專利名稱：包覆有可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和分化的包衣的醫(yī)療裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及供植入軀體的血管或空腔器官的各種醫(yī)療裝置(medical device)。具 體來說，本發(fā)明涉及置于腔內(nèi)的，其表面與血液直接接觸的各種人造的醫(yī)療裝置， 例如，各種包有包衣的移植片固定模(stent)、移植片固定模移植物(stent graft)、 合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管以及血管修補(bǔ)篩(vascular prosthetic filter) 等類醫(yī)療裝置。植入的醫(yī)療裝置上的的包衣材料，具有促進(jìn)祖代內(nèi)皮細(xì)胞在該植入 的醫(yī)療裝置的表面黏附、生長和分化的作用，并可形成功能性內(nèi)皮細(xì)胞層，從而抑 制在植入部位的血管和器官的內(nèi)膜增殖過程。
背景技術(shù)：
動(dòng)脈粥樣硬化癥是當(dāng)今世界上人類死亡和喪失能力的主要原因之一。動(dòng)脈粥樣硬 化癥的起因，與動(dòng)脈的內(nèi)腔表面有脂肪性蝕斑沉積相關(guān)。這類脂肪性蝕斑的沉積作 用可引起動(dòng)脈管的橫徑狹。這類沉積作用最終會(huì)造成在病變部位遠(yuǎn)端的血行受阻， 而導(dǎo)致受該動(dòng)脈供血的組織發(fā)生缺血性損害。
心冠動(dòng)脈是為心臟供血的。在美國，心冠動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥(CAD)是最為常 見的嚴(yán)重威脅生命的一種慢性疾病，受其侵害的人群可達(dá)1100萬人。心冠動(dòng)脈粥樣 硬化癥造成的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)損失，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他大多數(shù)疾病。心冠動(dòng)脈內(nèi)腔狹窄對 于心臟肌肉的損害作用，首先是發(fā)生心絞痛，并繼以心肌梗死，最后導(dǎo)致死亡。在 美國，每年發(fā)生心肌梗死形成的患者人數(shù)，要高達(dá)150萬例。這類患者中有60萬人 (或40%)是罹患急性心肌梗死形成，這類患者中有30萬人以上都是在抵達(dá)醫(yī)院之前就己經(jīng)死亡。(Harrison氏內(nèi)科醫(yī)學(xué)原理，第14版，1998)。
對于心冠動(dòng)脈粥樣硬化癥，能夠采用經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)心冠氣囊血管成形術(shù) (PTCA)進(jìn)行治療。在美國，每年要施行這種經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)心冠氣囊血管成形 術(shù)的矯治程序，可達(dá)40萬例。這種經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)心冠氣囊血管成形術(shù)的矯治 程序的操作，是將氣囊導(dǎo)管插入一條外周動(dòng)脈管內(nèi)，順著動(dòng)脈系統(tǒng)探索進(jìn)入受阻的 心冠動(dòng)脈部位。然后使氣囊膨脹，將該段動(dòng)脈管撐開，趟平阻塞該處的脂肪性蝕斑 塊，從而增加該受損動(dòng)脈管截面積的血液流量。然而，這種治療方法往往并不能使 受損的心冠動(dòng)脈管持久地維持開張狀態(tài)。在接受經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)心冠氣囊血管 成形術(shù)治療的患者中，在6個(gè)月之內(nèi)，為了矯治心冠動(dòng)脈再狹窄問題而需要重復(fù)施 治的病例，竟可高達(dá)50%。這種在施行經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)心冠氣囊血管成形術(shù)之后 再度發(fā)生狹窄的問題，在醫(yī)學(xué)上就稱之為再狹窄癥。在急性的再狹窄癥方面，血管 會(huì)重新纏巻收縮。隨后，發(fā)生纏巻收縮的血管的中層平滑肌細(xì)胞，對于施行氣囊矯 治程序的動(dòng)脈管部位所引起損傷發(fā)生反應(yīng)而增殖。平滑肌細(xì)胞的增殖部分地是由損 傷部位釋放的各種炎性因子所介導(dǎo)的。這類炎性因子包括，凝血嗯烷A2、血小板衍 生生長因子(PDGF)以及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)現(xiàn)已開發(fā)了多種不同的技術(shù)來克 服這種再狹窄癥問題。包括對于患者采用各種藥物或器械(利用移植片固定模)施行 治療。(Harrison氏內(nèi)科醫(yī)學(xué)原理，第14版，1998)。
在用于制服再狹窄癥的各種治療程序方面，已經(jīng)證明移植片固定模是最為有效的 一種。這類移植片固定模，是可安置在受侵害的血管段內(nèi)，使該處的血管內(nèi)腔保持 正常狀態(tài)的一種金屬支架。在受侵害的血管段內(nèi)放置這種移植片固定模，就可防止 該動(dòng)脈段發(fā)生纏巻而形成封閉狀態(tài)。移植片固定模還可防止該動(dòng)脈管段沿著中層組 織發(fā)生局部開裂。移植片固定?？墒箘?dòng)脈管腔保持大于單獨(dú)采用經(jīng)由皮下的血管腔 內(nèi)心冠氣囊血管成形術(shù)所形成的管腔，從而可減少再狹窄癥多達(dá)30%。但是，盡管獲 得這樣的成功，這種移植片固定模仍然未能完全消除再狹窄癥。(Suryapranata等， 1998。對于選擇的若干急性心肌梗死形成患者的冠心動(dòng)脈部位使用移植片固定模與 血管腔內(nèi)心冠氣囊血管成形術(shù)的隨機(jī)性比較。循環(huán)系統(tǒng)97:2502-2502)。
動(dòng)脈管狹窄問題，也可在心冠動(dòng)脈之外的其他血管部位發(fā)生。其中包括腹主動(dòng)脈 與骼動(dòng)脈、下腹股溝動(dòng)脈、遠(yuǎn)側(cè)深股動(dòng)脈、遠(yuǎn)側(cè)胭動(dòng)脈、脛動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈以及 腸系膜動(dòng)脈等。外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥(PAD)的流行情況，與受侵害的具體解剖 部位，以及對于阻塞部位采用的診斷判定標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)。在傳統(tǒng)上，醫(yī)師都是采用間歇 性跛行測試方法，來判定是否存在外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥。不過，這種方法有可能過于低估人群中的實(shí)際發(fā)病情況。這類外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥的發(fā)病率是 隨年齡而變動(dòng)的，在老齡人群中，外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥的發(fā)病率是逐漸增長 的。據(jù)來自美國國家醫(yī)院流量調(diào)查的數(shù)據(jù)估計(jì)，每年首次記錄的診斷為慢性外周動(dòng)
脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥病例，男性有55，000例，女性有44,000例；而首次記錄的診 斷為急性外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥病例，則有男性60， 000例和女性50， 000例。 其中有91%的急性外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥病例都是侵害下肢部位。在外周動(dòng)脈 的動(dòng)脈粥樣硬化癥(PAD)患者中，伴發(fā)冠心動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥(CAD)的比率可能 超過50%。此外，在外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥的患者中，腦血管的發(fā)病情況也有增 長。
外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥都可采用經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)氣囊血管成形術(shù)(PTA) 施行治療。施行經(jīng)由皮下的血管腔內(nèi)氣囊血管成形術(shù)并結(jié)合安置移植片固定模，可 減少再狹窄癥的發(fā)病率。不過，在采用諸如移植片固定模之類的醫(yī)療裝置所獲得的 術(shù)后效果，卻與采用標(biāo)準(zhǔn)的血管再造術(shù)(即，釆用靜脈或修補(bǔ)用旁路材料)所獲得的 效果并不相稱。(外科學(xué)原理，Schwartz等編，第20章，動(dòng)脈管疾病，第7版，McGraw-Hill 保健專業(yè)分部，紐約1999)。
較好的是，對于外周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥采用建立旁路的程序進(jìn)行治療，艮P， 對于被封鎖的動(dòng)脈段，采用一種移植物建立一段旁路。(外科學(xué)原理，Schwartz等編， 第20章，動(dòng)脈管疾病，第7版，McGraw-Hill保健專業(yè)分部，紐約1999)。這類移 植物可包括，自體同源性靜脈段，例如，隱靜脈；或者，合成的移植物，例如，采 用聚酯、聚四氟乙烯(PTFE)或膨脹性聚四氟乙烯(ePTFE)或其他各種聚合物材料。其 術(shù)后的開放率，與多種不同的因素有關(guān)。其中包括，旁路移植物的內(nèi)腔大小、用作 移植物的合成材料的類型，以及流出物的部位等。不過，盡管是采用了旁路移植物， 卻還是會(huì)遺留下內(nèi)膜過度增殖以及血栓形成等重大問題。例如，在腹股溝下采用膨 脹的聚四氟乙烯旁路移植物施行旁路矯治程序經(jīng)3年后的開放率，對于股-胭動(dòng)脈旁 路是54%，而對于股-脛動(dòng)脈旁路則僅有12%。
因而，有必要大大改進(jìn)各種移植片固定模、合成的旁路移植物以及其他持久性接 觸血液的表面和/或裝置，以便可進(jìn)一步減少心冠動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥(CAD)和外 周動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化癥(PAD)的發(fā)病率和死亡率。
對于移植片固定模，所用的方法是，采用各種抗凝血?jiǎng)┗蚩乖侏M窄劑來涂敷移植 片固定模，以便減少血栓形成和再狹窄癥。例如，用放射活性物質(zhì)浸漬移植片固定 模，顯示出能夠抑制心肌成纖維細(xì)胞的游動(dòng)和增殖，從而抑制再狹窄癥。(美國專利號(hào)5, 059, 166、 5, 199， 939和5, 302, 168)。對于經(jīng)受治療的血管施行輻照處理，能夠 在患者體內(nèi)引起嚴(yán)重的邊緣再狹窄癥問題。此外，輻照處理方法并不許可對受損害 的血管進(jìn)行均勻處理。
或者，對于移植片固定模還可采用化學(xué)藥劑來包敷，例如，肝素、磷酸膽堿、雷 帕霉素和紫杉酚，所有這類藥劑都有可能緩減血栓形成和/或再狹窄癥。所述肝素和 磷酸膽堿，雖然對于動(dòng)物模型在短時(shí)內(nèi)有可能明顯減少血栓形成，但是用這類藥劑 施行治療，對于預(yù)防再狹窄癥則并沒有長期效果。而且，肝素有可能誘發(fā)血小板減 少癥，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的血栓栓子性并發(fā)癥，例如中風(fēng)。由此看來，在這種治療再狹 窄癥的操作實(shí)施方面，對于移植片固定模還無法涂敷足夠治療有效量的肝素或磷酸 膽堿。
己經(jīng)在若干不同的治療方式中，采用了各種合成材料的移植物，來減少施術(shù)后的 再狹窄癥和血栓癥。(Boe等，1998。小口徑人造血管修補(bǔ)術(shù)現(xiàn)狀。生理學(xué)和生物化 學(xué)檔案。106:100-115)。例如，據(jù)報(bào)道，聚氨酯的復(fù)合物，例如，多孔性聚碳酸酯 氨基甲酸乙酯具有相當(dāng)于膨脹性聚四氟乙烯(ePTFE)移植物的減少再狹窄癥的作用。
其移植物的表面是采用射頻發(fā)熱放電作用對聚對二苯甲酸酯移植物進(jìn)行氟素化處理 作了修飾。這類合成的移植物還已經(jīng)采用膠原之類的生物分子進(jìn)行了浸漬處理。不 過，這類方法都并沒有明顯的減少血栓形成或再狹窄癥發(fā)生率的長期效果。
內(nèi)皮細(xì)胞(EC)層是在正常血管壁上的一種重要的成分可在血流與周圍的血管壁 組織之間形成一個(gè)界面。這類內(nèi)皮細(xì)胞還可參與各種生理活動(dòng)，包括，血管形成、 發(fā)生炎癥過程以及防止血栓形成(Rodgers GM. FASSEB J 1988; 2:116-123)。據(jù)近
期的一系列研究表明，除了組成血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞之外，在出生后的外周血行中， 還用內(nèi)皮細(xì)胞和祖代內(nèi)皮細(xì)胞(EPC)進(jìn)入血液循環(huán)之中。(AsaharaT等?？茖W(xué)19W; 275:964-967; Yin AH，等。血液1997; 90:5002-5012; Shi Q，等。血液圍;92:362-367; Gehling UM，等，血液2000; 95:3106-3112; Lin Y等，臨床研究雜志2000; 105:71-77)。
據(jù)認(rèn)為，祖代內(nèi)皮細(xì)胞可在受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯層的循環(huán)系統(tǒng)區(qū)域，包括創(chuàng)傷和 缺血性損傷部位游動(dòng)(Takahashi T等，國家醫(yī)學(xué)1999; 5:434-438)。在正常的成年 人中，在外周血行內(nèi)的祖代內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量可達(dá)每立方毫米3-10個(gè)(Tkahashi T等' 國家醫(yī)學(xué)1999; 5:434-438;胸外科年鑒。2000; 70:629-834)。如今已經(jīng)證明，血 管對于損害作用的反應(yīng)，每一階段都會(huì)受到內(nèi)皮層的影響(甚至是控制)。據(jù)信，在 發(fā)生損傷而安置移植片固定模的血管段迅速建立功能性內(nèi)皮細(xì)胞層，可有助于設(shè)置 一套循環(huán)細(xì)胞因子的屏障，防止血栓的不良作用，而制止?jié)撛诘膰?yán)重并發(fā)癥，以及
8依賴內(nèi)皮細(xì)胞的作用能力，而產(chǎn)生使其下方平滑肌細(xì)胞層鈍化的各種物質(zhì)。(Van Belle等，1997;移植片固定模的內(nèi)皮細(xì)胞成形術(shù)。循環(huán)系統(tǒng)95:438-448; Bos等， 1998。小口徑人造血管修補(bǔ)術(shù)現(xiàn)狀。生理學(xué)和生物化學(xué)檔案。106:100-115)。
在植入移植片固定模之后，對局部施用一種內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原——血管內(nèi)皮細(xì)胞生 長因子(VEGF)，就可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在移植片固定模表面生長(Van Belle等，1997; 移植片固定模的內(nèi)皮細(xì)胞成形術(shù)。循環(huán)系統(tǒng)95:438-448)。在損傷部位應(yīng)用一種重 組蛋白質(zhì)生長因子一血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的鹽水溶液，就可誘發(fā)所需的作用效果。 這種血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可在植入移植片固定模之后，利用一種通道氣囊導(dǎo)管輸 入損傷部位。此項(xiàng)技術(shù)并不理想，因?yàn)?，?jù)證實(shí)，其一次輸入劑量的效果太低，而 且所獲的效果不一致。因而，這種施治程序并不能每次都精確地重現(xiàn)。
對于合成材料的移植物，也已經(jīng)播種了內(nèi)皮細(xì)胞。但是這種播種內(nèi)皮細(xì)胞的臨床 效果一般都太差。即施術(shù)之后的管腔開張率都太低(Lio等，1998，微血管移植術(shù)的 新概念和新材料修補(bǔ)性移植的內(nèi)皮細(xì)胞播種和基因治療方法。顯微外科學(xué) 18:263-256)，其原因極是由于細(xì)胞未能妥善地黏附在移植物上和/或由于通過離體 操作處理，以至細(xì)胞喪失了其內(nèi)皮細(xì)胞功能。
因而，在該具體部位的各種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及各種環(huán)境條件，對于內(nèi)皮細(xì)胞 在血管損傷部位的黏附、生長以及分化等功能的調(diào)節(jié)作用，都是十分重要的因素。 據(jù)此，就有必要開發(fā)一些新的方法和材料，對于這類醫(yī)療裝置，包括各種移植片固 定模和合成材料的移植片固定模進(jìn)行包敷處理。這樣就可在植入的裝置上促進(jìn)和加 速功能性內(nèi)皮細(xì)胞層的形成，使得在目標(biāo)血管段或移植的內(nèi)腔部位形成一片融合的 內(nèi)皮細(xì)胞單層組織，并且抑制新的內(nèi)膜組織的增殖過程。這種類型的包敷技術(shù)，不 僅可抑制再狹窄癥的發(fā)生，而且還可抑制因移植裝置所引起的各種血栓栓子性并發(fā) 癥。這種改良方案所提供的各種方法和材料，都可消除原來的技術(shù)中的各種缺陷， 而對于冠心動(dòng)脈性動(dòng)脈粥樣硬化癥(CAD)和外周動(dòng)脈性動(dòng)脈粥樣硬化癥(PAD)的發(fā)病 率和死亡率帶來顯著重大的良性效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是，提供有包衣層的醫(yī)療裝置，例如，移植片固定模、移植片固定 模移植物、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)用篩片、人工心臟、左心室內(nèi)、外輔助裝置 (LVAD)以及合成的人造血管，用于治療各種血管疾病，其中包括，再狹窄癥、動(dòng)脈 粥樣硬化癥、血栓癥、血管阻塞等。在一個(gè)方面，提供了一種醫(yī)療裝置，所述裝置包括，(a)—層包衣層，(b)至少 一種具有治療有效量的抗體、抗體片段或其組合，以及(C)至少一種化合物；其特征 在于，所述包衣包括至少一層生物相容的基質(zhì)；所述至少一種抗體或抗體片段可直 接對抗祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原；且所述至少一種化合物可刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞 在該醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮組織。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移植片固定模移植物、 合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、 開放性卵圓孔隔膜封閉裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液 透析導(dǎo)管、房室吻合分流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、 留置式靜脈導(dǎo)管、留置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。更優(yōu)選醫(yī)療裝置是一種
