專利名稱：：生物素用于預防光老化的用途的制作方法生物素用于預防光老化的用途本發(fā)明涉及生物素，優(yōu)選以特定比例組合的生物素和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，用于預防由日光誘導的皮膚老化(光老化)的用途。如果皮膚長期暴露于UV輻射下，那么這導致受影響皮膚區(qū)域出現(xiàn)表皮和真皮損傷，諸如角化過度、角質(zhì)化形成細胞發(fā)育不良和真皮彈性組織變性，從而長期以具有光化或日光角化癥的光老化皮膚形式存在。皮膚光損傷和光老化的分子機理已成為廣泛研究的課題。uv輻射使得整個范圍的細胞表面生長因子和細胞活素受體活化(Rittie和Fisher2002)。這種配體獨立的受體活化誘發(fā)多個集中刺激轉(zhuǎn)錄因子AP-1的下游信號途徑(downstreamsignalingpathways)。通過AP-1上調(diào)的基因中的一些是若干基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的成員。因此，MMP是造成日光UV輻射誘導皮膚損傷的原因，從而影響皮膚色調(diào)和彈性，導致過早老化。MMP使皮膚細胞外基質(zhì)中的膠原質(zhì)和彈性蛋白降解。MMP表達和活性的增加導致膠原質(zhì)的蛋白質(zhì)水解增加，同時膠原質(zhì)表達減少會導致皮膚彈性組織變性并起皺(Bemeburg2003)。其癥狀包括皮革樣肌理(leatherytexture)、皺紋、斑點狀色素沉著、松弛和灰黃。MMP是最重要的且被充分確定的與光老化相關(guān)的基因之一。因此，為了確定物質(zhì)對光老化的的防護能力，最感興趣的調(diào)查是它們對UVA誘導的MMP的抑制性的影響。生物素是水溶性維生素，其對皮膚、頭發(fā)和指甲的功能很重要生物素缺乏會導致鱗狀的粗糙皮膚和易斷指甲。此外，生物素是若干種羧化酶(諸如乙?；?CoA羧化酶、甲基巴豆?；?CoA羧化酶、線粒體丙酰-CoA羧化酶、線粒體丙酮酸羧化酶)中負責二氧化碳轉(zhuǎn)化的輔助因子。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是會抑制各種皮膚膠原酶的膳食化合物中的一種(Lee等，2005)。本文所用術(shù)語"EGCG"指(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯及/或其衍生物(例如酯化形式、苷、硫酸酯/鹽)中的一種或多種。本發(fā)明的目的在于提供一種會預防由日光誘導的皮膚老化(光老化)的活性成分。本文所用術(shù)語"日光"指天然的和/或人造的日光，其除了UV輻射以外由其還包括IR輻射。因此，所述活性成分應(yīng)當預防由UV輻射引起的皮膚老化以及由IR引起的皮膚老化。現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的通過如下實現(xiàn)使用生物素用于減少由日光誘導的膠原質(zhì)和/或彈性蛋白降解、皺紋、細紋和/或皮膚老化膠原酶以及/或者用于抑制由日光誘導的膠原酶。甚至更驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過生物素和EGCG的協(xié)同組合會以甚至更優(yōu)選的方式實現(xiàn)本發(fā)明的目的。因此，更優(yōu)選使用協(xié)同組合的生物素和EGCG以減少由日光誘導的膠原質(zhì)和/或彈性蛋白降解、皺紋、細紋和/或皮膚老化膠原酶以及/或者抑制由日光誘導的膠原酶?；钚猿煞挚梢酝ㄟ^口服組合物或局部用/化妝用組合物的形式施用，然而優(yōu)選口服。本文所用術(shù)語"口服組合物"指用口服用的組合物。因此，本發(fā)明的口服組合物可以作為食品、飼料和飲料的補充劑，作為膳食補充劑或者作為藥物制劑，它們可以是固體(諸如膠囊或片劑)或液體(諸如溶液或懸浮液)。此外，術(shù)語"口服組合物"還包括含有一種或兩種本發(fā)明的活性成分的食品、飼料和飲料。本文所用術(shù)語"局部用組合物"指可以局部施用到哺乳動物的角質(zhì)組織上的化妝品組合物。本申請中使用的術(shù)語"化妝品組合物"指例如在R6mppLexikonChemie，第10版1997，GeorgThiemeVerlagStuttgart,NewYork,標題為"Kosmetika"的章節(jié)中定義的化妝品組合物。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還涉及一種口服組合物，其包含比例在1:l至l:5000范圍內(nèi)的協(xié)同組合的生物素和EGCG。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不會預見到生物素與EGCG的組合對于抑制4UVA誘導的MMP1具有出眾的協(xié)同作用，從而達到防老化/抗皺效果。