專利名稱：：一種具有抗氧化活性的中藥提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥配制品，具體涉及一種中藥材的提取物。
背景技術(shù)：
：強(qiáng)肌健力方，是我國著名老中醫(yī)鄧鐵濤教授經(jīng)驗(yàn)方，源于金元四大家之一李東垣補(bǔ)中益氣湯。但又有異于原方，不同者有三一是東垣之補(bǔ)中益氣湯用藥分量頗輕；二是東垣立此方，是治療"脾胃之氣下流，使谷氣不得升浮"所致的"氣高而喘，身熱而煩，其脈洪大而頭痛，或渴不止，其皮膚不任風(fēng)寒而生寒熱"之證；三是東垣所立之法"甘溫除大熱"之法。"強(qiáng)肌健力飲"與"補(bǔ)中益氣湯"藥味雖同，但分量各異，以致所主治之病證，所針對(duì)之病機(jī)以及立法組方之旨亦不相同。后人又總結(jié)歷代運(yùn)用補(bǔ)中益氣湯的經(jīng)驗(yàn)，改變了配伍分量成為"補(bǔ)中益氣丸"(炙黃芪200g、黨參60g、炙甘草100g、白術(shù)60g、當(dāng)歸60g、升麻60g、柴胡60g和陳皮60g載《中國藥典》2000年版第一部480頁)。藥典"補(bǔ)中益氣丸"，黃芪與甘草分量最多，且均炙用，黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮分量相等。鄧鐵濤教授根據(jù)張錫純治大氣下陷宜重用生箭黃芪之經(jīng)驗(yàn)，黃芪重用，生用而不用炙，甘草輕用亦不用炙，取其不致甘守太過之意；陳皮輕用以作反佐，取其行氣而無損氣之弊。鄧鐵濤教授治療重癥肌無力重用黃芪，受清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》補(bǔ)陽還五湯之啟發(fā)，該方取"治痿獨(dú)取陽明"之意，重用生黃芪四兩(120克)為主藥，在于救脾胃，主肌肉，充肺氣，主升陷，營衛(wèi)充和，氣血流暢，達(dá)到強(qiáng)肌健力之目的，以之為君；黨參、白術(shù)健脾，當(dāng)歸質(zhì)潤辛溫入血以配參芪，使氣血相生，陰陽相濟(jì)，肌肉得以濡養(yǎng)，以上3藥任臣藥之職；柴胡、升麻升發(fā)脾陽，共為佐藥。陳皮一味以反佐，達(dá)理氣行滯、舒暢氣機(jī)之目的；甘草和中，調(diào)和諸藥，作使藥之用。強(qiáng)肌健力方(也稱為強(qiáng)肌健力系列)包括強(qiáng)肌健力飲、強(qiáng)肌健力膠囊和強(qiáng)肌健力口服液三種劑型。第一種劑型，強(qiáng)肌健力飲，為中藥飲片，需要煎煮，上世紀(jì)50年代開始使用，其配方為黃芪20:黨參6:白術(shù)5:當(dāng)歸4:升麻3:柴胡陳皮i:甘草i。第二種劑型，強(qiáng)肌健力膠囊，1988年開始在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院使用至今，其配方為黃芪84.0Kg，柴胡12.6Kg，白術(shù)21.0Kg，甘草4.2Kg，陳皮4.2Kg，當(dāng)歸16.8Kg，黨參25.2&§，升麻12.6Kg和五爪龍21.0Kg(鄧鐵濤教授強(qiáng)肌健力系列治療重癥肌無力簡(jiǎn)介，載于《理論探討臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究鄧鐵濤基金資助課題論文匯編》廣州廣州中醫(yī)藥大學(xué)鄧鐵濤研究所，2006:90)。第三種劑型，強(qiáng)肌健力口服液。配方為黃芪560克，黨參168克，白術(shù)140克，當(dāng)歸113克，升麻87克，柴胡80克，陳皮28克，甘草28克，山梨酸鉀2克，果葡糖漿50ml，共制成1000ml。該制劑由廣州中醫(yī)學(xué)院花都制藥廠和廣州中醫(yī)學(xué)院中藥與保健開發(fā)研究所共同研制所得，載于"強(qiáng)肌健力飲申報(bào)資料"U994年)項(xiàng)目4"制備工藝及其研究資料"第2頁，2003年獲國家藥監(jiān)局臨床研究批文，批文號(hào)為2003l00874?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究表明，強(qiáng)肌健力方入脾經(jīng)，益氣補(bǔ)脾之力強(qiáng)。在治療與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量水平有關(guān)的疾病中常用強(qiáng)肌健力方與其它藥物進(jìn)行配伍，但普遍存在治療周期長，效果不明顯的缺陷。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中醫(yī)藥領(lǐng)域引入了現(xiàn)代提取方法提取中藥有效成分，以提高藥效和降低副作用。目前，中藥的提取方法主要有氯仿-甲醇超聲提取，乙醇提取和水提取。由于氯仿和甲醇都是有毒性溶劑，因此氯仿-甲醇超聲提取物主要進(jìn)行脂溶性化學(xué)成分分析。乙醇提取物和水提取物為最常用中藥的提取方法，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)強(qiáng)肌健力乙醇提取和水提取物的抗氧化活性較低，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無保護(hù)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗氧化活性的中藥提取物。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是一種具有抗氧化活性的中藥提取物，該提取物是強(qiáng)肌健力方中藥的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色譜具有以下圖譜特征在保留時(shí)間依次為5.30土0.05min、5.80土0.10min和6.55士0.35min處有吸收峰，所述吸收峰的相對(duì)峰面積依次為4.43-10.48%、32.9~56.03%和1.75~2.02%;其中，所述的高效液相色譜條件為-色譜柱DikmaDiamonsiiC185um250X4.6mm;樣品lmg/mL的所述提取物的無水乙醇溶液；進(jìn)樣量20pL;流動(dòng)相體積比為25:70:3:2的水、甲醇、乙腈和thf混合物；流速0.500ml/min;檢測(cè)波長225nm;所述強(qiáng)肌健力方中藥來源于強(qiáng)肌健力口服液，由以下重量份的藥材組成黃芪560，黨參168,白術(shù)140，當(dāng)歸113，升麻87，柴胡80，陳皮28和甘草28。