn)重疊，至少在剪接位點(diǎn)存在于內(nèi)含子中的情況下不重疊。針對(duì)外顯子內(nèi)部序列的寡核苷酸優(yōu)選地不含有與鄰近的內(nèi)含子互補(bǔ)的序列。因此，還提供了本發(fā)明的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其功能性等同物用于抑制肌養(yǎng)蛋白前mRNA的外顯子包含入所述前mRNA的剪接所產(chǎn)生的mRNA中。優(yōu)選應(yīng)用外顯子跳躍技術(shù)，從而肌養(yǎng)蛋白前mRNA所產(chǎn)生的mRNA的外顯子缺乏產(chǎn)生了雖然較短但更具功能性的肌養(yǎng)蛋白的編碼區(qū)。在本語(yǔ)境中，如前文所定義的，抑制外顯子的包含優(yōu)選地表示檢測(cè)到原始的異常肌養(yǎng)蛋白mRNA和/或蛋白降低。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，寡核苷酸的功能性等同物優(yōu)選地表示如本文本文所定義的寡核苷酸，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)被取代，并且其中至少在某種程度上保留了所述功能性等同物的活性。優(yōu)選地，所述功能性等同物的活性提供了功能性肌養(yǎng)蛋白。因此，所述功能性等同物的所述活性優(yōu)選地通過(guò)定量功能性肌養(yǎng)蛋白的量或通過(guò)定量功能性肌養(yǎng)蛋白mRNA的量來(lái)評(píng)價(jià)。優(yōu)選地，功能性肌養(yǎng)蛋白(或功能性肌養(yǎng)蛋白mRNA)在本文中被定義為能夠與肌動(dòng)蛋白及DGC蛋白的成員結(jié)合的肌養(yǎng)蛋白(或由所述mRNA編碼的肌養(yǎng)蛋白)。寡核苷酸的所述活性的評(píng)價(jià)，優(yōu)選地通過(guò)RT-PCR(m-RNA)進(jìn)行，或通過(guò)免疫熒光或蛋白印跡分析(蛋白)進(jìn)行。當(dāng)其表示至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%或者更高的功能性等同物所來(lái)源的所述寡核苷酸的相應(yīng)活性時(shí)，所述活性優(yōu)選地保留至某種程度。這類活性可以在個(gè)體的肌肉組織或肌細(xì)胞中或者在體外于細(xì)胞中，通過(guò)與功能性等同物所來(lái)源的所述寡核苷酸的相應(yīng)寡核苷酸的活性進(jìn)行比較來(lái)測(cè)量。在本申請(qǐng)中，當(dāng)使用詞語(yǔ)寡核苷酸時(shí)，其可以由本文所定義的該寡核苷酸的功能性等同物替代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含前文所定義的與肌養(yǎng)蛋白前mRNA的外顯子44結(jié)合和/或互補(bǔ)的序列的本發(fā)明的寡核苷酸是這樣的互補(bǔ)部分是本發(fā)明寡核苷酸長(zhǎng)度的至少50%，更優(yōu)選至少60%，甚至更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%或者甚至更優(yōu)選至少95%，或者甚至更優(yōu)選至少98%，或者甚至更優(yōu)選至少99%，或者甚至更優(yōu)選100%。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸由如本文所定義的與肌養(yǎng)蛋白前mRNA的部分互補(bǔ)的序列組成。作為實(shí)例，寡核苷酸可以包含與本文所定義的肌養(yǎng)蛋白前mRNA的部分互補(bǔ)的序列和另外的側(cè)翼序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸的所述互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、M、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，用另外的側(cè)翼序列改良蛋白與寡核苷酸的結(jié)合，或改良寡核苷酸的熱力學(xué)性質(zhì)，更優(yōu)選地改良靶RNA結(jié)合親和力。因此，并不絕對(duì)要求互補(bǔ)區(qū)中的所有堿基能夠與相反鏈中的堿基配對(duì)。例如，當(dāng)設(shè)計(jì)寡核苷酸時(shí)，可以例如并入不與互補(bǔ)鏈上的堿基配對(duì)的殘基?？梢栽试S某種程度的錯(cuò)配，如果在細(xì)胞環(huán)境中，核苷酸的長(zhǎng)度足夠與互補(bǔ)部分雜交。在該語(yǔ)境中，“足夠”優(yōu)選地表示利用EP1619249的實(shí)施例1所述的凝膠遷移率變動(dòng)分析，寡核苷酸的結(jié)合是可檢測(cè)的。任選地，所述寡核苷酸還可以通過(guò)轉(zhuǎn)染入患者的肌細(xì)胞來(lái)進(jìn)行測(cè)試。靶向外顯子的跳躍可以通過(guò)RT-PCR評(píng)價(jià)(如EP1619249所述)?；パa(bǔ)區(qū)優(yōu)選地如此設(shè)計(jì)，即當(dāng)組合時(shí)，他們對(duì)前mRNA中的外顯子是特異性的?？梢杂酶鞣N長(zhǎng)度的互補(bǔ)區(qū)來(lái)產(chǎn)生這樣的特異性，因?yàn)檫@取決于系統(tǒng)中其他(前)mRNA的實(shí)際序列。一種或多種其他前mRNA也會(huì)能夠與寡核苷酸雜交的風(fēng)險(xiǎn)隨著寡核苷酸大小的增加而降低。明顯的是，在互補(bǔ)區(qū)中包含錯(cuò)配但保留與前mRNA中靶向區(qū)域雜交和/或結(jié)合的能力的寡核苷酸可以用于本發(fā)明中。然而，優(yōu)選地，至少互補(bǔ)部分不包含這樣的錯(cuò)配，因?yàn)檫@些部分通常比在一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)區(qū)中具有這樣的錯(cuò)配的寡核苷酸具有更高的效率和更高的特異性。據(jù)認(rèn)為較高的雜交強(qiáng)度(即，增加與相反鏈的相互作用的數(shù)目)有利于增加干擾系統(tǒng)的剪接機(jī)構(gòu)的過(guò)程的效率。優(yōu)選地，互補(bǔ)為90%至100%。通常，在20個(gè)核苷酸的寡核苷酸中，這允許1或2個(gè)錯(cuò)配，或者在40個(gè)核苷酸的寡核苷酸中，允許1、2、3或4個(gè)錯(cuò)配，或者在60個(gè)核苷酸的寡核苷酸中，允許1、2、3、4、5或6個(gè)錯(cuò)配。本發(fā)明的優(yōu)選分子包含基于核苷酸的序列或由基于核苷酸的序列組成，該基于核苷酸的序列與選自DMD前mRNA的外顯子44的序列反義。DMD前mRNA的序列優(yōu)選地選自SEQIDNO1:5，-GUGGCUAACAGAAGCU；SEQIDNO25‘-GGGAACAUGCUAAAUAC；SEQIDNO35，-AGACACAAAUUCCUGAGA和SEQIDNO4:5’-CUGUUGAGAAA。本發(fā)明的分子優(yōu)選為分離的分子。本發(fā)明的分子優(yōu)選為核酸分子或基于核苷酸的分子或寡核苷酸或反義寡核苷酸，其與選自SEQIDN0:l、2、3或4的外顯子44的序列結(jié)合和/或互補(bǔ)。本發(fā)明的優(yōu)選分子包含約8至約60個(gè)核苷酸或由約8至約60個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含約10至約50個(gè)核苷酸或由約10至約50個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含約17至約40個(gè)核苷酸或由約17至約40個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含約18至約30個(gè)核苷酸或由約18至約30個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含約18至約M個(gè)核苷酸或由約18至約M個(gè)核苷酸組成，最優(yōu)選包含約20個(gè)核苷酸或由約20個(gè)核苷酸組成，例如18個(gè)核苷酸、19個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸或23個(gè)核苷酸。本發(fā)明的優(yōu)選分子包含8至60個(gè)核苷酸或由8至60個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含10至50個(gè)核苷酸或由10至50個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含17至40個(gè)核苷酸或由17至40個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含18至30個(gè)核苷酸或由18至30個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含21至60個(gè)核苷酸或由21至60個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含22至55個(gè)核苷酸或由22至55個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含23至53個(gè)核苷酸或由23至53個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含M至50個(gè)核苷酸或由M至50個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含25至45個(gè)核苷酸或由25至45個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含26至43個(gè)核苷酸或由沈至43個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含27至41個(gè)核苷酸或由27至41個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含觀至40個(gè)核苷酸或由觀至40個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含四至40個(gè)核苷酸或由四至40個(gè)核苷酸組成，更優(yōu)選包含18至M個(gè)核苷酸或由18至M個(gè)核苷酸組成，或者優(yōu)選地包含11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸或由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含選自表IA所示的反義核苷酸序列的反義核苷酸序列的分子，或由選自表IA所示的反義核苷酸序列的反義核苷酸序列組成的分子。