移植片固定模。還更優(yōu)選移植片固定模包括選自不銹鋼、NiTi、 MP35N以及鉻合金的 材料。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方式中，移植片固定模還包括一個(gè)外套層、遮蔽層或包封 層，其材料選自交聯(lián)PVA水凝膠、ePTFE、 PTFE、多孔型HDPE、聚氨酯和對苯二甲酸 酯。優(yōu)選合成的人造血管中含有選自交聯(lián)的聚乙烯醇、ePTFE、 PTFE、多孔型HDPE、 聚氨酯和對苯二甲酸酯的一種物質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有選自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖和白明膠的 一種合成材料。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有選自膠原、彈性蛋白、層粘 連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維素以及無定形碳的一種天然 存在的材料。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有碳原子數(shù)為C2。-C徹的球烯。
更優(yōu)選球烯是Ce?；駽7。球烯。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗 體和人源化抗體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或抗體片段是以共價(jià)或 非共價(jià)結(jié)合的方式，或以一種連接分子共價(jià)拴系的方式，與所述醫(yī)療裝置生物相容 性基質(zhì)包衣的最外層相結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或抗體片段 對于人的始祖代內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或 抗體片段可直接對抗選自CD133、 CD34、 C歸O、 CD117、 HLA-DR、 VEGFR-1、 VEGFR-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2 和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。優(yōu)選至少一種抗體是含有Fab或F(ab')2片段的單克隆抗體。更優(yōu)選至少一種抗體是以連接分子共價(jià)拴系的方式與該醫(yī)療裝置的
生物相容的基質(zhì)包衣的最外層相結(jié)合。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體片段含有合成的或天然來源的小分子物質(zhì)。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種化合物是選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、
成纖維細(xì)胞生長因子-3(FGF-3)、 FGF-4、 FGF-5、 FGF-6、 FGF-7、 FGF-8、 FGF-9、堿
性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性因子、轉(zhuǎn)化生長因子ei、酸性成纖維細(xì)胞生
長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰島素樣生長因子、粒細(xì) 胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子BB、血小 板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白(trhombospondin)、增 殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素以及神 經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的一種生長因子。更優(yōu)選生長因子是VEGF家族或促血管生成素家 族中的一種成分。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有葡聚糖，至少一種抗體是結(jié) 合CD34細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，且至少一種化合物是VEGF或Ang-2。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有葡聚糖，至少一種抗體是結(jié) 合CD133細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，且至少一種化合物是VEGF或Ang-2。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有白明膠，至少一種抗體是結(jié) 合CD34或CD133細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，且至少一種化合物是VEGF或Ang-2。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，，生物相容的基質(zhì)中含有白明膠或葡聚糖，至少一種 抗體是結(jié)合Tie-2細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，且至少一種生長因子是VEGF或 Ang-2。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)中含有球烯，至少一種抗體是結(jié)合 Tie-2細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，且至少一種生長因子是VEGF或Ang-2。 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，祖代內(nèi)皮細(xì)胞是一種人體細(xì)胞。 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用來包衣醫(yī)療裝置的組合物，組合物含 有(a)生物相容的基質(zhì)，(b)治療有效量的至少一種抗體、抗體片段或其組合，以及 (c)治療有效量的至少一種用來刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞在醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮細(xì)胞層 的化合物。優(yōu)選醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血 管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、PF0隔膜封閉 裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分 流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、留置式靜脈導(dǎo)管、留
11置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管護(hù)鞘和藥物輸送口。優(yōu)選生物相容的基質(zhì)含有選自聚氨酯、嵌 段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖 和白明膠的一種合成材料。還優(yōu)選生物相容的基質(zhì)含有選自膠原、彈性蛋白、層粘 連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維素以及無定形碳的一種天然 存在的材料。還優(yōu)選生物相容的基質(zhì)包括碳原子數(shù)為C2。-C，的球烯。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或抗體片段包括選自CD133、CD34、CDw90、 CDH7、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子R-1、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sca-1)、干細(xì)胞因子l(SCF/c-Kti配體)、Tie-2和HAD-DR的一 種祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體選自多克隆的、嵌合的、人源化的和 單克隆的抗體，且所述單克隆抗體含有Fab或F(ab，)2片段。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種化合物是選自血管內(nèi)皮生長因子、成纖維 細(xì)胞生長因子-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因子-5成纖維細(xì)胞生長 因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成纖維細(xì)胞生長因子-9、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子ei、酸性成纖維 細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰島素樣生長因子、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子BB、 血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白(trhombospondin)、 增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素以及 神經(jīng)鞘氨醇卜磷酸酯的一種生長因子。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種包衣醫(yī)療裝置的方法，包括以下步驟
a. 在醫(yī)療裝置表面至少敷上一層生物相容的基質(zhì)，其中生物相容的基質(zhì)含有選 自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙 烯酯、葡聚糖、白明膠、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝 素、血纖蛋白、纖維素以及碳和球烯的至少一種成分，以及
b. 在生物相容的基質(zhì)中同時(shí)或相繼加入治療有效量的至少一種抗體、抗體片段 或其組合，和小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原相互作用，并將 所述祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該裝置表面，以及至少一種刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞在醫(yī)療裝置 表面形成內(nèi)皮細(xì)胞層的化合物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移植片固定模移植物、 合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、開放性卵圓孔(PFO)隔膜封閉裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、 血液透析導(dǎo)管、房室吻合分流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接 合夾、留置式靜脈導(dǎo)管、留置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體是以共價(jià)或非共價(jià)方式附著在包裹該 醫(yī)療裝置的生物相容的基質(zhì)上。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，球烯是"?；駽7。球烯。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或抗體片段可直接對抗選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-服、血管內(nèi)皮生長因子R-1、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18(CD146) 、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c- Kti配體)、Tie-2 和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。優(yōu)選至少一種抗體是一種單克隆抗體并包括抗 體的大分子或小分子。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種化合物是選自血管內(nèi)皮生長因子、成纖維 細(xì)胞生長因子-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因子-5成纖維細(xì)胞生長 因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成纖維細(xì)胞生長因子-9、
堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子ei、酸性成纖維
細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、胰島素樣生長因子、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子BB、 血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白(trhombospondin)、 增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素以及 神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的一種生長因子。
在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種治療哺乳動(dòng)物血管疾病的方法，包括將該 醫(yī)療裝置移植入哺乳動(dòng)物的血管或管狀器官，醫(yī)療裝置被(a)生物相容的基質(zhì)，(b) 治療有效量的至少一種抗體、抗體片段或其組合，以及(c)至少一種化合物包衣；其 中，抗體或抗體片段可識(shí)別和結(jié)合袓代內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原，從而消除該祖代內(nèi)皮 細(xì)胞在基質(zhì)表面的活動(dòng)能力，且化合物用來刺激固定的祖細(xì)胞以在該醫(yī)療裝置表面 形成內(nèi)皮細(xì)胞層。優(yōu)選醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的 人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、開放 性卵圓孔隔膜封閉裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析 導(dǎo)管、房室吻合分流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、留 置式靜脈導(dǎo)管、留置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)含有至少一種選自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明 膠、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維 素、無定形碳和球烯的組分。更優(yōu)選球烯是C6?；駽7。球烯。更優(yōu)選至少一種抗體或抗
體片段可直接對抗選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子 R-l、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞 因子l(SCF/c- Kti配體)、Tie-2和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。還更優(yōu)選至 少一種抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體，且所述單克隆 抗體含有抗體的大分子或小分子。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種化合物是選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因子-5、成 纖維細(xì)胞生長因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成纖維細(xì) 胞生長因子-9、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子 fH、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小 板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素 以及神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的一種生長因子。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，血管性疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化癥、血管瓣膜再狹窄 癥、血栓癥、血管和管狀器官閉塞癥。
本發(fā)明的醫(yī)療裝置中，優(yōu)選生物相容的基質(zhì)包括Ce。或C7。球烯，至少一種抗體 或其片段可識(shí)別和結(jié)合祖細(xì)胞表面抗原CD34或CD133，且化合物是VEGF或Ang-2。
優(yōu)選球烯排列成納米管。
在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了一種抑制哺乳動(dòng)物內(nèi)膜增殖的方法，該方法包 括將一種醫(yī)療裝置植入哺乳動(dòng)物的血管或管狀器官，醫(yī)療裝置被(a)至少一層生物相 容的基質(zhì)，(b)治療有效量的至少一種抗體、抗體片段或其其組合，以及(c)至少一 種化合物包衣；其中，抗體或抗體片段可識(shí)別和結(jié)合祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，