本發(fā)明所述的提取物在常溫(25°C)下為深咖啡色膏體，略有芳香氣味；難溶解于水，易溶于有機(jī)溶劑，在乙醇中溶解量為20mg/ml，氯仿溶解量為50mg/ml，二甲亞砜中溶解量為30mg/ml。本發(fā)明提取物是用乙酸乙酯提取強(qiáng)肌健力方中藥得到的，具體是將強(qiáng)肌健力方中各種藥材粉碎成10~40目的細(xì)粉，加入6~12倍的乙酸乙酯在8090。C下回流提取812小時(shí)，減壓并加熱濃縮去除乙酸乙酯。為了得到效果更好的提取物，在乙酸乙酯提取前或提取后還可以用堿液皂化法、酶解法或有機(jī)溶劑浸提法脫脂；為了盡量保護(hù)強(qiáng)肌健力方中藥材有效成分不受破壞，我們推薦用有機(jī)溶劑法脫脂，具體方法是用強(qiáng)肌健力方藥粉質(zhì)暴612倍的有機(jī)溶劑在809(TC下回流提取812小時(shí)，除去有機(jī)溶劑提取物，所述的有機(jī)溶劑可以是石油醚、乙醚或異丙醇等弱極性溶劑。上述方法中，用乙酸乙酯提取的溫度優(yōu)選87X:，時(shí)間優(yōu)選12小時(shí)。上述方法所得的提取物還可以用硅膠柱層析純化，具體方法為將本發(fā)明提取物上硅膠層析柱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫2次，取洗脫液蒸發(fā)濃縮成無色蠟狀固體即可；所述的梯度洗脫的程序?yàn)槭兔训挠昧繌?00%按1%遞減至0，乙酸乙酯的用量相應(yīng)遞增。本發(fā)明提取物制備方法中所述的固體與液體之間的比例為重量/體積比(本領(lǐng)域的習(xí)慣做法)，即固體為重量單位，液體為體積單位。本發(fā)明所述的提取物的鑒定方法為將所得提取物用無水乙醇(分析純)溶解，配成lmg/mL濃度，并用濾膜(0.45Pm)過濾后，在以水、甲醇、乙腈和THF(體積比為25:70:3:2)為流動(dòng)相，波長為225nm，色譜柱為DikmaDiamonsilC185um250X4.6mm，進(jìn)樣量為20uL，流速為0.500ml/min的條件下進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)。本發(fā)明提取物對(duì)ABTS自由基和過氧自由基具有很好的清除作用，還可抑制脂質(zhì)過氧化，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。已有不少研究指出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞損傷可能是由氧化損傷造成，本發(fā)明提取物的藥理實(shí)驗(yàn)也證明本發(fā)明提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有保護(hù)作用，因此，本發(fā)明提取物可用于制備保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物。本發(fā)明提取物可加入藥學(xué)上可接受的輔料制備成各種常規(guī)劑型，如片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液等，其中以膠囊劑為佳。經(jīng)硅膠柱層析純化后還可以制備成注射劑。以下通過藥理試驗(yàn)及其結(jié)果來說明本發(fā)明具有的技術(shù)效果。一、不同溶劑的強(qiáng)肌健力方中藥提取物的比較1、各種提取物的制備本發(fā)明提取物(即乙酸乙酯提取物)按實(shí)施例2方法制備。石油醚提取物用強(qiáng)肌健力方藥粉質(zhì)量6-12倍的石油醚在85'C下回流提取12小時(shí)后除去石油醚。無水乙醇提物用強(qiáng)肌健力方藥粉質(zhì)量6-12倍的無水乙醇在92'C下回流提取12小時(shí)后除去無水乙醇，即得。95%乙醇提取物用強(qiáng)肌健力方藥粉質(zhì)量6-12倍的95乙醇在95。C下回流提取12小時(shí)后除去95乙醇。水提物:用強(qiáng)肌健力方藥粉質(zhì)量6-12倍的蒸餾水在IO(TC下回流提取12小時(shí)后除去水份。2、各種提取物中總酚含量的測(cè)定測(cè)量方法參照2005年《藥典》(《中華人民共和國藥典》2005版，第一部，附錄XB):將上述五種提取物用相應(yīng)的溶劑溶解配成1mg/mL溶液。各取樣品液200tiL，補(bǔ)加200nL95乙醇。置于試管內(nèi)，加入500uL0.25molZL的Folin-Ciocalteu試劑，充分混合，靜置3min。再加lmL15。/()Na2C03溶液，充分混合，靜置30min?；旌弦河?.45uM的微孔濾膜過濾，在760nm處測(cè)A值，以15°/^32<:03溶液為空白。以連苯三酚為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖1所示。3、結(jié)果表l強(qiáng)肌健力各提取物的總酚含量(％，以連苯三酚計(jì)，n=3,Mean±SD)提取溶劑石油醚乙酸乙酯無水乙醇95%乙醇水含量(％)1.786±0.09568.813±0.1933.8610.2571.932±0.02681.634±0.162結(jié)果如表1所示，強(qiáng)肌健力飲原藥材用六種不同的溶劑提取，以乙酸乙酯提取物中的總酚含量最高。以下藥效實(shí)驗(yàn)中所用的石油醚提取物、乙醇提取物、水提物和本發(fā)明提取物均按上述實(shí)驗(yàn)一(即不同溶劑的強(qiáng)肌健力方中藥提取物的比較)中方法制備。二、抗氧化活性研究1對(duì)DPPH自由基的清除能力DPPH實(shí)際上是以自由基DPPH的形式存在的，所以，有個(gè)單電子，在519nm有強(qiáng)吸收，其乙醇水溶液呈很深的藍(lán)紫色，加入受試物后，在519nm處可以監(jiān)測(cè)DPPH'被清除的效果，這種效果通常用對(duì)DPPH的抑制率來表示。顯然，抑制率越大，DPPH自由基清除越徹底，受試物的抗氧化性越強(qiáng)。