與具有核苷酸序列SEQIDNO1:5，_GUGGCUAACAGAAGCU的核苷酸結(jié)合和/或互補(bǔ)和/或反義的本發(fā)明的分子或核酸分子，優(yōu)選地包含以下反義核苷酸序列或由以下反義核苷酸序列組成SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDNO31、SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO38,SEQIDNO:39、SEQIDNO:41,SEQIDNO42,SEQIDNO49或SEQIDNO:54。革巴向DMD前mRNA的該區(qū)域的優(yōu)選分子包含以下反義核苷酸序列或由以下反義核苷酸序列組成SEQIDNO5,SEQIDNO49或SEQIDNO54。最優(yōu)選的寡核苷酸包含SEQIDNO:5的反義核苷酸序列或由SEQIDNO5的反義核苷酸序列組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含反義核苷酸序列SEQIDNO55，-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG或由反義核苷酸序列SEQIDNO5:5，-UCAGCUUCUGUUAGCCACUG組成的分子。據(jù)發(fā)現(xiàn)，該分子非常有效地調(diào)節(jié)肌細(xì)胞中DMD基因的外顯子44的剪接。包含SEQIDNO:5的本發(fā)明的這種優(yōu)選分子包含21至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含22至55個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含23至53個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含M至50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含25至45個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含26至43個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含27至41個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含觀至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含四至40個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選地包含20、21、22、23、M、25、沈、27、觀、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸或者由20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含反義核苷酸序列SEQIDNO49或討或者由反義核苷酸序列SEQIDNO49或M組成的分子。包含SEQIDNO49或SEQIDNO54的本發(fā)明的這些優(yōu)選分子還包含18至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含18至55個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含20至53個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含M至50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含25至45個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含26至43個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含27至41個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含洲至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含四至40個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選地包含18、19、20、21、22、23、M、25、沈、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸，或者由18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。在另一實(shí)施方案中，與SEQIDNO2:5，-GGGAACAUGCUAAAUAC反義的本發(fā)明的分子優(yōu)選地包含SEQIDNO43或SEQIDNO44的反義核苷酸序列或由SEQIDNO43或SEQIDNO44的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO43或SEQIDNO44的本發(fā)明的優(yōu)選分子還包含17至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含18至30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含21至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含22至55個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含23至53個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含M至50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含25至45個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含沈至43個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含27至41個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含觀至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含四至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含18至24個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選地包含17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、對(duì)、25、洸、27、沘、29、30、31、32、33、；34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。仍然在另一實(shí)施方案中，與SEQIDNO3:5’-AGACACAAAUUCCUGAGA反義的本發(fā)明的分子，優(yōu)選地包含SEQIDNO47或SEQIDNO48的反義核苷酸序列或者由SEQIDNO47或SEQIDNO48的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO47或SEQIDNO48的本發(fā)明的這些優(yōu)選分子還包含17至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含18至30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含17至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含22至55個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含23至53個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含24至50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含25至45個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含沈至43個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含27至41個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含28至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含四至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含18至24個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選地包含17、18、19、20、21、22、23、對(duì)、25、洸、27、沘、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸，或者由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。仍然在另一實(shí)施方案中，與SEQIDNO4:5，_CUGUUGAGAAA反義的本發(fā)明的分子優(yōu)選地包含SEQIDNO45或SEQIDNO46的反義核苷酸序列或由SEQIDNO45或SEQIDNO46的反義核苷酸序列組成。包含SEQIDNO45或SEQIDNO:46的本發(fā)明的這些優(yōu)選分子還包含11至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含11至30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選包含11至60個(gè)核苷酸，或者優(yōu)選地包含11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、1332、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸，或者由11、12、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明的分子的核苷酸序列可以含有RNA殘基，或者一個(gè)或多個(gè)DNA殘基，和/或一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物或等同物，如將在下文進(jìn)一步所詳細(xì)地描述的。