使該祖代內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)的表面失去活，且至少一種化合物用來刺激固定的祖代內(nèi) 皮細(xì)胞以在該醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮細(xì)胞層。優(yōu)選醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移 植片固定模移植物、合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起 搏器導(dǎo)子、除纖顫器、開放性卵圓孔隔膜封閉裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉合器、 血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、留置式靜脈導(dǎo)管、留置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)含有至少一種選自聚氨酯、嵌段的聚 氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明 膠、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維 素、無定形碳和球烯的組分。優(yōu)選球烯是C6?；駽7。球烯。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體或抗體片段含有選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子R-1 、血管內(nèi)皮生長因子R-2 、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2 和HAD-DR的袓代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種抗體片段選自單克隆的、多克隆的、嵌合 的和人源化的抗體，并包括抗體的大分子或小分子。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種化合物是選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因子-5、成 纖維細(xì)胞生長因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成纖維細(xì) 胞生長因子-9、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子 fU、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小 板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-A1、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素 以及神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的生長因子。
在本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了一種醫(yī)療裝置，包含一層包衣層和治療有效量 的至少一種小分子物質(zhì)，其中，包衣層含有至少一層生物相容的基質(zhì)，且所述小分 子與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原相互作用，并將所述祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該裝置表面。 優(yōu)選醫(yī)療裝置選自移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心臟瓣 膜、導(dǎo)管、血管修補(bǔ)篩、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、開放性卵圓孔隔膜封閉 裝置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉合器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分 流、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、留置式靜脈導(dǎo)管、留 置式動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)含有選自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素 /肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、和白明膠的人 工合成材料。
15在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)含有選自膠原、彈性蛋白、層粘連 蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維素、無定形碳的天然存在的材料。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物相容的基質(zhì)含有碳原子數(shù)約為c2。-c，的球烯。 更優(yōu)選球烯是a?；駽7。球烯。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，小分子選自天然存在的肽類、合成肽類、糖肽類、 脂肽類、脂質(zhì)類、糖類、有機(jī)分子類、無機(jī)分子類以及核酸類。更優(yōu)選小分子對于 人源的祖代內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，小分子以共價(jià)或非共價(jià)方式附著在基質(zhì)的表面，或 者通過連接分子以共價(jià)方式栓系在包覆該醫(yī)療裝置的基質(zhì)包衣的最外層。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，小分子是選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、 血管內(nèi)皮生長因子R-1、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞抗 原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面 抗原的配體。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，醫(yī)療裝置還包括一種選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因子-5、成 纖維細(xì)胞生長因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成纖維細(xì) 胞生長因子-9、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子 Pl、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素1、促血管生成素2、 胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小 板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋 白、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白介素8、甲狀腺素 以及神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的生長因子。
本發(fā)明的第七個(gè)方面提供了一種治療哺乳動(dòng)物治療血管性疾病的方法，將上述 醫(yī)療裝置植入有此治療需要的哺乳動(dòng)物的血管或管狀器官。
本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了一種抑制哺乳動(dòng)物抑制內(nèi)膜增殖的方法，將上述醫(yī)療 裝置植入有此治療需要的哺乳動(dòng)物的血管或管狀器官。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，這類醫(yī)療裝置的包衣層包含有一種生物相容的基質(zhì)、至少一種 抗體或抗體片段或抗體與片段的組合物以及至少一種諸如生長因子之類的物質(zhì)，可 用于調(diào)節(jié)被俘獲的祖代內(nèi)皮細(xì)胞在該醫(yī)療裝置表面黏附、生長和分化，以誘導(dǎo)功能 性內(nèi)皮層的形成，賴以抑制內(nèi)膜層的增殖，從而防止再狹窄癥的發(fā)生，最后改善接受血管疾病治療的患者的預(yù)后過程。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述生物相容的基質(zhì)包含有一層外表面，以供治療有效量的至 少一種抗體、抗體片段或抗體與抗體片段的組合物附著其上。這類抗體或抗體片段 能夠識(shí)別一種抗原，使之與袓代內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜或表面相結(jié)合，令這類細(xì)胞固定 在該基質(zhì)層的表面。此外，包衣層包含有至少一種治療有效量的物質(zhì)，可，可賴以 刺激固定的祖代內(nèi)皮細(xì)胞，在該醫(yī)療裝置上加速形成成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層。
本發(fā)明的這類醫(yī)療裝置，可能是一種供植入器官或有空腔的體軀部分，也可能是， 但不限于移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心臟瓣膜、導(dǎo)管、 血管修補(bǔ)用篩片、起搏器、起搏器導(dǎo)子、除纖顫器、開放性卵圓孔(PFO)隔膜封閉裝 置、血管夾、動(dòng)脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導(dǎo)管、房室吻合分流 器、大動(dòng)脈血管瘤移植物裝置或組件、靜脈瓣、縫線、血管接合夾、留置式靜脈或 動(dòng)脈導(dǎo)管、血管鞘和藥物輸送口。例如，本發(fā)明的該類移植片固定模可能是用不銹
鋼、鎳鈦合金(NiTi)或鉻合金構(gòu)成。合成的人造血管可能是采用交聯(lián)PVA水凝膠、 聚四氟乙烯、膨脹性聚四氟乙烯(ePTFE)、多孔型高密度聚乙烯(HDPE)、聚氨酯以及 對苯二甲酸酯制成。
形成本醫(yī)療裝置的包衣層的生物相容的基質(zhì)，包含一種合成物質(zhì)，例如，聚氨酯、 嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚 糖或白明膠?；蛞环N天然存在的物質(zhì)，例如膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋 白、玻連蛋白之類的基底膜成分、肝素、血纖蛋白、纖維素以及無定形碳或球烯 (fullerene)。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施例中，其醫(yī)療裝置中包含的生物相容的基質(zhì)，是由各種球烯 材料中的一種所組成。在該實(shí)施例中的球烯含有碳原子數(shù)約為C2。-C，，更具體的是 所述球烯含有碳原子數(shù)約為U或C7。。本發(fā)明中的球烯還可能在醫(yī)療裝置表面排列成 納米管(nanotube)。
在醫(yī)療裝置的包衣層中包含至少一種抗體或抗體的片段。該種抗體可能是單克隆 抗體或多克隆抗體、嵌合型抗體或人源化抗體。這類抗體或抗體的片段能夠識(shí)別和 結(jié)合祖代內(nèi)皮(能夠轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓墓δ苄詢?nèi)皮細(xì)胞的各種內(nèi)皮細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞) 細(xì)胞表面的抗原，并調(diào)節(jié)這類細(xì)胞在醫(yī)療裝置表面的黏附能力。本發(fā)明的這類抗體 或抗體片段能夠以共價(jià)或非共價(jià)的方式附著在基質(zhì)的表面，或者通過一種連接分子 以共價(jià)的方式栓系在醫(yī)療裝置的基質(zhì)包衣的最外層。在本發(fā)明的這一方面，例如， 單克隆抗體還可包含有Fab或F(ab')2片段。本發(fā)明的抗體片段可包含任何大小的片
17段，例如，能夠保留與抗體一樣的識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)抗原的特性。
本發(fā)明的抗體或抗體片段所識(shí)別和結(jié)合的各種抗原，具有受治療哺乳動(dòng)物的特異 性。其特異性與細(xì)胞系列物關(guān)。在一項(xiàng)實(shí)施例中，其抗體或抗體片段是對人類祖代
內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原具有特異性，例如，CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管 內(nèi)皮生長因子(VEGF)R-1、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18(CD146)、 CD130、干細(xì)胞 抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2和HAD-DR。
在另一項(xiàng)實(shí)施例中，醫(yī)療裝置的包衣材料中包含至少一層上述的生物相容的基 質(zhì)。該基質(zhì)有一層外表面，可供具有治療有效量的至少一種天然或合成來源的小分 子物質(zhì)附著在其上。該小分子物質(zhì)可識(shí)別袓代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，并與之相 互作用，使該祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在裝置表面，而形成一層內(nèi)皮細(xì)胞層。該類小分子 物質(zhì)具有不同的來源，例如，各種細(xì)胞成分，例如，各種脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸、 糖類等，都能夠產(chǎn)生與抗體同樣的效果或作用。在本發(fā)明這一方面，在醫(yī)療裝置上 的包衣材料中，除了抗體或抗體片段之外，還可包含一種化合物，例如生長因子。
本發(fā)明的包衣材料中的一種化合物，可以是能夠刺激或加速祖代內(nèi)皮細(xì)胞生長和 分化成為成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層的任何物質(zhì)。例如，本發(fā)明所采用的一種化合物 是一種生長因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子血小 板誘導(dǎo)的生長因子、乙1型轉(zhuǎn)化性生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋 白、促血管生成素l(Ang-1)、促血管生成素2(Ang-2)、胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小板衍生生長因子BB、血小板 衍生生長因子AB以及內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1。
本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明的敷有包衣的醫(yī)療裝置，用于治療血管疾病的各種方 法，例如，動(dòng)脈粥樣硬化癥、再狹窄癥、血栓形成、動(dòng)脈瘤以及血管阻塞。在本發(fā) 明的該項(xiàng)實(shí)施例中，提供了優(yōu)于本領(lǐng)域其他各種方法的一種改良方法，可將醫(yī)療裝 置牢固連接在其插入的血管壁部位，例如，移植片固定?；蚝铣傻娜嗽煅堋⑿呐K 瓣膜、腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤裝置以及各種組件、以求建立血管系統(tǒng)的自身平衡，從而預(yù) 防過度的內(nèi)膜組織增殖。在治療動(dòng)脈粥樣硬化癥的本方法中，其動(dòng)脈可能是心冠動(dòng) 脈，也可能是外周動(dòng)脈例如股動(dòng)脈。對于靜脈，也可采用本發(fā)明的各種技術(shù)和方法 進(jìn)行治療。
本發(fā)明還提供了一種工程性方法，可將康復(fù)反應(yīng)過程都包括在內(nèi)。在一項(xiàng)實(shí)施例 中提供的一種方法，可在移植的血管中的目標(biāo)病變處植入裝置的管腔表面，迅速誘 導(dǎo)融合的內(nèi)皮細(xì)胞層的形成。所述內(nèi)皮細(xì)胞有氧化一氮合成酶以及其他抗炎癥性因子和炎癥調(diào)節(jié)性因子的表達(dá)。本發(fā)明還提供了在提高生物相容的方面優(yōu)于本領(lǐng)域其 他各種裝置的一種醫(yī)療裝置，并且還可通過減少或抑制平滑肌細(xì)胞游動(dòng)、平滑肌細(xì) 胞分化，以及在醫(yī)療裝置植入部位的管腔內(nèi)表面一帶有膠原沉積，從而減少或抑制 以組織為基礎(chǔ)的內(nèi)膜組織過度增殖過程以及再狹窄癥。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施例中，其對于易用裝置包敷包衣的一種方法，包括如下一些 步驟:對于該醫(yī)療裝置表面至少包敷一層生物相容的基質(zhì)，其特征在于，該生物相容
的基質(zhì)至少包含一種組合物，選自聚氨酯、嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、
纖維素酯、聚乙二醇、聚乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明膠、膠原、彈性蛋白、層粘連 蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維素以及碳和球烯。
同時(shí)或隨后，對于生物相容的基質(zhì)加入至少一種治療有效量的抗體抗體片段或其 其組合，以及可刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的至少一種化合物。
本發(fā)明另外還提供了對哺乳動(dòng)物治療血管疾病的一種方法，包括如下步驟:對于 哺乳動(dòng)物的血管或管形器官植入一種醫(yī)療裝置，其特征在于，該醫(yī)療裝置上包敷有 (a)—層生物相容的基質(zhì)，(b)至少一種治療有效量的抗體、抗體片段或其其組合， 以及(c)至少一種化合物；其特征在于，該種抗體或抗體片段能夠識(shí)別和結(jié)合祖代內(nèi) 皮細(xì)胞表面的一種抗原，并使之固定在該基質(zhì)的表面；而該種物質(zhì)則可刺激被固定 的祖代內(nèi)皮細(xì)胞，在醫(yī)療裝置的表面形成一層內(nèi)皮細(xì)胞層。
本發(fā)明另外還提供了對哺乳動(dòng)物抑制內(nèi)膜組織增殖的一種方法，包括如下步驟 對于哺乳動(dòng)物的血管或管形器官植入一種醫(yī)療裝置，其特征在于，該醫(yī)療裝置上包 敷有(a)至少一層生物相容的基質(zhì)，(b)至少一種治療有效量的抗體、抗體片段或其 其組合，以及(c)至少一種化合物；其特征在于，該種抗體或抗體片段能夠識(shí)別和結(jié) 合祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，并使該種祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該基質(zhì)的表面，以 及所述至少一種化合物則可剌激被固定的祖代內(nèi)皮細(xì)胞，在醫(yī)療裝置的表面形成一 層內(nèi)皮細(xì)胞層。
附圖簡述


圖1A是通過一種橫向連接分子以共價(jià)方式系留在基質(zhì)上的示意圖象。圖1B顯 示錨定在基質(zhì)上的Ce。0分子的圖解。圖1C一種包敷有本發(fā)明的基質(zhì)包衣的移植片固
定模的示意圖象描述。
圖2A是黏附在含有從富集培養(yǎng)基分離的細(xì)胞的纖連蛋白包敷的載玻片上的祖代 內(nèi)皮細(xì)胞的一種相差顯微照相圖象。圖2B是黏附在含有利用包敷有抗CD34抗體的磁珠分離的細(xì)胞的纖連蛋白包敷的載玻片上的祖代內(nèi)皮細(xì)胞的一種相差顯微照相圖
象。圖2D和2F是經(jīng)7天培育后并用PI核染劑染色的袓代內(nèi)皮細(xì)胞的顯微照相圖象。 從這些圖象中可以見到，表達(dá)成熟的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，都是由對于Tie-2(圖2E 和圖2G)的抗體熒光，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子R-2(VEGFR-2)(圖2C)的抗體反應(yīng) 性來顯示。
圖3A和3B都是對于內(nèi)皮細(xì)胞的氧化一氮合成酶，eNOS和甘油醛磷酸酯脫氫酶 (GAPDH)的半定量RT-PCR溴乙非啶染色的2%瓊脂糖凝膠的照相圖象。在纖連蛋白包 敷的載玻片上經(jīng)3天(圖3B)和7天(圖3A)培育之后，祖大內(nèi)皮細(xì)胞就可開始表達(dá)eNOS m飄。
圖4A-4E都是在CMDx和CD34抗體(4A);白明膠和抗-CD34抗體(4B);空白的不 銹鋼碟(4C)附著D的各種HUVEC的顯微照相圖象；CMDx包敷的和白明膠包敷的不銹 鋼碟都曾經(jīng)用于培育過HUVEC細(xì)胞并用碘化丙錠染色。
