專(zhuān)利名稱(chēng)：一種反義寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸及其等同物以及將它們用于誘導(dǎo)外顯子從mRNA中去除的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，反義技術(shù)已經(jīng)得到相當(dāng)大的發(fā)展。反義技術(shù)的一般領(lǐng)域可分為若干方面。這些方面之一是外顯子跳躍領(lǐng)域。在該領(lǐng)域中，向細(xì)胞中加入小分子從而特異地干擾信使RNA(mRNA)的剪接，并且更具體地，干擾成熟的mRNA中的特定外顯子的結(jié)合，或者更準(zhǔn)確地說(shuō)是成熟的mRNA中的特定外顯子結(jié)合不足。在外顯子跳躍領(lǐng)域中，可以區(qū)分為兩種一般方法。一種方法集中在干擾剪接(即，外顯子序列的物理連接)的酶促過(guò)程。另一種方法依賴(lài)于干擾剪接過(guò)程的"邏輯學(xué)"(logistics)，即干擾通過(guò)剪接機(jī)制對(duì)外顯子的識(shí)別。兩種方法均使用小分子來(lái)獲得所需的效果。該小分子都共有核酸分子能夠"雜交"至互補(bǔ)序列的特性。這樣的小分子的實(shí)例當(dāng)然是RNA和DNA、以及修飾的RNA和DNA (如LNA和嗎啉代化合物(morpholinos)、以及諸如PNA的核酸模擬物)。這些分子進(jìn)一步被稱(chēng)為通用術(shù)語(yǔ)"小分子"或更加經(jīng)常使用的術(shù)語(yǔ)"反義寡核苷酸(AON)"。小分子被認(rèn)為是通過(guò)雜交至pre-mRNA(前體mRNA)的特定位點(diǎn)而發(fā)揮作用的。雜交被認(rèn)為干擾剪接的酶促過(guò)程或者外顯子的識(shí)別。目前，外顯子跳躍集中在將一種或多種外顯子從成熟的mRNA中特異性去除。然而，使剪接機(jī)制改變方向從而將其他的外顯子包括在mRNA中也是可能的。例如，這種方法可應(yīng)用在進(jìn)行選擇性剪接的基因中。在這些情形下，可將小分子設(shè)計(jì)為使剪接機(jī)制改變方向，以便更加有效地形成具體的可選擇方案(specific alternative)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種反義寡核苷酸(AON)，包括表2中示出的序列或者由表2中示出的序列組成。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，包括14-40個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。根據(jù)本發(fā)明的AON,在一種實(shí)施方式中，包括14-25個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括SEQ ID N0:118表示的h44A0N4 或者由 SEQ ID NO :118 表示的 h44A0N4 組成。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON是修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物。
根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括選自2' _0_甲基核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、嗎啉代核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、和/或乙撐橋聯(lián)核酸(ENA)核苷酸中的一種或多種修飾。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括一個(gè)或多個(gè)2' _0_甲基寡核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、嗎啉代寡核苷酸、鎖核酸(LNA)寡核苷酸、和/或乙撐橋聯(lián)核酸(ENA)寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括嗎啉代磷酰二胺寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括一個(gè)或多個(gè)2' _0_甲基硫代膦酸酯核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，所述AON包括一個(gè)或多個(gè)2' _0_甲基硫代膦酸酯寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的A0N，在一種實(shí)施方式中，包括全長(zhǎng)硫代膦酸酯骨架，且其中，所有核苷酸包括2' -0-甲基修飾。根據(jù)本發(fā)明的AON,在一種實(shí)施方式中，少于10%的核苷酸是核苷酸類(lèi)似物。 本發(fā)明還提供了一種載體，表達(dá)上述AON或其前體。根據(jù)本發(fā)明的載體，在一種實(shí)施方式中，其為病毒載體。根據(jù)本發(fā)明的載體，在一種實(shí)施方式中，其為腺相關(guān)病毒載體。在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外顯子跳躍過(guò)程能夠變得更加有效。