優(yōu)選本發(fā)明的分子包含一個(gè)或多個(gè)殘基，該殘基經(jīng)修飾增加核酸酶抗性和/或增加反義核苷酸對(duì)靶序列的親和力。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義核苷酸序列包含至少一種核苷酸類似物或等同物，其中核苷酸類似物或等同物被定義為具有修飾的堿基和/或修飾的主鏈和/或非天然核苷間連接或這些修飾的組合的殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷酸類似物或等同物包含修飾的主鏈。此類主鏈的實(shí)例為嗎啉代主鏈；氨基甲酸酯主鏈；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰基(formacetyl)和硫代甲?；?thioformacetyl)主鏈；亞甲基甲?；?methyleneformacetyl)主鏈；核糖乙酰基(riboacetyl)主鏈；含有烯烴的主鏈；氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主鏈、亞甲基亞胺基和亞甲基胼基主鏈；以及酰胺主鏈。二氨基磷酸酯(Phosphorodiamidate)嗎啉代低聚物為已經(jīng)作為反義試劑而研究的修飾的主鏈寡核苷酸。嗎啉代寡核苷酸具有不帶電的主鏈，其中DNA的脫氧核糖由6元環(huán)代替并且磷酸二酯鍵由二氨基磷酸酯鍵代替。嗎啉代寡核苷酸對(duì)酶促降解具有抗性，并且看起通過(guò)阻止翻譯干擾前mRNA剪接而不是通過(guò)激活RNaseH(核糖核酸酶H)來(lái)充當(dāng)反義試劑發(fā)揮作用。已經(jīng)通過(guò)物理破壞細(xì)胞膜的方法將嗎啉代寡核苷酸成功地送遞至組織培養(yǎng)細(xì)胞，并且比較這些方法中的幾個(gè)方法的研究發(fā)現(xiàn)劃痕負(fù)載(scrapeloading)是最有效的送遞方法；然而，由于嗎啉代主鏈?zhǔn)遣粠щ姷模躁?yáng)離子脂類不是細(xì)胞中嗎啉代寡核苷酸吸收的有效介質(zhì)。最近的報(bào)告證明，嗎啉代寡核苷酸形成三鏈體，并且由于非離子主鏈，這些研究表明，嗎啉代寡核苷酸在沒有鎂的情況下能夠形成三鏈體。還優(yōu)選的是，主鏈的殘基之間的連接不包含磷原子，例如由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合或者一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成的連接。優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包含具有修飾的聚酰胺主鏈的肽核酸(PNA)(Nielsen,etal.(1991)Science254，1497-1500)。對(duì)于堿基對(duì)的識(shí)別，基于PNA的分子是DNA分子的真實(shí)模擬。PNA主鏈由通過(guò)肽鍵連接的N-(2-氨基乙基)_甘氨酸單元組成，其中核堿基通過(guò)亞甲基羰基鍵連接至主鏈。替代性主鏈包含一碳延伸的吡咯烷PNA單體(GovindarajuandKumaH2005)Chem.Commun，495-497)。由于PNA分子的主鏈含有不帶電的磷酸基團(tuán)，所以PNA-RNA雜化物通常分別比RNA-RNA或RNA-DNA雜化物更穩(wěn)定(Egholmetal(1993)Nature365,566-568)。另一優(yōu)選的主鏈包含嗎啉代核苷酸類似物或等同物，其中核糖或脫氧核糖由6元嗎啉代環(huán)代替。最優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包含二氨基磷酸酯嗎啉代低聚物(PMO)，其中核糖或脫氧核糖由6元嗎啉代換代替，并且鄰近的嗎啉代環(huán)之間的陰離子磷酸二酯鍵由非離子二氨基磷酸酯鍵代替。仍然在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸類似物或等同物包含磷酸二酯鍵中一個(gè)非橋接氧的取代。這種修飾稍微使堿基配對(duì)不穩(wěn)定，但是明顯地增加了對(duì)核酸酶降解的抗性。優(yōu)選的核苷酸類似物或等同物包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；H-膦酸酯；包括3’_亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯在內(nèi)的甲基及其他烷基膦酸酯；次膦酸酯；包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在內(nèi)的氨基磷酸酯；硫羰基氨基磷酸酯；硫羰基烷基膦酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸鹽(selenophosphate)或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。本發(fā)明的另一優(yōu)選核苷酸類似物或等同物包含一個(gè)或多個(gè)糖部分，其是2’、3’和/或5’位置處的單或二取代的，如-OH；-F；取代或未取代、直鏈或支鏈低級(jí)(Cl-ClO)的烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可以被一個(gè)或多個(gè)雜原子中斷；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；0-、S-或N-烯丙基；0-烷基-0-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲基氨基氧基乙氧基(dimethylaminooxyethoxy)；以及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物或者脫氧吡喃糖或其衍生物，優(yōu)選核糖或其衍生物或者脫氧核糖或其衍生物。優(yōu)選的衍生化的糖部分包含鎖核酸(LockedNucleicAcid，LNA)，其中2’-碳原子連接至糖環(huán)的3’或4’碳原子，從而形成雙環(huán)糖部分。優(yōu)選的LNA包括2，-0，4，-C-乙烯橋接的核酸(Moritaetal.2001.NucleicAcidResSupplementNo.1:241-242)。這些取代賦予核苷酸類似物或等同物RNaseH和核酸酶抗性并增加對(duì)靶RNA的親和力。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸類似物或等同物包含一個(gè)或多個(gè)堿基修飾或取代。修飾的堿基包括合成和天然堿基，如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤以及本領(lǐng)域已知或會(huì)知道的嘧啶和嘌呤的其他氮雜、脫氮(deaza)、-羥基、-鹵代、-硫代、巰基、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，并不需要統(tǒng)一地修飾反義寡核苷酸的所有位置。另外，多于一個(gè)的前述類似物或等同物可以被并入單個(gè)反義寡核苷酸或者甚至反義寡核苷酸的一個(gè)位置處。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸具有至少兩種不同類型的類似物或等同物。本發(fā)明優(yōu)選的反義寡核苷酸包括2’-0烷基硫代磷酸酯反義寡核苷酸，如2'-0-甲基修飾的核糖(RNA)、2’-0_乙基修飾的核糖、2’-0_丙基修飾的核糖和/或諸如鹵代衍生物的這些修飾的取代衍生物。本發(fā)明的最優(yōu)選反義寡核苷酸包2’-0-甲基硫代磷酸酯核糖。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以將不同的反義寡核苷酸組合，用于外顯子44有效跳躍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少兩種反義寡核苷酸的組合用于本發(fā)明的方法中，例如，兩種不同的反義寡核苷酸、三種不同的反義寡核苷酸、四種不同的反義寡核苷酸或五種不同的反義寡核苷酸?？梢詫⒎戳x寡核苷酸連接至增強(qiáng)細(xì)胞的反義寡核苷酸吸收的部分，優(yōu)選生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞。這些部分的實(shí)例為膽固醇；碳水化合物；維生素；生物素；脂類；磷脂；穿透細(xì)胞的肽，其包括但不限于觸角蛋白(antennapedia)、TAT、運(yùn)送子(transportan)和帶正電的氨基酸，如寡精氨酸、聚精氨酸、寡賴氨酸或聚賴氨酸；抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如抗體提供的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抗體的Fab片段或單鏈抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如卵形單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cameIoidsingledomainantigen-bindingdomain)。優(yōu)選的反義寡核苷酸包含肽連接的ΡΜ0?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的合適方法間接地給予寡核苷酸。例如，可以向個(gè)體或所述個(gè)體的細(xì)胞、組織或器官提供表達(dá)載體形式的寡核苷酸，其中該表達(dá)載體編碼包含所述寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄本。優(yōu)選地通過(guò)基因送遞媒介物將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞、組織、器官或個(gè)體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了基于病毒的表達(dá)載體，該基于病毒的表達(dá)載體包含驅(qū)動(dòng)本文所鑒定的分子表達(dá)或轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒或轉(zhuǎn)錄盒?？梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)粒來(lái)源的反義寡核苷酸表達(dá)或者由基于腺病毒的載體或基于腺伴隨病毒的載體所提供的病毒表達(dá)來(lái)為細(xì)胞提供能夠干擾基本序列的分子，該分子導(dǎo)致高效的外顯子44跳躍。