專利名稱：遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防/改善劑，其特征在于，該預(yù)防/改善劑為起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑，含有分子量1500以下的化合物。
背景技術(shù)：
肌營養(yǎng)不良是肌纖維的破壞/變性(肌壞死)與再生反復(fù)發(fā)生，從而使肌肉萎縮和肌肉無力隨之發(fā)展的遺傳性肌肉疾病的總稱，其中，進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良是眾所周知的。屬于進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良之一的杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy:DMD)在肌營養(yǎng)不良中最為普遍，其因X染色體上的肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變而發(fā)病(參照非專利文獻(xiàn)I)。由于幼年時(shí)期發(fā)病的進(jìn)行性肌肉萎縮，DMD患者通常會(huì)在20歲左右因心力衰竭或呼吸器官衰竭而死亡。肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)(以下也簡單表示為“肌營養(yǎng)不良蛋白”。)存在于肌細(xì)胞的細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，通過將由肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白引起的肌肉收縮所產(chǎn)生的機(jī)械性能量以良好的平衡傳遞至細(xì)胞膜、周圍的結(jié)締組織、腱等，并進(jìn)行調(diào)節(jié)，以不施加過度的沖擊，由此發(fā)揮保護(hù)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的作用。在DMD患者的情況下，由于其肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變，肌纖維中完全不存在或僅存在極少量肌營養(yǎng)不良蛋白，因此會(huì)因肌肉收縮而導(dǎo)致肌細(xì)胞的細(xì)胞膜破損，從而使比通常量更多的鈣離子流入肌纖維中。過量的鈣會(huì)使誘發(fā)鈣蛋白酶、蛋白酶等的破壞肌肉或誘發(fā)細(xì)胞凋亡 的酶活化，其結(jié)果導(dǎo)致成纖維細(xì)胞被活化而出現(xiàn)纖維化，組織形成瘢痕，肌細(xì)胞難以再生，肌肉萎縮逐漸發(fā)展。另一方面,屬于進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良之一的貝克氏型肌營養(yǎng)不良(Beckermusculardystrophy:BMD)也是因肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變而發(fā)病的，其發(fā)病時(shí)間通常為成年，癥狀的發(fā)展也比DMD緩慢。雖然DMD和BMD均因肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變而發(fā)病，但其癥狀的程度、發(fā)展速度不同。DMD和BMD的這個(gè)差別可通過讀碼框規(guī)則來說明。對(duì)于肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA而言,產(chǎn)生提前終止密碼子(premature termination codon:PTC)的突變(無義突變)通常會(huì)引起重度的DMD表現(xiàn)型(杜氏)，而維持了肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA原有讀碼框的突變(整碼突變，in-frame mutation)則會(huì)成為癥狀更輕的BMD表現(xiàn)型(貝克氏型)(參照非專利文獻(xiàn)2)。但是，令人意外的是，報(bào)告有:雖然若干輕癥BMD患者的肌營養(yǎng)不良蛋白基因上具有無義突變，但通過使包含該無義突變的外顯子跳躍，會(huì)產(chǎn)生新型的讀碼框內(nèi)的肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA(參照非專利文獻(xiàn):Γ6)。由于跳躍而缺失部分外顯子的該肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA編碼所得的肌營養(yǎng)不良蛋白(截短型肌營養(yǎng)不良蛋白)比正常的肌營養(yǎng)不良蛋白短，但在某種程度上殘存保持肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能，因此肌營養(yǎng)不良的癥狀比較輕，另夕卜，肌肉萎縮的發(fā)展速度也變慢。從根本上治療肌營養(yǎng)不良的方法尚未確立，以往，除了功能訓(xùn)練、用于預(yù)防關(guān)節(jié)攣縮的伸展之外，只不過針對(duì)心力衰竭/呼吸障礙進(jìn)行對(duì)癥治療。但是，近年來，本發(fā)明人等、其它研究人等開發(fā)了針對(duì)DMD的新治療方法，備受期待。該治療方法是通過使用肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA的反義寡核苷酸(AON)誘發(fā)外顯子跳躍，實(shí)現(xiàn)從DMD表現(xiàn)型向BMD表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)換，從而使癥狀減輕的方法(非專利文獻(xiàn)3)。為了在DMD患者的細(xì)胞中誘發(fā)外顯子跳躍，對(duì)于任意剪接部位或剪接促進(jìn)元件設(shè)計(jì)了幾種不同的AON。這些AON可以修復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA的讀碼框。例如，通過外顯子19的外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)的Α0Ν，可觀察到前述DMD患者細(xì)胞中產(chǎn)生外顯子19的跳躍、生成截短型肌營養(yǎng)不良蛋白(參照非專利文獻(xiàn)3飛)。另外，外顯子51的AON也多用于患者細(xì)胞，現(xiàn)在，這些AON還處于臨床研究階段(參照非專利文獻(xiàn)6 8)。然而，AON存在必須定期進(jìn)行肌肉注射或靜脈注射、對(duì)患者而言比較麻煩的問題、或大量制備需要高額費(fèi)用的問題。此外，對(duì)作為肌營養(yǎng)不良模型小鼠的mdx小鼠進(jìn)行AON處理時(shí)，骨骼肌中的肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)在某種程度上得以恢復(fù)，但心臟中的肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)難以恢復(fù)(非專利文獻(xiàn)9)。因此，臨床上非常期待用于調(diào)節(jié)外顯子跳躍的低分子。報(bào)告有作為低分子的非氨基糖苷類無義突變抑制基因化合物的PTC124(注冊商標(biāo))(3-[5-(2-氟代苯基)-1，2，4-噁二唑-3-基]苯甲酸)能夠治療具有無義突變的部分DMD患者(非專利文獻(xiàn)10、11)，現(xiàn)在，在美國等正在進(jìn)行2b期的臨床試驗(yàn)。PTC124是通過在核糖體翻譯時(shí)連讀(read-through)提前終止密碼子(PTC)的方式進(jìn)行誘發(fā)，從而在某種程度上恢復(fù)具有全長功能的肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)的治療藥，但對(duì)其它依賴基因無義突變的mRNA分解機(jī)理的影響尚未明確。然而，本發(fā)明人等確認(rèn)TG003(后述通式(I)中，R1和R2為甲基、R3為甲氧基的化合物)可作為Cdc-1ike激酶(Clk)特異性激酶抑制劑。TG003是在體外和體內(nèi)兩種情況下均對(duì)剪接產(chǎn)生影響的化合物(參照非專利文獻(xiàn)12和13)，本發(fā)明人等在相關(guān)專利申請(qǐng)(參照專利文獻(xiàn)I)中記載了:TG003具有介由SR蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)來調(diào)節(jié)替代剪接的作用、可利用所述作用來進(jìn)行癌癥等疾病的預(yù)防、治療。但是，迄今為止，TG003可促進(jìn)肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子的跳躍尚屬未知?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)_9] 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1:美國專利申請(qǐng)公開第20050171026號(hào)說明書非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:Cell (1988) 53，219-228.