(BloisM.，1958.Antioxidantdeterminationsbytheuseofastablefreeradical.Nature181，Letter,1199-1200.)本文依據(jù)Brand-Williams法進(jìn)行檢湖!KBrand-Wi出ams,W.,Cuvelier，M.E.&BersetC.,1995.Useofafreeradicalmethodtoevaluateantioxidantactivity.Lebensmittel-WissenschaftundTechnologies28，25-30.):將實(shí)驗(yàn)一中各提取物配成濃度為5mg/mL的樣品液，除水提物外用水做溶劑外，其余均用DMSO作溶齊iJ。取樣品液4,10，20，30，40，50"L，加入到l.OmLDPPH測(cè)試液(0.1mmol/L)中，補(bǔ)加95%乙醇，使總反應(yīng)體積為1.5mL。充分振搖，靜置30分鐘，測(cè)各反應(yīng)液的A值(519nm)，以95乙醇為空白。依據(jù)下式計(jì)算抑制率抑制率-[l-(A-A樣)/A0]X100%。其中AO-未加樣的DPPH溶液的吸光度；A-加樣后DPPH溶液的吸光度；A樣-樣品液自身的吸光度。公式中引入A樣是為了消除樣品液本身顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果如下(表2)表2強(qiáng)肌健力飲各提取物對(duì)DPPH的抑制率(％，n=3，Mean土SD，GSH為陽性對(duì)照組)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從結(jié)果可以看出強(qiáng)肌健力飲的各提取物中，以本發(fā)明提取物清除DPPH自由基能力最強(qiáng)。2對(duì)ABTS自由基的清除能力ABTS'+自由基是由ABTS[2，2，-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulf^nicacid)]即[2，2'墨聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]，經(jīng)活性氧氧化后生成的穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基，向其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS'十發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。根據(jù)褪色程度來判斷該物質(zhì)對(duì)ABTS'+的清除能力[5]。(ReR.，PellegriniN.,ProteggenteA.，PannalaA.，etal,1999.AntioxidantactivityapplyinganimprovedABTSradicalcationdecolorizationassay.FreeRadicalBiology&Medicine26,1231-1237.)，從清除體夕卜自由基的角度反映樣品的抗氧化能力。7.4mmol/LABTS儲(chǔ)備液和2.6mmol/LK2S208儲(chǔ)備液各取0.55mL等體積混合，在室溫，避光條件下放置12小時(shí)，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。使用前加入無水乙醇約43mL稀釋成ABTS.+工作液，要求在3(TC,734nm波長下的吸光度為1.10±0.02。將已經(jīng)配制好的各提取物母液用無水乙醇(水提物用蒸餾水)稀釋成不同濃度的測(cè)試液0.3mL，然后在相應(yīng)試管中分別加入1.2mL的ABTS.+工作液，充分混合后，避光，室溫下放置2小時(shí)。以無水乙醇為空白，在734nm波長下測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照。最后結(jié)果取3組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。抑制率的計(jì)算公式抑制率二(Ao-A)AV1100。/。，其中A0為未加樣品的ABTS+溶液的吸光度；A為樣品與ABTS+反應(yīng)后的吸光度。結(jié)果如表3所示。表3強(qiáng)肌健力飲各提取物對(duì)ABTS'+的抑制率(％，n=3，Mean土SD，Trolox為陽性對(duì)照組)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表3可以看出，本發(fā)明提取物對(duì)ABTS+有很好的清除作用。3總還原能力總還原能力常用于反映樣品的抗氧化活性強(qiáng)弱，該法依據(jù)Oyaizu法W(Oyaizu，M.，1986.Studiesonproductofbrowningreactionpreparedfromglucoseamine.Jpn.J.Nutr.44，307-315.)強(qiáng)肌健力飲各提取物，除水液外，其余均用DMSO作溶劑，濃度為10mg/mL。各提取物依次取0.05,0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，l.OmL，加入到磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)中'并使總體積為3.5mL,再加入2.5mLK3Fe(CN)6溶液(lg/100mL)，充分混合后，于5(TC水浴20min，充分反應(yīng)。然后，加入2.5mL三氯乙酸溶液(10g/100mL)終止反應(yīng)。以2500g/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水、2.5mLFeCl3溶液(0.1g/100mL),充分混合，并開始計(jì)時(shí)，在90s時(shí)，于700nm處測(cè)A值。A值越大，提示相對(duì)總還原能力越強(qiáng)。結(jié)果如表4所示。