圖5A-5C都是包敷CMDx而沒有抗體的對照組的顯微照相圖象；圖5D-5F都是包
敷白明膠而在其表面沒有抗體結(jié)合的對照組不銹鋼碟的顯微照相圖象。
圖6A-6C都是包敷CMDx并在其表面結(jié)合抗-CD34抗體的不銹鋼碟的顯微照相圖象。
圖6I^6F都是包敷白明膠基質(zhì)而在其表面結(jié)合抗體的不銹鋼碟的顯微照相圖象。 圖7是包敷CMDx，在其表面結(jié)合抗體，并培育祖細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)的不銹鋼碟的顯
微照相圖象。
圖8A-8B都是包敷CMDx，在其表面結(jié)合抗-CD34抗體，并培育祖細(xì)胞經(jīng)7天而有
抗-KDR抗體形成的不銹鋼碟的顯微照相圖象。
圖9A-9B都是包敷CMDx，在其表面結(jié)合抗-CD34抗體，并培育祖細(xì)胞經(jīng)7天而有
抗-Tie-2抗體形成的不銹鋼碟的顯微照相圖象。
圖10A-10C都是包敷CMDx，并在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培育祖細(xì)胞經(jīng)3周的不銹鋼 碟的相差顯微照相圖象。其中顯示為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。
圖11是包敷功能性球烯并在其表面結(jié)合祖細(xì)胞的本發(fā)明的移植片固定模的不銹 鋼碟的示意圖解。
圖12A-12D都是經(jīng)溴化丙錠和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子R-1(VEGFR-2)抗體染色 的有或無抗-CD34抗體的球烯-包敷的若干樣本的顯微照相圖象。
圖13A-13D都是心冠動(dòng)脈的外植體移植在赤裸的不銹鋼質(zhì)移植片固定模(圖 13A-13C)和球烯包敷的樣本(圖13B"13D)上經(jīng)4周后的顯微照相圖象，分別是底倍擴(kuò)圖14A-14G都是1和48小時(shí)的掃描電子顯微照相圖象。在葡聚糖包敷的(圖14A) 和葡聚糖/抗-CD34抗體包敷的(圖14B)移植片固定模上移植l小時(shí)的外植體。圖14C 和圖14D顯示對照樣本的外植體，以及圖14E-G是在移植之后48小時(shí)的葡聚糖/CD34 抗體包敷的移植片固定模。圖14H-14M是取自移植之后4周的雄性約克夏豬的心冠 動(dòng)脈外植體橫截面的組織學(xué)顯微照相圖象分別是，無包敷(赤裸的不銹鋼質(zhì))(圖 14H-141)、葡聚糖包敷的對照組(圖14J和14K)以及葡聚糖/抗-CD34抗體包敷的(圖 14L和14M)。
圖15A、 15B和15C分別是其表面沒有抗體的葡聚糖-血漿-包敷的移植片固定模， 以及葡聚糖-血漿包敷的/抗-CD34抗體包敷的18毫米長的移植片固定模上的48小 時(shí)外植體切片的共焦顯微照相圖象。
圖16A和16B都是碘化丙錠和抗-凝集素/FITC-結(jié)合的樣本的顯微照相圖象。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了可植入體內(nèi)的一種有包衣的醫(yī)療裝置，例如，移植片固定模、包敷 醫(yī)療裝置的方法和材料組合物以及利用該醫(yī)療裝置治療各種血管疾病的方法。圖1A -1C顯示本發(fā)明的一種醫(yī)療裝置表面包衣的示意圖。該醫(yī)療裝置的包衣中包含一種生 物相容的基質(zhì)，可促進(jìn)在該裝置表面的內(nèi)皮細(xì)胞形成一片融合層，并抑制過度的內(nèi) 膜組織增殖過程，從而防止發(fā)生再狹窄癥和血栓相成。在一項(xiàng)實(shí)施例中，所述基質(zhì) 材料包含一種合成的或天然存在的物質(zhì)，其中含有至少一種治療有效量的抗體，可 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞黏附在醫(yī)療裝置上，以及至少一種生長因子之類的 物質(zhì)，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化。在該裝置移植之時(shí)，黏附在該裝置表面上的 細(xì)胞，就會(huì)在該醫(yī)療裝置的內(nèi)腔表面，轉(zhuǎn)化為融合一片的成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層。 在醫(yī)療裝置上的內(nèi)皮細(xì)胞融合層的形成，可減少受移植部位的再狹窄癥和血栓癥的 發(fā)生。
在此采用的"醫(yī)療裝置"是指臨時(shí)或持久性引入哺乳動(dòng)物體內(nèi)，以供預(yù)防或治療 一種醫(yī)學(xué)問題的材料。這類裝置材料包括，可經(jīng)皮下、經(jīng)皮層或通過外科手術(shù)，置 于某個(gè)器官、組織或器官的內(nèi)腔，例如，動(dòng)脈、靜脈、心室或心房等部位的任何物 件。這類醫(yī)療裝置材料可包括，移植片固定模、移植片固定模移植物、有包衣層移 植片固定模，其包衣層材料有，例如，聚四氟乙烯(PTFE)、膨脹性聚四氟乙烯(ePTFE)， 或是，合成的人造血管、人工心臟瓣膜、人工心臟以及可將修補(bǔ)的器官血管循環(huán)系
21統(tǒng)相連接的固定夾、靜脈瓣膜、腹主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤(AAA)移植物、下腔靜脈篩片、永久性輸藥導(dǎo)管、螺巻栓子、在血管栓塞形成時(shí)使用的栓子材料(例如，交聯(lián)PVA水凝膠)、血管縫線、血管接合固定夾、通過心肌血管重新形成的移植片固定模、和/或其他各 種導(dǎo)管類材料。采用本發(fā)明的各種材料組合物和方法對醫(yī)療裝置包敷的包衣，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞在 醫(yī)療裝置表面形成融合內(nèi)皮細(xì)胞層。從而防止發(fā)生再狹窄癥，以及調(diào)節(jié)由于植入乙 用裝置所造成的局部慢性炎癥反應(yīng)和其他血栓栓塞形成性并發(fā)癥。包敷醫(yī)療裝置的基質(zhì)材料可包含一種合成物質(zhì)，例如，聚合性凝膠泡沫，其中有由聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚-L-乳酸、纖維素酯或聚乙二醇制成的各種水凝膠。 在另一項(xiàng)實(shí)施例中，所述基質(zhì)是各種天然存在的物質(zhì)，例如，膠原、血纖蛋白、彈 性蛋白或無定形碳等?；|(zhì)可以有多層，第一層可以是合成材料或天然存在的材料， 第二層可以含有抗體。各層可相繼順次排列，第一層是直接與移植片固定?；蚝铣?材料移植物表面相接觸，第二層則有一面直接與第一層相接觸，，另一面則與血管內(nèi) 腔相接觸?；|(zhì)層還可包含至少一種生長因子、細(xì)胞因子等類物質(zhì)，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增 殖和分化過程。例如，本發(fā)明可采用的有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其異構(gòu)體、堿 性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血小板誘導(dǎo)性因子(PIGF)、轉(zhuǎn)化生長因子P 1(TGF，(31)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、骨粘連蛋白、促血管生成素1、促血管 生成素2、胰島素樣生長因子(ILGF)、血小板衍生生長因子AA(PDGF-AA)、血小板衍 生生長因子BB(PDGF-BB)、血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落 刺激因子(GM-CSF)等，或其各種功能性片段。在另一項(xiàng)實(shí)施例中，該種基質(zhì)材料可包含各種球烯，其所含的碳原子數(shù)約為 C2。-C15。。這類球烯也可排列成納米管樣，其中含有各種分子或蛋白質(zhì)。這種基質(zhì)也可 應(yīng)用于不銹鋼質(zhì)、聚四氟乙烯(PTFE)質(zhì)或膨脹性聚四氟乙烯質(zhì)(ePTFE)的醫(yī)療裝置材 料表面，其表面再包敷一層抗體和生長因子，而具備功能性?；蛘撸?，可在不 銹鋼質(zhì)醫(yī)療裝置上先敷上一層聚四氟乙烯或膨脹性聚四氟乙烯，在敷上第二層球烯， 然后加上抗生素和生長因子。該基質(zhì)層可以非共價(jià)或共價(jià)的方式附著在醫(yī)療裝置上。各種抗生素類和生長因子 類都可利用異性或同性雙功能交聯(lián)試劑，以共價(jià)方式附著在該基質(zhì)上。生長因子可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與抗體一起或在抗體結(jié)合之后加入該基質(zhì)內(nèi)。在此采用的術(shù)語"抗體"是指一種單克隆的、多克隆的、人源化的或嵌合型的抗體，或其各類組合物，其特征在于，該類單克隆的、多克隆的、人源化的或嵌合型 的抗體，可與一種抗原或該種抗原的功能性等價(jià)物相結(jié)合。術(shù)語抗體片段包括一種 抗體的諸如Fab， F(ab')2等任何片段部分，且具有任何大小，即，大或小分子；具有與抗體同樣的作用和功效。(包含有多數(shù)單個(gè)抗體分子的一種抗體，相當(dāng)于每克分子抗體有6.022xl()23個(gè)分子)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的移植片固定?；蚝铣刹牧弦浦参铮笥幸粚雍?有不同抗體的生物相容的基質(zhì)材料，該類抗體可調(diào)節(jié)血行中的祖代內(nèi)皮細(xì)胞黏附在 醫(yī)療裝置上。本發(fā)明的這類抗體，可識(shí)別和結(jié)合血行中的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原， 并使該類細(xì)胞固定在裝置表面。在一項(xiàng)實(shí)施例中，其抗體是可與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面 抗原，或者一種祖細(xì)胞或干細(xì)胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)(識(shí)別和結(jié)合)的單克隆類抗體。 這類抗原有，例如，血管內(nèi)皮生長因子受體-1、-2和-3(VEGFR-1、VEGFR-2、和VEGFR-31 以及VEGFR受體族的各種異構(gòu)體)、Tie-1、Tie-2、CD34、Thy-l、Thy-2、Muc-18(CD146)、 CD30、干細(xì)胞抗原-l(Sca-l)、干細(xì)胞因子(SCF或c-配套配體)、CD133抗原、VE-鈣粘著蛋白、P1H12、 TEK、促血管生成素-l(Ang-l)、促血管生成素-2 (Ang-2)或一 種在祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的抗原。在一項(xiàng)實(shí)施例中，可采用能夠與一種抗原相反 應(yīng)的單一型的抗體。也可選用能夠直接對抗祖代內(nèi)皮細(xì)胞的不同抗原的多數(shù)不同抗 體，混合一起加入基質(zhì)材料中。在另一項(xiàng)實(shí)施例中，是混合選用各種單克隆抗體， 分別以不同的特異性細(xì)胞表面抗原為靶標(biāo)，而提高其上皮細(xì)胞層的形成率。在本發(fā) 明的這一方面，例如，是選用抗-CD34和抗-133組合，并將其附著在移植片固定模上的基質(zhì)材料表面。在此采用的"治療有效量的抗體"的含意是能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞 附著在移植片固定模上的基質(zhì)材料表面所用的抗體用量。實(shí)施本發(fā)明時(shí)所需的抗體 用量，以所選用的抗體性質(zhì)而有所不同。例如，所采用的抗體用量取決于該種抗體 與其所反應(yīng)的抗原之間的結(jié)合常數(shù)。關(guān)于一種抗體對具體抗原所需的治療有效量的 確定方法，在本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員中，都是普遍熟知的。在此采用的術(shù)語"化合物"是指諸如生長因子之類的物質(zhì)，例如，屬于促血管生 成素家族和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)族的一種成分；以及維生素類，例如，A和 C，可刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化過程，成為成熟的，可表達(dá)例如氧化一氮合成 酶分子的功能性內(nèi)皮細(xì)胞。在此采用的術(shù)語"生長因子"是指肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白或其一種片段或 修改變體，或一種合成材料，都能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞的生長和分化過程'形成成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞。成熟的內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)氧化一氮合成酶，從而 可向組織內(nèi)釋放氧化 -氮。如下表1所示為可用于對醫(yī)療裝置包敷的若干生長因子。表1^因子 內(nèi)皮細(xì)胞特異性酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF) 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 成纖轉(zhuǎn)化性生長因子-(TGF-) 維細(xì)胞生長因子3(FGF-3) 成纖維細(xì)胞生長因子4(FGF-4) 成纖維細(xì)胞生長因子5 (FGF-5) 成纖維細(xì)胞生長因子6 (FGF-6) 成纖維細(xì)胞生長因子7 (FGF-7) 成纖維細(xì)胞生長因子8 (FGF-8) 成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF-9) 血管原素1 血管原素2肝細(xì)胞生長因子/分散因子(HGF/SF)血小板衍生生長因子(PDE-CGF)轉(zhuǎn)化性生長因子-a(TGF-a)轉(zhuǎn)化性生長因子-(J(TGF-p)腫瘤壞死因子-a(TNF-a)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子121 (VEGF121)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子145(VEGF145)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165(VEGF165)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子189(VEGF189)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子206(VEGF206)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子B(VEGF-B)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C(VEGF-C)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子D(VEGF-D〉血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子E(VEGF-E)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子F(VEGF-F)胎盤生長因子促血管生成素-l促血管生成素-2血小板反應(yīng)蛋白(TSP)增殖蛋白肝配蛋白-A1(B61)E-選擇蛋白雞趨化學(xué)性和血管原性因子(cCAF) 肥胖蛋白肝素親和調(diào)整肽(HARP) 肝素顆粒細(xì)胞群落剌激因子胰島素樣生長因子白介素8甲狀腺素神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯否否否否否否否否否否是是否是否否否是是是是是是是是是是是否否否是是是否是否否否否否否否在此采用的術(shù)語"血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)"的含義是，如上表1所列述的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(除了用數(shù)字或組母縮略詞特別標(biāo)明的異構(gòu)體)的所有各種異 構(gòu)體。在此采用的術(shù)語"治療有效量的生長因子"的含義是，可刺激或誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、 祖細(xì)胞或干細(xì)胞的生長和分化過程，從而在醫(yī)療裝置材料的內(nèi)腔表面形成成熟的功 能性的內(nèi)皮細(xì)胞的融合層。在本發(fā)明的操作實(shí)施中所需的生長因子用量，隨所用的 生長因子的性質(zhì)和該生長因子與其受體之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)關(guān)系而有變化。例如，據(jù)證實(shí)，IOO微克的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可刺激內(nèi)皮細(xì)胞黏附在醫(yī)療裝置上，并形成 內(nèi)皮細(xì)胞融合層。至于有關(guān)用于刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化過程所用的生長因子的 治療有效量的確定方法，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都是耳熟能詳?shù)?。在此采用?內(nèi)膜組織增殖"是，在血管壁上平滑肌的增殖和基質(zhì)的沉積異常增 多現(xiàn)象。在此采用的"再狹窄癥"是指血管內(nèi)腔再度狹窄現(xiàn)象。血管可因再狹窄癥 而發(fā)生阻塞。經(jīng)心冠動(dòng)脈腔內(nèi)氣囊血管成形術(shù)(PTCA)或血管腔內(nèi)氣囊血管成形術(shù) (PTA)之后，正常情況下并不存在于內(nèi)膜組織的，來自中層和動(dòng)脈外膜層的平滑肌細(xì) 胞會(huì)增殖和向內(nèi)膜層游動(dòng)，并分泌各種蛋白質(zhì)，而在內(nèi)膜層中形成平滑肌細(xì)胞和基 質(zhì)蛋白質(zhì)的積聚。這一積聚過程可導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)腔的狹窄，致使狹窄部遠(yuǎn)端的血流量 減少。在此采用的"抑制再狹窄癥"是指抑制平滑肌細(xì)胞的游動(dòng)和增殖過程，并伴 以制止其蛋白質(zhì)的分泌能力，從而抵制了再狹窄癥，以及相應(yīng)發(fā)生的各種并發(fā)癥。能夠采用本發(fā)明的醫(yī)療裝置、方法和組合物材料進(jìn)行治療的對象是哺乳動(dòng)物，具 體來說，就是人類、犬、貓、豬、嚙齒動(dòng)物或猴類等。本發(fā)明的各種方法可在體內(nèi)或活體外實(shí)施。術(shù)語"祖代內(nèi)皮細(xì)胞"是指在任何發(fā)育階段的各種內(nèi)皮細(xì)胞，從源自骨髓、血液 或局部組織的祖細(xì)胞或千細(xì)胞，到成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞，但是都不可是惡變細(xì)胞。對于有包敷層的醫(yī)療裝置進(jìn)行在活體外的研究或使用方面，可從動(dòng)脈管或靜脈 管，例如，人的臍帶靜脈，分離出完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞；從外周血液或骨髓內(nèi)分離 出祖代內(nèi)皮細(xì)胞。將內(nèi)皮細(xì)胞與包敷有基質(zhì)材料(含有可黏附內(nèi)皮細(xì)胞的抗體、生長 因子或其他物質(zhì))的醫(yī)療裝置一起培育，使內(nèi)皮細(xì)胞與醫(yī)療裝置相結(jié)合。