在實際暴露于日光/UV光之前使用數(shù)天至數(shù)周協(xié)同組合的生物素和EGCG還會預防光老化。在強烈日曬(即日光浴)之前、期間和/或之后立即涂敷，其也具有防護性。如果生物素與EGCG組合施用，那么本發(fā)明優(yōu)選使用(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯本身。在本發(fā)明的進一步優(yōu)選實施方式中，所用EGCG具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、甚至更優(yōu)選至少92%、最優(yōu)選至少94%的純度。由其優(yōu)選的是含有EGCG的水性綠茶萃取物，其中EGCG的含量基于所述提取物的總量為至少80%(優(yōu)選為至少85%、更優(yōu)選為至少90%、甚至更優(yōu)選為至少92%、最優(yōu)選為至少94%)，所述萃取物例如且優(yōu)選通過US6，383，392、EP1103550、US10/246112和EP1077211中所述的任意一種方法得到。優(yōu)選地，其它多酚和兒茶素(諸如沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素和表兒茶素)的總量基于所述綠茶提取物的總重小于或等于5重量％。更優(yōu)選地，沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量小于或等于2.5重量％，和/或表兒茶素沒食子酸酯的含量小于或等于5重量％(優(yōu)選小于或等于3重量％)。根據(jù)本發(fā)明，有利的是，咖啡因在綠茶提取物中的含量基于所述綠茶提取物的總重小于或等于2.5重量％(優(yōu)選小于或等于0.1重量％)，和/或沒食子酸在綠茶提取物中的含量基于所述綠茶提取物的總重小于或等于0.1重量％。如果生物素與EGCG組合施用，那么根據(jù)本發(fā)明有利的是，生物素與EGCG的比例在1:l至l:5000的范圍內(nèi)，優(yōu)選在l:3至1:3000的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在l:5至1:1000的范圍內(nèi)。如果意欲口服活性成分，那么根據(jù)本發(fā)明有利的是，以其有效日常用量(日劑量)處于下述范圍內(nèi)的方式服用活性成分。因此，日劑量是以一次使用全部的方式(通過單一劑量)施用還是以多次劑量的形式施用并不相關(guān)。生物素對于體重約70kg的人來說，日劑量不應(yīng)超過40mg，優(yōu)選不應(yīng)超過25mg;對于體重約70kg的人來說，日劑量優(yōu)選介于0.03至40mg之間，更優(yōu)選介于0.06至25mg之間。EGCG:對于體重約70kg的人來說，日劑量為50至600mg;對于體重約70kg的人來說，優(yōu)選日劑量為150至300mg。如果組合物被制備成適于口服的片劑、膠囊、顆?；蛏┬问剑敲纯梢允褂觅x形劑，諸如作為載劑的乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、脲、淀粉、糊精和/或麥芽糊精、磷酸鈣和/或磷酸氫鈣、高嶺土、結(jié)晶和/或微晶纖維素和/或硅酸；結(jié)合劑，諸如水、乙醇、丙醇、單糖、葡萄糖溶液、淀粉和/或氫化淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基淀粉、蟲膠(shellac)、甲基纖維素、乙基纖維素、磷酸鈣和/或聚乙烯基吡咯垸酮；繃解劑，諸如干淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素、交聯(lián)維酮、藻酸鈉、瓊脂粉末、海帶淀粉粉末(laminaranpowder)、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸甘油一酯、淀粉和/或乳糖；防繃解劑，諸如硬脂酸、可可油脂和/或氫化油；吸收劑(absorbefacient)，諸如季銨堿和/或月桂基硫酸鈉；保濕劑，諸如丙三醇和/或淀粉；吸附劑，諸如淀粉、乳糖、高嶺土、斑脫土和/或硅膠；潤滑劑，諸如被純化的滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末和/或聚乙二醇；矯味劑(tastecorrigents)，諸如蔗糖、桔皮、檸檬酸和/或琥珀酸；等等。如果組合物被制成片劑形式，那么其可以被提供為由常見包衣包覆的片劑，例如糖包衣片劑、明膠包衣片劑、腸包衣片劑、膜包衣片劑、雙層包衣片劑、多層包衣片劑等等。膠囊通過如下制成將根據(jù)本發(fā)明的化合物與以上或者根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)列舉的各種載劑混合，然后將混合物裝入硬質(zhì)凝膠膠囊、軟質(zhì)膠囊等等中?？梢詫⒕哂卸喾N維生素和礦物的補充劑加入本發(fā)明的組合物中，從而例如使營養(yǎng)良好平衡或者獲得在一些膳食中缺乏的適量必需營養(yǎng)。