許多關(guān)于外顯子跳躍的早期研究是使用針對(duì)抗肌萎縮蛋白基因中外顯子跳躍的AON而進(jìn)行的。迄今為止，我們已經(jīng)識(shí)別了一系列的114個(gè)外顯子-居間AON (exon-internal AON),它們?cè)谂囵B(yǎng)的肌細(xì)胞中誘導(dǎo)35個(gè)外顯子的跳躍(14)。我們的數(shù)據(jù)表明，有效的外顯子-居間AON可能是通過(guò)對(duì)富含絲氨酸/精氨酸的(SR)蛋白家族成員結(jié)合至外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)位點(diǎn)的空間位阻而發(fā)揮作用的(15)。SR蛋白結(jié)合至外顯子序列移動(dòng)(exon sequence motive)并集結(jié)其他的剪接因子以介導(dǎo)剪接作用(19)。對(duì)于我們所研究的多數(shù)外顯子而言，單個(gè)ESE的AON-靶向(AON-targeting)足以誘導(dǎo)顯著水平的外顯子跳躍(14)。然而，對(duì)于一些外顯子而言，跳躍效率低至O。在本發(fā)明中，我們證實(shí)了通過(guò)用兩個(gè)或多個(gè)外顯子居間AON來(lái)靶向外顯子可以提高跳躍水平。為此目的，本發(fā)明提供了一種用于確定在產(chǎn)生含所述mRNA前體的外顯子的細(xì)胞中是否能提高從成熟的mRNA中去除外顯子的效率的方法，所述方法包括為所述細(xì)胞提供能夠雜交至所述外顯子的外顯子居間部分的第一反義寡核苷酸(AON)，并在為所述細(xì)胞提供能夠雜交至所述外顯子的另一外顯子居間部分的第二 AON后，確定所述效率是否得到提高。優(yōu)選通過(guò)與每一種單獨(dú)AON的效率比較水平來(lái)確定效率的提高。本文使用的術(shù)語(yǔ)"提高的效率"是指這樣的情形，其中⑴去除了靶標(biāo)外顯子的mRNA的量高于每一種單獨(dú)A0N，或(ii)在所述細(xì)胞中能夠檢測(cè)靶標(biāo)外顯子的去除的時(shí)間間隔增力口，或(iii) 二者的結(jié)合。與使用單個(gè)AON的外顯子跳躍方法相比，本發(fā)明的方法還提供了額外的穩(wěn)健性。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于在由細(xì)胞產(chǎn)生的pre-mRNA中誘導(dǎo)外顯 子跳躍的方法，該方法包括為所述細(xì)胞提供至少兩個(gè)能夠雜交至所述pre-mRNA上外顯子的不同外顯子居間部分的A0N，并培養(yǎng)所述細(xì)胞以允許所述pre-mRNA進(jìn)行剪接?！N序列由于其終止于成熟mRNA中的pre-mRNA的一部分，因而通常被稱(chēng)為外顯子。pre-mRNA包含至少一個(gè)內(nèi)含子。第一個(gè)外顯子包含帽子-位點(diǎn)而最后一個(gè)外顯子通常包含poly A信號(hào)。在本發(fā)明中，外顯子跳躍優(yōu)先定向于居間外顯子。居間外顯子是外顯子2至外顯子n-1中的任一個(gè)，其中n是所述pre-mRNA中的外顯子總數(shù)。當(dāng)外顯子跳躍時(shí)，其就不再包括在成熟mRNA中。這種特征可被一些人看作是，預(yù)示著該序列不再是外顯子而是內(nèi)含子(或內(nèi)含子的一部分)。因此，在本文中將外顯子限定為存在于pre-mRNA中的序列，在不為細(xì)胞提供誘導(dǎo)所述外顯子跳躍的AON時(shí)，其通過(guò)表達(dá)所述pre-mRNA的細(xì)胞的剪接機(jī)制而結(jié)合至成熟的mRNA中。因此，本發(fā)明中的外顯子跳躍方法也被認(rèn)為是用于將外顯子序列改變?yōu)閮?nèi)含子序列的方法，可替換地，本發(fā)明的方法是一種用于掩蔽(masking)外顯子序列的方法，因而當(dāng)外顯子序列被掩蔽時(shí)，所述外顯子序列不再被細(xì)胞的剪接機(jī)制識(shí)別為外顯子?？梢砸远喾N不同的方式來(lái)為細(xì)胞提供AON。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)將所述AON結(jié)合至基因遞呈載體(優(yōu)選脂質(zhì)體)中從而將所述AON提供至所述細(xì)胞中。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)表達(dá)所述AON或其前體的載體的方式將所述AON提供至所述細(xì)胞中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體包括病毒載體、優(yōu)選腺相關(guān)病毒載體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種基因遞呈載體，包括至少兩個(gè)對(duì)相同外顯子特異的外顯子居間AON。 使用至少兩個(gè)對(duì)相同外顯子特異的外顯子居間AON使得本發(fā)明的方法更加強(qiáng)有力。此外，其使得當(dāng)僅使用一個(gè)AON時(shí)不能有效跳躍的外顯子有效跳躍。不受理論的限制，可以認(rèn)為外顯子-居間AON通過(guò)阻遏結(jié)合至外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)位點(diǎn)的所謂的SR(Ser-Arg)蛋白的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)外顯子的跳躍。