在另一項(xiàng)實(shí) 施例中，可用內(nèi)皮細(xì)胞來轉(zhuǎn)化內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞含有各種媒體物質(zhì)，可表 達(dá)各種生長因子或蛋白質(zhì)，因而能夠抑制血栓發(fā)生或再狹窄癥或其他治療結(jié)局。本發(fā)明的治療各種血管疾病的方法，能夠施用于任何動(dòng)脈或靜脈。在本發(fā)明范圍 內(nèi)可包括任何動(dòng)脈部位的動(dòng)脈皺樣硬化癥，例如，心冠動(dòng)脈、腹股溝下動(dòng)脈、腹主25動(dòng)脈/骼動(dòng)脈、鎖骨下動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈和腎動(dòng)脈。其他例如，切開動(dòng)脈瘤所造成的 各型血管阻塞癥，也都屬于本發(fā)明的范疇。對于哺乳動(dòng)物治療血管疾病的方法包括，將帶有包敷層的醫(yī)療裝置植入患者的 器官或血管內(nèi)，例如，在血管造型外科手術(shù)方面，可采用有包敷層的移植片固定模。 一旦植入就位之后，該移植片固定模就可由其包敷層所含的抗體，識(shí)別和結(jié)合祖代 內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原，而將該祖代內(nèi)皮細(xì)胞俘獲。 一旦該祖代內(nèi)皮細(xì)胞粘敷在該基 質(zhì)上后，其包敷層內(nèi)的生長因子就可促進(jìn)這批新結(jié)合的祖代內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化， 而在移植片固定模的內(nèi)腔表面形成一片融合而成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層?；蛘?，其 醫(yī)療裝置先在活體外包敷從患者體的血液、骨髓或血管分離的袓細(xì)胞、干細(xì)胞或成 熟的內(nèi)皮細(xì)胞，再植入其體內(nèi)。該兩種方法中，在醫(yī)療裝置內(nèi)腔中存在的內(nèi)皮細(xì)胞 都能夠抑制過度的內(nèi)膜組織增殖和血栓癥。艦雄按照J(rèn)affe等，臨床研究雜志，52:2745-2757， 1973的方法(在此已經(jīng)收錄作為 參考材料，并在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用)，從人的臍帶靜脈內(nèi)取得人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。 其方法的基本步驟是，用膠原酶處理血管壁剝離所述細(xì)胞，并放入包敷白明膠的組 織培養(yǎng)瓶中，在含有10%低內(nèi)毒素的胎牛犢血清、90微克/毫升無防腐劑的豬肝素、 20微克/毫升內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充劑(ECGS)和谷氨酰胺的M199培養(yǎng)基中培育。按照Asahara等，(供血管生成的假定的祖代內(nèi)皮細(xì)胞的分離。1&275:964-967， 1997。已經(jīng)收錄在此作為參考材料)。用對CD34的抗體包敷的磁珠與分組的人外周 血液一起培育。經(jīng)過培育之后，洗提出結(jié)合的細(xì)胞，可在EBM-2培養(yǎng)基中培育。 (Clonetics， San Diego， CA)或者可采用富集培養(yǎng)基分離方法來分離這類細(xì)胞。其 基本方法是，從健康男性志愿者取得外周靜脈血液，采用密度梯度離心分提法提取 單核細(xì)胞，將細(xì)胞涂抹在經(jīng)纖維接合素包敷的培育玻片上(Becton Dickinson)，在 補(bǔ)充5%胎牛血清、人VEGF-A、人成纖維細(xì)胞生長因子-2、人表皮細(xì)胞生長因子、胰 島素樣生長因子-1和抗壞血酸的EC基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(EBM-2) (Clonetics)中培育。每 48小時(shí)更換培養(yǎng)基，令祖代內(nèi)皮細(xì)胞生長7天之后，利用對于CD45、 CD34、 CD31、 VEGFR-2、 Tie-2和E-選擇蛋白等的熒光抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。采用各種常規(guī)方法，用任何表達(dá)媒體對哺乳動(dòng)物細(xì)胞施行轉(zhuǎn)染處理，該類表達(dá)媒 體含有可編碼各種蛋白質(zhì)的任何克隆基因，這類蛋白質(zhì)有，例如，血小板衍生生長 因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或氧化一氮合成酶(NOS)等。(參見，例如，哺乳動(dòng)物表達(dá)酶體和轉(zhuǎn)染試劑盒，由Stratagene，San Diego，CA商品供應(yīng))。例如， 按照Rosengart等(采用表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子121cDNA的一種腺病毒媒體直接 用于心肌內(nèi)施行血管生成基因治療第一期試驗(yàn)的6個(gè)月評估報(bào)告。外科手術(shù)年鑒。 230(4) :466-470(1999)。已經(jīng)收錄在此供參考)的各種方法，采用表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞 生長因子(VEGF)cDNA的腺病毒表達(dá)媒體，對純化的豬的祖代內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行血管內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)染處理。
拔謬
在本發(fā)明的方法中采用的單克隆抗體，可按照Kohler和Milstein(關(guān)于能夠分泌 預(yù)先確定其特性的抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培育方法。自然265:495-497， 1975，在此 已經(jīng)收錄以供參考)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行制備，或者可直接從商品來源取得。內(nèi)皮細(xì)胞可 用作一種可產(chǎn)生直接對抗內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的一種免疫原。
可直接對抗內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆抗體，可將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或提純的 祖代內(nèi)皮細(xì)胞注入小鼠或大鼠體內(nèi)來制備。經(jīng)過足夠的時(shí)間之后，將小鼠撲殺，提 取其脾臟細(xì)胞。將該脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞，通常在含有非離子型洗 滌劑例如聚乙二醇中進(jìn)行融合處理，制備成永存性細(xì)胞。將這類制成的包括融合性 雜交瘤的細(xì)胞，培育在一種選擇性培養(yǎng)基，例如，HAT-培養(yǎng)基中，這種生存的細(xì)胞 可在使用限定稀釋條件的這種培養(yǎng)基中生長。這種細(xì)胞是在適宜的容器，例如，微 量滴定孔穴中生長，從其上清液中篩取具有所需特異性，即，可與內(nèi)皮細(xì)胞抗原發(fā) 生反應(yīng)的單克隆抗體。
現(xiàn)成有可增量產(chǎn)生單克隆抗體的各種技術(shù)，例如，可將雜交瘤細(xì)胞注入能夠容受 該類細(xì)胞的哺乳動(dòng)物宿主的腹腔內(nèi)，然后收集其腹水。如果從腹水中收集的單克隆 抗體的數(shù)量不足，還可從該宿主的血液中收集抗體?，F(xiàn)成還有可分離和提純單克隆 抗體的各種常規(guī)方式，可從其他各種蛋白質(zhì)和夾雜物中分離出這種單克隆抗體。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，還包括抗內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體的各種有用的結(jié)合性片段，例如， 這類單克隆抗體的Fab,F(ab，)2?？刹捎酶鞣N常規(guī)技術(shù)來取得這類抗體片段。例如， 可采用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，對抗體進(jìn)行肽酶消化處理，而制備有用的結(jié)合性片 段。
本發(fā)明的各種抗體屬于鼠源性IgG級的抗體類；然而，實(shí)際并不限于此。上述的 抗體以及在功能方面與上述抗體相當(dāng)?shù)母鞣N抗體，無論是鼠源性的、哺乳動(dòng)物包括 人源性的、還是其他來源的，或者其各種組合物，都包括在本發(fā)明范疇內(nèi)，以及另
27外還有其他各級例如，IgM、 IgA、 IgE、等，包括這幾級內(nèi)的各種同型體。在各種抗
體方面，術(shù)語"功能等價(jià)"其含義是，兩個(gè)不同抗體分別與同一抗原的同一抗原部
位相結(jié)合的現(xiàn)象；換言之，就是不同的抗體競爭與同一抗原相結(jié)合的現(xiàn)象。其抗原 可以是在同一分了上，或者在不同的分子上。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，采用的是可與內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體。據(jù)證 實(shí)，附著在固體支持物上的抗-CD34單克隆抗體，能夠從人的外周血行中俘獲祖代內(nèi) 皮細(xì)胞。這類租代內(nèi)皮細(xì)胞被俘獲之后，就能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞。(Asahara等，1997， 供血管生成的推定的祖代內(nèi)皮細(xì)胞的分離處理。科學(xué)275:964-967。)由雜交瘤產(chǎn)生 的可直接對抗CD34的單克隆抗體，可取自美國標(biāo)準(zhǔn)組織收集中心(Rockville， MD)。
在另一項(xiàng)實(shí)施例中，是采用可與各種內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長 因子受體-UVEGFR-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)、 CD133或Tie-2相
反應(yīng)的各種單克隆抗體。
也可采用可與接受醫(yī)療裝置移植的同一物種中分離的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生對抗反應(yīng)的 多克隆抗體。
術(shù)語"移植片固定模"的含義是，可插入或植如血管內(nèi)腔而擴(kuò)張其血管內(nèi)腔橫徑 的任何醫(yī)療裝置材料。該術(shù)語"移植片固定模"包括，有商品供應(yīng)的已經(jīng)按照本發(fā) 明的方法進(jìn)行包敷的不銹鋼質(zhì)支持模架；這類支持模架上包敷的材料有，例如，聚 四氟乙烯(PTFE)或膨脹性聚四氟乙烯(ePTFE)。在一項(xiàng)實(shí)施例中'包括'經(jīng)皮下輸入 以治療心冠動(dòng)脈的各種閉塞癥，或?qū)τ谄⑴K、頸動(dòng)脈、骼部和腿幗部血管，封閉各 種切口或動(dòng)脈瘤的各種移植片固定模。這類支持模架可用聚合物或金屬構(gòu)件組成， 其上敷以含有抗體和一種生長因子之類物質(zhì)的基質(zhì)層，該支持模架上也可采用基質(zhì) 材料與聚合物混合的復(fù)合構(gòu)件制成。例如，可采用一種可變形的金屬絲制成的支持 模架，例如，在美國專利號(hào)4,886,062中，Wiktor已經(jīng)作了展示'在此已經(jīng)收錄作 為參考。在公開發(fā)表的國際專利申請?zhí)朩091/12779 "內(nèi)腔藥物沖洗修補(bǔ)術(shù)"(在此已 經(jīng)收錄以供參考)中展示的，用一種有彈性的材料制成的可自行張開的支持模架也已 經(jīng)可供使用。也可選用不銹鋼、各種聚合物、鎳鈦合金、鉭、金、鉑銥合金或埃爾 吉洛伊非磁性合金、MP35N，以及其他含鐵材料制造。支持模架可通過一根導(dǎo)管輸送 入體腔達(dá)到治療部位，將該支持模架放出，使之在血管內(nèi)張開直接支撐其內(nèi)腔壁。 在另一項(xiàng)實(shí)施例中，采用一種生物可降解性支持模架(H. Tamai，心冠動(dòng)脈支持模架手冊，297頁，第3版，PW Serruys和MJB Kutryk編，Martin Dunitz (2000))。對 于本領(lǐng)域老資格的技術(shù)人員都很清楚，其他各種規(guī)格的可自行張開的支持模架(例 如，彈性金屬制的支持模架)，也都可使用本發(fā)明的各種抗體、生長因子、和基質(zhì)材料。
會(huì)成辦微微
術(shù)語"合成性移植物"的含義是，具有生物相合特性的任何人造的修補(bǔ)性材料。 在一項(xiàng)實(shí)施例中，其合成性移植物材料可以是聚乙烯對苯二酸酯(Dacron⑧，PET)或 聚四氟乙烯(Teflon⑧，ePTFE)。在另一項(xiàng)實(shí)施例中，其合成性移植物可包括，聚氨 酯、交聯(lián)PVA水凝膠和/或各種生物相容的水凝膠泡沫。在還有第3項(xiàng)實(shí)施例中，其 一種合成性的移植物是，其內(nèi)層是多孔性聚碳酸酯氨基甲酸乙酯，外層是多孔性聚 乙烯對苯二酸酯。對于本領(lǐng)域的老資格技術(shù)人員顯然都很清楚，任何生物相容的合 成材料的移植物，都可使用本發(fā)明的各種抗體、生長因子、和基質(zhì)材料。(Bos等， 1998，小口徑的血管修補(bǔ)材料現(xiàn)狀。生理學(xué)和生物化學(xué)檔案。106:100-115，在此 己經(jīng)收錄作為參考文獻(xiàn))。各種合成性移植物都可用作有病的血管段對血管的端-端、 端-側(cè)、偵i」-端、側(cè)-側(cè)或血管內(nèi)腔的接合材料，或旁路材料，例如，作為腹主動(dòng)脈動(dòng) 脈瘤的裝置材料。
基jr
(A) 合成性物質(zhì)-用于包敷支持模架或合成性移植物的基質(zhì)材料，可以選自各種合 成性材料，例如，聚氨酯、嵌段性聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙 二醇、交聯(lián)PVA水凝膠、各種生物相容的水凝膠泡沫或各種親水性葡聚糖、例如， 羧甲基葡聚糖。
(B) 天然存在的物質(zhì)-選自天然存在物質(zhì)中的基質(zhì)材料有，例如，膠原、纖連蛋白、 玻璃體結(jié)合素、彈性纖維、層粘連蛋白、肝素、血纖蛋白、纖維素或碳。對于基質(zhì) 材料的初基本要求是，具有足夠的彈性和柔韌性，能夠在支持模架或合成性移植物 的暴露表面，保持不致破裂。
(C) 各種球烯類-基質(zhì)材料也可以采用球烯(術(shù)語"球烯"包含多種球烯分子)。各種 球烯是含有大量碳原子的材料。在不同的球烯中，其碳原子(C)的數(shù)量大約可在 C2fC15。。各種球烯可采用本領(lǐng)域的老資格技術(shù)人員都熟知的，采用元素碳或含碳材料 進(jìn)行高溫富裕的處理方法來生產(chǎn)。例如，利用激光使碳汽化蒸發(fā)、在電弧中將碳加熱或?qū)N類物質(zhì)在碳黑生成火焰中燃燒。(美國專利號(hào)5，292,813的Patel等；在此 引入作為參考材料；美國專利號(hào)5， 558， 903的Bhushan等；在此引入作為參考材料)。 其每一種處理方法都可產(chǎn)生含碳的沉積物或碳黑物質(zhì)。采用適用的溶劑，例如，二 甲苯，就可從這種碳黑中獲得各種球烯?？捎酶鞣N已知的方法，特別是高性能的液 相層析法(HPLC)，將各種球烯分離開來。也可利用合成的方法生產(chǎn)各種球烯，或者 通過商品供應(yīng)渠道，取自Dynamic Enterprises, Ud. ， Berkshire, England;或者 Southern Chemical Group, LLC, Tucker, Georgia, 或Bucky USA, Houston, Texas。 這類球烯可采用多種不同的方式，使之沉積在支架表面，包括，升華處理、激光 汽化處理、反應(yīng)濺射處理、離子束處理、噴涂包敷處理、浸漬涂層處理、滾搽或刷 涂包敷處理等，如美國專利號(hào)5,558,903所展示，或由移植片固定模的表面衍生而 成。
這類球烯的一種重要的特性是，能夠生成"有活性的碳"。這類球烯的電子結(jié)構(gòu)， 是以多數(shù)結(jié)合的電子協(xié)調(diào)地存在于該分子表面周圍的一種交迭的兀-軌道系統(tǒng)。(化學(xué) 和工程新聞，1991-04-08， 59頁，己經(jīng)在此引入以供參考)。各種球烯以活性炭的形 式，表現(xiàn)出明顯的對于弱相互作用的范德華力。在球烯表面的吸附性質(zhì)，可使其本 身發(fā)生另外一些變化，來引導(dǎo)各種特異性的細(xì)胞膜相互作用。例如，可選擇性地與 特定細(xì)胞類型的細(xì)胞膜或細(xì)胞膜上的特定成分，例如，各種植物血寧素或抗體相結(jié) 合的具有各種化學(xué)特性的特定分子，都能夠吸附在球烯的表面。因而，就可利用不
同的分子能夠吸附在球烯表面的特性，而創(chuàng)造出能夠有選擇性地吸附不同細(xì)胞類型， 例如，祖代內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、原始外植體、T-細(xì)胞的各種亞群等 的各種表面。美國專利號(hào)5,310， 669的Richmond等，在此已經(jīng)列為參考材料；St印hen R. Wilson,球烯類的生物學(xué)特性。球烯:化學(xué)、物理學(xué)和工藝學(xué)，Kadish等編，John Willey & Sons, NY2000,已經(jīng)再次列為參考材料。
球烯還可與其他原子或分子相混合而形成一種納米管。(Liu等，, 280:1253-1256(1998)。已經(jīng)在此列為參考文獻(xiàn))。關(guān)于碳納米管的合成和制備方法， 在本領(lǐng)域中都是普遍熟知的。(美國專利號(hào)5,753,088的01k等，以及美國專利號(hào) 5， 641， 466的Ebbson等，兩份材料都已經(jīng)在此列為參考文獻(xiàn))。各種蛋白質(zhì)之類的分 子都能夠結(jié)合在碳納米管之內(nèi)。例如，納米管可以充滿各種酶類，例如，Zn2Cd2-金 屬硫因、細(xì)胞色素C和C3以及切開納米管的端部后有乙型-內(nèi)酰胺酶。(David等， 無機(jī)化學(xué)檔案272:261(1998); Cook等，科學(xué)技術(shù)詳解5 (4:695 (1997);兩者都已經(jīng) 在此列為參考文獻(xiàn))。球烯的三維空間結(jié)構(gòu)也都可使用。美國專利號(hào)5,338.571的Mirkin等，在此已 經(jīng)引為參考文獻(xiàn)，揭示了以如下幾種方式在基礎(chǔ)表面形成球烯的各種三維空間多層 的結(jié)構(gòu)(i)化學(xué)改型的球烯，提供一種形成鍵合的種類；(ii)對基礎(chǔ)表面進(jìn)行化學(xué) 處理，以形成可有效地與在溶液中的球烯的鍵合形成種類形成共價(jià)鍵合的一種鍵合 種類；以及(iii)使改型的各種球烯與經(jīng)過處理的基礎(chǔ)表面相接觸，使之形成與該處 理過的基礎(chǔ)表面發(fā)生共價(jià)鍵合的球烯層。
(A) 基質(zhì)材料在醫(yī)療裝置方面的應(yīng)用 基質(zhì)材料必須與支持模架或合成材料移植物的表面緊密黏附。較好的是，可采用 連續(xù)的若干薄層基質(zhì)材料來實(shí)現(xiàn)這一要求?；蛘?，可將抗體和生長因子材料只用于 直接接觸血管內(nèi)腔的外層表面?？上嗬^連續(xù)若干層采用不同類型的各種基質(zhì)材料。 可在基質(zhì)層包敷在支持模架上之后，再將各種抗體以共價(jià)或非共價(jià)方式，包敷在基 質(zhì)材料上。