表4強(qiáng)肌健力飲各提取物總還原能力(A7Mnm，n=3,mean土SD，GSH為陽性對(duì)照組)濃度陽性對(duì)照組石油醚乙酸乙酯無水乙醇95乙醇提取水提物mg/mLGSH提取物提取物提取物物0.0830.55±0.0170.55±0.015O.IO士O.OO0.42±0.0210.54±0.0280.074±0.00630.1671.08±0.0210.53±0.0320.11±0.00400.45±0.01870.54±0.0160.166±0.0210.331.96±0.0750.62±0.0160.26±0.0340.57±0.00950.66±0.0230.26±0.00780.502.47±0.0430.59±0.0390.39±0.0130.67±0駕0.69±0.0140.38±0細(xì)0.672.5±0.000.67±0.0250.58±0.0950.74±0.0120.80±0.0390.49±0.00901.002.5±0.000.68±0.00941.07±0.180.93±0.0230.92±0.0500.73±0.00691.332.5±0.000.84±0扁1.17±0.001.06±0.0641.13±0.0670.96±0.0201.672.5±0.000.88±0.001.34±0.0711.24±0細(xì)1.27±0.0601.19±0.027從以上結(jié)果可以看出，強(qiáng)肌健力飲各種提取物中，以本發(fā)明提取物的總還原能力最強(qiáng)。4清除過氧自由基(*02)能力過氧自由基(*o2)是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的一種常見的自由基，能誘發(fā)機(jī)體疾病及衰老。本文采用連苯三酚自氧化法測(cè)定清除過氧自由基(02)能力[2](MarklundS，MarklundG1974.Involvementofthesuperoxideanionradicalintheautoxidationofpyrogallolandconvenientassayforsuperoxidedismutase.Eur.J.Biochem47,469-474).連苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化生成過氧自由基(*02)，同時(shí)，生成半醌。由于半醌在A325nm處有吸收，因此，可以通過檢測(cè)入325nm處的A值的增大速率(AA/厶t)來衡量樣品的清除過氧自由基(《02)能力。將各提取物配成lmg/mL,分別取50、100、200、300、400、500nL，加入到Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH8.2，含lmmol/LEDTA)中，并使總反應(yīng)體積為1475"。再加25yL連苯三酚溶液(6mmol/L，溶于10mmol/L鹽酸溶液中)，迅速混合，開始計(jì)時(shí)。在分光光度計(jì)325nm處測(cè)A值，以Tris-HCl緩沖液為空白。從60秒開始讀數(shù)，此后，每隔30秒讀數(shù)一次，到300秒為止。以A值的增加速率(AA/厶t)衡量抗氧化活性，AA/At值越小，表明樣品抑制連苯三酚自氧化效果越強(qiáng)。抑制率依下式計(jì)算(式中，當(dāng)取樣量為0yL時(shí)，即為對(duì)照組。)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>表5強(qiáng)肌健力飲各提取物清除過氧自由基02能力(％，n=3,Mean±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從以上結(jié)果可以看出，強(qiáng)肌健力飲各種提取物中，以乙酸乙酯提取物的清除過氧自由基*02能力最強(qiáng)。5清除脂質(zhì)過氧化能力脂質(zhì)過氧化也是機(jī)體內(nèi)常見的氧化損傷形式，它可以影響細(xì)胞，人類的許多重大疾病都與之有關(guān)[8]。(Sevanian,A.，Ursini,F.，2000.Lipidperoxidationinmembranesandlowdensitylipoproteins:similaritiesanddifferences.FreeRadicalBiol.Med.29，306-311.本文所采用的方法依據(jù)文獻(xiàn)[9]略作修改(SiddhurajuP.，2006.AntioxidantactivityofpolyphenoliccompoundsextractedfromdefattedrawanddryheatedTamarindusindicaseedcoat.LWT，doi:10.1016/j.lwt2006.07.010.):取312.6mg亞油酸和78.2mgTween20加入到20mL30o/o(v/v)乙醇中，充分混合搖勻，得亞油酸乳液。在1.5mL亞油酸乳液中，加入各種濃度的樣品液0.1mL，并用蒸餾水調(diào)至總體積2.0mL。該混合液置于敞口玻璃中，室溫反應(yīng)72小時(shí)后，取出0.15mL置于試管內(nèi)。依次加入3.65mL75%(V/V)乙醇、0.1mLNH4SCN(30g/100mL)、O.lmLFeS04(0.02moI/L溶于3.6%HC1中)，混合。3分鐘后，在500nm處測(cè)A值，以75%乙醇為空白(Unico2100分光光度計(jì)，上海)。計(jì)算公式-脂質(zhì)過氧化的抑制率二(1—A艦/Ao)X100%式中，A樣品-加樣時(shí)的A值；A^樣品量為0"L的A值。表6強(qiáng)肌健力飲各提取物清除過氧白由基.02能力(。/。,n-3，Mean土SD,GSH為對(duì)照組)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果如表6所示，本發(fā)明提取物對(duì)過氧自由基02具有很好的清除能力。三、本發(fā)明提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)作用1、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化試劑低糖DMEM(L-DMEM)、Percoll和胎牛血清(FBS)為GIBCOL公司產(chǎn)品，抗體免抗CD34、CD44、CD45、生物素化二抗(羊抗兔)、SABC、DAB染色試劑盒均購自武漢博士德公司。MTT為SIGMA公司產(chǎn)品。