表達(dá)優(yōu)選地由聚合酶III啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，例如U1、TO或U7RNA啟動(dòng)子。優(yōu)選的送遞媒介物是病毒載體，如腺伴隨病毒載體(AAV)、諸如慢病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒(GoyenvalleA，etal·RescueofdystrophicmusclethroughU7snRNA-mediatedexonskipping.Science2004；306(5702):1796-9，DeAngelisFG，etal·ChimericsnRNAmoleculescarryingantisensesequencesagainstthesplicejunctionsofexon51ofthedystrophinpre—mRNAinduceexonskippingandrestorationofadystrophinsynthesisinDelta48-50DMDcells(帶有針對(duì)月/I養(yǎng)蛋白前mRNA的外顯子51的剪接點(diǎn)的反義序列的嵌合snRNA分子在Delta48-50DMD中誘導(dǎo)外顯子跳躍并恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白合成hftOcNatlAcadSciUSA2002；99(14):9456-61或DentiMA,etal.Chimericadeno-associatedvirus/antisenseUlsmallnuclearRNAeffectivelyrescuesdystrophinsynthesisandmusclefunctionbylocaltreatmentofmdxmice(嵌合腺伴隨病毒/反義Ul小核RNA通過(guò)mdx小鼠的局部治療有效地解救肌養(yǎng)蛋白合成和肌肉功能).HumGeneTher2006；17(5):565-74)等。此外，可以將質(zhì)粒、人工染色體、可用于人基因組細(xì)胞中的靶向同源重組和整合的質(zhì)粒合適地用于送遞本文所定義的寡核苷酸。本發(fā)明優(yōu)選的是那些載體，其中轉(zhuǎn)錄由PolIII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，和/或其中轉(zhuǎn)錄本為與Ul或U7轉(zhuǎn)錄本融合物的形式，這獲得送遞小轉(zhuǎn)錄本的良好結(jié)果。技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)合適的轉(zhuǎn)錄本。優(yōu)選的是PolIII驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄本。優(yōu)選地，為與Ul或U7轉(zhuǎn)錄本融合轉(zhuǎn)錄本的形式(參見，相同的GoyenvalleAetal，DeAngelisFGetal或DentiMAetal)。這樣的融合物可以如所述產(chǎn)生(GormanL,etal,Stablealterationofpre-mRNAsplicingpatternsbymodifiedU7smallnuclearRNAs(fflil^i^WU7/Jn^RNA11地改變前mRNA剪接模式).ProcNatlAcadSciUSA1998；95(9):4擬9_34或SuterD，etal,Double-targetantisenseU7snRNAspromoteefficientskippingofanaberrantexoninthreehumanbeta—thalassemicmutations(雙革巴向反義U7snRNA促進(jìn)三禾中人β地中海貧血突變中的異常外顯子的有效跳躍).HumMolGenet1999；8(13):2415-23)。可以送遞寡核苷酸自身。然而，寡核苷酸也可以由病毒載體編碼。通常，寡核苷酸為RNA轉(zhuǎn)錄本的形式，該RNA轉(zhuǎn)錄本包含所述轉(zhuǎn)錄本的一部分中的寡核苷酸的序列。一種優(yōu)選的反義寡核苷酸表達(dá)系統(tǒng)是基于腺病毒伴隨病毒(AAV)的載體。已經(jīng)開發(fā)了單鏈和雙鏈基于AAV的載體，該載體可以延長(zhǎng)小反義核苷酸序列的表達(dá)，用于使DMD的外顯子44高效跳躍。優(yōu)選的基于AAV的載體包含由聚合酶III啟動(dòng)子(PolIII)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒。優(yōu)選的PolIII啟動(dòng)子為，例如Ul、TO或U7RNA啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明還提供了基于病毒的載體，其包含PolIII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，用于表達(dá)本發(fā)明的誘導(dǎo)DMD基因的外顯子44跳躍的反義寡核苷酸?？紤]到已經(jīng)目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的進(jìn)步，所以期望改善為個(gè)體或所述個(gè)體的細(xì)胞、組織、器官提供寡核苷酸和/或其等同物的方式。當(dāng)然，可以并入這樣的未來(lái)改進(jìn)，來(lái)利用本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)重建mRNA的所述效果?？梢詫⒐押塑账岷?或其等同物自身送遞至個(gè)體、所述個(gè)體的細(xì)胞、組織或器官。當(dāng)給予寡核苷酸和/或其等同物時(shí)，優(yōu)選將寡核苷酸和/或其等同物溶于與送遞方法相容的溶液中?？梢酝ㄟ^(guò)提供水溶液中的質(zhì)粒，為肌細(xì)胞或生肌細(xì)胞提供用于反義寡核苷酸的質(zhì)粒?；蛘?，可以利用已知的轉(zhuǎn)染試劑，通過(guò)轉(zhuǎn)染來(lái)提供質(zhì)粒。對(duì)于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)和/或心室內(nèi)給藥，優(yōu)選溶液為生理鹽水溶液。特別優(yōu)選的是，在本發(fā)明中使用賦形劑或轉(zhuǎn)染試劑，其有助于將本文所定義的每種組分送遞至細(xì)胞和/或送遞入細(xì)胞，優(yōu)選肌細(xì)胞。能夠形成復(fù)合物、納米顆粒、微團(tuán)、小泡和/或脂質(zhì)體的賦形劑或轉(zhuǎn)染試劑是優(yōu)選的，其將復(fù)合或捕捉在小泡或脂質(zhì)體中的本文所定義的每種組分送遞通過(guò)細(xì)胞膜。許多這些賦形劑在本領(lǐng)域是已知的。合適的賦形劑或轉(zhuǎn)染試劑包括聚乙烯亞胺(PEI；ExGen500(MBIFermentas))；LipofectAMINE2000或其衍生物；或者類似的陽(yáng)離子聚合物，其包括聚丙烯亞胺或聚乙烯亞胺共聚物(PEC)和衍生物；合成親水脂分子(SAINT-18)；IipofectinTM；DOTAP；和/或病毒衣殼蛋白，其能夠自我組裝成可以將本文所定義的每種組分送遞至優(yōu)選肌細(xì)胞的細(xì)胞的顆粒。已經(jīng)證實(shí)這樣的賦形劑有效地將諸如反義核酸的寡核苷酸送遞至包括肌細(xì)胞在內(nèi)的各種培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于整體細(xì)胞存活率，將它們的高轉(zhuǎn)染潛力與期望的低至中等的毒性組合。結(jié)構(gòu)修飾的便利可以用于允許進(jìn)一步的修飾以及它們的其他(體內(nèi))核酸轉(zhuǎn)移特征和毒性的分析。Lipofectin代表脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)例。其由兩種脂質(zhì)組分組成陽(yáng)離子脂質(zhì)N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)(cp.D0TAP，其是甲基硫酸鹽)和中性脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性組分介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)釋放。另一組送遞系統(tǒng)是聚合納米顆粒?？梢詫⒅T如已知為DNA轉(zhuǎn)染試劑的二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖的聚陽(yáng)離子與氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)組合以配制陽(yáng)離子納米顆粒，其可以將優(yōu)選寡核苷酸的本文所定義的每種組分跨越細(xì)胞膜送遞入細(xì)胞。除了這些常見的納米顆粒材料以外，陽(yáng)離子肽魚精蛋白提供了配制寡核苷酸與膠體的替代方法。這種膠態(tài)納米顆粒系統(tǒng)可以形成所謂的proticle，其可以通過(guò)簡(jiǎn)單的自我組裝過(guò)程來(lái)包裝并介導(dǎo)寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)釋放而制備。技術(shù)人員可以選擇并采用任何上述或其他可商購(gòu)的替代賦形劑和送遞系統(tǒng)來(lái)包裝和送遞用于本發(fā)明的寡核苷酸從而將其送遞，用于治療人的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良。此外，可以將寡核苷酸共價(jià)或非共價(jià)連接至靶向配體，該靶向配體經(jīng)特別的設(shè)計(jì)促進(jìn)吸收入細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)和/或其細(xì)胞核。這樣的配體可以包含(i)化合物(包括但不限于肽(樣)結(jié)構(gòu))，其識(shí)別促進(jìn)細(xì)胞吸收的細(xì)胞、組織或器官特異性元件，和/或(ii)化學(xué)化合物，其能夠促進(jìn)吸收入細(xì)胞和/或寡核苷酸從諸如核內(nèi)體或溶酶體的小泡的細(xì)胞內(nèi)釋放。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將寡核苷酸配制于組合物或藥物或組合物中，并為其提供至少賦形劑和/或用于送遞的靶向配體和/或?qū)⑵渌瓦f細(xì)胞和/或增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)送遞的送遞裝置。