在對支持模架之類的醫(yī)療裝置施行包敷處理方面，可用中等粘度的基質(zhì)液態(tài)溶 液，將支持模架浸漬或噴涂。每一層涂敷后，都要將支持模架晾干，再可涂敷下一 層。在一項(xiàng)實(shí)施例中，其菲薄涂料樣的包敷層的厚度，總共不超過ioo微米。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，對于支持模架表面，先進(jìn)行功能性處理，再加上基質(zhì)層。然后，
再將抗體和生長因子結(jié)合在基質(zhì)層的表面。在本發(fā)明的這一方面，對于支持模架表
面的技術(shù)是創(chuàng)造一類具有功能性的化學(xué)基團(tuán)。再用這類化學(xué)基團(tuán)，例如，胺類，將
賴以支持抗體和生長因子的基質(zhì)的中層固定。
在另一項(xiàng)實(shí)施例中，先制備一種適用的基質(zhì)包敷溶液，g卩，將一種藥物載體，例
如，聚右旋左旋(混旋)丙交酯(以R203形式供應(yīng)，Boehringer Inc., Ingelheim, Germany) 480毫克，以無菌條件溶于3毫升氯仿中。不過，在原則上，具有生物可降 解性(或非生物可降解性)以及血液和組織相合性(生物相容的)，并能夠溶解、分散 或乳化的任何基質(zhì)材料，都可作為基質(zhì)使用，只要在使用于醫(yī)療裝置包敷處理之后， 能夠迅速自行干燥成為油漆樣或涂料樣的包敷層。
例如，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)員工中，對于采用血纖蛋白包敷支持模架的技術(shù)都是 熟知的。在Muller等申請的美國專利號(hào)4,548，736(在此已經(jīng)列為參考材料)中，是 采用含有凝血酶的血纖蛋白原處理，使血纖蛋白凝固。較好的是，如Gerendas在其 美國專利號(hào)3， 523, 807中論述，或在已發(fā)表的歐洲專利申請材料0366564中論述，(該 兩份材料都己經(jīng)在此列為參考文獻(xiàn))，為了改善植入裝置的機(jī)械特性和生物穩(wěn)定性，在本發(fā)明的含有血纖蛋白的支持模架中的血纖蛋白，在凝固過程須加入因子VIII和 鈣成分。較好的是，在本發(fā)明中用于處理血纖蛋白的血纖蛋白原和凝血酶，都必須 取自須施行支持模架植入的同一種動(dòng)物或人體，以避免任何動(dòng)物種間的免疫反應(yīng)， 例如，人抗牛反應(yīng)。血纖蛋白的生產(chǎn)，可以是將血纖蛋白原和凝血酶混合，鑄成菲 薄的血纖蛋白膜，然后利用半透膜的滲透作用除去所述水分。在歐洲專利申請
0366564材料中，是利用一種基礎(chǔ)材料(較好的是，具有多孔性或?qū)τ谀富蜓w 蛋白原具有高度親和力)處理血纖蛋白原溶液和凝血酶溶液。結(jié)果，其血纖蛋白原就 可在醫(yī)療裝置表面發(fā)生聚合作用，而形成血纖蛋白層。利用這種方法重復(fù)多次敷以 血纖蛋白層，就可得到任何所需厚度的血纖蛋白層?；蛘?，可先使血纖蛋白凝固， 然后調(diào)入一種粉劑加水碾磨，并裝入加熱的模具中，壓鑄成所需的形狀(美國專利號(hào) 3,523,807)。將已經(jīng)成形的血纖蛋白膜用一種固定劑，例如，戊二醛或甲醛處理， 更可提高其穩(wěn)定性。在本領(lǐng)域的老資格技術(shù)人員所知的這類或其他各種方法，都可 供本發(fā)明用于制造和形成血纖蛋白薄膜。
在對合成材料的移植物包敷膠原方面，對于膠原的制備和將其包敷在合成材料的 移植物裝置的方法，都是一般都熟知的，并在Weadock等的美國專利號(hào)5, 851， 230(在 此已經(jīng)列為參考文獻(xiàn))中已經(jīng)論述。該專利報(bào)告中論述了對于合成材料移植物包敷膠 原的各種方法，在多孔性移植物基材上黏附膠原的方法，通常是將膠原分散在移植 物基材上，待其干燥，重復(fù)數(shù)次。膠原的分散材料的制備， 一般是將不溶性的膠原(以 重量計(jì)，大約1-2%)以酸性pH(pH范圍為2-4)制成分散混合物。通常是用注射器將 該分散物注入移植物內(nèi)腔，并用手揉搓，使該膠原糊劑料包敷在其整個(gè)內(nèi)表面。按 要求其包敷和干燥處理步驟可重復(fù)操作多次。
在還有一項(xiàng)實(shí)施例中、是采用無定形碳來包敷支持模架或合成材料的移植物。在 此列為參考材料的美國專利號(hào)5,198,263中，論述了在氟化處理或其他鹵化物氣體 的條件下，以高速低溫的沉積方式，生產(chǎn)無定形碳薄膜的一種方法。按照本發(fā)明的 方法，其沉積過程可在低于IOO 。C包括室內(nèi)大氣的溫度下實(shí)施，其方法包括，射頻 處理、血漿輔助處理、化學(xué)蒸發(fā)沉積處理等。采用本發(fā)明的各種方法制備的無定形 碳薄膜層，對于各種類型的基材，能夠牢固黏附。包括例如，各種玻璃、金屬、半 導(dǎo)體以及塑料。
球烯分子部分與含胺的聚合物中的反應(yīng)性氨基團(tuán)相結(jié)合時(shí)，可形成-球烯-移植 物。含胺聚合物類可按照美國專利號(hào)5,292,813所述進(jìn)行制備。該方法中的化學(xué)修 改技術(shù)，可使直接使球烯直接與支持模架相結(jié)合。在另一項(xiàng)實(shí)施例中，可按照上述的方法，使球烯沉積在支持模架或合成材料移植物表面。(參見，Leone等的 W099/32184，在此已引為參考材料)。各種球烯(例如，C6。)也可通過一種環(huán)氧化物的 鍵合作用，黏附在不銹鋼材料的表面(Yaniago等，各種有機(jī)性的球烯通過氧化作用、 還原作用以及C-0與C-C鍵合作用等形成反應(yīng)過程的化學(xué)衍生狀況。有機(jī)化學(xué)雜志， 584796-4798(1998)，已經(jīng)在此引為參考材料)。其附著作用是與氧素形成鍵合。這 種物質(zhì)及其結(jié)合處理方案，在美國Bucky公司都有商品供應(yīng)(BuckyUSA， Houston, Texas)。
(B) 對于基質(zhì)材料加入抗體和生長因子-各種抗體可促進(jìn)祖代內(nèi)皮細(xì)胞的黏
附
能力，各種生長因子則是以共價(jià)或非共價(jià)的方式與基質(zhì)相結(jié)合，而促進(jìn)細(xì)胞的生 長和分化?？蓪⒖贵w和生長因子與基質(zhì)包敷溶液混合，再涂敷于裝置表面，抗體和 生長因子就可與基質(zhì)層相結(jié)合。通常，抗體和生長因子是附著在包敷在裝置的內(nèi)腔 面所涂敷的基質(zhì)的最外層。因而所述抗體和生長因子，就可突出在其與循環(huán)血行相 接觸的表面?？贵w和生長因子都可采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)施敷于表面的基質(zhì)層。
在一項(xiàng)實(shí)施例中，是將抗體加入含有基質(zhì)材料的溶液中。例如，對于抗-CD34單 克隆抗體的Fab片段，用含有濃度為500-800毫克/分升的人血纖蛋白原的溶液一起 培育。就能夠判定抗-CD34單克隆抗體的Fab片段的濃度所發(fā)生的變化，本領(lǐng)域的一 般技術(shù)人員也都能夠確定其最適宜的濃度，而不必過分依賴實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將支持模架 放入Fab/血纖蛋白混合物中，再添加濃縮的凝血酶(濃度至少達(dá)到1000單位/毫升)。 將所形成的含有直接與基質(zhì)相結(jié)合的Fab片段的聚合化的血纖蛋白混合物，在支持 模架或合成材料的移植物表面壓制成薄膜層(小于ioo微米)。實(shí)際上，任何類型的 抗體或抗體片段都能夠依此方法結(jié)合在基質(zhì)溶液中，再包敷到支持模架或合成材料 的移植物表面。
例如，在另一項(xiàng)實(shí)施例中，帶有或不帶有抗體片段的完整抗體以及生長因子，都 可以共價(jià)方式與基質(zhì)相結(jié)合。在一項(xiàng)實(shí)施例中，各種抗體和(各種)生長因子都可利 用異種-或同種-雙功能連接分子以共價(jià)的方式與基質(zhì)栓系在一起。在此采用的術(shù)語 "栓系起來"是指，利用連接分子將抗體栓系在基質(zhì)上。有關(guān)本發(fā)明所用的連接分 子，是在基質(zhì)黏附在支持模架上之后，再以共價(jià)方式將連接分子與該基質(zhì)相連接。 在與基質(zhì)形成共價(jià)結(jié)合之后，該連接的分子可對基質(zhì)提供一批活性功能性基團(tuán)。依 賴這類功能性基團(tuán)，就可進(jìn)一步與一種或多種抗體形成共價(jià)結(jié)合。圖1A顯示的是通過膠聯(lián)分子的結(jié)合狀態(tài)。所述內(nèi)皮細(xì)胞1. 01通過細(xì)胞表面的抗原1. 02與抗體1. 03 相結(jié)合，該抗體通過膠聯(lián)分子1. 04與基質(zhì)1. 05-1. 06栓系在一起?；|(zhì)1. 05-1. 06 黏附于支持模加1.07上。各種連接分子能夠與基質(zhì)直接(g卩，通過羧基)相連接，也 可通過著名的連接化學(xué)作用相連接，例如，酯化作用、酰胺化作用以及?；饔?br> 連接分子可以是一種雙胺或三胺的功能性物質(zhì)，可通過酰胺鍵合而與基質(zhì)相結(jié) 合，并可提供胺功能基團(tuán)而與抗體發(fā)生反應(yīng)。例如，連接分子可以是聚胺功能性聚 合物。例如，聚乙烯亞胺(PEI)、聚烯丙基酰胺(PALLA)或聚乙二醇(PEG)。已經(jīng)有多 種聚乙二醇衍生物，例如，m聚乙二醇-琥珀酰二酰亞胺基丙酸酯或m聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺，包括若千共價(jià)結(jié)合方案，都已經(jīng)由Shearwater Corporation, Birmingham, Alabama提供商品供應(yīng)。(還可參見Weiner等，聚乙二 醇襯墊對于固定的抗體對抗原俘獲的影響。生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志 45:211-219(2000)，已經(jīng)在此列為參考文獻(xiàn))。須注意，對于具體的結(jié)合劑的選擇， 須根據(jù)所用的抗體類型而定，這種選擇不必過分依賴實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。也可采用這類聚合 物的混合材料。這類分子中，含有多數(shù)未定的胺功能性基團(tuán)，可用于對一種或多種 抗體施行表面固定處理。
抗體可附著在已經(jīng)直接沉積在支持模架表面上的C6。球烯層。各種交聯(lián)劑則可以 共價(jià)方式附著在球烯層上。先使抗體附著在交聯(lián)劑層，然后，就可附著在支持模架 上。圖lB顯示了Ce。的結(jié)合情況。其中，內(nèi)皮細(xì)胞2.01通過細(xì)胞表面抗原2.02與抗 體2.03相結(jié)合，而抗體再以共價(jià)或非共價(jià)的方式與基質(zhì)2.04結(jié)合，基質(zhì)2.04則以 共價(jià)方式，通過C6。2.05與支持模架2.06相結(jié)合。
本發(fā)明的各種小型分子物質(zhì)，含有可用于替代抗體、生長因子或其片段合成性或 天然存在的各種分子或肽類物質(zhì)。例如，凝集素是一類天然存在的非免疫原性的與 糖類結(jié)合的肽類。 一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性凝集素抗原(Ulex Europaeus Uea 1) (Schatz
等2000人子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和1型血血纖蛋白溶酶原催化物抑制因子的 分離、鑒定以及炎癥介導(dǎo)的表達(dá)。生物繁殖62:691-697)具有能夠?qū)ψ娲鷥?nèi)皮細(xì)胞 表面的選擇性結(jié)合能力。
已經(jīng)創(chuàng)造出能夠以各種細(xì)胞表面受體作為靶標(biāo)的一種合成性"小型分子物質(zhì)"。 這類分子物質(zhì)能夠有選擇地與(各種)特異性受體相結(jié)合，并且能夠針對特異性細(xì)胞 類型，例如，祖代內(nèi)皮細(xì)胞選定耙標(biāo)。已經(jīng)能夠合成可以識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物， 例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的小型分子物質(zhì)SU11248(Sugen Inc.) (Mendel 等2003，以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體和血小板衍生生長因子受體為靶標(biāo)的一種新型的酪氨酸激酶抑制物SU11248在體內(nèi)的抗腫瘤活性藥物動(dòng)力學(xué)/藥物活力相互關(guān) 系的確定。臨床癌癥研究 一月；9(1) :327-37); PTK787/ZK222584(Drevs J等，2003， 受體的各種酪氨酸激酶:抗癌癥治療的一些新的主要靶標(biāo)。現(xiàn)到藥物的各種靶標(biāo)。二 月;4(2) :113-121);以及SU6668(Laird， AD等，2000，在體內(nèi)SU6668對Flk-1/KDR 和乙型PDGFR的抑制作用，在小鼠體內(nèi)可導(dǎo)致腫瘤血管系統(tǒng)迅速凋亡和腫瘤衰退。 FASEB雜志，五月；16(7) :681-690);都是可與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2相結(jié) 合的小型分子物質(zhì)。
以內(nèi)皮細(xì)胞表面為靶標(biāo)的合成性小型分子物質(zhì)的另一個(gè)亞組是，甲型(v)乙型 (3)integrin(alpha(v)beta(3)integrin)抑制物。SM256和SD983(Kerr JS等，1999 新型小分子物質(zhì)alpha v integrin拮抗物:與已知的各種促血管生成素類抑制物的 抗癌癥功效相比較?？拱┌Y研究，三月，四月；19(2A):959-968)是兩種合成分子， 能夠以存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的alpha(v)beta(3)作為靶標(biāo)，并與之相結(jié)合。
試驗(yàn)性實(shí)施例
本發(fā)明分節(jié)詳細(xì)列述各項(xiàng)試驗(yàn)實(shí)施例如下。下述各節(jié)都是在本發(fā)明的理解范圍， 但是，如后附的權(quán)利要求所述，并無意圖也切勿解釋為對于本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
內(nèi)皮祖細(xì)胞的表型鑒定
據(jù)新近介紹(Asahara T, Murohara T， Sullivan A等，供血管生成用的推定的內(nèi) 皮詛代細(xì)胞的分離方法。,，1997; 275:964-967)，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)可采用CD34+ 磁珠分離法(Dynal Biotech)或富集培養(yǎng)基分離法進(jìn)行分離。其方法大體是，從健康 男性志愿者取得外周靜脈血液，以密度梯度離心法分離所述單核細(xì)胞組合物。將該 細(xì)胞材料涂布在用人的纖連蛋白包敷的培育玻片(Bcton Dickinson)上的培養(yǎng)基內(nèi)。 培養(yǎng)基是EC基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(EBM-2) (Clonetics)，其中補(bǔ)充了 5%的胎牛血清、人血 管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-A、人成纖維細(xì)胞生長因子-2、人表皮生長因子、胰島素樣生 長因子-1以及抗壞血酸、每48小時(shí)更換培養(yǎng)基，令內(nèi)皮祖細(xì)胞培育7天。這批試驗(yàn) 結(jié)果如圖2A和2B所示，其中由抗-CD34分離的細(xì)胞，形如紡錘狀，表明是在分化為 內(nèi)皮細(xì)胞。
采用免疫組織化學(xué)方法測定內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的表型。其方法大體是，將內(nèi)皮祖細(xì)胞 放入2%多聚甲醛(PFA) (Sigma)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) (Sigma)溶液經(jīng)10分鐘，用
磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，再用各種內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物染色:例如，兔抗人血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2 (Alpha Diagnostics, Intl. Inc.)、小鼠抗人Tie-2 (CloneAb33， Upstate Biotechnology)、小鼠抗人CD34 (Becton Dickinson)、內(nèi)皮細(xì)胞凝 集素(Ulex Eur叩aeus Uea) (Sigma)以及小鼠抗人因子8(Sigma)。將細(xì)胞暴露在熒光 素異硫氰酸鹽(FITC)結(jié)合的次級抗體，就可驗(yàn)證抗體的存在。碘化丙錠(PI)則作為 細(xì)胞核染色標(biāo)記物。這組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2C-2G所示。圖2C所示為，培育24小時(shí) 之后表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2的情況，驗(yàn)證了該細(xì)胞正是內(nèi)皮細(xì)胞；圖 2D和2F在培育7天之后，結(jié)合的細(xì)胞的細(xì)胞核染色情況；以及圖2E和2G表明是細(xì) 胞著染和對抗Tie-2抗體的同一個(gè)視野的情況。
內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮合成酶(eNOS)，這是內(nèi)皮細(xì)胞功能的一種 特性。可采用反向轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-PCR)對于內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮合成酶 mRNA進(jìn)行測定?？墒箖?nèi)皮祖細(xì)胞在EBM-2培養(yǎng)基中生長7天后，采用基因洗脫哺乳 動(dòng)物總RNA試劑盒(Sigma)來分離總RNA，再在260納米波長測定其吸光值進(jìn)行定量。 對于總RNA采用Omniscript反向轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)用1微克隨意的引物反向轉(zhuǎn)錄 成20微升容量。每種反向轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)物取最終反應(yīng)容量的等份量(2-IO微升)，在兩 組平行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增處理，其中采用內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮合成酶(eNOS) (299bp產(chǎn)物，正義5，-TTCCGGGGATTCTGGCAGGAG-3，，反義5，-GCCATGGTCGCCGCAG-3，) 或GAPDH (343bp產(chǎn)物，正義5，-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3，，反義5，-GAGATCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')作為特異性引物，和T叫聚合酶(Pharmacia Biotech Amersham)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)周期程序如下94。C5分鐘，65 。C 45分鐘，72°C30分 鐘(用內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮合成酶時(shí)須經(jīng)35個(gè)周期，用GAPDH時(shí)須經(jīng)25個(gè)周期)。反 向轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行分析采用溴非乙啶 染色進(jìn)行眼觀判定，并采用密度測計(jì)法進(jìn)行定量測定。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3A和3B 所示。圖中顯示，在含有或不含氧的培育條件下，細(xì)胞在培養(yǎng)基中培育3天后，都 有氧化一氮合成酶(eNOS)的表達(dá)，在培育7天之后，可持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮 合成酶mRNA。內(nèi)皮細(xì)胞氧化一氮合成酶mRNA的存在，表明細(xì)胞在培育第3天就分化 為成熟的內(nèi)皮性，開始在功能方面如同完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞。
