用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光rt-pcr引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物、探針及試劑盒。所述引物與探針的序列如SEQ ID NO.1～6所示。所述試劑盒中含有引物、探針、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA提取試劑、熒光PCR反應(yīng)試劑、施馬倫貝格病毒陽性對照和陰性對照。本發(fā)明建立的施馬倫貝格病毒熒光RT-PCR試劑盒及檢測方法具有特異、敏感、重復性好、快速、費用低廉，是施馬倫貝格病毒快速檢測的良好方法。
【專利說明】用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物、探針及試劑 合 Sl

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光 RT-PCR引物、探針及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 施馬倫貝格病（Schmallenberg，SB)是2011年11月在德國北萊茵-威斯特法倫 州施馬倫貝格鎮(zhèn)牛羊中發(fā)現(xiàn)的一種新的病毒性動物傳染病，該病的主要臨床特征是：受感 染母羊流產(chǎn)、死胎，新生羔羊畸形、成活率下降，感染牛表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、產(chǎn)奶量下降等，對 畜牧業(yè)造成了較大危害。
[0003] 目前SB的實驗室診斷方法主要包括細胞培養(yǎng)分離病毒等病原檢測方法，以及酶 聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)、間接免疫熒光試驗（IFA)和中和試驗（NT)等血清學方法。病毒分 離通常是確診疫病的金標準，但由于成年患病動物常不表現(xiàn)臨床癥狀，難以掌握病毒血癥 的具體時期，且費時費力，因此病毒分離的實施受到一定的限制，不適應(yīng)快速檢測的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物組及試 劑盒。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述熒光RT-PCR引物組及試劑盒在檢測施馬倫貝 格病毒上的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物和探針，所述引物是根據(jù)施馬倫貝格病 毒核衣殼蛋白基因序列的高度保守區(qū)域設(shè)計的。其核苷酸序列如下所示： 60F :5' - GCTTGCCTGGGCCAAAT -3'（SEQ ID NO. 1)， 60R:5' - CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3' （SEQ ID N0.2)， 60P :Fam-5' - TGGATTCTCTCCTGCTGC -3' -Eclipse (SEQ ID NO. 3); 一種用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR試劑盒，其含有以上所述的引物和探針， 還含有反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA提取試劑、熒光PCR反應(yīng)試劑、施馬倫貝格病毒陽性對照 和陰性對照。
[0007] 所述施馬倫貝格病毒陽性對照為施馬倫貝格病毒CDNA的質(zhì)粒，所述陰性對照為 無菌采取澳洲進口牛血清，經(jīng)檢測BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV為陰性。
[0008] 以上所述的試劑盒在施馬倫貝格病毒檢測中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明建立的施馬倫貝格病毒熒光RT-PCR試劑盒及檢測方法具有特異、敏感、重復性 好、快速、費用低廉，是施馬倫貝格病毒快速檢測的良好方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1為RT-PCR電泳結(jié)果圖（M :DNA Marker DL-2000 ;P :陽性對照；1 :引物60擴增 pMD-SBV ;N:陰性對照）； 圖2為SBV熒光RT-P CR檢測結(jié)果； 圖3為SBV熒光RT-PCR特異性試驗； 圖4為陽性質(zhì)粒稀釋敏感性試驗； 圖5為SBV熒光RT-PCR標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0012] 實施例1引物設(shè)計 從Genebank下載多個施馬倫貝格病毒（SBV)的核衣殼蛋白基因序列，用DNASTAR 5. 07 軟件進行比對，尋找高度保守的區(qū)域，然后選取適當?shù)暮艘職さ鞍谆蛐蛄蟹謩e設(shè)計2套 特異性檢測SBV核衣殼蛋白基因的引物、Taqman探針，送大連寶生物技術(shù)有限公司合成， 用DEPC處理水溶解，-80°C避光保存。引物、探針見表1 : 表I SBV熒光RT-PCR引物、探針

【權(quán)利要求】
1. 用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物和探針，其特征在于，所述引物是根據(jù) 施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白基因序列的高度保守區(qū)域設(shè)計的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR引物和探針，其特征 在于，其核苷酸序列如下所示： 60F :5' - GCTTGCCTGGGCCAAAT -3'（SEQ ID NO. 1)， 60R：5, - CGAATTGCTGCAAGAAGGTTCT -3, (SEQ ID NO. 2), 60P :Fam-5, - TGGATTCTCTCCTGCTGC -3, -Eclipse (SEQ ID N0.3)。
3. -種用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR試劑盒，其含有權(quán)利要求1或2所述的 引物和探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒中還含有反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA提取試劑、熒光PCR反應(yīng)試劑、施馬倫貝 格病毒陽性對照和陰性對照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測施馬倫貝格病毒的熒光RT-PCR試劑盒，其特征在 于，所述施馬倫貝格病毒陽性對照為施馬倫貝格病毒cDNA的質(zhì)粒，所述陰性對照為無菌采 取澳洲進口牛血清，經(jīng)檢測BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV為陰性。
6. 權(quán)利要求3?5任一項所述的試劑盒在施馬倫貝格病毒檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450959SQ201410680100
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】楊素, 陶旻, 陳軒, 黃海超, 徐海聶, 沙才華, 廖秀云, 羅寶正, 薄清如 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局