在本發(fā)明中，除此之外，發(fā)現(xiàn)外顯子可包含所謂的獨(dú)立ESE位點(diǎn)。這意味著當(dāng)一個(gè)ESE位點(diǎn)的活性由于例如所述外顯子上的AON的存在而被阻斷或阻遏時(shí)，在所述外顯子上的另一個(gè)獨(dú)立的ESE仍保持功能性。由于該ESE保持功能性，該外顯子仍然有效地結(jié)合至mRNA中。這種效應(yīng)可以通過(guò)靶向所述外顯子上的所有獨(dú)立的ESE位點(diǎn)而被抵消。在這種情況下，基本上所有的ESE位點(diǎn)被AON靶向，從而阻斷或阻遏SR蛋白結(jié)合至所述ESE位點(diǎn)，所述ESE位點(diǎn)隨后導(dǎo)致由此靶向的外顯子的有效跳躍?？梢砸远喾N方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)ESE位點(diǎn)的阻斷或阻遏。例如，所述AON的雜交可改變外顯子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而使SR蛋白不再結(jié)合至所述ESE位點(diǎn)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述AON與靶標(biāo)外顯子上預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)的至少部分重疊。這樣，SR蛋白與所述位點(diǎn)的結(jié)合由于所述AON與其雜交而受到位阻。優(yōu)選所述AON與至少一個(gè)預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)重疊。當(dāng)預(yù)測(cè)的ESE位點(diǎn)具有成簇的傾向時(shí)，所述AON優(yōu)選與所述外顯子上的至少兩個(gè)、優(yōu)選至少三個(gè)預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)重疊。因此，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一 AON在所述外顯子RNA上的雜交位點(diǎn)與所述外顯子RNA上的至少一個(gè)預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)重疊。優(yōu)選地，所述第二 AON在所述外顯子RNA上的雜交位點(diǎn)與所述外顯子RNA上的至少一個(gè)預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)重疊。將所述第一 AON和所述第二 AON靶向于所述外顯子RNA上的單個(gè)預(yù)測(cè)ESE位點(diǎn)并不是優(yōu)選的。盡管可能有這樣的情況，優(yōu)選的是所述第一 AON靶向于不同的ESE而不是所述第二 AON。這可以以多種方式實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選通過(guò)避免所述AON在所述外顯子RNA上雜交位點(diǎn)的顯著重疊來(lái)避免對(duì)相同ESE的靶向。因此，優(yōu)選所述第一 AON的雜交位點(diǎn)與所述第二AON的雜交位點(diǎn)表現(xiàn)為少于5個(gè)連續(xù)核苷酸重疊。更加優(yōu)選地，所述位點(diǎn)具有少于3個(gè)并且更加優(yōu)選少于I個(gè)重疊或沒(méi)有重疊?？梢匀菀椎赝ㄟ^(guò)AON的選擇來(lái)避免這樣的重疊。由于本發(fā)明的AON優(yōu)選在所述外顯子RNA上具有線(xiàn)性且連續(xù)的雜交位點(diǎn)，因而優(yōu)選通過(guò)避免所使用的AON中具有顯著的序列同一性而避免重疊。在這個(gè)方面，優(yōu)選所述第一 AON和所述第二 AON具有少于5個(gè)連續(xù)的核苷酸序列同一性。優(yōu)選在所述外顯子RNA上的所述第一和所述第二雜交位點(diǎn)具有少于3個(gè)連續(xù)的核苷酸重疊、更加優(yōu)選少于2個(gè)、并且優(yōu)選少于I個(gè)核苷酸重疊或沒(méi)有重疊。類(lèi)似地，所述第一 AON和所述第二 AON優(yōu)選具有少于3個(gè)連續(xù)的核苷酸序列同一丨I"生、更加優(yōu)選少于2個(gè)并且優(yōu)選少于I個(gè)核苷酸序列同一丨I"生。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述外顯子包括至少2個(gè)獨(dú)立的ESE位點(diǎn)。所述第一 AON優(yōu)選靶向于至少2個(gè)獨(dú)立的ESE位點(diǎn)而所述第二 AON靶向于其中的第二個(gè)。本文中使用的限定條件"序列同一丨丨生(sequence identity)"優(yōu)選指應(yīng)用核苷酸A、C、G或T的同一性，其中T可由U替代。近年來(lái)，已經(jīng)產(chǎn)生許多不同的核苷酸類(lèi)似物。其中的一些與所描述的典型或天然核苷酸在種類(lèi)和數(shù)量上具有相同的結(jié)合特性。然而，它們中的大多數(shù)在種類(lèi)上具有相似的(mimic)結(jié)合特性，而在數(shù)量上卻沒(méi)有。在許多情況下，類(lèi)似物與互補(bǔ)核苷酸的結(jié)合強(qiáng)度低于相應(yīng)的經(jīng)典核苷酸(classical nucleotide)。