清潔級(jí)SD大鼠10只，220-250g，雌性，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(粵檢證字2005A0I0號(hào))。2、MSC分離、擴(kuò)增與鑒定將大鼠骨髓用L-DMEM沖出，充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，300g離心10分鐘，去上清，D-Hanks重懸，離心去上清后，加4mLD-Hanks混勻。Percoll貯存液按0.56:0.44混合，取4mL放入10mL離心管內(nèi)，吸骨髓液在離液面2cm處貼管壁緩緩加入。水平離心機(jī)900g離心30分鐘，收集單核細(xì)胞層，用DMEM洗滌兩次。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整密度，按lxl06/cm2密度接種,37'C，5。/。飽和濕度的C02孵箱培養(yǎng),培養(yǎng)液為含10%FBS的L-DMEM,3d后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞,2-3天換液1次,接近融合的MSC用含0.25%胰酶室溫消化2-3分鐘，按lxl04/cm2傳代，傳至第3代得到lxl07/cm2個(gè)細(xì)胞。將部分MSC接種至含蓋片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，滴加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，2小時(shí)后細(xì)胞處于貼壁未分化狀態(tài)，取出蓋片做Brdu,CD44免疫組化及兩者結(jié)合的免疫組化雙重染色。3、H202損傷MSC模型傳3代MSC分為對(duì)照組、H202損傷組、本發(fā)明提取物組、石油醚提取物組、無水乙醇提取物組、95%乙醇提取物組和水提物組。對(duì)照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；11202損傷組在含10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加H202損傷；本發(fā)明提取物組、石油醚提取物組、無水乙醇提取物組、95%乙醇提取物組和水提物組MSC經(jīng)H202損傷3小時(shí)后，換分別含有不同濃度的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、無水乙醇提取物、95%乙醇提取物和水提取物的培養(yǎng)液。上述7組在作用24小時(shí)后分別MTT法檢測(cè)。含各種提取物的培養(yǎng)液的配制將所述4提取物分別稱取30mg，乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、無水乙醇提取物、95%乙醇提取物分別溶于lml二甲亞礬中，水提物溶于lml蒸餾水中，得到不同溶劑提取物供試液各30mg/ml。4、MTT法測(cè)細(xì)胞活性MTT法原理是活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。因此，MTT光吸收值，反應(yīng)了活細(xì)胞數(shù)量多少。制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl05/mL,接種于96孔板，每孔20(HiL。每孔加入MTT(5mg/mL)20pL，MSC37。C孵育4小時(shí),棄上清。每孔加入二甲基亞砜150pL，振搖10分鐘，于4卯nm波長測(cè)光吸收值(A)。5、結(jié)果由表7可見，H202損傷組細(xì)胞吸光值明顯減少，與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P〈0.01)，說明H202損傷MSC模型造模成功；隨乙酸乙酯提取物濃度的增大，細(xì)胞吸光值逐漸增高，與對(duì)照組和與H202損傷組比較，差別有顯著性(PO.Ol)。乙酸乙酯提取物以濃度依賴方式對(duì)11202損傷MSC具有修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，石油醚提取物、乙醇提取物和水提取物對(duì)H202損傷MSC修復(fù)作用無影響。研究結(jié)果表明本發(fā)明提取物對(duì)H2Cb損傷MSC具有保護(hù)作用。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>11近代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明谷胱甘肽為(GSH)作用強(qiáng)的抗氧化劑，因此本發(fā)明選用GSH為陽性對(duì)照與本發(fā)明提取物作用比較，結(jié)果表明本發(fā)明提取物比GSH作用強(qiáng)。以上結(jié)果提示本發(fā)明提取物具有進(jìn)一步研發(fā)新型對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)作用藥物的潛力，并且可能獲得比傳統(tǒng)抗氧化劑更好的效果。圖1是以連苯三酚為對(duì)照品繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2是實(shí)施例1所得提取物的氣相色譜-質(zhì)譜圖圖3是實(shí)施例2所述提取物的高效液相圖譜。圖4是實(shí)施例2所述提取物的氣相色譜-質(zhì)譜圖。圖5是實(shí)施例3所述提取物的高效液相圖譜。圖6是實(shí)施例4所述提取物的高效液相圖譜。具體實(shí)施方式例l一、本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過20目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、有效部位的提取取40g強(qiáng)肌健力細(xì)粉用250ml乙酸乙酯(分析純)加熱至90°C繼續(xù)回流提取12小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀提取物。