因此，本發(fā)明還包含藥物可接受的組合物，該藥物可接受的組合物包含寡核苷酸并且還包含至少一種賦形劑和/或用于送遞的靶向配體和/或?qū)⑺龉押塑账崴瓦f至細(xì)胞和/或增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)送遞的送遞裝置。應(yīng)當(dāng)理解，如果組合物包含諸如后文所定義的輔助化合物的其他組分，則該組合物的每種組分可以不配制于一種單一的組合或組合物或制劑中。取決于它們的特性，技術(shù)人員會(huì)知道哪種類型的制劑最適合本文所定義的每種組分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含寡核苷酸和如后文所定義的其他輔助化合物的組件試劑盒(kitofparts)形式的組合物或制劑。優(yōu)選的寡核苷酸用于預(yù)防或治療個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)。可以用本發(fā)明的寡核苷酸治療的個(gè)體可能已經(jīng)診斷為患有DMD或BMD?；蛘?，可以用本發(fā)明的寡核苷酸治療的個(gè)體可能尚未診斷為患有DMD或BMD，但是該個(gè)體可以是考慮到其遺傳背景而具有增加的發(fā)展DMD或BMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。優(yōu)選的個(gè)體是人。若需要，可以通過(guò)添加藥物可接受的載體將表達(dá)本發(fā)明反義寡核苷酸的分子或載體并入藥理活性混合物中。因此，本發(fā)明還提供了藥物組合物，該藥物組合物包含包含本發(fā)明的反義寡核苷酸的分子，或者表達(dá)本發(fā)明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體。在另一方面，提供了包含本文所定義的寡核苷酸的組合物。優(yōu)選地，所述組合物包含至少兩種不同的本文所定義的寡核苷酸。更優(yōu)選地，這兩種不同的寡核苷酸經(jīng)設(shè)計(jì)使一個(gè)或兩個(gè)或更多個(gè)外顯子跳躍。本發(fā)明包括多重跳躍，其中誘導(dǎo)外顯子44跳躍的本發(fā)明的寡核苷酸與誘導(dǎo)另一外顯子跳躍的另一寡核苷酸聯(lián)合使用。在該語(yǔ)境中，另一外顯子可以為外顯子43、45或52。多外顯子跳躍已經(jīng)公開于EP1619249中。DMD基因?yàn)榫哂性S多不同外顯子的大基因?？紤]到該基因位于X染色體上，受到影響的，主要是男孩，盡管女孩也可以受該疾病的影響，因?yàn)樗鼈兛梢詮母改附邮茉摶虻膲目截惢蛘哂捎谒麄兊募〖?xì)胞中特定偏向的X染色體失活而遭受功能性等位基因的特定偏向失活。蛋白由至少2.4Mb的多個(gè)外顯子(79)編碼。缺陷可以發(fā)生在DMD基因的任何部分。特定外顯子或特定的多個(gè)外顯子的跳躍可以常見地導(dǎo)致重建的mRNA，其編碼比正常肌養(yǎng)蛋白短但是至少具有部分功能的肌養(yǎng)蛋白。開發(fā)基于外顯子跳躍技術(shù)的藥物的實(shí)踐問(wèn)題是，可能導(dǎo)致細(xì)胞中功能性肌養(yǎng)蛋白缺乏的眾多突變。盡管可以通過(guò)單一外顯子的跳躍來(lái)修正多個(gè)不同的突變這一事實(shí)，但是這樣的眾多突變要求對(duì)不同突變需要跳躍不同的外顯子產(chǎn)生一系列不同的藥物。能夠誘導(dǎo)兩個(gè)或更多個(gè)外顯子跳躍的寡核苷酸或包含如后文所定義的至少兩種不同寡核苷酸的組合物的優(yōu)勢(shì)在于，可以用單一的藥物使多于一個(gè)外顯子跳躍。這種屬性不僅是實(shí)用的，而且對(duì)于治療許多不同DMD或特定的嚴(yán)重BMD突變而僅需要產(chǎn)生有限數(shù)目的藥物是非常有用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另一選擇是選擇特定功能性重建的肌養(yǎng)蛋白，并制備能夠產(chǎn)生這些優(yōu)選的肌養(yǎng)蛋白的化合物。這樣的優(yōu)選的最終結(jié)果還稱為輕微表型肌養(yǎng)蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物優(yōu)選為藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物可接受的載體、佐劑、稀釋劑和/或賦形劑。還提供了這樣的藥物組合物，其可以包含任何藥物可接受的載體、填充劑、防腐劑、佐劑、增溶劑、稀釋劑和/或賦形劑。這樣的藥物可接受的載體、填充劑、防腐劑、佐劑、增溶劑、稀釋劑和/或賦形劑可以例如在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEdition(制藥科學(xué)和實(shí)踐，第20版).Baltimore,MD=LippincottWilliams&Wilkins，2000中發(fā)現(xiàn)。所述組合物的每一特征都在前文中進(jìn)行了定義。如果使用幾種寡核苷酸，則本文中已經(jīng)定義的濃度或劑量可以指所用的全部寡核苷酸的總濃度或劑量或者所用或所添加的每種寡核苷酸的濃度或劑量。因此，在一實(shí)施方案中，提供了組合物，其中所用的每種寡核苷酸的量或寡核苷酸的總量按0.5mg/kg至10mg/kg的量劑量給藥。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的反義寡核苷酸或表達(dá)本發(fā)明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體在調(diào)節(jié)DMDmRNA剪接中的用途。剪接優(yōu)選地于體外在人生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)。更優(yōu)選的是，剪接于體內(nèi)在人生肌細(xì)胞或肌細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)節(jié)。包含本發(fā)明的一種或多種核苷酸類似物或等同物的優(yōu)選反義寡核苷酸在全身送遞時(shí)調(diào)節(jié)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的一種或多種肌細(xì)胞中的剪接。在這一方面，包含特定核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的全身送遞可能導(dǎo)致靶向肌細(xì)胞的亞群，而包含不同核苷酸類似物或等同的反義寡核苷酸可能導(dǎo)致靶向肌細(xì)胞的不同亞群。因此，在一實(shí)施方案中，優(yōu)選地使用包含不同核苷酸類似物或等同物的反義寡核苷酸的組合，用于調(diào)節(jié)DMDmRNA的外顯子44跳躍。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的反義寡核苷酸或表達(dá)本發(fā)明的反義寡核苷酸的基于病毒的載體在制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。因此，在另一方面，提供了本文所定義的寡核苷酸或組合物在制備用于預(yù)防或治療個(gè)體的杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良或貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良的藥物中的用途。所述用途的每種特征在前文進(jìn)行了定義。本發(fā)明的用途或方法中的治療為至少1周，至少1個(gè)月，至少幾個(gè)月，至少1年，至少2、3、4、5、6年或更長(zhǎng)。用于本發(fā)明的本文所定義的每種分子或寡核苷酸或其等同物可以適合于直接體內(nèi)給予受DMD或BMD影響或面臨發(fā)展DMD或BMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以直接體內(nèi)、離體或體外給藥。本發(fā)明的寡核苷酸、組合物、化合物或輔助化合物的給藥頻率可以取決于幾種參數(shù)，如患者的年齡、患者的突變、分子的數(shù)量(即，劑量)、所述分子的制劑。頻率可以為兩周或4周或5周或者更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)至少1次。本發(fā)明的寡核苷酸的劑量范圍優(yōu)選地基于臨床試驗(yàn)中的劑量漸增而設(shè)計(jì)(體內(nèi)使用)，其中存在嚴(yán)格的方案要求。本文所定義的分子或寡核苷酸可用的劑量為0.lmg/kg至20mg/kg，優(yōu)選為0.5mg/kg至10mg/kg。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用的本文所定義的寡核苷酸的濃度范圍為0.InM至ΙμΜ。優(yōu)選地，該范圍用于諸如肌細(xì)胞或肌肉組織的細(xì)胞模型的體外用途。更優(yōu)選地，所用濃度的范圍為0.3ηΜ至400ηΜ，甚至更優(yōu)選為InM至200ηΜ。如果使用幾種寡核苷酸，則該濃度或劑量可以指寡核苷酸的總濃度或劑量或者所添加的每種寡核苷酸的濃度或劑量。上文給出的寡核苷酸的濃度或劑量范圍為體外或離體使用的優(yōu)選濃度或劑量。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，取決于所用的寡核苷酸、要治療的靶細(xì)胞、基因靶標(biāo)及其表達(dá)水平、所用的培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)染和孵育條件，所用的寡核苷酸的濃度或劑量還可以變化并且需要進(jìn)一步優(yōu)化。本發(fā)明所用的本文所定義的寡核苷酸可以適合于體內(nèi)給予受DMD或BMD影響或面臨發(fā)展DMD或BMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以體內(nèi)、離體或體外給藥。所述寡核苷酸可以直接或間接給予受DMD或BMD影響或面臨發(fā)展DMD或BMD風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的細(xì)胞、組織和/或器官，并且可以直接或間接體內(nèi)、離體或體外給藥。由于杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良和貝克肌營(yíng)養(yǎng)在不良肌細(xì)胞中具有明顯表型，所以優(yōu)選地所述細(xì)胞是肌細(xì)胞，還優(yōu)選地所述組織是肌肉組織和/或還優(yōu)選地所述器官包含肌肉組織或由肌肉組織組成。優(yōu)選的器官為心臟。優(yōu)選地，所述細(xì)胞包含編碼突變體肌養(yǎng)蛋白的基因。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為患有DMD或BMD個(gè)體的細(xì)胞。