還有一些類(lèi)似物與2個(gè)或多個(gè)經(jīng)典核苷酸具有相似的結(jié)合特性，并且還有一些核苷酸類(lèi)似物，它們 被有效地結(jié)合于核酸中卻不表現(xiàn)出對(duì)相對(duì)鏈上特定的經(jīng)典核苷酸的顯著選擇性或不表現(xiàn)為結(jié)合至相對(duì)鏈上特定的經(jīng)典核苷酸上。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員熟知這些以及相似的類(lèi)似物的細(xì)節(jié)并且能夠?qū)⑺鼈儜?yīng)用在本發(fā)明的AON中，只要該AON能夠雜交至外顯子RNA上的雜交位點(diǎn)即可。本發(fā)明的AON優(yōu)選包括14-40個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。優(yōu)選地，所述AON包括14_25個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。本發(fā)明的AON優(yōu)選包括少于10 %的核苷酸類(lèi)似物。AON優(yōu)選包括少于4個(gè)核苷酸類(lèi)似物、優(yōu)選少于3個(gè)、更加優(yōu)選少于2個(gè)。本發(fā)明的AON優(yōu)選為修飾的寡核苷酸。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述AON包括一個(gè)或多個(gè)2，-0-甲基寡核糖核苷酸，這使得AON能夠抵抗核糖核酸酶H誘導(dǎo)的DNA/RNA雜交鏈(hybrid)的降解。此外，可以利用硫代膦酸酯骨架(phosphorothiatebackbone)來(lái)提高AON對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性并增強(qiáng)細(xì)胞的攝取(cellular uptake)。在一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的AON具有全長(zhǎng)硫代膦酸酯骨架并且所有堿基(核苷酸)具有2' -0-甲基修飾?？商鎿Q地，已經(jīng)利用嗎啉代磷酰二胺DNA(嗎啉代化合物)、鎖核酸(LNA)以及乙撐橋聯(lián)核酸(ENA, ethylene bridged nucleic acids)寡聚物來(lái)調(diào)節(jié)剪接。因此，本發(fā)明的AON還可具有這些修飾。這些修飾使得寡聚物對(duì)核糖核酸酶H和核酸酶具有抗性并且提高其對(duì)于靶標(biāo)RNA的親和力。對(duì)于ENA和LNA修飾，這種提高是通過(guò)降低的序列特異性而實(shí)現(xiàn)的。外顯子的外顯子居間部分，是不表現(xiàn)為與外顯子的5'-或3'-末端重疊的部分。外顯子的5'-或3'-末端包含與外顯子連接區(qū)相關(guān)的序列信息。外顯子的外顯子居間部分是居間于外顯子邊界內(nèi)的至少I(mǎi)個(gè)、以及至少2個(gè)、并且更加優(yōu)選至少5個(gè)核苷酸。除了如上文所限定的外顯子居間部分之外，外顯子居間AON還可以具有延伸至外顯子邊界或超過(guò)邊界的核苷酸。然而，這并不是優(yōu)選的情況。本發(fā)明的方法優(yōu)選進(jìn)一步包括，當(dāng)為所述細(xì)胞提供所述第二 AON可提高從產(chǎn)生所述mRNA前體的細(xì)胞中的所述成熟mRNA中去除所述外顯子的效率時(shí)，將所述第一 AON和所述第二 AON包含在一組AON中。隨后優(yōu)選將所述組用于獲得表達(dá)所述pre-mRNA的靶細(xì)胞中的外顯子跳躍。本發(fā)明還提供了包括至少2個(gè)AON的組，其中所述AON的至少第一個(gè)能夠雜交至外顯子的外顯子居間部分而所述AON的第二個(gè)能夠雜交至所述外顯子的另一個(gè)外顯子居間部分。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組是通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述AON的所述第一個(gè)和所述第二個(gè)靶向于所述外顯子RNA上的ESE位點(diǎn)。更加優(yōu)選地，所述AON的所述第一個(gè)和所述第二個(gè)靶向于所述外顯子RNA上的獨(dú)立的ESE位點(diǎn)。本發(fā)明的組可以以多種方式進(jìn)行使用。在一種實(shí)施方式中，所述組用來(lái)至少部分地減少細(xì)胞中異常蛋白(aberrant protein)的產(chǎn)生。這樣的蛋白可以是，例如腫瘤蛋白或病毒蛋白。在許多腫瘤中，不僅存在腫瘤蛋白而且其相對(duì)的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的表型有關(guān)。類(lèi)似地，不僅存在病毒蛋白而且在細(xì)胞中病毒蛋白的量均決定著特定病毒的毒性。此夕卜，對(duì)于病毒的有效增殖和蔓延，在生命周期中的表達(dá)周期(timing of expression)以及 細(xì)胞中某些病毒蛋白的量的平衡決定著病毒能否有效地產(chǎn)生。使用本發(fā)明的組，可以降低細(xì)胞中異常蛋白的量，使得例如腫瘤細(xì)胞的致瘤性(轉(zhuǎn)移)減少和/或使得病毒侵染的細(xì)胞產(chǎn)生較少的病毒。