具有多種維生素和礦物的補充劑還可用于疾病預防和對由于生活方式和共有的不當膳食結(jié)構(gòu)(有時在糖尿病患者中可見)引起的營養(yǎng)缺乏和不足的防護。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是食品或飲料組合物。飲料可以例如是運動飲品、能量飲品或其它軟飲品、或任意適當?shù)娘嬃现苿?。運動飲品是這樣的飲料，其應(yīng)當為運動員補充體液以及恢復電解質(zhì)、6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>糖和其它營養(yǎng)。運動飲品同時是等壓的，這意味著它們含有與人體中的營養(yǎng)物質(zhì)相同的比例。能量飲品是這樣的飲料，其包含(合法的)刺激物、維生素(尤其是維生素B)以及/或者礦物質(zhì)，從而使使用者能量猛增。通常的成分包括咖啡因、瓜拉那(guarana)(來自瓜拉那植物的咖啡因)和/或?；撬帷⒏鞣N形式的人參、麥芽糊精、肌醇、肉堿、肌酸、葡醛內(nèi)酯(glucuronolactone)、輔酶Q10和/或銀杏葉提取物(ginkgobiloba)。其中的一些可以包含高水平的糖或葡萄糖，而另一些完全或部分采用糖醇和/或人造甜味劑(如環(huán)己氨基磺酸Ca(Ca-clamate)或天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame))增甜。一些上述飲料被調(diào)味和/或被著色。軟飲品是不含酒精的飲品。一般而言，該術(shù)語僅用于涼飲料。熱巧克力、茶和咖啡被認為不是軟飲品。該術(shù)語原本專指碳酸飲品并且仍常用在這種方式中。如果組合物被制成以下食品中的任意一種的形式，那么根據(jù)本發(fā)明組合物中生物素的含量和EGCG(如果需要)的含量選自下表所給定范圍是有利的<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如果組合物被制成片劑或膠囊形式，那么根據(jù)本發(fā)明組合物中生物素的含量和EGCG(如果需要)的含量選自下表所給定范圍是有利的:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例lEGCG和生物素在抑制UV-A誘導的基質(zhì)金屬蛋白酶表達上的協(xié)同效應(yīng)將初代人真皮纖維原細胞在不含谷氨酰胺且被抗生素/抗真菌素、2mML-谷氨酸鹽和7.5%的胎牛血清補充的EMEM(Earle的最低必要培養(yǎng)基)中在37"/5%0)2下進行培養(yǎng)，并且生長至100%融合。照射前48小時，用在EMEM(具有AB/AM、L-谷氨酸鹽和2%FCS)中的期望物質(zhì)預孵化細胞。24小時后，培養(yǎng)基用含有該物質(zhì)的新培養(yǎng)基(新制成的)替換。為了照射，將培養(yǎng)基取出，在用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)進行6次洗滌步驟后用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)進行替換。然后，將該板暴露于30J/cn^的UVA1下。UVA1的輸出量為約150mW/cm2。照射后，將細胞微型板中的磷酸緩沖鹽水與含有物質(zhì)的培養(yǎng)基(+7.5%FCS)(新制備的)交換，然后將細胞在C02孵化器中孵化另外24小時(MMP-1確定)。取出培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖的鹽水沖洗細胞，然后將整塊板冷凍在液氮中。采用Rneasy總RNA試劑盒(Qiagen,Hilden;Germany)分離總RNA。通過260/280下的光度測量確定RNA濃度。利用用于RT-PCR的SuperscriptTMmFirst-Strand合成系統(tǒng)將總RNA(75ng)的等分試樣應(yīng)用于cDNA-合成。分析兩個試樣中的每種化合物。在Opticon1(MJResearch,Waltham，MA，USA)上采用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)實施PCR反應(yīng)。為了比較實時PCR對照細胞和被處理細胞間的相對表達，使用2(—55€(7))方法。結(jié)果匯總在表1中。與在未照射細胞中探測到的水平(未示出)相比，UV-A處理使MMP-1RNA增加了10倍。EGCG和生物素使這種表達分別減少了13%和66%。明顯不同的是，當組合這些物質(zhì)時，UV-A誘導的MMP-1表達完全消失了。這意味著EGCG和生物素對MMP-1調(diào)節(jié)具有協(xié)同效應(yīng)，因為觀察到的抑制作用與預期的抑制作用(單個化合物數(shù)值的總和)之間的差值為正值(即21%)。