除非另外指明，可以將本文所述的每個(gè)實(shí)施方案與本文所述的另一實(shí)施方案組合。在本文及其權(quán)利要求中，動(dòng)詞“包含”及其變形以其非限制性意義使用，以表示包括該詞語(yǔ)之后的項(xiàng)，但是并不排除未特別指出的項(xiàng)。此外，動(dòng)詞“由…組成”可以由“基本上由…組成”代替以表示本文所定義的化合物或輔助化合物除了特別指定的組分外可以包含其他組分，所述其他組分并不改變本發(fā)明的獨(dú)特特征。此外，通過(guò)不定冠詞“a(—個(gè))”或“an(—個(gè))”對(duì)要素的引用不排除存在多于一項(xiàng)要素存在的可能性，除非上下文明確地要求有且僅有一項(xiàng)要素。因此，不定冠詞“a(—個(gè))”或“an(—個(gè))”通常表示“至少一個(gè)”。當(dāng)詞語(yǔ)“大約”或“約”當(dāng)與數(shù)值聯(lián)合使用時(shí)(大約10，約10)優(yōu)選地表示值可以為大于該值的10%或小于該值的的給定值。本文所用的表述“體內(nèi)”可以表示，在可以分離自細(xì)胞所來(lái)源的有機(jī)體的細(xì)胞體系中。優(yōu)選的細(xì)胞為肌細(xì)胞。體內(nèi)還可以表示在組織中或在多細(xì)胞有機(jī)體中，該多細(xì)胞有機(jī)體優(yōu)選為本文所定義的患者。在本發(fā)明中，體內(nèi)與通常與無(wú)細(xì)胞體系相關(guān)的體外相反。本說(shuō)明書所引用的全部專利和文獻(xiàn)通過(guò)引用特此整體并入本文。除非另外指明，可以將本文所指的每個(gè)實(shí)施方案組合在一起。在下文的實(shí)施例中將進(jìn)一步解釋本發(fā)明。這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍，而是僅僅用于闡明本發(fā)明。附例圖1.在來(lái)自健康對(duì)照或具有外顯子45缺失的DMD患者的轉(zhuǎn)染的肌細(xì)胞中，經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)來(lái)自DMD基因的外顯子44跳躍的AON的評(píng)價(jià)。(A)在來(lái)自具有外顯子45缺失的患者分化的肌細(xì)胞(肌管)中，所有測(cè)試(轉(zhuǎn)染)的AON以150nM的濃度誘導(dǎo)了外顯子44跳躍，并且PS188(SEQIDNO:5)、PS190(以前公開%h44A0N2；Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)、PS191(SEQIDNO47)、PS193(SEQIDNO48)、PS194(SEQIDNO46)和PS196(SEQIDNO51)證明了最高的效率(84%-94%)0(B)還通過(guò)以150nM和400nM轉(zhuǎn)染至健康人對(duì)照細(xì)胞來(lái)測(cè)試大部分Α0Ν。結(jié)果總結(jié)于該柱狀圖中。PS188(SEQIDNO:5)、PS190、PS191(SEQIDNO:47)、PS193(SEQIDNO:48)、PS194(SEQIDNO46)和PS196(SEQIDNO51)被證實(shí)在誘導(dǎo)外顯子44跳躍中最有效。注意，患者細(xì)胞中外顯子44跳躍水平通常高于對(duì)照細(xì)胞，因?yàn)橐韵率聦?shí)與健康細(xì)胞相比，在患者細(xì)胞中，外顯子44跳躍是讀框恢復(fù)的并且更具功能性且穩(wěn)定。在所有實(shí)驗(yàn)中，在未轉(zhuǎn)染的肌細(xì)胞中沒有觀察到外顯子44跳躍(數(shù)據(jù)未顯示)。(C)在對(duì)照肌細(xì)胞中，以150nM和400nM的轉(zhuǎn)染濃度類似地測(cè)試了PS197(SEQIDNO52)以及3個(gè)另外的AON即PS199(SEQIDNO44)、PS200(SEQIDNO49)和PS201(SEQIDNO50)的實(shí)施例。外顯子44跳躍百分比為1%(PS199)M44%(PS200)。M:DNA大小標(biāo)記(IOObp梯)。圖2.通過(guò)轉(zhuǎn)染人對(duì)照肌細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞(PB-MNC)進(jìn)行的PS188(SEQIDNO5)其他評(píng)價(jià)。(A)劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)。在人對(duì)照肌細(xì)胞中，在從50nM增加至400nM的轉(zhuǎn)染劑量，PS188表現(xiàn)出水平漸增的外顯子44跳躍(一式3份)，在400ηΜ時(shí)高達(dá)45%。(B)用200nMPS188轉(zhuǎn)染健康個(gè)體的PB-MNC。盡管肌養(yǎng)蛋白在該類型的細(xì)胞中僅以低水平表達(dá)這一事實(shí)，但是仍然明顯地觀察到了外顯子44跳躍。這些結(jié)果證實(shí)了PS188誘導(dǎo)來(lái)自DMD基因的外顯子44跳躍的效率。M=DNA大小標(biāo)記。圖3.通過(guò)向表達(dá)全長(zhǎng)人DMD基因的轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠和廣泛的毒性研究中所包括的獼猴(cynomolgusmonkey)給藥而進(jìn)行的PS188(SEQIDNO5)的其他評(píng)價(jià)。(A)向hDMD小鼠的腓腸肌(Gl和G2)肌肉內(nèi)注射2x40gPS188后，觀察到外顯子44跳躍，盡管是低水平的。這證實(shí)PS188在肌肉組織中體內(nèi)誘導(dǎo)人外顯子44跳躍的能力。鑒于這樣的事實(shí)，即與營(yíng)養(yǎng)不良肌纖維相比，該小鼠模型已經(jīng)具有通常表現(xiàn)出較低水平的AON吸收的健康肌纖維，所以低水平是預(yù)期的。NT在未處理的hDMD肌肉中，未觀察到外顯子44跳躍。M:DNA大小標(biāo)記。(B)在PS188的毒性試驗(yàn)所包括的猴中，以6mg/kgPS188的劑量水平進(jìn)行每4天1小時(shí)、持續(xù)29天的靜脈內(nèi)輸注后，在外周血單核細(xì)胞(PB-MNC)中觀察到外顯子44跳躍。在未處理的猴中(NT)，未觀察到外顯子44跳躍。M=DNA大小標(biāo)記。實(shí)施例實(shí)施例1材料與方法AON設(shè)計(jì)(部分地)基于靶外顯子RNA的重疊開放二級(jí)結(jié)構(gòu)，這是通過(guò)m-倍程序(m-foldprogram,Mathewsetal.，JMolBiol1999；288(5):911_40)預(yù)測(cè)的；(部分)地基于重疊推定SR-蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這是通過(guò)ESE-發(fā)現(xiàn)軟件(ESE-Findersoftware,rulai.cshl.edu/tools/ESE/)(Cartegnietal.,NucleicAcidsRes2003；31(13):3568_71)預(yù)測(cè)的；以及基于避免3個(gè)或更多個(gè)核苷酸或CpG對(duì)的G段(G-stretch)。Α0Ν(參見表1)由Eurogentec(Belgium)禾口ProsensaTherapeuticsBV(Leiden,Netherlands)合成，并且含有2’-0-甲基RNA和全長(zhǎng)硫代磷酸酯主鏈。組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和RT-PCR分析如以前所述(Aartsma-Rusetal.HumMolGenet2003;12(8)907-14；Havengaetal.JVirol2002；76(9):4612_20)，處理來(lái)自健康個(gè)體(“人對(duì)照”)或具有外顯子45缺失的DMD患者的肌管培養(yǎng)物。為了篩查Α0Ν，用150nM和/或400nM的每種AON轉(zhuǎn)染肌管培養(yǎng)物。使用轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI，ExGen500MBIFermentas)或衍生物(UNIFectylin，ProsensaTherapeuticsBV，Netherlands)，并且每克AON2μ1ExGen500或UNIFectylin0將具有熒光標(biāo)記的對(duì)照AON用于證實(shí)最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效率(通常獲得超過(guò)90%的熒光核)。如所述(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，轉(zhuǎn)染后24至48小時(shí)分離RNA。利用位于外顯子44側(cè)翼的外顯子中的引物，通過(guò)巢式RT-PCR分析來(lái)測(cè)定外顯子跳躍效率(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)。利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN)，從瓊脂糖凝膠分離PCR片段，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試齊[J盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測(cè)序儀(ΡΕAppliedBiosystems)，進(jìn)行序列驗(yàn)證(由Leiden基因組技術(shù)中心(LGTC))。對(duì)于定量，利用DNAIOOOLabChips試劑盒在Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,USA)上分析PCR產(chǎn)物。結(jié)果設(shè)計(jì)了一系列靶向外顯子44中的序列的Α0Ν，并通過(guò)轉(zhuǎn)染和隨后的分離的RNA的RT-PCR及序列分析在健康對(duì)照和患者來(lái)源的肌管培養(yǎng)物中進(jìn)行測(cè)試。在源自具有外顯子45缺失的DMD患者的肌管中，對(duì)于每個(gè)A0N(PS187至PS201)，以150nM誘導(dǎo)特異性外顯子44跳躍，并且PS188(SEQIDNO5)、PS190(以前公開為h44A0N2，Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)、PS191(SEQIDNO:47)、PS193(SEQIDNO:48)、PS194(SEQIDNO:46)和PS196(SEQIDNO:51)證明了最高水平的跳躍(在150nM時(shí)，84%至94%)(圖1A)。