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組用來(lái)將所述異常蛋白轉(zhuǎn)化為功能蛋白。在一種實(shí)施方式中，所述功能蛋白能夠發(fā)揮正常存在于細(xì)胞中但不存在于待處理細(xì)胞中的蛋白的功能。即使是功能部分恢復(fù)也常常會(huì)導(dǎo)致這樣處理的細(xì)胞性能顯著改善。由于具有更好的性能，這樣的細(xì)胞還可比未修飾的細(xì)胞具有選擇性?xún)?yōu)勢(shì)，因而有助于處理的有效性。本發(fā)明的這個(gè)方面特別適用于缺陷基因表達(dá)的恢復(fù)。這是通過(guò)導(dǎo)致靶標(biāo)外顯子的特異性跳躍，從而繞開(kāi)或校正有害突變(通常為導(dǎo)致翻譯終止的終止突變或移碼點(diǎn)突變、單-或多-外顯子缺失或插入)而實(shí)現(xiàn)的。與基因-導(dǎo)入策略(gene-introduction strategy)相比，夕卜顯子跳躍基因理論要求給予少得多的治療劑，通常為，但不限于，包括或類(lèi)似于約14-40個(gè)核苷酸的A0N。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用14-25個(gè)核苷酸的A0N，因?yàn)檫@些分子更易于產(chǎn)生并可更加有效地進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明的組使對(duì)于隨后的有效且安全的外顯子跳躍策略和/或給藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)具有更多的靈活性。基因功能恢復(fù)AON組的另外一個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)是其恢復(fù)(至少是一些)內(nèi)源基因活性，其仍進(jìn)行它的大多數(shù)或所有基因調(diào)控線(xiàn)路(gene-regulatory circuitry),從而確保適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平和組織特異性異構(gòu)體的合成。本發(fā)明的這個(gè)方面原則上可應(yīng)用于任何遺傳病或疾病的遺傳易感性，其中，當(dāng)翻譯讀碼框被原始突變打斷時(shí)，特定外顯子的靶向性跳躍可恢復(fù)翻譯讀碼框。當(dāng)內(nèi)部稍短或改變的蛋白的翻譯具有全部或部分功能的時(shí)候，這種應(yīng)用尤其有益。優(yōu)選的實(shí)施方式(對(duì)于該優(yōu)選實(shí)施方式，這種應(yīng)用可能具有治療價(jià)值)是對(duì)于腫瘤抑制基因(例如在乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)節(jié)性硬化癥、神經(jīng)纖維瘤等中涉及的那些)中第二命中突變的素因(predisposition),其中活性的(部分)恢復(fù)通過(guò)第二命中突變將消除缺對(duì)染色體(缺體型，nullosomy)的現(xiàn)象，并因此將防止腫瘤發(fā)生。另一種優(yōu)選的實(shí)施方式涉及具有直接導(dǎo)致疾病發(fā)生作用的缺陷型基因產(chǎn)物的(部分)恢復(fù)，例如，血友病A(凝血因子VIII缺乏)、先天性甲狀腺功能低下癥的一些形式(由于甲狀腺球蛋白合成缺乏)以及杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)(其中伴X染色體的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因中的移碼缺失、復(fù)制以及終止突變導(dǎo)致嚴(yán)重的、進(jìn)行性肌退化)。DMD在青春期晚期或成人期早期通常是致命的，而相同基因中的非移碼缺失或復(fù)制則會(huì)導(dǎo)致輕微得多的貝克爾氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(Becker Muscular Dystrophy, BMD),其與35-40歲至正常的預(yù)期壽命相一致。在正如應(yīng)用于DMD的實(shí)施方式中，本發(fā)明通過(guò)如所需要的多個(gè)鄰近的外顯子而使外顯子跳躍能夠延及存在的缺失(或改變存在復(fù)制的mRNA產(chǎn)物)，從而恢復(fù)讀碼框并產(chǎn)生內(nèi)部稍微變短但仍具有功能的蛋白?；谕瑯?equivalent)具有這種誘導(dǎo)缺失的BMD患者具有輕微得多的臨床癥狀，DMD患者的病情在AON-治療后將有一個(gè)輕微得多的過(guò)程?？紤]到本發(fā)明的組的許多臨床應(yīng)用，本發(fā)明的方法優(yōu)選進(jìn)一步包括向人類(lèi)細(xì)胞提供所述組。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的一組AON。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組包括表I或表2中的AON中的至少一種。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括至少表I和/或表2中的AON的一組AON。