表l:MMP-1在皮膚纖維原細胞中的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2長效防老化預防的片劑組成-.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制備:將生物素、TeavigoTG、成塊的乳糖、微晶纖維素、二氧化硅和交聯(lián)維酮加入適當?shù)娜萜髦校缓笥脻L筒混合機混合20分鐘。硬脂酸鎂用1mm的篩子進行過篩，加入，然后將組合物再混合2分鐘。采用KorschXP1片劑沖壓機將粉末壓制成片劑，沖模尺寸為17X7.87mm的橢圓形。從春天(即日光曝曬量增加前至少兩個月)開始應(yīng)當每天服用一片，服用整個季節(jié)。實施例3促進防老化保護的速溶飲品組成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用500pm的篩子過篩所有成分。將粉末置于適當?shù)娜萜髦?，然后在滾筒共混機中混合至少20分鐘。通過加水使35g粉末形成1升飲料。速溶飲品包含50mgEGCG和0.5mg生物素/(每份240ml備飲飲品)。推薦在大量日曬或日光浴期間和以后每天飲用至多3份。實施例4用于連續(xù)基礎(chǔ)防老化保護的薄荷糖組成<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將TeavigoTG、生物素、抗壞血酸細顆粒、山梨糖醇、芳香劑(AromaFrescofortePermaseal60470-31(Givaudan)禾口AromaEiszuckerPermaseal60153-73(Givaudan))、甜味劑和PEG6000混入滾筒中，然后用滾筒混合機混合10分鐘。用1mm的篩子過篩山梨糖醇和二氧化硅，然后將其在單獨的滾筒中混合10分鐘。將兩個粉末混合物組合，然后再混合10分鐘。用lmm的篩子過篩硬脂酸鎂，添加后再混合2分鐘。采用KorschXPl片劑沖壓機將粉末壓制成片劑，沖模尺寸為8mm圓形。推薦每天服用至多5個薄荷糖。TEAVIGOTG:DSMNutritionalProducts的商品；TablettoseTM80:BrenntagN.V.的商品；Aerosil200:Degussa的商品PolyplasdoneXL10:ISP的商品。權(quán)利要求1.生物素用于抑制由日光誘導的膠原酶的用途。2.生物素用于減少由日光誘導的膠原質(zhì)和/或彈性蛋白降解的用途。3.生物素用于預防和/或減少由日光誘導的皺紋和細紋以及/或者光老化的用途。4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的生物素的用途，所述生物素與(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)協(xié)同組合。5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，生物素與EGCG在所述組合中的比例在l:l至l:5000的范圍內(nèi)。6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，生物素與EGCG在所述組合中的比例在l:3至1:3000的范圍內(nèi)。7.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，生物素與EGCG在所述組合中的比例在l:5至1:1000的范圍內(nèi)。8.如權(quán)利要求1-7中任意一項所述的生物素和可選應(yīng)用的EGCG的用途，所述生物素和可選應(yīng)用的EGCG在適于口服的組合物中作為活性成分。9.一種含有生物素和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的組合的口服組合物，其特征在于，生物素與EGCG的比例在1:1至1:5000的范圍內(nèi)。10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，生物素與EGCG的比例在l:3至1:3000的范圍內(nèi)。11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，生物素與EGCG的比例在l:5至1:1000的范圍內(nèi)。全文摘要本發(fā)明涉及生物素優(yōu)選以特定比例組合的生物素和(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)用于預防由日光誘導的皮膚老化(光老化)的用途。文檔編號A61K31/4188GK101678003SQ200880015483公開日2010年3月24日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日發(fā)明者瑞吉納·格勞克澤克,約瑟夫·斯楚瓦格爾申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司