實(shí)施例2
包敷抗-CD34抗體的不銹鋼碟對內(nèi)皮細(xì)胞的俘獲
在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心)一 直生長在內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中。細(xì)胞是培育在用CMDX和白明膠包敷的樣本上，其 表面有或沒有結(jié)合的抗體，或者是裸露的不銹鋼(SST)樣本。經(jīng)培育之后，除去培養(yǎng)基，對樣本用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗兩次。將細(xì)胞固定在2%多聚甲醛(PFA)中 IO分鐘，再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，每次10分鐘以保證固定劑已全部除去。每 份樣本須在室溫下用封閉溶液培育30分鐘，以封閉所有的非特異性封閉現(xiàn)象。樣本 經(jīng)用磷酸鹽緩沖鹽水一次清洗之后，暴露在以1:100稀釋的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 受體-2抗體中培育過夜。然后再將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，以保證全部初 級抗體完全除去。將在封閉溶液制備的熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的次級抗體，以1:100 的稀釋度分別加入每份樣本，在Belly Dancer裝置中于室溫下培育45分鐘。經(jīng)培 育之后，樣本再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，再用含有O. l%Tween 20的磷酸鹽緩沖 鹽水溶液清洗1次，然后再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗。將樣本用碘化丙錠(PI)封裝， 并在共焦顯微鏡下觀察。
圖4A-4E是如下各類不銹鋼(SST)樣本的顯微照相圖象包敷CMDX和抗-CD34抗體 (圖4A)、包敷白明膠和抗-CD34抗體(圖4B)、裸露的不銹鋼材料(圖4C)、包敷CMDX 而無抗體(圖4D)以及包敷白明膠而無抗體(圖4E)。圖中數(shù)據(jù)顯示，惟有包敷抗體的 樣本，由碘化丙錠染色呈現(xiàn)的含有多數(shù)附著在樣本表面細(xì)胞。對照的裸露的不銹鋼 碟的表面卻也有少數(shù)細(xì)胞附著。
圖5A-5C是在其表面有CMDX包敷而無抗體結(jié)合的對照樣本的顯微照相圖象。圖 5A顯示，由碘化丙錠染色顯示在樣本表面有很少量細(xì)胞黏附。圖5B顯示，黏附的細(xì) 胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2陽性，表明這類細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。顯示了細(xì)胞核 染色與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2陽性的綠色熒光組合的情況。圖5D-F是在其表 面包敷白明膠而無抗體結(jié)合的對照樣本的顯微照相圖象。圖5D顯示，樣本中因無碘 化丙錠的染色而未顯出細(xì)胞存在，各份樣本也未顯現(xiàn)綠色熒光發(fā)射(參見圖5E和5F)。
圖6A-6C是在其表面包敷CMDX并且有抗-CD34抗體結(jié)合其上的不銹鋼樣本的顯微 照相圖象。其數(shù)據(jù)表明，各樣本上含有多數(shù)黏附的細(xì)胞，已經(jīng)接近融合一片單層(圖 6A)。并且據(jù)所述綠色熒光顯示，是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2陽性的表現(xiàn)(圖6B 和6C)。同樣，圖6D-6F是在其表面包敷白明膠并且有抗-CD34抗體結(jié)合其上的樣本 的顯微照相圖象。其各項(xiàng)數(shù)據(jù)也表明，由多數(shù)紅染的細(xì)胞核與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因 子受體-2/熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的抗體所呈現(xiàn)的綠色熒光顯示，有人臍帶靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞附著在樣本表面(圖6E和6F)。
實(shí)施例3
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2和Tie-2對于祖代內(nèi)皮細(xì)胞的染色作用按照實(shí)施例l所述，從人的血液中分離祖細(xì)胞，并在活體外的生長培養(yǎng)基中，培
育24小時(shí)、7天、和3周。培育之后，除去培養(yǎng)基，將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗 兩次。細(xì)胞再用2%多聚甲醛(PFA)固定處理10分鐘，然后用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3 次，每次10分鐘。以保證除去所有的固定劑成分。每份樣本用440微升山羊性(對 于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2)或馬性(對于Tie-2)封閉溶液在室溫下培育30分 鐘。以封閉全部非特異性結(jié)合作用。將樣本用磷酸緩沖鹽水清洗1次，再加入用封 閉溶液稀釋成1:100的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2或Tie-2抗體，將樣本培育過 夜。再將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，以保證清除全部初級抗體。對每份樣本 按照1:100稀釋加入馬性或山羊性封閉溶液制備的熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的次級抗 體(200微升)，在Belly Dancer裝置中于室溫下培育45分鐘。經(jīng)培育之后，樣本再 用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，再用含有0. l%Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水溶液清洗1 次，然后再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗。將樣本用碘化丙錠(PI)封裝，并在共焦顯微鏡 下觀察。
圖7是經(jīng)CMDX包敷，在其表面含有CD34抗體的樣本，加入細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)培育 后的顯微照相圖象。由樣本表面呈現(xiàn)的紅染的細(xì)胞核，顯示其樣本的表面有祖細(xì)胞 被俘獲。其數(shù)據(jù)還表明，大約有75%的細(xì)胞的形態(tài)呈圓形，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長 因子受體-2呈陽性。
圖8A和8B是從培育7天的細(xì)胞取得的樣本。圖8A顯示，在樣本中呈現(xiàn)紅染的 細(xì)胞核，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2呈陽性，表明其中含有細(xì)胞(圖8B， 100%)， 由細(xì)胞的紡錘形顯示其具有較多的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
圖9A和9B是在其表面包敷CMDX并含有CD34抗體的樣本，加入細(xì)胞培育7天， 經(jīng)培育之后再將樣本暴露Tie-2抗體的顯微照相圖象。在圖9A可見到有紅染的細(xì)胞 核，表明樣本表面有多數(shù)細(xì)胞附著。并且，據(jù)細(xì)胞發(fā)射的綠色熒光表明，附著在樣本 表面的細(xì)胞也是Tie-2陽性(100。/。))(圖29B)?？傊跇颖局屑尤爰?xì)胞培育7天后， 在CD34抗體包敷的樣本，據(jù)其表面有多數(shù)細(xì)胞附著，以及在附著的細(xì)胞表面存在著 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2和Tie-2受體的情況表明，這種樣本能夠俘獲內(nèi)皮細(xì) 胞。此外，在培育7天的樣本表面存在著100%內(nèi)皮細(xì)胞的情況表明，非內(nèi)皮細(xì)胞都 已經(jīng)被分離，或者，在培育的第7天，所有附著的細(xì)胞都已經(jīng)表達(dá)了內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo) 記物。
圖10A-10C是在內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基中培育生長周的祖代內(nèi)皮細(xì)胞的相差顯微照 相圖象。圖10A顯示，據(jù)其中形成的類似血管內(nèi)腔(箭頭所示)二維管狀結(jié)構(gòu)(箭頭)表明，所述細(xì)胞已經(jīng)分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。圖10B顯示，細(xì)胞已經(jīng)形成多層的三 維結(jié)構(gòu)，即， 一個(gè)細(xì)胞在另一個(gè)細(xì)胞的上部。這種情況驗(yàn)證了有關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的生長 期延長時(shí)就開始形成一個(gè)落在一個(gè)上面的多層結(jié)構(gòu)的報(bào)道。圖10C顯示，在涂布培
育生長3周之后的祖細(xì)胞己經(jīng)具備內(nèi)皮細(xì)胞的外觀，該圖示確認(rèn)，由樣本表面存在 CD34/熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的抗體的綠色熒光證實(shí)，所述細(xì)胞已經(jīng)是內(nèi)皮細(xì)胞。
上述數(shù)據(jù)表明，從人的血液分離的白血細(xì)胞中含有CD34陽性的祖細(xì)胞，并且容 易表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的各種表面抗原(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2和Tie-2)。此項(xiàng)數(shù) 據(jù)也表明，抗祖細(xì)胞或干細(xì)胞表面抗原的各種抗體，也可包敷在本發(fā)明的醫(yī)療裝置 表面，用于俘獲這類細(xì)胞。
實(shí)施例4
對于不銹鋼的球烯包敷以及球烯配以抗-CD34抗體和/或 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Ang-2， VEGF)的包敷
不銹鋼支持模架和平碟都可采取如下程序，敷以功能性球烯層，而可附著各種抗 體和/或生長因子(血管內(nèi)皮生長因子或促血管生成素)
第一步是，對于不銹鋼的支持模架或碟子，用0.5M HC1進(jìn)行活化處理，同時(shí)還 清除其表面的任何鈍化性污染物。從活化處理池中取出該金屬樣本，用蒸餾水沖洗， 經(jīng)甲醇脫水，放在75。C烘爐上烘干。再將該支持模架浸入加有氧化球烯(C6。-0)甲苯 衍生溶液經(jīng)24小時(shí)。該氧化球烯可通過在該支持模架上可發(fā)現(xiàn)的Fe-0、 Cr-0、 Ni-O 而與該支持模架相結(jié)合。將支持模架從該衍化池中取出，用甲苯?jīng)_洗，再放入 Soxhlet抽提器經(jīng)16小時(shí)，用新鮮的甲苯清除其中自然吸附的C6。。將支持模架取出， 再放入105°C烘爐中干燥過夜。這一反應(yīng)過程可制成具有單層球烯的完全衍化的支 持模架或碟子。
第二步是，由癸二酸與亞硫酰二氯或氯氧化硫(S0Cl2)而形成氯化癸二酰。該氯化 癸二酰再與鋰鋁[t-叔丁基LH和二甘醇二甲醚發(fā)生反應(yīng)，可產(chǎn)生1,10-癸二醇 (decanediol)，其反應(yīng)式如下
<formula>formula see original document page 39</formula>第三步是，在支持模架或碟子的表面(由第一步)形成N-甲基吡咯烷.衍生物。將 等摩爾量的球烯和N-甲基甘氨酸與第二步的反應(yīng)產(chǎn)物1，10-癸二醇，在充氮回流的 甲苯溶液中再進(jìn)行48小時(shí)反應(yīng)，球烯分子可進(jìn)一步衍化，而產(chǎn)生N-甲基吡咯烷衍生 的球烯-不銹鋼支持模架或碟子，列述如下
經(jīng)衍生處理的不銹鋼支持模架或碟子須進(jìn)行清洗冊底除去任何化學(xué)品殘跡，再用 于結(jié)合抗體(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和促血管生成素-2 (Ang-2))和/或用于其 他標(biāo)準(zhǔn)操作程序。如實(shí)施例1所述，從人血液中提取分離祖細(xì)胞，暴露處理用抗-CD34 抗體包敷的球烯碟子，經(jīng)培育之后，將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗兩次。細(xì)胞用2%多 聚甲醛(PFA)固定處理10分鐘，再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，每次10分鐘，以保 證除去全部的固定劑。每一份樣本都用封閉溶液在室溫下培育30分鐘，，以封閉全 部非特異性結(jié)合。將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗一次，再暴露在1:100稀釋的血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2抗體，培育過夜。然后將樣本用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次， 以保證除去全部初級抗體。分別對每份樣本加入以1:100稀釋度用封閉溶液制備的 熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的次級抗體。，放入Belly Dancer裝置在室溫下培育45分鐘。 經(jīng)培育之后，經(jīng)培育之后，樣本再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗3次，再用含有O. l%Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水溶液清洗1次，然后再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗。將樣本用碘化 丙錠(PI)封裝，并在共焦顯微鏡下觀察。圖11顯示是用功能性的球烯包敷的本發(fā)明 的支持模架表面并結(jié)合祖細(xì)胞的示意圖象。圖12A-12B分別是球烯包敷的沒有碘化 丙錠(PI)染色(12A)，也沒有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)的抗體/熒 光素異硫氰酸鹽結(jié)合的(FITC)抗體染色的對照樣本的顯微照相圖象。圖12C和12D 是包敷有球烯/抗-CD34抗體包衣的樣本的顯微照相圖象。如各插圖所示，在抗-CD34 抗體包敷的樣本中，含有較多附著在其表面的細(xì)胞，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受 體-2呈現(xiàn)陽性。
如實(shí)施例5所述，將含有或不含抗體的球烯包敷的樣本，植入一組約克夏豬體內(nèi)。 對移植的支持模架進(jìn)行組織學(xué)研究，對支持模架分割的片段用10%緩沖的福爾馬林 沖洗30秒鐘，并固定在10%緩沖的福爾馬林中備用。每個(gè)支持模架切割成5份l 毫米支架的近側(cè)段、l毫米近側(cè)端段、中段、l毫米遠(yuǎn)側(cè)邊段以及l(fā)毫米遠(yuǎn)側(cè)端段。 各段樣本材料都采用蘇木紫伊紅(服)和彈性蛋白三色劑(Elastin Trichrome)染色。圖13A-13D都是通過已經(jīng)植入4周的支持模架的心冠動(dòng)脈外植體橫截面的顯微照相 圖象。其數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)球烯包敷(圖13B和13D)的支持模架，與對照材料相比較(裸 露的支持模架，圖13A和13C)，可抑制在支持模架部位的過度的內(nèi)膜組織增殖。
實(shí)施例5
豬體氣囊損傷研究
對一組體重在25-30千克的一組幼齡約克夏豬，植入抗體包敷的支持模架。豬群 按照"實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用手冊"(NIH出版號(hào)80-23，修訂版，1985)進(jìn)行照料。先令 豬群饑餓過夜，再施用增靜劑氯胺酮(20毫克/千克)。再經(jīng)施用戊硫代巴比妥(12毫 克/千克)誘導(dǎo)麻醉后，分別插管并連接通氣機(jī)，輸以氧和一氧化二氮的混合氣體 (l:2[容量/容量])。麻醉過程以0.5-2.5容量％異氟烷來維持。同時(shí)施以抗生素預(yù) 防措施，用普魯卡因青霉素-G和芐星青霉素-G(鏈霉素)混合物1000毫克施行肌肉內(nèi) 注射。
在無菌條件下，對左側(cè)頸動(dòng)脈施行動(dòng)脈切開術(shù)，對左側(cè)頸動(dòng)脈插入一個(gè) 8F (French, 1F=0. 33毫米)口徑的插管套管，各例試驗(yàn)豬分別給予100單位/千克體重 的肝素。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，還要定時(shí)給予2， 500國際單位的肝素濃縮藥團(tuán)，以維持 大約300秒鐘的活化凝固時(shí)間。再在該頸動(dòng)脈套管中插入一條6F 口徑規(guī)格的導(dǎo)管， 通入心門抵達(dá)心冠動(dòng)脈。對心冠動(dòng)脈內(nèi)輸入200微克三硝酸甘油酯后，進(jìn)行血管造 影術(shù)，并采用定量心冠動(dòng)脈血管照相裝置對其影象進(jìn)行分析。對于心冠動(dòng)脈的近端 部位插入一條3F 口徑的栓子切除術(shù)導(dǎo)管，探向其遠(yuǎn)端段選定的植入移植片固定模的 部位，并剝除其上的內(nèi)皮細(xì)胞層。將經(jīng)包敷R并結(jié)合抗-CD34抗體的移植片固定模， 通過定向?qū)Ч芩椭列墓趧?dòng)脈剝除內(nèi)皮細(xì)胞層的部位。利用裸露的不銹鋼支持模架或 包敷基質(zhì)而沒有抗體的支持模架作為對照。植入左前降支心冠動(dòng)脈(LAD)或右心冠動(dòng) 脈(RCA)或旋繞心冠動(dòng)脈(Cx)的各支持模架，在模架與動(dòng)脈之家的比率市是1:1。通 過血管造影術(shù)來確定對支持模架的校準(zhǔn)和位置，然后取出插管套管，將皮膚分兩層 閉合。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，將實(shí)驗(yàn)豬放在300毫克的ASA上。
實(shí)驗(yàn)豬在植入移植片固定模之后，分別在l、 3、 7、 14和28天將各例豬只先按 照上述方式施行鎮(zhèn)靜和麻醉，然后撲殺。采取植入支持模架的心冠動(dòng)脈部位，連帶 其近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)的無支持模架的血管段各1厘米，作為外植體樣本。用3種方法處理 該植入支持模架的心冠動(dòng)脈，即，組織學(xué)方法、免疫組織化學(xué)方法以及掃描電子顯 微鏡方法。在免疫組織化學(xué)方法方面，將摘出的支持模架用10%福爾馬林輕輕沖洗30秒鐘，