在這種實(shí)施方式的一個(gè)優(yōu)選方面，表I和/或表2中的至少 2 個(gè) AON 的所述組包括 h2A0Nl 和 h2A0N3、h43A0Nl 和 h43A0N2、h43A0Nl 和 h43A0N3、h43A0Nl 和 h43A0N4、h43A0Nl 和 h43A0N5、h43A0N2 和 h43A0N5、h43A0N3 和 h43A0N5、h43A0N4 和 h43A0N5、h45A0Nl 和 h45A0N4、h45A0Nl 和 h45A0N5、h45A0Nl 和 h45A0N9、h45A0N2 和 h45A0N3、h45A0N2 和 h45A0N4、h45A0N2 和 h45A0N5、h45A0N3 和 h45A0N4、h45A0N3和 h45A0N5、h45A0N3 和 h45A0N9、h45A0N4 和 h45A0N5、h45A0N5 和 h45A0N9、h46A0N4 和h46A0N8、h46A0N4 和 h46A0N20、h46A0N4 和 h46A0N22、h46A0N6 和 h46A0N21、h46A0N8 和h46A0N22、h46A0N8 和 h46A0N23、h46A0N8 和 h46A0N26、h46A0N9 和 h46A0N21、h46A0N9 和 h46A0N22、h46A0N9 和 h46A0N26、h46A0N22 和 h46A0N24、h46A0N24 和 h46A0N26、h47A0Nl和 h47A0N3、h47A0Nl 和 h47A0N5、h47A0N2 和 h47A0N3、h47A0N2 和 h47A0N5、h47A0N3 和h47A0N4、h47A0N3 和 h47A0N5、h47A0N3 和 h47A0N6、h47A0N4 和 h47A0N5、h47A0N5 和h47A0N6、h48A0N I 和 h48A0N4、h48A0Nl 和 h48A0N6、h48A0Nl 和 h48A0N8、h48A0Nl 和h48A0N9、h48A0Nl 和 h48A0N10、h48A0N2 和 h48A0N10、h48A0N3 和 h48A0N4、h48A0N4 和h48A0N6、h48A0N6 和 h48A0N8、h48A0N6 和 h48A0N9、h48A0N6 和 h48A0N10、h48A0N7 和h48A0N9、h57A0Nl和h57A0N3和/或h57A0N2和h57A0N3。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表I和/或表2中的至少2個(gè)AON的組包括h43A0Nl和h43A0N3、h45A0Nl和h45A0N4、h45A0Nl 和 h45A0N5、h45A0Nl 和 h45A0N9、h45A0N2 和 h45A0N3、h45A0N2 和 h45A0N4、h45A0N3 和 h45A0N4、h45A0N3 和 h45A0N5、h45A0N3 和 h45A0N9、h45A0N4 和 h45A0N5、h45A0N5 和 h45A0N9、h46A0N9 和 h46A0N21、h47A0Nl 和 h47A0N3、h47A0Nl 和 h47A0N5、h47A0N2 和 h47A0N3、h47A0N2 和 h47A0N5、h47A0N3 和 h47A0N4、h47A0N3 和 h47A0N5、h47A0N3和 h47A0N6、h47A0N4 和 h47A0N5、h47A0N5 和 h47A0N6、h48A0Nl 和 h48A0N4、h48A0Nl 和h48A0N8、h48A0N3 和 h48A0N4、h57A0Nl 和 h57A0N3、h57A0N2 和 h57A0N3。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表I和/或表2中的至少2個(gè)AON的組包括h45A0Nl和h45A0N4、h45A0Nl 和 h45A0N5、h45A0Nl 和 h45A0N9、h45A0N2 和 h45A0N3、h45A0N3 和 h45A0N4、h45A0N3 和 h45A0N5、h45A0N3 和 h45A0N9、h45A0N4 和 h45A0N5、h45A0N5 和 h45A0N9、h47A0Nl 和 h47A0N3、h47A0Nl 和 h47A0N5、h47A0N2 和 h47A0N3、h47A0N2 和 h47A0N5、h47A0N3和 h47A0N4、h47A0N3 和 h47A0N5、h47A0N3 和 h47A0N6、h47A0N4 和 h47A0N5、h47A0N5 和h47A0N6、h57A0Nl 和 h57A0N3、h57A0N2 和 h57A0N3。本發(fā)明進(jìn)一步提供了表 2 的 AON。優(yōu)選地,表 2 中的所述 AON 是 h33A0Nl、h33A0N2、h44A0N3、h44A0N4、h45A0Nll 或 h52A0N3。
在一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療患有腫瘤、病毒感染和/或遺傳疾病和/或遺傳易感性的個(gè)體的方法，該方法包括對(duì)所述個(gè)體給予本發(fā)明的AON組。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明的AON組的藥物組合物。優(yōu)選地，所述組用于治療患有腫瘤、病毒感染和/或遺傳疾病和/或遺傳易感性的個(gè)體。優(yōu)選地，所述組用于治療杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生含有mRNA前體的外顯子的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞包括能夠雜交至所述外顯子的外顯子居間部分的第一 AON、以及能夠雜交至所述外顯子的另一外顯子居間部分的第二 AON。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例 結(jié)果與討論在一個(gè)外顯子中的雙重靶向我們假設(shè)通過(guò)在一個(gè)外顯子中靶向多個(gè)ESE，對(duì)于使用單獨(dú)的AON不能以高水平跳躍的外顯子，可以提高跳躍效率。圖IA中描述了對(duì)于這些中的每個(gè)外顯子的AON與推斷的ESE (由ESEfinder預(yù)測(cè)得到的)的相對(duì)位置。我們首先測(cè)試了對(duì)2個(gè)不可跳躍的外顯子(外顯子47和57)的雙重靶向。當(dāng)用這些AON的不同組合對(duì)人對(duì)照肌管培養(yǎng)物進(jìn)行處理時(shí)，正如用RT-PCR分析所確定的(