二、所得提取物的鑒定將所得到的咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物經(jīng)硅膠柱層析，1%梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無色蠟狀固體，然后按以下方法(氣相色譜-質(zhì)譜方法)標(biāo)定取強(qiáng)肌乙酸乙酯的提取物(凝固狀)18.3mg溶于330mg四氫呋喃(THF,色譜純，迪馬公司)中，并用濾膜(0.45ym)過濾后，在下述條件進(jìn)行GC/MS檢測(cè)氣相色譜條件分離采用DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30mXO.25mmi.d.)，載氣為氦氣，分流比為1/10，進(jìn)樣口溫度為280。C;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0°C，以8。C/min升至280'C，保留20min;質(zhì)譜條件EI源，離子源溫度250'C,轟擊電子能量70eV,電子倍增器電壓1.7kV,質(zhì)量掃描范圍28400amu。進(jìn)樣量lpL;儀器Agilent5973NGC/MSD。結(jié)果如圖6所示，1號(hào)峰(14.8min)和2號(hào)峰(16.8min)為非典型峰,因?yàn)樾盘?hào)太弱；3實(shí)施例2一、本發(fā)明提取物制備-1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過20目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、脫脂取40g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加250ml石油醚(分析純)，加熱至50。C，回流提取12小時(shí)，去除石油醚提取部位。3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?50ml乙酸乙酯(分析純)加熱至90°C繼續(xù)回流提取12小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀提取物0.4g。二、所得提取物的鑒定1、高效液相色譜分析將所得提取物用無水乙醇(分析純)溶解，配成lmg/mL濃度，并用濾膜(0.45nm)過濾后，進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)。洗脫條件為水甲醇乙腈THF=25:70:3:2。檢測(cè)所用的儀器是高效液相儀DIONEXsummitP680(單泵)，檢測(cè)器UVD-170，波長250nm;色譜柱DikmaDiamonsilC185um250X4.6mm;進(jìn)樣量20uL;流速0.500mL/min。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，所得提取物特有的主要吸收峰為1號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.307min，相對(duì)峰面積Rel.Area為5.99%;2號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.898min，相對(duì)峰面積Rel.Area為48.52%;3號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為6.270min,相對(duì)峰面積Rel.Area為2.02%。2、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物經(jīng)硅膠柱層析，1%梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無色蠟狀固體，然后使用氣相色譜-質(zhì)譜方法標(biāo)定(具體方法同例1)，結(jié)果如圖3和表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三、本發(fā)明提取物注射液(Injectio)的制備本品為中藥強(qiáng)肌健力經(jīng)提取有效成分制成的無菌水溶液。2ral相當(dāng)于強(qiáng)肌健力有效成分10tng。1、精制將所得到的咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物經(jīng)硅膠柱層析，1%梯度石油醚_乙酸乙酯洗脫2次，得無色蠟狀固體，即為本發(fā)明提取物精制品。2、處方本發(fā)明提取物精制品500mg，1,2丙二醇20ml，吐溫_802ml。制成注射液100ml。3、制法取本發(fā)明提取物精制品(無色蠟狀固體)500mg，加1,2丙二醇20ml溶解，振搖使強(qiáng)肌健力精制有效成分完全溶解，再加注射用水至100ml。然后，加活性碳0.5%(V/V)，充分?jǐn)嚢?，過濾，最后以G3重熔玻璃漏斗過濾，灌封，IOO'C流通蒸氣滅菌30min，即得。四、本發(fā)明提取物注射液的使用方法肌肉注射和穴位注射，首次4ml，以后每次2ml，一日1-2次。實(shí)施例3一、本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力藥物進(jìn)行粉碎，過40目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、脫脂取60g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加500ml石油醚(分析純)，加熱至50t，回流提取10小時(shí)，去除石油醚提取部位。3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?00ml乙酸乙酯(分析純)加熱至70t繼續(xù)回流提取10小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物0.6g。二、所得提取物的鑒定1、高效液相色譜分析將所得提取物用無水乙醇(分析純)溶解，配成lmg/mL濃度，并用濾膜(0.45ym)過濾后，進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)。