非專利文獻(xiàn)2 =Genomics (1988) 2，90-95.
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發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防/改善劑，其特征在于，該預(yù)防/改善劑為起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑，含有分子量1500以下的化合物。本發(fā)明人等在針對(duì)400名以上的肌營養(yǎng)不良患者分析其肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變時(shí)，發(fā)現(xiàn)了外顯子31中具有根據(jù)背景技術(shù)中記載的讀碼框規(guī)則預(yù)測會(huì)成為重度DMD表現(xiàn)型的無義突變，但其癥狀卻是BMD型的患者。對(duì)所述患者的肌營養(yǎng)不良蛋白基因的mRNA進(jìn)行分析時(shí)，明確了:外顯子31的該無義突變會(huì)誘發(fā)外顯子31的跳躍，由此部分生成用于編碼功能性截短型肌營養(yǎng)不良蛋白的成熟mRNA。因此，本發(fā)明人等探求促進(jìn)外顯子跳躍的低分子化合物，發(fā)現(xiàn)了:作為Clk特異性抑制劑的TG003依賴于用量地促進(jìn)內(nèi)在性肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子31、外顯子27的跳躍，能夠增強(qiáng)患者的細(xì)胞中的功能性截短型肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及以下預(yù)防/改善劑:⑴一種預(yù)防/改善劑，其特征在于，該預(yù)防/改善劑為起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑，含有分子量1500以下的化合物；(2)上述(I)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，前述化合物為具有剪接調(diào)節(jié)作用的化合物；(3)上述(I)或
(2)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，前述化合物為具有誘發(fā)/促進(jìn)包含突變的外顯子的跳躍的效果的化合物；(4)上述(I)至(3)中任一項(xiàng)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，前述化合物為Cdc-1ike激酶抑制化合物；(5)上述(4)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，前述Cdc-1ike激酶抑制化合物為通式(I)所示的化合物，[化學(xué)式I]
權(quán)利要求
1.種預(yù)防/改善劑，其特征在于，該預(yù)防/改善劑為起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑，含有分子量1500以下的化合物。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述化合物為具有剪接調(diào)節(jié)作用的化合物。
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述化合物為具有誘發(fā)/促進(jìn)包含突變的外顯子的跳躍的效果的化合物。
4.據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述化合物為Cdc-1ike激酶抑制化合物。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述Cdc-1ike激酶抑制化合物為通式(I)所示的化合物， [化學(xué)式I]
6.據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述突變?yōu)闊o義突變。
7.據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述無義突變?yōu)橐种扑龌虻耐怙@子剪接增強(qiáng)子活性、和/或、使所述基因的外顯子剪接沉默子活性提升的無義突變。
8.據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述基因?yàn)榧I養(yǎng)不良蛋白基因，所述功能性截短型蛋白質(zhì)為功能性截短型肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)，所述遺傳性疾病為杜氏肌營養(yǎng)不良。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子為肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子31或外顯子27。
10.據(jù)權(quán)利要求9所述的預(yù)防/改善劑，其特征在于，所述肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子31的突變?yōu)樾蛄刑?hào)I的多聚核苷酸序列的核苷酸編號(hào)4303中的鳥嘌呤向胸腺嘧啶的無義突變，外顯子27的突變?yōu)樾蛄刑?hào)I的多聚核苷酸序列的核苷酸編號(hào)3613中的鳥嘌呤缺失的移碼突變。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑。本發(fā)明使用的預(yù)防/改善劑的特征在于，該預(yù)防/改善劑為起因于基因外顯子的突變、且可使包含該突變的外顯子跳躍而生成功能性截短型蛋白質(zhì)的遺傳性疾病的預(yù)防/改善劑，含有分子量1500以下的化合物。
文檔編號(hào)A61P21/04GK103096928SQ20118003032
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者萩原正敏, 松尾雅文, 片岡直行, 西田篤史 申請(qǐng)人:萩原正敏, 松尾雅文