圖1BC，附加表I)，可獲得外顯子47和57的顯著跳躍水平。有趣的是，對(duì)于外顯子47，只有非重疊AON的組合誘導(dǎo)外顯子跳躍，而那些重疊的組合則是無(wú)效的(附加表I)。類(lèi)似地，對(duì)于外顯子57，幾乎重疊的AON的組合(h57A0Nl和h57A0N2)不誘導(dǎo)外顯子跳躍。這符合我們的假設(shè)，即這些外顯子中存在兩個(gè)相互排斥的ESE位點(diǎn)。對(duì)于外顯子2和外顯子45，只有單個(gè)AON可重復(fù)性地誘導(dǎo)低水平的外顯子跳躍(分別為，h2A0Nl和h45A0N5)?？梢酝ㄟ^(guò)將有效的h45A0N5與無(wú)效的AON組合，以及通過(guò)結(jié)合2個(gè)單獨(dú)的無(wú)效AON(例如h45A0N3和h45A0N9)來(lái)誘導(dǎo)外顯子45的相當(dāng)高水平的跳躍(圖1D)。因此，對(duì)于這個(gè)外顯子，也可能存在兩個(gè)有效的ESE。相對(duì)而言，AON的組合不會(huì)提高外顯子2的跳躍效率。實(shí)際上，將有效的h2A0Nl與無(wú)效的h2A0N2組合消除了外顯子2的跳躍(圖1E)。對(duì)于h2A0Nl與h2A0N3 (重疊少于h2A0N2)的組合卻沒(méi)有觀察到這種干擾。對(duì)于外顯子43和48，有效的AON只有到中等水平的跳躍。對(duì)于這些外顯子，跳躍水平不會(huì)由于使用AON的組合而得到提高(附加表I)。在這些外顯子中可以存在3個(gè)或甚至更多的ESE。因此，我們用3個(gè)不同AON的組合靶向于外顯子48，仍然不能提高跳躍水平。因此，看起來(lái)這個(gè)外顯子的剪接更加可能在很大程度上獨(dú)立于ESE位點(diǎn)。這得到了以下事實(shí)的支持預(yù)測(cè)的剪接位點(diǎn)是正確的(perfect) (3'剪接位點(diǎn))或接近正確的(5,剪接位點(diǎn))，并且對(duì)于外顯子48預(yù)測(cè)只有少量的ESE。最后，我們使用外顯子46特異性的AON組合，其中的一些單獨(dú)使用就已經(jīng)非常有效。我們目的是將跳躍水平提高至(接近)100%。然而，當(dāng)與單個(gè)靶向相比時(shí)，所使用的組合中沒(méi)有一種可進(jìn)一步提高跳躍水平(附加表I)。這表明阻斷I個(gè)ESE就足以擾亂該外顯子的正確剪接。該外顯子上的ESE位點(diǎn)彼此依賴(lài)，因而通過(guò)阻斷一個(gè)，就可以使多個(gè)或所有ESE失活?？商鎿Q地，pre-mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)合AON后可發(fā)生改變，從而對(duì)于SR蛋白結(jié)合不再可獲得其他的ESE位點(diǎn)。有趣的是，不管單個(gè)AON是否有效，(部分)重疊組合看起來(lái)再次消極地干擾單獨(dú)外顯子的跳躍能力。預(yù)期2個(gè)無(wú)效的、重疊AON的組合也會(huì)是無(wú)效的，因?yàn)樗鼈兌咧械拿恳粋€(gè)靶向于非功能性ESE位點(diǎn)或其二者均靶向于相同的兩個(gè)(或多個(gè))相互排斥的ESE位點(diǎn)。對(duì)于重疊的、有效AON的組合，這種發(fā)現(xiàn)是未預(yù)料到的。然而，這些AON會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)，并迫使彼此從動(dòng)態(tài)過(guò)程(dynamic process)中的祀標(biāo)轉(zhuǎn)錄本中分離,從而對(duì)于SR蛋白可再次獲得靶標(biāo)位點(diǎn)。在結(jié)合后，SR蛋白將其他的剪接因子集結(jié)至剪接位點(diǎn)，并因而增強(qiáng)外顯子的增加而非外顯子跳躍。材料與方法AON和引物上文中已經(jīng)描述了所有用于雙重靶向?qū)嶒?yàn)的AON(見(jiàn)附加表I) (11、14、15)。所有AON均包含2-0-甲基RNA、硫代磷酸酯骨架以及5'熒光素標(biāo)記并且由Eurogentec (比利時(shí))制造。(RT-)PCR引物選自跳躍的外顯子側(cè)面的外顯子(Eurogentec，比利時(shí)；如果要求可提供序列)。