洗脫條件為水甲醇乙腈THF=25:70:3:2。檢測(cè)所用的儀器是高效液相儀DIONEXsummitP680(單泵)，檢測(cè)器UVD-170，波長275nm;色譜柱DikmaDiamonsilC185um250X4.6mm;進(jìn)樣量20uL:流速0.500mL/min。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,所得提取物特有的主要吸收峰為1號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.266min,相對(duì)峰面積Rel.Area為10.48%;2號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.746min，相對(duì)峰面積Rel.Area為32.9%;3號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為6.591min,相對(duì)峰面積Rel.Area為1.75%。2、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物經(jīng)硅膠柱層析，1%梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫2次，得無色蠟狀固體，然后使用氣相色譜-質(zhì)譜方法標(biāo)定(具體方法同例1)，所述提取物中含有十四碳羧酸5.5%、十六碳羧酸10.36%、十八碳羧酸14.33%,十六碳羧酸甲酯16.80%、十六碳羧酸乙酯10.8%、十八碳羧酸乙酯7.00%、十八碳-9-烯羧酸甲酯14.00%、多酚8.11%，3-膽甾醇6.64%，3,5二膽甾烯3.01%。三、本發(fā)明提取物膠囊(C邵sulae)的制備處方咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物250mg，碳酸鈣45mg，淀粉5mg。每個(gè)膠囊重300mg。制法將碳酸鈣與淀粉混勻，過篩，再與適量乙醇稀釋的浸膏混合，過120目篩，于60-70'C烘干2h，裝膠囊。四、本發(fā)明提取物膠囊的使用方法常用量每日l次，每次l-2粒，4周為一療程，可再服兩個(gè)療程，藥量可酌減。例4一、本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過10目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、脫脂取60g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加600ml石油醚(分析純)，加熱至70"C，回流提取8小時(shí)，去除石油醚提取部位。3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?00ml乙酸乙酯(分析純)加熱至80°C繼續(xù)回流提取8小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物0.6g。二、所得提取物的鑒定1、高效液相色譜分析將所得提取物用無水乙醇(分析純)溶解，配成lmg/mL濃度，并用濾膜(0.45iim)過濾后，進(jìn)行高效液相HPLC檢測(cè)。洗脫條件為水甲醇乙腈THF=25:70:3:2。檢測(cè)所用的儀器是高效液相儀DIONEXsummitP680(單泵)，檢測(cè)器UVD-170，波長300腦；色譜柱DikmaDiamonsilC185um250X4.6mm;進(jìn)樣量20uL;流速0.500mL/min。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,所得提取物特有的主要吸收峰為1號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.304min,相對(duì)峰面積Rel.Area為4.43%;2號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為5.887min，相對(duì)峰面積Rel.Area為56.03%;3號(hào)峰保留時(shí)間Ret.Time為6.235min，相對(duì)峰面積Rel.Area為1.80%。2、化學(xué)成份分析將所得到的咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物經(jīng)硅膠柱層析，1%梯度石油醚-乙酸乙酯洗脫1次，得無色蠟狀固體，然后使用氣相色譜-質(zhì)譜方法標(biāo)定(具體方法同例1),所述提取物中含有十四碳羧酸2.5%、十六碳羧酸13.36%、十八碳羧酸7.33%，十六碳羧酸甲酯15.60%、十六碳羧酸乙酯9.36%、十八碳羧酸乙酯6.50%、十八碳-9-烯羧酸甲酯13.00%、多酚7.53%，3-膽甾醇3.64%，3，5二膽甾烯2.4%。三、本發(fā)明提取物片劑(Tablet)的制備處方咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物400mg，碳酸鈣90mg,淀粉10mg。每片重500mg。制法將碳酸鈣與淀粉混勻，過篩，再與適量乙醇稀釋的浸膏混合，過90目篩，于60-70'C烘干，壓片。四、本發(fā)明提取物片劑的使用方法作用與用途本品有促進(jìn)MSC生長和促進(jìn)MSC作用，主要用于治療骨病、再障和神經(jīng)疾病，腫瘤化療后骨髓保護(hù)。用法與用量常用量每曰l次，每次1-2片，4周為一療程，可再服兩個(gè)療程，藥量可酌減。例5本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過10目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、有效部位的提取取60g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，720ml乙酸乙酯(分析純)加熱至80°C繼續(xù)回流提取8小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯。3、脫脂將步驟2所得的提取物裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加720ml石油醚(分析純)，加熱至70。C，回流提取12小時(shí)，去除石油醚提取部位，得到咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物。例6本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過10目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、有效部位的提取取60g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，720ml乙酸乙酯(分析純)加熱至80°C繼續(xù)回流提取8小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀強(qiáng)肌健力提取物。3、脫脂將步驟2所得的提取物裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加720ml乙醚(分析純)，加熱至70t，回流提取8小時(shí)，去除乙醚提取部位。例7本發(fā)明提取物制備1、粉碎采用萬能磨粉機(jī)將強(qiáng)肌健力進(jìn)行粉碎，過20目篩為所需強(qiáng)肌健力細(xì)粉。2、脫脂取40g強(qiáng)肌健力細(xì)粉，裝入濾筒中，然后放入索氏提取器內(nèi)，加250ml異丙醇(分析純)，加熱至90'C，回流提取12小時(shí)，去除異丙醇提取部位。3、有效部位的提取將經(jīng)石油醚提取除雜后的殘?jiān)?50ml乙酸乙酯(分析純)加熱至87°C繼續(xù)回流提取12小時(shí)，然后減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到咖啡色膏狀提取物。權(quán)利要求1、一種具有抗氧化活性的中藥提取物，該提取物是強(qiáng)肌健力方中藥的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色譜具有以下圖譜特征在保留時(shí)間依次為5.30±0.05min、5.80±0.10min和6.55±0.35min處有吸收峰，所述吸收峰的相對(duì)峰面積依次為4.43～10.48％、32.9～56.03％和1.75～2.02％；其中，所述的高效液相色譜條件為色譜柱DikmaDiamonsilC185um250×4.6mm；樣品1mg/mL的所述提取物的無水乙醇溶液；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相體積比為25∶70∶3∶2的水、甲醇、乙腈和THF混合物；流速0.500ml/min；檢測(cè)波長225nm；所述強(qiáng)肌健力方中藥由以下重量份的藥材組成黃芪560，黨參168，白術(shù)140，當(dāng)歸113，升麻87，柴胡80，陳皮28和甘草28。2、權(quán)利要求1所述的提取物的制備方法，該方法包括以下步驟(1)粉碎將強(qiáng)肌健力方中各種藥材粉碎成1040目的細(xì)粉；(2)提取剩下的藥渣加入612倍的乙酸乙酯在809(TC下回流提取812小時(shí)，減壓并加熱濃縮去除乙酸乙酯即可。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于用乙酸乙酯提取的溫度為87t:，時(shí)間為12小時(shí)。4、如權(quán)利要求2或3所述的提取物的制備方法，其特征在于該方法還包括一個(gè)在步驟(2)前或步驟(2)后進(jìn)行的脫脂步驟，該步驟為用612倍的有機(jī)溶劑在809(TC下回流提取812小時(shí)，棄去有機(jī)溶劑提取物；其中所述的有機(jī)溶劑為石油醚、乙醚或異丙醇。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于該方法還包括以下步驟將所得提取物上硅膠層析柱，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫2次，取洗脫液蒸發(fā)濃縮成無色蠟狀固體即可；所述的梯度洗脫的程序?yàn)槭兔训挠昧繌?00%按1%遞減至0，乙酸乙酯的用量相應(yīng)遞增。6、權(quán)利要求1所述提取物在制備保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。7、一種保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物，該藥物由權(quán)利要求1所述的提取物和藥學(xué)上可接受的輔料組成。全文摘要本發(fā)明提供了一種具有抗氧化活性的中藥提取物，該提取物是強(qiáng)肌健力方中藥的乙酸乙酯提取物，所述的乙酸乙酯提取物的高效液相色譜具有以下圖譜特征在保留時(shí)間依次為5.30±0.05min、5.80±0.10min和6.55±0.35min處有吸收峰，吸收峰的相對(duì)峰面積依次為4.43～10.48％、32.9～56.03％和1.75～2.02％；其中，所述的高效液相色譜條件為色譜柱DikmaDiamonsilC185um250×4.6mm；樣品1mg/mL的所述提取物的無水乙醇溶液；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相體積比為25∶70∶3∶2的水、甲醇、乙腈和THF混合物；流速0.500ml/min；檢測(cè)波長225nm。本發(fā)明所述提取具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有保護(hù)作用，可用于制備保護(hù)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的藥物。文檔編號(hào)A61K36/752GK101380382SQ200810199198公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月16日優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日發(fā)明者劉小斌,周健洪,徐志偉,李熙燦,鄧鐵濤,陳東風(fēng)申請(qǐng)人:廣州中醫(yī)藥大學(xué)