并保存在10%福爾馬林/磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中，備用。預(yù)定供免疫組織化學(xué) 方法處理的支持模架，都用2%多聚甲醛(PFA)的磷酸鹽緩沖鹽水溶液沖洗30秒鐘， 然后放入2%多聚甲醛溶液中浸泡15分鐘，再用磷酸鹽緩沖鹽水清洗和保存，以備 用家兔抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2 (VEGFR-2)或小鼠抗人Tie-2進(jìn)行免疫組織 化學(xué)方法檢測。
供掃描電子顯微鏡方法(SEM)的移植片固定模的制備程序是，將支持模架用10% 緩沖的福爾馬林沖洗30秒鐘，放入2。/。多聚甲醛(PFA)2. 5%戊二醛的0. 1M 二甲次砷 酸鈉緩沖液中固定過夜。然后將樣本用二甲次砷酸鈉緩沖液清洗3次，并留置清洗 過夜。再用1。/。四氧化鋨(Sigma)的0. 1M 二甲此砷酸鈉緩沖液中完成后固定處理。隨 后再用乙醇遞增級次進(jìn)行脫水處理(乙醇級次為30%、 50%、 70%、 85%、 95%、 100%、 100%)，最后用C02進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥處理。經(jīng)干燥處理之后，對樣本進(jìn)行濺金處理后 在掃描電子顯微鏡下觀察。(對豬的心冠動(dòng)脈采用經(jīng)肝素包敷的Palmatz-Schatz移 植片固定模以減免血栓形成的支持模架。循環(huán)系統(tǒng)93:423-430，已經(jīng)在此引為參考 資料)。
在組織學(xué)方法方面，將裝入移植片固定模的血管段，用10%緩沖的福爾馬林沖洗 30秒鐘，放入2。/。多聚甲醛(PFA)2. 5%戊二酸的0. 1M 二甲次砷酸鈉緩沖液中固定過夜。 將每份支持模架分割成5段，g卩，支持模架近側(cè)l毫米、支持模架近側(cè)端l毫米、 支持模架中段、支持模架遠(yuǎn)側(cè)緣1毫米以及支持模架遠(yuǎn)側(cè)1毫米。各分段用蘇木紫 伊紅(HE)和彈性蛋白三色劑染。
圖14A-14G顯示的是，在植入1小時(shí)(圖14A和14B)和48小時(shí)((圖14C-14G)摘
取的，在掃描電子顯微鏡下觀察的各例外植體。這些顯微照相圖象清晰地顯示了， 經(jīng)葡聚糖/抗-CD34抗體包敷的支持模架(14B， 14E-G)，在48小時(shí)后與采用葡聚糖包 敷的對照材料(圖14A、 14C、禾卩14D)相比較，已經(jīng)俘獲了祖代內(nèi)皮細(xì)胞，在高倍放 大(400x)時(shí)，可見到外觀呈紡錘形的細(xì)胞形態(tài)。
從豬體心冠動(dòng)脈的外植體橫截面，也顯示出與對照組材料(裸露的不銹鋼，14H 和141;右旋糖膏包敷的材料，14J和14K)相比較，在經(jīng)葡聚糖/抗-CD34抗體包敷 的支持模架(1L， 14M)上，其內(nèi)膜組織增殖現(xiàn)象明顯受到抑制。如圖13B-13D所示， 由球烯類包敷的支持模架植入物，與裸露的不銹鋼模架對照材料相比較，對內(nèi)膜組 織增殖的抑制作用也相當(dāng)良好。
圖15A和15B分別顯示的是，葡聚糖-血漿包敷的沒有抗體在其表面結(jié)合的移植片固定模，以及葡聚糖-血漿包敷的有抗CD34抗體結(jié)合的18毫米長度的移植片固定
模的共焦顯微照相圖象。各例移植片固定模都是植入幼齡約克夏豬體的心冠動(dòng)脈內(nèi)， 其各例外植體都采用免疫組織化學(xué)方法處理，并用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體
-2(VEGFR-2)染色，然后用熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的次級抗體處理，再用共焦顯微鏡 觀察。圖15B和15C顯示，在含有抗體的移植片固定模段，由其中顯現(xiàn)的綠色熒光 表明有內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋；與之相比較，在沒有抗體的支持模架上，就完全缺乏內(nèi)皮細(xì) 胞層(圖15A)。
實(shí)施例6
內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與在固定的應(yīng)用于移植片固定模上的抗體基質(zhì)的結(jié)合
現(xiàn)介紹將直接對抗內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞表面抗原的一種抗體，固定在應(yīng)用于血管內(nèi)移 植片固定模的生物相容的基質(zhì)上的一種方法如下。于是就可吸收一種內(nèi)皮細(xì)胞生長 因子，在與血液相接觸時(shí)，可提高血行中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的附著能力，并且生長成熟 為功能性內(nèi)皮細(xì)胞層。
基質(zhì)層 的沉積過程:采用本領(lǐng)域的老資格技術(shù)人員所熟知的各種方法，對于不銹 鋼支持模架材料用血漿沉積方法處理，將胺的功能導(dǎo)入移植片固定模表面。對于沉 積在移植片固定模上的胺的功能層，通過采用一種標(biāo)準(zhǔn)的程序(已知是一種水溶性含 碳二亞胺化學(xué)處理)激活羧基功能性葡聚糖(CMDX)上的羧基基團(tuán)，在胺功能層上結(jié)合 一層羧基功能性葡聚糖層。其操作是在水體條件中進(jìn)行，其中在血漿沉積層上的胺 基團(tuán)，可在血漿層與功能性葡聚糖之間形成酰胺鍵結(jié)合。
抗體的固定過程對抗內(nèi)皮祖細(xì)胞表面抗原的各種抗體，例如，小鼠單克隆抗人 CD34，可通過在水溶性含碳亞胺化學(xué)處理方法，在緩沖的酸性溶液中培育，與功能 性葡聚糖(CMDX)包敷的移植片固定模以共價(jià)的方式結(jié)合。
生長因子的吸收過程:在將單克隆抗人CD34固定在應(yīng)用于移植片固定模的功能性 葡聚糖，再將該裝置培育在相當(dāng)于吸收入功能性葡聚糖的生長因子的濃度的一種內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子，例如，促血管生成素-2的水溶液中。經(jīng)此處理的裝置用生理緩沖 鹽水溶液淋洗之后，于疊氮化鈉防腐溶液中保存。
采用標(biāo)準(zhǔn)的血管造影技術(shù)檢査，上述植入豬心冠動(dòng)脈并暴露接觸人血液的裝置， 在受處理的斯坦特支持膜架表面上可產(chǎn)生加強(qiáng)對血行中內(nèi)皮祖細(xì)胞的承受和附著， 以及轉(zhuǎn)化為成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層的能力。預(yù)期快速形成的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層， 可減少裝置引起的血栓形成，并可調(diào)整內(nèi)膜組織增殖的程度。實(shí)施例7
內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和抗體在移植片固定模上的固定過程
以下介紹有關(guān)將對抗內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原以及內(nèi)皮細(xì)胞生長因子固定在 應(yīng)用于血管內(nèi)的移植片固定模上的生物相容的基質(zhì)的步驟。這種生物相容的基質(zhì)層 在與血液接觸時(shí)，可加強(qiáng)血行中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的附著過程，以及促使其轉(zhuǎn)化為成熟 的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層。
基質(zhì)層的沉積過程:采用本領(lǐng)域老資格的技術(shù)人員已知的各種方法，利用血漿沉 積方法處理不銹鋼材料的移植片固定模，對該支持模架表面導(dǎo)入胺的功能。對于沉 積在移植片固定模上的胺的功能層，通過采用一種標(biāo)準(zhǔn)的程序(已知是一種水溶性含 碳二亞胺化學(xué)處理方法)激活羧基功能性葡聚糖(CMDX)上的羧基基團(tuán)，在胺功能層上 結(jié)合一層羧基功能性葡聚糖層。其操作在水體條件中進(jìn)行，其中在血漿沉積層上的 胺基團(tuán)，可在血漿層與功能性葡聚糖之間形成酰胺鍵結(jié)合。
抗體和生長因子的固定過程
對抗內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的各種抗體，例如，小鼠單克隆抗人CD34，以及 一種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，例如，促血管生成素-2，都可在酸性條件下，在水溶性含 碳的二亞胺溶液中，以等摩爾濃度進(jìn)行培育，以共價(jià)的方式與有羧基功能性葡聚糖 (CMDX)包敷的支持模架相結(jié)合。該經(jīng)過處理的裝置用生理緩沖鹽水溶液淋洗之后， 于疊氮化鈉防腐溶液中保存。
采用標(biāo)準(zhǔn)的血管造影技術(shù)檢查，上述植入豬心冠動(dòng)脈并暴露接觸人血液的各例裝 置，在受處理的斯坦特支持膜架表面，可加強(qiáng)對血行中內(nèi)皮祖細(xì)胞的承受和附著， 以及轉(zhuǎn)化為成熟的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層。預(yù)期快速形成的功能性內(nèi)皮細(xì)胞層，可以減 少裝置引起的血栓形成，并可調(diào)整內(nèi)膜組織增殖的程度。
實(shí)施例8
移植片固定模的小分子物質(zhì)發(fā)揮的功能
按實(shí)施例1所述的方法分離祖代內(nèi)皮細(xì)胞。將細(xì)胞涂布在纖連蛋白包敷的玻片上， 在EBM-2培養(yǎng)基中培育生長7天。用碘化丙錠(PI)和一種熒光素異硫氰酸鹽結(jié)合的 內(nèi)皮細(xì)胞特異性凝集素(UlexEur叩aeusUea l)固定和染色。該組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖16A 和16B所示。圖示表明，所述祖代內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)與纖連蛋白包敷的玻片相結(jié)合，并 且細(xì)胞在其表面表達(dá)為凝集素的一種配體。
權(quán)利要求
1. 一種醫(yī)療裝置，所述裝置包括，一層包衣層，其在體內(nèi)促進(jìn)祖代內(nèi)皮細(xì)胞在該醫(yī)療裝置表面黏附、生長和分化，所述包衣層包含(a)治療有效量的至少一種選自抗體、抗體片段，或其組合和小分子物質(zhì)的物質(zhì)；(b)一種生物相容的基質(zhì)；以及(c)至少一種化合物；其中所述至少一種物質(zhì)直接對抗祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，或與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原相互作用，并將所述祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該裝置表面；且所述至少一種化合物可刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞，在該醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮組織。
2. 如權(quán)利要求1所述的醫(yī)療裝置，其特征在于，所述至少一種抗體或抗體片段 可直接對抗選自CD133、 CD34、 CDw90 、 CD117、 HLA-DR、 VEGFR-1 、 VEGFR-2 、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2 和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。
3. 如權(quán)利要求1所述的醫(yī)療裝置，其特征在于，所述至少一種化合物是選自血 管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-3(FGF-3) 、 FGF-4、 FGF-5、 FGF-6、 FGF-7、 FGF-8、 FGF-9、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性因子、轉(zhuǎn)化生長因 子P1、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素l、促血管生成素2、 胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、血小 板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋 白(trhombospondin)、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、白 介素8、甲狀腺素以及神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的一種生長因子。
4. 如權(quán)利要求1所述的醫(yī)療裝置，其特征在于，所述小分子選自天然存在的肽 類、合成肽類、糖肽類、脂肽類、脂質(zhì)類、糖類、有機(jī)分子類、無機(jī)分子類以及核 酸類。
5. 如權(quán)利要求1所述的醫(yī)療裝置，其特征在于，所述小分子是選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子R-l、血管內(nèi)皮生長因子R-2、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2 和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的配體。
6. —種包衣組合物，其在體內(nèi)促進(jìn)祖代內(nèi)皮細(xì)胞在醫(yī)療裝置表面黏附、生長和分化，所述組合物含有(a)—種生物相容的基質(zhì)；(b)治療有效量的至少一種選自抗 體、抗體片段，或其組合和小分子物質(zhì)的物質(zhì)；以及(c)至少一種化合物；其中所述 至少一種物質(zhì)直接對抗祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，或與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗 原相互作用，并將所述祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該裝置表面；且所述至少一種化合物可 刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞，在該醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮組織。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述至少一種抗體或抗體片段可 直接對抗選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子R-1、血管 內(nèi)皮生長因子R-2、Muc-18 (CD146) 、CD130、干細(xì)胞抗原(Sca-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。
8. —種包衣醫(yī)療裝置的方法，所述方法包括以下步驟a. 在醫(yī)療裝置表面至少敷上一層生物相容的基質(zhì)，其中，所述生物相容的基質(zhì) 含有選自聚氨酯、嵌段的聚氨酯-尿素/肝素、聚-L-乳酸、纖維素酯、聚乙二醇、聚 乙酸乙烯酯、葡聚糖、白明膠、膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋 白、肝素、血纖蛋白、纖維素以及碳和球烯的至少一種成分，以及b. 在所述生物相容的基質(zhì)中同時(shí)或相繼加入(i) 治療有效量的至少一種物質(zhì)，選自抗體、抗體片段或其組合，和小分子物質(zhì)， 其中至少一種物質(zhì)直接對抗祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種抗原，或與祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面 的抗原相互作用，并將祖代內(nèi)皮細(xì)胞固定在該裝置表面；禾口(ii) 至少一種化合物，刺激祖代內(nèi)皮細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞，在該醫(yī)療裝置表面形成內(nèi)皮組織。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述至少一種抗體或抗體片段可直 接對抗選自CD133、 CD34、 CDw90、 CD117、 HLA-DR、血管內(nèi)皮生長因子R-l、血管內(nèi) 皮生長因子R-2、 Muc-18 (CD146) 、 CD130、干細(xì)胞抗原(Sea-1)、干細(xì)胞因子1 (SCF/c-Kti配體)、Tie-2和HAD-DR的祖代內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述至少一種化合物是選自血管內(nèi) 皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-3、成纖維細(xì)胞生長因子-4、成纖維細(xì)胞生長因 子-5成纖維細(xì)胞生長因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、成纖維細(xì)胞生長因子-8、成 纖維細(xì)胞生長因子-9、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板誘導(dǎo)性生長因子、轉(zhuǎn)化生 長因子ei、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、骨粘連蛋白、促血管生成素1、促血管生成 素2、胰島素樣生長因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板衍生生長因子AA、 血小板衍生生長因子BB、血小板衍生生長因子AB、內(nèi)皮細(xì)胞PAS蛋白1、血小板反應(yīng)蛋白(trhombospondin)、增殖蛋白、肝配蛋白-Al、 E-選擇蛋白、肥胖蛋白、肝素、 白介素8、甲狀腺素以及神經(jīng)鞘氨醇1-磷酸酯的一種生長因子。
全文摘要
在此提供包覆有可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和分化的包衣的醫(yī)療裝置，生產(chǎn)一種醫(yī)療裝置的各種成分和方法。這類醫(yī)療裝置包括，例如，移植片固定模、移植片固定模移植物、合成的人造血管、心臟瓣膜等，都用含有各種抗體、抗體片段或小分子物質(zhì)的生物相容的基質(zhì)進(jìn)行包衣。這種生物相容的基質(zhì)對于始祖細(xì)胞表面抗原具有識(shí)別、結(jié)合和/或相互作用的能力，從而可將所述細(xì)胞固定在該裝置表面。該種裝置所用的包衣材料，還可含有一種化合物或生長因子，能夠促進(jìn)在該裝置表面的始祖代內(nèi)皮細(xì)胞，從受束縛的細(xì)胞狀態(tài)，加速黏附、生長和分化過程，而成為成熟的和功能性的內(nèi)皮細(xì)胞的能力，以防止內(nèi)膜增殖。在此公開發(fā)表了有關(guān)這類醫(yī)療裝置的方法，及其各種組成成分，以及對于患有各種血管性疾病，例如，血管瓣膜再狹窄癥、動(dòng)脈粥樣硬化癥或者其他類型的血管性障礙問題的哺乳動(dòng)物進(jìn)行治療的各種方法。
文檔編號(hào)A61BGK101502674SQ20081018431
公開日2009年8月12日 申請日期2003年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月6日
發(fā)明者M·A·庫里澤斯基, M·J·B·庫特里克, R·J·小科托尼, S·M·羅蘭德 申請人:祥豐醫(yī)療有限公司