組織培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染以及RT-PCR分析如上所述獲得對(duì)照和DMD患者來(lái)源的肌管培養(yǎng)物(9、22)。對(duì)于外顯子跳躍實(shí)驗(yàn)，以200nM的每種AON進(jìn)行轉(zhuǎn)染，至少進(jìn)行兩次。在所有的實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，以每 U g AON 中 2 至 3. 5 u I PEI 使用聚乙烯亞胺(PEI, ExGen 500, MBI Fermentas)。取決于可用于每個(gè)靶標(biāo)外顯子的有效AON的數(shù)量，測(cè)試AON的不同組合(附加表I)。制備每種AON的AON-PEI配合物的分離溶液(j^parate solution)。基于核熒光信號(hào)的存在，轉(zhuǎn)染效率通常超過(guò)80%。在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)分離RNA并如上所述進(jìn)行RT-PCR分析(14)。使用靶標(biāo)外顯子側(cè)面的外顯子中的引物，通過(guò)RT-PCR分析來(lái)證實(shí)每種AON的成功轉(zhuǎn)染。從瓊脂糖凝膠中分離PCR片斷并如上所述進(jìn)行序列分析(10)。表I.所使用的AON的特性
權(quán)利要求
1.一種反義寡核苷酸(AON),包括表2中示出的序列或者由表2中示出的序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Α0Ν，包括14-40個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Α0Ν，包括14-25個(gè)核苷酸或其類(lèi)似物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的Α0Ν，其中，所述AON包括SEQID NO :118表示的h44A0N4或者由SEQ ID NO :118表示的h44A0N4組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的Α0Ν，其中，所述AON是修飾的寡核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的Α0Ν，其中，所述AON包括至少ー個(gè)核苷酸類(lèi)似物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Α0Ν，其中，所述AON包括選自2'-O-甲基核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、嗎啉代核苷酸、鎖核酸(LNA)核苷酸、和/或こ撐橋聯(lián)核酸(ENA)核苷酸中的ー種或多種修飾。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Α0Ν，其中，所述AON包括ー個(gè)或多個(gè)2'_0_甲基寡核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、嗎啉代寡核苷酸、鎖核酸(LNA)寡核苷酸、和/或こ撐橋聯(lián)核酸(ENA)寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Α0Ν，其中，所述AON包括嗎啉代磷酰ニ胺寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Α0Ν，其中，所述AON包括ー個(gè)或多個(gè)2'_0_甲基硫代膦酸酯核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的Α0Ν，其中，所述AON包括ー個(gè)或多個(gè)2'_0_甲基硫代膦酸酷寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的Α0Ν，包括全長(zhǎng)硫代膦酸酯骨架，且其中，所有核苷酸包括2' -O-甲基修飾。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的Α0Ν，其中，少于10%的核苷酸是核苷酸類(lèi)似物。
14.ー種載體,表達(dá)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的AON或其前體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其為病毒載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體,其為腺相關(guān)病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種反義寡核苷酸。在本發(fā)明中提供了使用外顯子-居間AON來(lái)優(yōu)化外顯子跳躍的手段和方法。我們證實(shí)了通過(guò)靶向外顯子中的推斷的剪接調(diào)控序列(ESE)可提高跳躍效率。這種雙重靶向?qū)τ谠诒景l(fā)明之前難以獲得有效跳躍的外顯子是特別有益的。本發(fā)明還提供了表達(dá)所述反義寡核苷酸的載體。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102676529SQ201210175630
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2007年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者加里-讓·布德韋恩·范奧姆門(mén), 安內(nèi)米克·阿爾特斯馬-魯斯, 朱迪思·克里斯蒂娜·西奧多拉·范多伊特科姆 申請(qǐng)人:萊頓教學(xué)醫(yī)院