在來(lái)自健康個(gè)體的對(duì)照細(xì)胞中進(jìn)行類似的轉(zhuǎn)染。評(píng)價(jià)了外顯子44跳躍的百分比，并與患者細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行比較(圖1B)。對(duì)照百分比通常低于患者細(xì)胞的百分比，這是外顯子44跳躍后對(duì)照轉(zhuǎn)錄本無(wú)義介導(dǎo)的RNA衰變(decay)所固有的(參見，例如圖1A(患者細(xì)胞)比圖IC(對(duì)照細(xì)胞)的PS197結(jié)果)。在對(duì)照肌細(xì)胞中，以150nM和400nM的濃度，測(cè)試了三個(gè)其他的A0N(PS199(SEQIDNO44)、PS200(SEQIDNO49)和PS201(SEQIDNO50)。外顯子44跳躍百分比的范圍為1%(PS199)至44%(PS200)(圖1C)。基于所有的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，AONPS187、PS188、PS190、PS191、PS192、PS193、PS194、PS196和PS200被認(rèn)為是最有效的，并且AONPS189,PS197、PS198、PS199和PS201是效率最低的。在劑量應(yīng)答實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)應(yīng)用一式三份從50nM至400nM的漸增劑量，還在健康人對(duì)照肌細(xì)胞中測(cè)試了PS188(SEQIDNO5)。因此，觀察到水平漸增的外顯子44跳躍，在400nMPS188時(shí)高達(dá)45%(圖2A)。實(shí)施例2材料與方法將收集于EDTA管中的新鮮健康人對(duì)照血液樣品在HistoPaque梯度介質(zhì)(HistoPaquegradient)頂部分層。一旦離心，則收集含有單核細(xì)胞的第二層(從頂部到底部，4層)，將其洗滌并再次離心。將細(xì)胞團(tuán)重懸浮于增殖培養(yǎng)基中，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。在6孔板中，每孔接種SxlO6個(gè)細(xì)胞，并在37°C、5%CO2的條件下孵育3hr(小時(shí))。然后將細(xì)胞用0或200nMPS188(SEQIDNO5；2'OMePSRNA；ProsensaTherapeuticsBV)轉(zhuǎn)染，每盤兩份。轉(zhuǎn)染后72hr分離RNA，并利用位于外顯子44側(cè)翼的DMD-基因特異性引物(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，通過(guò)RT-PCR分析進(jìn)行分析。序列分析(由Leiden基因組技術(shù)中心(LGTC))，禾Ij用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測(cè)序儀(ΡΕAppliedBiosystems)針對(duì)分離的PCR產(chǎn)物(利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN))進(jìn)行，以確認(rèn)RNA水平的特異性外顯子44跳躍。結(jié)果在來(lái)自健康對(duì)照個(gè)體的轉(zhuǎn)染的外周血單核細(xì)胞(PB-MNC)中，當(dāng)以200nM應(yīng)用時(shí)，PS188誘導(dǎo)新的較短的轉(zhuǎn)錄本片段產(chǎn)生(圖2B)。將該片段分離并測(cè)序，并且由于外顯子44的特異性跳躍而得以證實(shí)。在非轉(zhuǎn)染的PB-MNC中，未觀察到外顯子44跳躍。這些結(jié)果表明，PS188是有效的體外誘導(dǎo)人外顯子44跳躍的化合物。實(shí)施例3材料與方法反義寡核糖核苷酸(AON)將正常和mdx小鼠(Sicinskietal.(1989)·Science244:1578_1580)注射小鼠特異性m46A0N4(vanDeutekometal.(2001)HumMolGenet101547-1554)，而將hDMD小鼠注射人特異性PS196(SEQIDNO51)或PS188(SEQIDNO5)。兩種AON都含有全長(zhǎng)硫代磷酸酯主鏈和2，-0-甲基修飾的核糖分子(PS196=Eurogentec,Belgium；PS188=ProsensaTherapeuticsBV)。正常、mdx和轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠正常小鼠(C57Bl/6NCrL)和mdx小鼠(C57Bl/10ScSn_mdx/J)獲得自CharlesRiverLaboratories(TheNetherlands)。轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠在我們自己的LUMC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行改造。簡(jiǎn)言之，通過(guò)與帶有含有全長(zhǎng)(2.4Mb)人DMD基因的2.7Mb的YAC的酵母原生質(zhì)球融合，對(duì)胚胎干細(xì)胞(ES)進(jìn)行遺傳修飾。該YAC以前通過(guò)酵母中較小的重疊YAC的同源重組來(lái)構(gòu)建(DenDunnenetal.(1992).HumMolGenet119-28)如通過(guò)PFGE定位、全基因的外顯子-PCR分析和中期FISH分析所評(píng)價(jià)的，ES細(xì)胞表現(xiàn)出整合了一個(gè)拷貝的全尺寸YAC，將該ES細(xì)胞用于產(chǎn)生純合hDMD小鼠(，tHoenetal.，J.Biol.Chem.2008)。轉(zhuǎn)基因hDMD小鼠看起來(lái)身體上未受遺傳修飾影響?？梢栽诩∪庵校赗NA和蛋白水平上，證實(shí)人DMD基因的合適表達(dá)。這些小鼠的改造獲得DutchMinistryofAgriculture(LNV)；projectnr.VVA/BD01.284(E21)的許可。AON的給藥小鼠的肌肉內(nèi)AON注射實(shí)驗(yàn)由Leiden大學(xué)醫(yī)學(xué)系(MedicalFacultyofLeidenUniversity)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(UDEC)許可(項(xiàng)目號(hào)00095，03027)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，注射Α0Ν，該AON為純?chǔ)?Ν，或與陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI；ExGen500(20χ),MBIFermentas)以ImlPEI每nmolAON的比率，在5%w/v葡萄糖溶液中復(fù)合，或者與15nmolSAINT-18TM(SynvoluxTherapeuticsB.V.,TheNetherlands)復(fù)合。SAINT-18TM送遞系統(tǒng)基于陽(yáng)離子吡啶鐺頭基團(tuán)，并且允許反義寡核苷酸的無(wú)毒送遞。通過(guò)腹膜內(nèi)注身寸11(ν/ν)的Hypnorm/Dormicum溶液(JanssenPharmaceutica,Belgium/Roche,TheNetherlands)，將小鼠麻醉。以40μ1的最終注射體積，利用帶有22號(hào)針的Hamilton注射器，將純A0N(PS188)給予至小鼠的兩塊腓腸肌中。小鼠以24h的間隔接受兩次40μ1注射。在注射后不同的時(shí)間點(diǎn)將它們處死，對(duì)于注射PS188的hDMD小鼠，為最后注射后10天。將肌肉分離并冷凍于液氮冷卻的2-甲基丁烷中。RT-PCR分析將肌肉樣品在RNA-Bee溶液(CamproScientific,TheNetherlands)中勻質(zhì)化。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，分離并純化總RNA。對(duì)于使用逆轉(zhuǎn)錄酶C.therm聚合酶(thermpolymerase)或Transcriptor(RocheDiagnostics,TheNetherlands)的cDNA合成，將300ng的RNA用于20μ1的反應(yīng)中，并且在60°C保持30min，該反應(yīng)使用小鼠或人特異性引物逆轉(zhuǎn)錄。第一PCR使用外部引物對(duì)(對(duì)于注射PS188的小鼠，側(cè)翼外顯子43-45)，反應(yīng)條件為94°C(40sec(秒))、60°C(40sec)和72°C(60sec)，20個(gè)循環(huán)。然后，利用在直接位于靶外顯子(對(duì)于注射PS188的小鼠，外顯子44)側(cè)翼的外顯子中的巢式引物組合，再次擴(kuò)增1μ1該反應(yīng)物(110稀釋)，反應(yīng)條件為940C(40sec),60°C(40sec)和72°C(60sec)，30個(gè)循環(huán)。在2%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。利用DNAIOOOLabChip⑧試劑盒和Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies,TheNetherlands)，通過(guò)定量PCR產(chǎn)物來(lái)測(cè)定跳躍效率。引物對(duì)和序列以前已有描述(Aartsma-Rusetal.(2002)NeuromusculDisord12Suppl:S71.8,17；vanDeutekometal.(2001)HumMolGenet101547-1554)序列分析利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN)，從2%瓊脂糖凝膠分離RT-PCR產(chǎn)物。由Leiden基因組技術(shù)中心(LGTC)，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試劑盒(ΡΕAppliedBiosystems)，直接進(jìn)行DNA測(cè)序，并在ABI3700測(cè)序儀(PEAppliedBiosystems)上進(jìn)行分析。MALDI-T0F質(zhì)譜按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書，利用核酸純化試劑盒(SequazymeTMPinpointSNP試劑盒的核酸純化試劑盒，AppliedBiosystems)，用96孔離心板(spinplate)(AppliedBiosystems)，純化RNA-Bee肌肉勻漿。將Iml等份的基質(zhì)溶液(50%乙腈中的50mg/ml3-羥基吡啶甲酸和25mM檸檬酸二銨)應(yīng)用于AnchorChipTM樣品靶標(biāo)(BrukerDaltonics,Germany)，并空氣干燥。以0.5ml等份將樣品點(diǎn)至基質(zhì)晶體上，并空氣干燥。在ReflexIIIMALDI-T0F質(zhì)譜儀(BrukerDaltonics,Germany)進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。以反射模式獲得光譜并積累約900激光發(fā)射。分析標(biāo)記和未標(biāo)記的m46A0N4樣品，用于比較。結(jié)果野生型肌肉中的外顯子跳躍我們首先建立小鼠肌肉中的體內(nèi)靶向的外顯子跳躍，并優(yōu)化不同的給藥參數(shù)。初始實(shí)驗(yàn)在野生型小鼠中進(jìn)行，而無(wú)義介導(dǎo)的RNA衰變會(huì)導(dǎo)致低估外顯子跳躍效率，AON的效果僅在mRNA水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。我們注射了0.9nmol至5.4nmol的劑量漸增的每種反義寡核苷酸?？偧∪釸NA的RT-PCR分析證明，在所有注射的樣品中出現(xiàn)了新的較短的轉(zhuǎn)錄本片段。序列分析證實(shí)了該產(chǎn)物中精確的外顯子44跳躍(數(shù)據(jù)未顯示)。分析了對(duì)側(cè)注射的肌肉的橫切片的熒光標(biāo)記的對(duì)照AON的分散和持續(xù)性。注射純AON后，我們?cè)谀承├w維內(nèi)觀察到高達(dá)一周的熒光信號(hào)。在較晚的時(shí)間點(diǎn)，只觀察到弱信號(hào)，并且主要在胞間隙中。甚至在3周后，PEI的使用明顯地增強(qiáng)了熒光信號(hào)的分散和持續(xù)性。然而，其還誘導(dǎo)吸收大部分熒光的纖維降解和單核細(xì)胞滲入。利用SAINT，在胞間隙(interstitialspace)中檢測(cè)到高達(dá)1周的大部分信號(hào)，這表明該試劑不有效地將AON送遞入肌纖維中。由于熒光信號(hào)可以不對(duì)應(yīng)于完整且功能性AON的存在，所以我們進(jìn)行了注射的肌肉樣品的MALDI-T0F質(zhì)譜。分析表明，在24小時(shí)內(nèi)從AON除去了熒光標(biāo)記。當(dāng)使用PEI時(shí)，標(biāo)記的AON僅在2周內(nèi)是可檢測(cè)的。間質(zhì)AON可能比細(xì)胞內(nèi)AON對(duì)降解更敏感。在全部3個(gè)系列中，在注射后3至4周觀察到未標(biāo)記的Α0Ν，但是當(dāng)存在于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，即在PEI系列中，該AON可以只是功能性的。hDMD肌肉中人特異性外顯子跳躍由于外顯子跳躍策略是序列特異性的治療方法，所以理想的臨床前驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)為小鼠實(shí)驗(yàn)背景中的靶人DMD基因。我們改造了這樣的轉(zhuǎn)基因“人化”DMD(hDMD)小鼠，其帶有整合和功能性的全長(zhǎng)人DMD基因的拷貝。hDMD小鼠肌肉中人肌養(yǎng)蛋白的表達(dá)通過(guò)橫切片的免疫組織化學(xué)分析，利用人特異性抗體(MANDYS106)來(lái)特異性地檢測(cè)。在肌肉RNA水平，利用小鼠或人特異性引物的RT-PCR證明了人DMD基因的正確轉(zhuǎn)錄。而且，一旦與mdx小鼠雜交，則hDMD構(gòu)建體表現(xiàn)為補(bǔ)償應(yīng)營(yíng)養(yǎng)不良缺陷，這如通過(guò)組織學(xué)和cDNA微陣列分析所評(píng)價(jià)的(，tHoenetal.,J.Biol.Chem.2008)0hDMD小鼠具有健康的肌纖維，該肌纖維通常表現(xiàn)出有限的裸AON的吸收。將與PEI復(fù)合的人特異性AONPS196(SEQIDNO51)，或無(wú)PEI的PS188(SEQIDNO5)注射到hDMD小鼠的腓腸肌中(24hr內(nèi)注射2x40μg)。在注射后7至10天，我們清楚地觀察到來(lái)自人DMD轉(zhuǎn)錄本的靶向的外顯子44的跳躍(圖3A)。盡管人特異性AON與相應(yīng)的小鼠序列是高度同源的，各自的20-mer中只有2或3個(gè)錯(cuò)配，但是小鼠內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的所受的影響并沒有達(dá)到任何可檢測(cè)的水平。序列分析證實(shí)PS188誘導(dǎo)了外顯子44跳躍。在未處理的hDMD肌肉中，沒有觀察到外顯子44跳躍。這些結(jié)果表明，PS188是誘導(dǎo)肌肉組織中人外顯子跳躍的有效化合物。實(shí)施例4材料與方法作為PS188的廣泛毒性項(xiàng)目的一部分，每4天通過(guò)1小時(shí)靜脈內(nèi)輸注(5mL/kg/h)處理非禁食的獼猴，持續(xù)29天，劑量水平為6mg/kgPS188(SEQIDNO5;2，OMePSRNA；AgilentLifeSciences，USA)。在每個(gè)處理天(第1、5、9、13、17、21、25和29測(cè)試天)，且在開始給藥前不久(盡可能的在給藥前，最多在給藥開始前1小時(shí)內(nèi))，新鮮地制備PS188制劑。制劑通過(guò)將PS188溶于磷酸鹽緩沖液來(lái)制備；如藥品的分析證書所提供的，考慮純度和水含量。按照每只動(dòng)物目前的體重，調(diào)整PS188的量。最后給藥(第33天)后96小時(shí)，將動(dòng)物處死。將全血樣品收集于EDTA管中，并(室溫下過(guò)夜運(yùn)輸后)在HiStoPaque梯度介質(zhì)的頂部分層。一旦離心，收集含有單核細(xì)胞的第二層(從頂部到底部，4層)，將其洗滌并再次離心。從所得的細(xì)胞團(tuán)分離RNA，并利用位于外顯子44側(cè)翼的DMD基因特異性引物(Aartsma-Rusetal.NeuromusculDisord2002；12Suppl:S71)，通過(guò)RT-PCR分析進(jìn)行分析。序列分析(由Leiden基因組技術(shù)中心(LGTC))，利用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction試齊[J盒(ΡΕAppliedBiosystems)禾口ABI3700測(cè)序儀(ΡΕAppliedBiosystems)，針對(duì)分離的PCR產(chǎn)物(利用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN))進(jìn)行，以確認(rèn)RNA水平上的特異性外顯子44跳躍。結(jié)果在每4天以6mg/kgPS188的劑量水平通過(guò)1小時(shí)靜脈內(nèi)輸注處理29天的猴中，于外周血單核細(xì)胞(圖3B)中，觀察到外顯子44跳躍，盡管事實(shí)是，這些細(xì)胞僅表達(dá)低水平的肌養(yǎng)蛋白。實(shí)際上，PS188所靶向的人和猴DMD序列是100%相同的。在未處理的猴中沒有觀察到外顯子44跳躍。這些結(jié)果表明，PS188是體內(nèi)誘導(dǎo)外顯子44跳躍的有效化合物。表1反義寡核苷酸序列表IA權(quán)利要求1.核酸分子，其與具有核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)的核苷酸結(jié)合和/或互補(bǔ)。2.如權(quán)利要求1所述的分子，其中所述分子包含反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸包含8至60個(gè)核苷酸或由8至60個(gè)核苷酸組成。3.如權(quán)利要求2所述的分子，其中所述反義寡核苷酸包含以下序列或由以下序列組成SEQIDNO5至SEQIDNO:42、SEQIDNO49或SEQIDNO:54。4.如權(quán)利要求3所述的分子，其中所述分子包含核苷酸序列SEQIDNO:5或由核苷酸序列SEQIDNO5組成。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分子，包含2’-0烷基硫代磷酸酯反義寡核苷酸。6.如權(quán)利要求5所述的分子，其中所述分子包含2’-0甲基硫代磷酸酯核糖。7.基于病毒的載體，包含PolIII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，用于表達(dá)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的分子，優(yōu)選地，所述分子與所述核苷酸序列5’-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)結(jié)合和/或互補(bǔ)。8.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的分子或權(quán)利要求7所述的載體和藥物可接受的載體。9.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的分子或權(quán)利要求7所述的載體在調(diào)節(jié)DMD前mRNA剪接中的用途。10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的分子或權(quán)利要求7所述的載體在制備用于治療DMD或BMD患者的藥物中的用途。11.用于誘導(dǎo)細(xì)胞中DMD基因的外顯子44跳躍的方法，所述方法包括為所述細(xì)胞提供權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的分子或權(quán)利要求7所述的載體。全文摘要本發(fā)明涉及與具有5′-GUGGCUAACAGAAGCU(SEQIDNO1)序列的核苷酸分子結(jié)合和/或互補(bǔ)的核酸分子，以及該分子在誘導(dǎo)DMD患者的DMD基因外顯子44跳躍的方法中的用途。文檔編號(hào)C12N15/113GK102171342SQ200980124158公開日2011年8月31日申請(qǐng)日期2009年5月14日優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日發(fā)明者勒德烏斯·約翰尼斯·普拉滕伯格,安妮姆耶克·阿斯馬-魯斯,朱迪思·克里斯蒂娜·塞奧多拉·萬(wàn)多伊特科姆,蓋瑞特-揚(yáng)·保德維金·萬(wàn)歐門,約瑟夫斯·約翰尼斯·德吉姆彼申請(qǐng)人:普羅森那技術(shù)公司,萊頓教學(xué)醫(yī)院